Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

ataksia teleangiektasiaa mutatoitunut ja Rad3 Related (ATR) proteiinikinaasi on keskeinen anturi yksijuosteisen DNA liittyy pysähtynyt replikaation haarukat ja korjaus välituotteita syntyvä DNA: n korjaukseen. XRCC1 on kriittinen entsyymi yhden lohkon tauko korjaus- ja pohjan leikkaaminen korjaus. XRCC1-LIG3 kompleksi on myös tärkeä vaikuttaja ligatointivaihe nukleotidin Leikkauskorjauksessa vastausta.

Methods

Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme synteettinen kuolleisuutta XRCC1 puutteellinen ja XRCC1 taitavia kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) ja ihmisen munasarjasyöpäsoluja käyttämällä ATR-estäjät (NU6027). Lisäksi tutkimme myös kykyä ATR estäjien voimistavan sisplatiinin sytotoksisuutta XRCC1 puutteellinen ja XRCC1 asiantunteva CHO ja ihmisen syöpäsoluja. Klonogeeniset määrityksiä, emäksinen COMET määritykset, γH2AX immunosytokemiassa, FACS solusyklin sekä FITC-anneksiini V virtaussytometrianalyysin tehtiin.

Tulokset

ATR esto on synteettisesti tappava XRCC1 puutteellinen soluissa osoituksena lisääntynyt sytotoksisuus, kertyminen kaksijuosteisen DNA katkoksia, G2 /M solukierron pysähtymisen ja lisäsi apoptoosin. Verrattuna sisplatiinia yksin, yhdistelmänä sisplatiinin ja ATR estäjä johtaa tehostetun sytotoksisuuden XRCC1 vajaiden solujen verrattuna XRCC1 taitavia soluihin.

Johtopäätökset

Tuloksemme antaa näyttöä, että ATR esto soveltuu synteettinen kuolleisuutta soveltamiseen ja sisplatiinin chemopotentiation in XRCC1 puutteellinen munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Sultana R, Abdel-Fatah T, Perry C, Moseley P, Albarakti N, Mohan V, et ai. (2013) ataksia verisuoniluomen mutaation ja Rad3 Related (ATR) proteiinikinaasi esto Synteettisesti Lethal in XRCC1 Puutteellinen munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10,1371 /journal.pone.0057098

Editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 marraskuu 2012; Hyväksytty: 17 tammikuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Sultana et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdistaminen DNA korjaus synteettisiä kuolleisuutta on jännittävä uusi strategia henkilökohtainen hoidon munasarjasyövän. DNA: n korjaukseen on olennaista käsittelyä DNA-vaurion kemoterapian aiheuttama, kuten platinating aineet (karboplatiini, sisplatiini) [1]. Sisäiset säikeen ristisidosyhdisteiden DNA additiotuotteiden aiheuttama platinating aineet, jos korjaamatta, lopulta johtaa solukuolemaan [2], [3]. DNA sisäistä lohkon siltoja korjataan pääasiassa nukleotidin Leikkauskorjauksessa (NER) soluissa [4], [5]. Platinating aineet voivat myös tuottaa vapaita happiradikaaleja, jotka aiheuttavat oksidatiivista pohja vahingot, joita käsitellään DNA base Leikkauskorjauksessa (BER) reitin soluissa [6], [7].

