Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa tarkastellaan roolia s-nitrosylation kasvun munasarjasyövän soluviljelmää käyttämällä pohjainen ja

vuonna vivo

lähestymistapoja. Käyttämällä nitrosylating ainetta, S-nitrosoglutathione (GSNO), fysiologinen typpioksidi molekyyliä, osoitamme, että GSNO hoito inhiboi proliferaatiota chemoresponsive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän solulinjoissa (A2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 ja PE04) annoksesta riippuvalla tavalla. GSNO hoito kumottu kasvutekijä (HB-EGF) indusoidun signaalin transduktio, kuten fosforylaation Akt, p42 /44 ja STAT3, joiden tiedetään olevan kriittiset roolit munasarjasyövän kasvuun ja etenemiseen. Tutkia terapeuttista potentiaalia GSNO

in vivo

, kantavien nude-hiirten vatsaonteloon ksenografteissa ihmisen A2780 munasarjasyövän solulinja (2 x 10

6) annettiin suun kautta GSNO annoksella 1 mg /painokilo. Päivittäinen oraalinen annostelu GSNO vaimensi merkittävästi kasvaimen massa (p 0,001) vatsaonteloon verrattuna vehikkeliin (fosfaattipuskuroitu suolaliuos) käsitellystä ryhmästä 4 viikkoa. GSNO myös voimisti sisplatiinin välittämä kasvaimen myrkyllisyys käytettäessä A2780 munasarjasyöpäpotilailla nude-hiirimallissa. GSNO n nitrosylating kykyä näkyi aiheuttama nitrosylation erilaisten tunnettujen proteiinien kuten NFKB p65, Akt ja EGFR. Uutena havaintona, havaitsimme, että GSNO myös indusoi nitrosylation kanssa käänteinen suhde on tyrosiinin 705 fosforylaatiota STAT3, vakiinnuttanut asemansa chemoresistance ja proliferaatiota in munasarjasyövän ja syövän yleensä. Kaiken Tutkimuksemme korostaa merkitystä S-nitrosylation keskeisten syövän edistää proteiinien moduloinnissa munasarjasyövän ja ehdottaa terapeuttista potentiaalia nitrosylating aineita (kuten GSNO) varten munasarjasyövän hoitoon yksinään tai yhdessä kemoterapeuttisten lääkkeiden kanssa.

Citation: Giri S, rottinki R, Deshpande M, Maguire JL, Johnson Z, Graham RP, et al. (2014) Prekliiniset terapeuttinen potentiaali Nitrosylating agentista Munasarjasyöpäleikkauksia. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10,1371 /journal.pone.0097897

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 07 tammikuu 2014; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2014; Julkaistu: 02 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Giri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Marsha Rivkin Scholar myöntäminen ja puolustusministeriön OCRP palkinnon W81XWH-12-1-0270 SG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OvCa) on viidenneksi yleisin kuolinsyy kaikista syövistä naisilla Yhdysvalloissa ja yleisin kuolinsyy gynekologisista syöpäsairauksia [1]. Korkeat kuolleisuus liittyy OvCa johtuu suurimmalla osalla potilaista (75%), joilla on laajalle levinnyt (vaihe III tai suurempi) taudin aikaan diagnoosi [2]. Köyhä 5 vuoden pysyvyys (30%) johtuu siitä, että useimmat OvCa n ovat käyttökelvottomaksi aikaan diagnoosin. Jos havaitaan varhaisessa vaiheessa, yli 90%: lla potilaista on parempi ennuste ja vastata terapian verrattuna potilaisiin, joilla on edennyt pitkälle tauti. Näin ollen voidaan ymmärtää paremmin tärkeimpiä molekyylitason tapahtumia pelaa tärkeä rooli OvCa voi johtaa parempaan diagnoosiin ja hoitoon.

S-nitrosoglutathione (GSNO) on nitrosylating aine, joka välittää translaation jälkeinen prosessi S-nitrosylation proteiineihin tuloksena modulaatioon niiden toimintaan. S-nitrosylation on tärkeä biologinen reaktio typpioksidin (NO) ja viittaa muuntaminen tioliryhmiä, mukaan lukien kysteiinitähteet proteiineja, jolloin muodostuu S-nitrosotiolit. Se on mekanismi dynaamisen posttranslational sääntelyn useimpien tai kaikkien pääluokkaa proteiinia ja on riippumaton entsyymikatalyysiä, labiili muutos, on /off-kytkin kaltainen photophosphorylation [3]; kuitenkin, denitrosylation voi olla entsymaattinen tai ei-entsymaattisen. Yhä useammat proteiineja on havaittu tehdään S-nitrosylation

in vivo,

nimeltään S-nitrosotiolit, ja niillä on tärkeä rooli erilaisissa prosesseissa vaihtelevat signaalin siirtoon, DNA korjaus, isäntä puolustus, ja verenpaine ohjaimen ionikanavan sääntelyä ja neurotransmission [3]. Kuitenkin rooli S-nitrosylation in OvCa kasvua ja etenemistä ei ole tutkittu.

Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan terapeuttisen vaikutuksen nitrosylating aineen (GSNO) in OvCa käyttämällä

in vitro

ja

in vivo

malleja ja tutkia roolia nitrosylation vuonna OvCa.

Methods

reagenssit ja vasta

GSNO ostettiin Maailman Tarkkuusinstrumentit (Sarasota, FL) ja sen puhtaus on 98%. Seuraavilla vasta-aineilla fosfo-STAT3 (Y705) (Cat # 9145, käytetään 1:1000), Pakt (Ser473) (Cat # 4060, käytetään 1:1000), p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat # 4370, käytetään 1:1000), STAT3 (Cat # 9139, käytetään 1:1000), Akt (Cat # 4685, käytetään 1:1000), p42 /44 (Cat # 9107, käytetään 1:1000) olivat Cell Signaling (Danvers, MA). Beeta-aktiini (b-aktiini) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Naudan sikiön seerumia ostettiin BioAbChem (Ladson, SC). Rekombinantti STAT3 ostettiin SignalChem (Richmond, Kanada).

Cell Culture

Ihmisen OvCa solulinjaa SKOV3 ja OVCARs olivat American Type Culture Collection (Manassas, VA). A2780, C200 ja OVCAR4 solulinjat olivat ystävällinen lahja Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center) [4]. PE01 ja PE04 olivat ystävällinen lahja Dr. Taniguchi (University of Washington, Seattle) [4]. Kaikki OvCa solulinjoja ylläpidettiin ja viljeltiin täydellisessä Roswell Park Memorial Institute (RPMI) jotka sisälsivät 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja.

Eläimet

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä.

Six – kahdeksaan viikkoa vanhoja naaraspuolisia karvattomia hiiriä ostettiin National Cancer Institute-Frederick Cancer Research ja Development Center (Frederick, MD). Kaikki hiiret majoitettu ja ylläpidettiin spesifisissä olosuhteissa tilat Mayo Clinic Rochester, MN. Tilat hyväksytään ja tarkastetaan American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC Accreditation # 000717) ja voimassa olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Agriculture, Yhdysvaltain Department of Health and Human Services, ja National Institutes of Health. Kaikki tutkimukset hyväksymä ja valvoma Mayo Clinic Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) pöytäkirjan mukaisesti numero A13909.

Hiiret huolletaan Institutional IACUC hyväksytty protokolla. A2780 solut pestiin kahdesti ja suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) 2 x 10

6/100 ui ja injektoitiin vatsaonteloon nude-hiiriin (päivä 0). Hoidon GSNO (1 mg /kg kehon painoa) aloitettiin 3 päivää inokulaation jälkeen solujen. GSNO annettiin suuonteloon 0,1 ml: n tilavuuteen 20 gaugen ruokintaneulan pallo halkaisija on 2,25 mm (Braintree Scientific, MA). Kontrolliryhmä sai PBS ajoneuvon. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin epämukavuutta ja punnittiin joka kolmas päivä tarkistaa kasvaimen kasvua. Yhdistelmä- tutkimuksissa, sisplatiinihoitoon (4 mg /kg kehon painoa) vatsaonteloon injektioita annettiin päivinä 7, 14 ja 21 yhdessä GSNO hoitoon, kuten edellä on kuvattu (päivä 0 otettiin päivänä ymppäyksen soluja). Sen jälkeen kasvain induktio, hiiriä tarkkailtiin päivittäin merkkejä hätä. Hiiret inhimillisesti tapettiin yliannostuksesta CO2 4 viikon kun kasvain taakka saavutti toimeksiannon paino hoitamattomilla hiirillä [4], [5] ja kasvaimet leikattiin irti ja kiinnitettiin formaliiniin leikkaamista varten.