XRCC1 (röntgen korjaus cross – täydentää geeni 1) proteiini on kriittinen tekijä BER ja yhden lohkon murtuma korjaukseen liittyvän reitin (SSBR). XRCC1-LIG3 kompleksi on myös tärkeä vaikuttaja ligatointivaihe nukleotidin Leikkauskorjauksessa (NER) vaste. XRCC1, 70 kDa proteiini, ei ole tunnettuja entsymaattista aktiivisuutta (tarkistetaan [8], [9], [10]). XRCC1 toimii molekyyli- telineiden proteiinia ja koordinoi DNA korjaukseen vuorovaikutuksessa useiden komponenttien BER /SSBR kuten PARP-1 [Poly (ADP-riboosi) polymeraasien 1], DNA glykosylaaseja, AP endonukleaasi (APE1) ja muut (tarkistetaan [ ,,,0],8], [9], [10]). XRCC1 puutos soluissa johtaa kertymistä yksittäisen DNA katkeamisen (SSBs), mutaatioita ja aiheuttaa kohonneet sisarkormatidinvaihdokset. XRCC1 puute solulinjoissa aiheuttaa yliherkkyyttä ionisoivan säteilyn ja kemoterapiaa [9]. Ihmisen yhdistys tutkimuksissa ituradan polymorfismien XRCC1 voivat vaikuttaa syövän riskiä [11], [12] ja vaikuttaa vastauksena platinaa kemoterapiaan [13], [14], [15], [16]. Ihmisen munasarjasyöpä olemme hiljattain osoittaneet, että kasvaimia usein yli-express XRCC1 (48%) ja merkittävästi liittyy korkeampi vaiheen (p = 0,006), vakavien tyypin kasvaimet (p = 0,008), optimaalista de-täyteaineena (p = 0,004 ), kaksi kertainen kuolemanriski (p = 0,007) ja etenemiseen (p 0,0001) [17]. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä XRCC1 ilmentyminen itsenäisesti liittyy selviytymisen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [HR 2,3, p = 0,002]. XRCC1 syöpäkasvain liittyivät platina herkkyys (p 0,0001). Pre-kliinisesti myös vahvistanut, että XRCC1 negatiiviset solut ovat yliherkkiä sisplatiinia verrattuna XRCC1 positiivisten solujen [17]. Yliherkkyys sisplatiiniin XRCC1 negatiivisissa soluissa liittyi kertyminen DNA säikeen katkoksia ja G2 /M solukierron pysähtymisen [17]. Meidän data ehdottaa, että XRCC1 on lupaava biomarkkereiden munasarjasyövän.

ataksia-telangiektasia mutatoitunut ja Rad3 Related (ATR) proteiinikinaasi on keskeinen anturi yksijuosteisen DNA liittyy pysähtynyt replikaation haarukat sekä syntyvän BER ja kaksinkertainen lohkon murtuma korjaus DNA korjaus välituotteita. Aktivoidut ATR vuorostaan ​​fosforyloi useita substraatteja osallisena solukierron säätelyssä, DNA: n replikaatio, DNA: n korjaukseen ja apoptoosin (tarkistetaan [18], [19], [20], [21], [22]). Prekliinisissä tutkimuksissa, ATR esto voi solumyrkkyterapiassa herkistymistä [22], [23], [24]. Pienmolekyylisalpaajilla ATR parhaillaan kehitteillä terapeuttiseen käyttöön syövän [20], [21], [22].

Kyky PARP estäjät aiheuttaa synteettisen kuolleisuutta BRCA puutteellinen munasarjasyöpiä [25], [26], [27] viittaavat siihen, että muut tekijät sisällä BER /SSBR voivat olla sopivia esimerkiksi henkilökohtainen lähestymistapoja. XRCC1 on kriittinen tekijä BER, SSBR ja NER. ATR on keskeinen anturi SSBs. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet ja vahvistettu synteettisen kuolleisuutta XRCC1 vajaiden solujen käsiteltiin ATR-inhibiittorit. Lisäksi verrattuna pelkkää sisplatiinia, yhdistelmänä sisplatiinin ja ATR-estäjä hoitotuloksia tiiviimpään sytotoksisuuden XRCC1 vajaiden solujen verrattuna XRCC1 taitavia soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet ja reagenssit

Pieni molekyyli ATR estäjiä NU6027 ja VE-821 ostettiin Tocris Bioscience, UK ja Tinib-työkalut, Tsekkiin. Yhdisteet liuotettiin 100% DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa. Sisplatiini (1 mg /ml) saatiin farmasian laitos, Nottinghamin yliopiston sairaaloissa, UK.

Solulinjat ja kulttuurin

Aiemmin hyvin tunnettu kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO); CHO9 (Wild tyyppi), EM-C11 (XRCC1-mutantti: C389Y korvaaminen johtaa XRCC1protein epävakauteen), EM-C12 (XRCC1-mutantti: E98K korvaaminen mikä vähentää XRCC1 proteiinin eheys) [28] toimitti professori Małgorzata Z. Zdzienicka , Department of Molecular Cell Genetics, Nicolaus-Copernicus University Torun, Bydgoszcz 85-094, Puola. Soluja kasvatettiin Hamin F-10 väliaine (PAA, UK) [jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA, UK) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä]. EM9-V (XRCC1 mutantti) ja EM9 pysyvästi transfektoitujen solujen ihmisen XRCC1 ekspressiovektorin (EM9-XH solut) [29] toimitti professori Keith Caldicott, Genome Damage ja vakaus Centre, University of Sussex, UK. -Soluja kasvatettiin DMEM (PAA, UK) [jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA, UK) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä]. Munasarjasyöpäsoluja OVCAR-3 ja OVCAR-4 kasvatettiin RPMI-elatusaineessa (PAA, UK) [jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA, UK) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä].

XRCC1 pudotus käyttäminen siRNA

kolme XRCC1 siRNA rakentaa (sekvenssit on lueteltu taulukossa 1) ja yhden negatiivisen sekoitetun ohjaus ja siRNA glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (positiivinen kontrolli) käytettiin näissä tutkimuksissa. SiRNA konstruktit ostettiin Ambion elämän tekniikoita, UK. Transfektioprotokolla oli aikaisemmin kuvatulla Fan et.al [30]. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (2 ml väliainetta /kuoppa ilman antibiootteja). 50% konfluenssiin, transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, siRNA (100 pmol) ja Lipofectamine (5 ui) olivat kukin erikseen sekoitetaan 250 ul OptiConcept MEM1 (GIBCO /Invitrogen) ilman FBS. Kun 5 minuutin inkubointi huoneenlämpötilassa, siRNA ja Lipofectamine-liuokset yhdistettiin ja inkuboitiin vielä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämä seos lisättiin sitten päällystetty soluja, viljellään 37 ° C: ssa yön yli ja väliaine korvattiin myöhemmin tuoreella elatusaineella plus penisilliiniä /streptomysiiniä (1%). Kun solut saavutti 100% konfluenssiin, ne trypsinoitiin ja sen jälkeen siirrettiin 75 cm

2 pulloissa kasvun jatkumiselle ja /tai hoitoon. XRCC1 pudotus arvioitiin western blottauksella eri aikapisteissä transfektion jälkeen (päivinä 3, 5 ja 7).

Western blot -analyysi

Proteiininäytteet valmistettiin lysoimalla solut RIPA-puskurissa (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoria (Sigma) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail 2 ja 3 (Sigma), ja sitten toteutettu western blot analysoidaan kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Ensisijainen vasta-olivat hiiren anti -XRCC1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja kanin anti-ATR (Novus Biologicals, USA). HRP-konjugaattia sekundäärinen vasta-aine oli kanin anti-hiiren ja vuohen anti-kani vastaavasti (Dako, Glostrup, Tanska).

klonogeeninen eloonläämismääritys

Kaksisataa solua kuoppaa kohti ympättiin kuuden kennon levyt. Solujen annettiin kiinnittyä 4 tunnin ajan. NU6027 tai VE-821 lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina ja levyt jätettiin inkubaattoriin 10 päivää varten CHO-soluja. SiRNA transfektoitu OVCAR-3 ja OVCAR-4-soluja, kolme päivää transfektion jälkeen, NU6027 tai VE-821 lisättiin osoitettuina pitoisuuksina, ja levyt jätettiin inkubaattoriin 14 päivää. Sisplatiinin ja ATR-inhibiittorin yhdistelmä-tutkimuksia varten solut ensin sisplatiinia 16 tunnin ajan ja sitten varovasti pestiin kahdesti 1X fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin tuoreessa, median kanssa tai ilman NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM OVCAR-3 solujen ) ja 10 päivää (CH-solut) tai 14 päivää (ihmisen syöpäsoluja). Inkuboinnin jälkeen väliaine heitettiin pois, kiinteä (ja metanolin ja etikkahapon seos) värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Eloonjääntifraktio = [No. muodostuneiden pesäkkeiden /(nro. solujen kylvetään x Pinnoitus tehokkuus)]. Kaikki klonogeenisten määritykset tehtiin kolmena kappaleena.