immunoblottianalyysi

kun määrätyn ajan inkuboinnin läsnä ollessa tai puuttuessa osoitettujen määrien GSNO, immunoblot-analyysi spesifisillä vasta-aineilla suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [6] – [9]. Lyhyesti, käsiteltyjen ja käsittelemättömien A2780 tai SKOV3- soluja käsiteltiin HB-EGF: ää (50 ng /ml) ja /tai GSNO (2 h esikäsittely ennen lisäämistä HB-EGF soluihin) eri ajanjaksoja (5-20 min ) hajotettiin hajotuspuskuriin [50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 50 mM Na3VO4 ja 0,5% Nonidet P-40], joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen ( Sigma, St. Louis, MO). Neljäkymmentä ug proteiineja erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Membraani blokattiin sitten 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl, ja 0,1% Tween 20, pH 7,5) ja inkuboitiin yön yli ensisijainen antiseerumeja fosfori-STAT3 (Y705), STAT3, s -p42 /44 (Thr202 /Y204), p42 /44, Pakt (Ser473), Akt tai β-aktiini sisälsi 5% rasvatonta maitoa tai 5% BSA tapauksessa fosfo-vasta-aineita. Inkuboinnin jälkeen HRP-konjugoidulla sekundaarisella Ab: blotit kehitettiin ECL-detektiojärjestelmässä (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Proliferaatiomääritykset

Solut (2,5-5,0 x 10

4) maljattiin 24-kuoppalevylle kolmena kappaleena ja käsiteltiin konsentraatiot GSNO 48 tuntia. Toimeton hapetettu GSNO käytettiin kontrollina. Toimeton hapetettu GSNO valmistettiin altistamalla GSNO liuosta (0,2 mM DMSO: ssa), jolloin valoa 7 päivää. Hapetetaan GSNO on väritön ja ei tuota NO, kun lisätään soluun median yksin tai solujen toisin valottamattomat GSNO (kuvio S1A x 400). Solut meneillään mitoosia laskettiin kasvaimissa, kaikkein aktiivisen alueen ( ”hot spot”) on vähintään 5 peräkkäistä HPFS-. Keskimäärin solujen käynnissä mitoosin kohti HPF oli lueteltu. Suurin halkaisija elinkelpoisten kasvain on laskettu yhteen suurimman yksiulotteinen halkaisija kunkin fragmentin kasvain käyttäen Olympus BX-41 mikroskooppia ja mikrometrin. Samoin necrotic alueilla mitattiin ja komposiitti live kasvaimen koon laskettiin kunkin dian julkaisemassa ennen [4], [5].

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmoitetaan keinot + SD ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Studentin t-testiä (Prism). P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GSNO estää leviämisen OvCa solulinjojen

vaikutuksen arvioimiseksi GSNO hoidon OvCa kasvuun, eri OvCa solu linjat (A2780, C200, PE01, PE04, OV202 ja SKOV3) käsiteltiin eri pitoisuuksilla GSNO (0,1-1 mM). Proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä 24 tunnin kuluttua. Hoidon GSNO inhiboivat näiden OvCa solulinjojen huomattavasti annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1), mukaan lukien sisplatiini resistenttejä C200 (Fig. 1 B), taksoli resistenttejä PE04 (Fig. 1 D) ja aggressiivinen SKOV3-solulinjoja (Fig. 1 E ). Lisääminen GSNO median julkaistiin NO annoksesta riippuvaisia ​​tavalla; kuitenkin, hapetetaan GSNO ei tuota NO (Fig. S1B-C). Olemme myös mitattiin IC50 GSNO soluproliferaatioon erilaisten OVCA solulinjojen avulla CalcuSyn- ohjelmaa. IC50 GSNO olivat 0,162, 0,385, 0,337, 0,427, 0,196 ja 0,235 mmol /l A2780, C200, PE01, PE04, OV2O2 ja SKOV3, vastaavasti (taulukko S1). GSNO käsittely vähenee myös soluproliferaatiota muiden OvCa solulinjojen OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 ja -10 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. S2). IC50 GSNO näissä solulinjoissa havaittiin differentiaalisesti ja luetellaan taulukossa S1. Inaktiivisen hapettunut muoto GSNO ei ollut vaikutusta proliferaatioon OvCa solulinjoissa.

prosenttiosuus elinkelpoisuuden A2780, C200, PE01, PE04, SKOV3- ja OV202 käsiteltiin osoitetulla annoksella S-nitrosoglutathione (GSNO; 0,1- 1 mM) määritettiin MTT-määrityksellä. Ei-aktiivinen GSNO (hapettunut, viimeinen bar) käytettiin verrokkina. Aineisto edustaa 3 erillisiä kokeita tehdään kolmena kappaleena. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05 ja NS; ei merkittävää verrattuna käsittelemättömiin soluihin käyttäen Studentin t-testiä (Prism).