Alkaline COMET Pitoisuus

Tämä määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, subkonfluentteja soluja altistettiin NU6027 (4 uM). 24 tunnin kuluttua solut uutettiin ja emäksinen komeetta määritykset suoritettiin. Alkali elektroforeesin puskuri sisälsi 200 mM NaOH, 1 mM EDTA: a ja pH 13. Levyt värjättiin sitten SYBR® vihreä (1:10,000 laimennos) (Molecular Probes) 10 minuuttia, ja kuvat oli visualisoida rodamiinisuodatinta Olympus BX40 mikroskooppi. Komeettoja analysoitiin Comet määritys III kuva-analyysi-ohjelmisto (käsityskyky Instruments, Suffolk, UK). Yhteensä 200 komeetta kuvien arvioitiin oliivi takaosan liike.

γH2AX Immunosytokemia

Soluja käsiteltiin 48 tuntia NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM OVCAR-3-solut) ja määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Sisplatiinin ja NU6027 yhdistelmä tutkimuksia, aluksi soluja käsiteltiin 16 tuntia sisplatiinin (1,5 uM CHO-soluja ja 1 uM OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluja) ja sitten varovasti pestiin kahdesti 1X fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin tuoreessa, median kanssa tai ilman NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluja), ja määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Taajuudet sisältävien solujen γH2AX pesäkkeitä määritettiin 100 solua per slide kolmessa erillisessä kokeessa. Nuclei sisältävät yli kuusi γH2AX pesäkkeitä pidettiin positiivisina.

Virtaussytometrinen Analyysit (FACS) solusyklin etenemisen

Soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM for OVCAR-3 tai OVCAR-4-solut). Solut myöhemmin kerättiin trypsiinikäsittelyllä ja sentrifugoinnilla (1000 rpm 5 minuutin ajan) ja FACS-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31].

Apoptosis Detection FITC-anneksiini V: Virtaussytometrinen analyysi

soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluja). Solut myöhemmin kerättiin trypsiinikäsittelyllä ja sentrifugoinnilla (1000 rpm 5 minuutin ajan) ja pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja sitten suspendoitiin uudelleen solujen 1X Binding puskurissa pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml. Sitten 100 ui liuosta (1 x 10

5 solua) siirrettiin 5 ml: n viljelmä putkeen ja 5 ui FITC anneksiini V: n ja 5 ui PI lisättiin. Sitten solut varovasti pyörteen ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa (25 ° C) pimeässä. Inkubaation jälkeen 400 ui: aan sitoutumispuskuria lisättiin jokaiseen putkeen, ja analysoitiin virtaussytometrialla 1 tunnin kuluessa. Sisplatiinin ja NU6027 yhdistelmä kokeita varten solut saivat ensin 16 tuntia sisplatiinin (1,5 uM CHO-soluja ja 1 uM OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluja) ja sitten varovasti pestiin kahdesti 1X fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin tuoreessa, median kanssa tai ilman NU6027 (4 uM CHO-solujen ja 6 uM OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluja), ja määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu. Aineisto analysoitiin FlowJo7.6.1 ohjelmistoa.

Evaluation of Drug Interaction (Combination Index) B

tutkimiseksi synergistinen ja lisäaineen toimintaa, yhdistelmä indeksi laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Annos-vaste-käyrät sisplatiinia tai NU6027 yksin muodostettiin ensin. Vaikutus yhdistetyn hoidon analysoitiin sitten yhdistelmä lääkkeen A (sisplatiini) ja B (NU6027), käyttämällä seuraavaa yhtälöä: Ac /Ae + Bc /Be = D, jossa Ac ja Bc vastaavat pitoisuudet lääkkeiden käytetään yhdistelmähoitoa, ja Ae ja Be, vastaa lääkkeiden pitoisuudet voivat, itse tuottavat samaa suuruusluokkaa vaikutus. Jos D (yhdistelmä indeksi) on 1 vaikutus yhdistelmä on synergistinen, kun taas jos D = 1 tai D on 1 vaikutus on additiivinen tai antagonistinen vastaavasti [32].

Tulokset

Synthetic letaalisuus

arvioida synteettisestä kuolleisuutta pre-kliinisesti, paneeli XRCC1 puutteellisia ja XRCC1 asiantunteva kiinanhamsterin munasarja ja ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa hoidettiin pienmolekyylisalpaajilla ATR (NU6027 ja VE-821 ).

kiinanhamsterin munasarjan (CHO).

CHO9 (Wild tyyppi), EM-C11 (XRCC1 puutteellista) ja EM-C12 (XRCC1 puutteellinen) tutkittiin klonogeeniset selviytymisen määrityksissä. Alussa arvioidaan XRCC1 ja ATR ilmaisun asema CHO9, EM-C11 ja EM-C12 soluissa. Western blot-analyysi kuviossa 1A osoittaa, että EM-C11 ja EM-C12 ei ole mitattavissa XRCC1 proteiinin ilmentymisen verrattuna CHO9. EM-C11, EM-C12 ja CHO9 hallitsee ATR ilme. Kuvio 1B osoittaa, että EM-C11: n ja EM-C12-solut ovat herkkiä NU6027 hoitoon verrattuna CHO9 soluihin. Samoin, EM-C11: n ja EM-C12-solut ovat myös herkkiä VE-821 verrattuna CHO9 soluihin (kuvio 1C). Tutkia, herkkyyden XRCC1 vajavaisten solujen ATR estäjiä voidaan korjata ilmentymistä villityypin XRCC1 proteiinia XRCC1 puutteellinen CHO-soluissa, suoritimme klonogeeniset määrityksissä EM9-V (XRCC1 mutantti) ja EM9-XH (pysyvästi transfektoitujen solujen ihmisen XRCC1 ekspressiovektorin). Kuvio 1D osoittaa, että EM9-V-solut ovat herkkiä NU6027 verrattuna EM9-XH.

klonogeeninen selviytymisen määritykset CH-soluja käsiteltiin NU6027 (B) ja VE-821 (C) ilmoitetuilla pitoisuuksilla (katso menetelmät yksityiskohdat). D. klonogeeninen selviytymisen määritykset EM9-V ja EM9-XH soluja käsiteltiin NU6027. E. Alkalinen COMET määritys CH käsitellyissä soluissa NU6027. EM-C11 ja EM-C12 osoitti korkeampi keskimääräinen takaosan liike verrattuna CHO9 soluihin. F. EM-C11 ja EM-C12-solut kerääntyvät merkittävästi suurempi γH2AX pesäkkeitä verrattuna CHO9 soluihin kun NU6027 hoitoa. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 6). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05.

Sitten toteutettiin toiminnallinen analyysi soluissa. ATR esto johtaa yksittäisen DNA lohkon murtuma (SSB) kertymistä. Siksi Emäksinen COMET määritys suoritettiin. Kuvio 1E yhteenveto tulokset CHO9, EM-C11 ja EM-C12 solut käsiteltiin 4 uM NU6027. Verrattuna esikäsittely näytteitä, 24 tunnin kuluttua altistumisesta ATR estäjä, EM-C11 ja EM-C12 solut osoittavat merkittävästi suurempi keskimääräinen takaosan liike verrattuna CHO9 (p 0,01). Tiedot vahvistavat SSB kumuloitumista ATR eston XRCC1 vajavaisten solujen.

DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) indusoivat fosforylaatio H2AX seriinin 139 (γH2AX). Kertyminen γH2AX pesäkkeitä tumassa on merkkiaine DSB. Siksi γH2AX immunosytokemiassa suoritettiin EM-C11, EM-C12 ja CHO9 soluja käsiteltiin 4 μΜ of NU6027. Nuclei sisältävät yli kuusi γH2AX pesäkkeitä pidettiin positiivisina. γH2AX immunosolukemiallinen vahvisti, että XRCC1 puutteellinen EM-C11 ja EM-C12 solut kertynyt enemmän γH2AX pesäkkeitä 48 tuntia (p = 0,02 ja p = 0,05) verrattuna CHO9 soluihin (kuviot 1 D).

kasaantuminen DSB: t voivat viivästyttää solusyklin etenemisen. FACS-analyysit siis suoritettiin EM-C11, EM-C12 ja CHO9 soluja käsiteltiin NU6027 (4 uM). Solusyklin etenemisen oli arvioida ja verrata kontrollinäytteisiin. 24 tunnin, EM-C11: n ja EM-C12 osoitettiin olevan pidätetty G2 /M-vaiheen solusyklin (p = 0,01 ja p = 0,03) verrattuna CHO9 soluihin (kuvio 2A ja 2B).

B. Kvantifiointi eri vaiheissa solusyklin on esitetty CH käsitelty solu NU6027. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 6). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05. C. FITC-anneksiini V apoptoosimäärityksessä Tässä näytetään. Solujen osuus varhaisessa vaiheessa apoptoosin on suurempi XRCC1 vajaiden solujen käsiteltiin NU6027 verrattuna villin tyypin soluihin.

kertyminen DSB, jos korjaamatta, indusoi apoptoosia soluissa. Näin ollen, FITC-anneksiini V: virtaussytometria-analyysi suoritettiin määrittämään solujen apoptoosia, käsiteltiin 4 uM NU6027 ja apoptoottisten solujen määrällisesti 48 tuntia. EM-C11 solujen osuus solun alussa apoptoosin nousi 7,5% 48 tunnin kuluttua hoidon NU6027 verrattuna 1,73% käsittelemättömissä soluissa. Samoin EM-C12-solut, prosentuaalinen varhaisten apoptoottisten solujen nousi 2,62%: sta 9,88%. Toisaalta vuonna CHO9 soluissa ei havaittu muutosta prosenttiosuuden varhaisen apoptoottisten solujen (3,22% hoitamattomassa ja 3,38% sen jälkeen 48 tunnin NU6027 hoidon (kuvio 2C).

esitetyt tiedot kiinalaisen hamsterin solut viittaa siihen, että XRCC1 puutteellinen solut ovat herkkiä ATR estäjiä. ATR esto johtaa lisääntyneeseen DSB kertymistä, G2 /M solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Tämä viittaa siihen, synteettinen kuolleisuutta suhde XRCC1 ja ATR. vahvista tietojen lisäksi selvitettiin ihmisen munasarjan syöpäsolulinjoja.

ihmisen munasarjasyövän soluja.

tuotti XRCC1 pudotus ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa käyttämällä kolmea siRNA-rakenteet (taulukko 1). transfektion jälkeen, solulysaateista otettiin näytteet päivinä 3, 5 ja 7 XRCC1 kaataa western blot analyysi. Kuvio 3A osoittaa, että kaikki kolme konstruktioita (siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3) indusoivat tehokkaan taintumisen (yli 80%) XRCC1 in OVCAR-3 solujen päivänä 3 verrattuna salattu negatiiviseen kontrolliin ja GAPDH positiivisena kontrollina. Vuonna klonogeenisten selviytymisen määritykset, NU6027 vähensi eloonjäämisen XRCC1 vajaiden solujen verrattuna taitavia soluja (kuvio 3B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös OVCAR-4-solut (kuva S1 A). γH2AX immunosolukemiallinen vahvisti, että XRCC1 vajaiden solujen kertynyt enemmän γH2AX pesäkkeitä 48 tuntia (p = 0,05, p = 0,01 ja p = 0,007) kuin salattu ohjaus (kuvio 3C). Lisäksi 24 tunnin kohdalla, XRCC1 vajaiden solujen osoitettiin olevan pidätetty G2 /M-vaiheen solusyklin (p = 0,05, p = 0,04 ja p = 0,05) verrattuna CHO9 soluihin (kuvio 3D). Vuonna XRCC1 vajaiden solujen osuus solujen apoptoosin kasvoi merkittävästi verrattuna salattu valvonnan yhteydessä NU6027 käsittely (kuvio 3E).

B. Klonogeeniset selviytymisen määritykset siRNA transfektoitujen OVCAR-3 soluja käsiteltiin NU6027 ilmoitetuilla pitoisuuksilla on esitetty tässä (katso menetelmät lisätietoja). C. XRCC1 vajaiden solujen kerääntyä merkittävästi suurempi γH2AX pesäkkeitä verrattuna salattu kontrollisoluihin upon NU6027 hoitoa. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 6). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01. D. kvantitointi eri vaiheissa solusyklin on esitetty siRNA transfektoitu OVCAR-3 solujen käsiteltiin NU6027 on esitetty tässä. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 3). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05. E. FITC-anneksiini V apoptoosin määritystä siRNA transfektoitujen OVCAR-3 solujen Tässä näytetään. Osuus solujen myöhäisen vaiheen apoptoosin on suurempi XRCC1 vajaiden solujen käsitelty NU6027 verrattuna salattu kontrollisoluihin.

Yhteenvetona tiedot CHO-soluista ja ihmisen solulinjoissa esittäneet näyttöä, että ATR-inhibiittorit aiheuttaa synteettinen kuolleisuutta XRCC1 vajavaisten solujen.

sisplatiini Chemopotentiation

Olemme aiemmin osoittaneet, että XRCC1 puutteellinen solut ovat herkkiä sisplatiinin [17]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme ensimmäinen vahvisti tämän havainnon XRCC1 puutteellinen EM-C11 ja EM-C12 soluissa verrattuna CHO9 villityypin soluja (kuvio 4A). Sitten arvioitiin yhdistelmä strategioita. Sytotoksisuus Sisplatiinin parannettiin NU6027 vuonna XRCC1 puutteellinen CH soluja verrattuna XRCC1 taitavia soluihin. Jotta voitaisiin arvioida vuorovaikutusta NU6027 ja sisplatiini, yhdistelmä indeksi laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Soluja viljeltiin, kun läsnä on kasvavia annoksia sisplatiinia (alue 0,5-3 uM) yhdessä pitoisuus NU6027 kykenee indusoimaan 50% kasvun inhibitio. NU6027 voimisti sytotoksisen sisplatiinin vaikutusta XRCC1 vajaiden solujen (taulukko 2). Jos yhdistelmä indeksi (D) on 1 vaikutus yhdistelmä on synergistinen, kun taas jos D = 1 tai D on 1 vaikutus on additiivinen tai antagonistinen vastaavasti [32]. Nykyisessä tutkimuksessa yhdistelmä indeksi oli yksi EM-C11 ja EM-C12 soluissa. Olemme päätellä, että lisälaite sisplatiinin sytotoksisuudelta NU6027 CHO-soluissa oli additiivinen sijaan synergistinen. Sitten eteni suorittavat toiminnalliset analyysit soluissa. Sisplatiinia yksin käsittely lisäsi DSB kertymistä XRCC1 vajaiden solujen, joka edelleen kasvoi NU6027 (p = 0,01 ja p = 0,02) (kuvio 4B). DSB kertyminen nähdään XRCC1 vajaiden solujen liittyi myös kertyminen apoptoottisten solujen, kuten on esitetty kuviossa 4C.

X-akseli tarkoittaa konsentraatio kasvaa sisplatiinin vain. NU6027 vahvistettiin 4 uM. B. XRCC1 puutteellinen CH soluihin kertyy merkittävästi suurempi γH2AX pesäkkeitä verrattuna XRCC1 taitavia CH solujen upon sisplatiinihoitoon yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin ja NU6027. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 6). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-anneksiini V apoptoosimäärityksessä Tässä näytetään. Solujen osuus varhaisessa vaiheessa sekä myöhäisen vaiheen apoptoosin on suurempi XRCC1 vajaiden solujen sisplatiinia yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin ja NU6027 verrattuna villin tyypin soluihin.

sitten suoritettiin samanlaiset tutkimukset siRNA transfektoiduissa ihmisen OVCAR-3 tai OVCAR-4-soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia nähdään CH soluissa, XRCC1 puutteellinen OVCAR-3 tai OVCAR-4-solut olivat herkkiä sisplatiinia. NU6027 parannettu sytotoksisuus sisplatiinin XRCC1 puutteellinen OVCAR-3 soluja verrattuna XRCC1 taitavia soluja (kuvio 5A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös OVCAR-4-solut (kuva S1 B). Yhdistelmä-indeksi tutkimukset (taulukko 2) osoitti, että useimmissa soluissa on yksi, paitsi OVCAR-3 soluja käsiteltiin Si RNA_3 (D = 0,93) ja OVCAR-4-soluja SiRNA_1 (D = 0,99). Yhdessä me päätellä, että ihmisen munasarjasyöpäsoluja tehostava vaikutus on todennäköisesti lisäaine. Sisplatiinia yksin käsittely lisäsi DSB kerääntymistä soluissa, jotka oli edelleen lisätä NU6027 (p = 0,02, p = 0,007 ja p = 004) (kuvio 5B). DSB kertyminen nähdään XRCC1 vajaiden solujen liittyi kertymistä merkittäviä apoptoottisten solujen kuten kuvassa 5C.

B. XRCC1 vajaiden solujen kerääntyä merkittävästi suurempi γH2AX pesäkkeitä verrattuna XRCC1 taitavia soluihin, kun sisplatiinia hoito yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin ja NU6027. Data edustaa keskiarvoja ± SEM (n = 6). Tulokset analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-anneksiini V apoptoosimäärityksessä Tässä näytetään. Osuus solujen myöhäisen vaiheen apoptoosin on suurempi XRCC1 vajaiden solujen sisplatiinia yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin ja NU6027 verrattuna villin tyypin soluihin.

Tässä esitetyt tiedot paitsi antaa lisää todisteita siitä, että XRCC1 puutteellinen solut ovat herkkiä sisplatiini-kemoterapian vaan myös siitä, että ATR esto additiivisesti lisää sisplatiinin toksisuus XRCC1 vajaiden solujen verrattuna XRCC1 taitavia soluihin.

Johtopäätökset

ATR proteiinikinaasi on keskeinen anturi single -stranded DNA liittyy pysähtynyt replikointi haarukat ja korjaus välituotteiden syntyvää BER ja DSB korjaus. ATR aktivointi säätelee useiden solun prosessien kuten solukierron säätelyssä, DNA: n replikaatio, DNA: n korjaukseen apoptoosin. XRCC1 on välttämätöntä BER ja SSBR ja edistää ligatointivaihe on NER vasteen. Me arveltu, että ATR esto voisi olla synteettisesti tappava XRCC1 vajavaisten solujen.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että ATR-inhibiittorit ovat synteettisesti tappava XRCC1 vajavaisten solujen. Olemme tehneet synteettinen kuolleisuutta seuraavista syistä. Ensinnäkin, CHO-solut sekä ihmisen syöpäsoluja puutteellinen XRCC1 olivat erittäin herkkiä ATR estäjiä. Toiseksi, toiminnalliset analyysit osoittivat, että ATR eston XRCC1 vajaiden solujen johti kertyminen DNA DSB: iden, G2 /M solukierron pysähtymisen ja lisäsi apoptoosin. Tämä tieto on yhdenmukainen tutkimus Peasland et al [22], jotka osoittivat, että NU6027 on synteettisesti tappava käsitelty solu PARP-inhibiittorin, joka estää BER. Lisäksi kirjoittajat osoittivat myös, että EM9 kiinan hamsterin soluja, joista puuttuu XRCC1 ovat myös herkkiä NU6027 [22]. Tiedot, kuten meidän, siis esitetä pakottavia todisteita siitä, että ATR esto on synteettisesti tappava BER vajavaisten solujen. Esitämme toimiva malli ATR esto synteettisenä kuolleisuutta strategian XRCC1 vajavaisten solujen. Lyhyesti, ATR esto johtaa SSB kertymistä. Solut puutteellisia XRCC1 eivät pysty käsittelemään SSBs jotka lopulta muunnetaan myrkyllisiä DSB: ihin on lisääntymään haarukat. Ylivoimainen DSB voi paitsi kyllästetty DSB: n korjautumisessa, mutta ATR inhibitio tunnetaan myös moduloida DSB korjaus suoraan [33], [34] edistää synteettisiä kuolleisuutta havaittiin soluissa.

Havaitsimme myös, että XRCC1 puutteellisia solut ovat herkkiä sisplatiinia. Sisplatiini herkkyyttä XRCC1 vajaiden solujen havaittu tutkimuksessamme on yhdenmukainen tuoreessa tutkimuksessa HepG2-soluissa, jossa sisplatiinia herkkyys osoitettiin seuraavat XRCC1 ehtyminen [35]. Emme havainneet tehostavien sisplatiinin sytotoksisuuden ATR estäjää XRCC1 villityypin soluista. Tämä on ristiriidassa aiempien prekliinisissä tutkimuksissa, joissa ATR inaktivaation (geneettisesti tai inhibiittorit) on havaittu olevan platinaa herkkyys paneelia solulinjojen [22]. Kuitenkin rajoitus Tutkimuksemme on, että tutkimus oli rajoitettu muutamia solutyyppejä vain. Siitä huolimatta meidän tietojen mukaan geneettisen taustan (esimerkiksi XRCC1 tila) voivat vaikuttaa platinan herkkyys. Yhteenvetona olemme osoittaneet synteettinen kuolleisuutta hakemuksen ATR estäjien XRCC1 vajavaisten solujen. ATR esto voi vaikuttaa myös platina herkkyyttä XRCC1 vajavaisten solujen.