onko tämä esto näkyi klonogeeniset säilyminen, pesäkkeenmuodostuskyvyn A2780, C200, PE01 ja PE04 solut tehtiin . Kuten kuviossa 2 on esitetty, yksittäinen hoito GSNO vaimensi merkittävästi klonogeenisten eloonjääminen OvCa solulinjojen annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 2). IC50 GSNO havaittiin olevan 0,122, 0,161, 0,356 ja 0,352 mmol /l A2780, C200, PE01 ja PE04, vastaavasti (taulukko S2). Inaktiivinen hapettunut muoto GSNO ei ollut vaikutusta pesäkkeiden muodostumista OvCa solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GSNO hoito voi aiheuttaa jatkuvaa proliferaation inhibitio eri OvCa solulinjojen, mukaan lukien solunsalpaajaresistentti solulinjat (C200 ja PE04) (Fig. 2B, C F).

Solut (2 x 10

3) /kuoppa (A2780, C200, PEO1 ja PEO4) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet S-nitrosoglutathione (GSNO) kerran. Hapetetaan GSNO käytettiin negatiivisena kontrollina (viimeinen bar). 2 viikon kuluttua pesäkkeitä värjättiin MTT ja laskettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen rinnakkaisen. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 ja NS; ei merkittävää verrattuna käsittelemättömiin soluihin käyttäen Studentin t-testiä (Prism).

GSNO vaimentaa kasvutekijät aiheuttama solumigraatioon ja invaasiota

in vitro

Seuraava tutkitaan vaikutus GSNO kasvutekijän välittämän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. SKOV3- soluja kasvatettiin yli yön matalan seerumin (0,2%), joka sisälsi alustaa naarmuuntunut käyttämällä steriiliä 200 ui pipetin kärki, kun ne olivat saavuttaneet 90% konfluenssin. Erilaisia ​​kasvutekijöitä, mukaan lukien HB-EGF: n ja SDF1 (50 ng ja 25 ng /ml, vastaavasti), lisättiin erikseen väliaineen läsnä ollessa tai puuttuessa GSNO (200 uM). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, haavan sulkeminen laskettiin. Kuten kuviossa 3A on esitetty, GSNO esti kaikki HB-EGF: n ja SDF1 välittämän soluvaelluksen SKOV3 solulinjassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin A2780 ja C200 solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Seuraavaksi arvioitiin vaikutusta GSNO moduloinnissa kasvutekijän välittämää invaasion SKOV3- soluihin käyttämällä Boyden kammion migraatiokokeessa (BD Bioscience, San Jose, CA), kuten aiemmin on kuvattu [11]. Kuvio 3B osoittaa selvästi, että GSNO hoito esti merkitsevästi kasvutekijän indusoiman invaasion SKOV3- solujen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Nämä tulokset osoittavat, että GSNO on kyky estää migraation ja invaasion OvCa soluja.

. Soluja kasvatettiin HB-EGF ja SDF1 puuttuessa tai läsnä ollessa S-nitrosoglutathione (GSNO) ja solumigraation mitattiin haavan määrityksessä kuvataan aineisto ja menetelmät. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD n = 7. B. vaikutuksen tutkimiseksi GSNO on invaasio, 1 x 10

5 SKOV3- soluja ympättiin ylempään kuoppiin 0,2 mM GSNO ylemmässä kammiossa transwell 500 pl viljelyalustaa. Erilaisia ​​kasvutekijöitä (HB-EGF ja SDF1) (25 ng /ml) lisättiin taustalla media. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, invaasio määritettiin valmistajan ohjeita noudattaen. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen rinnakkaisen. $$$ P 0,001 kasvutekijän käsitelty verrattuna kontrolliin. * P 0,05; *** P 0,001 GSNO käsitelty verrattuna kasvutekijä käyttämällä Studentin t-testiä (Prism).

GSNO kumoaa kasvutekijän aiheuttamaa signalointi OvCa soluissa

vaikutuksen tutkimiseksi GSNO kasvutekijän aiheuttamaa signalointia, seerumia A2780 ja SKOV3- soluja käsiteltiin GSNO seurasi HB-EGF hoito useina ajanjaksoina. Solut kerättiin ja immunoblotattiin eri signalointimolekyylien. Kuten kuviossa 4 on esitetty, hoito GSNO esti HB-EGF indusoimaa aktivoitumista STAT3, Akt ja p42 /44, kuten ilmenee vähentynyt tai puuttuu fosforylaation havaitsimme verrattuna HB-EGF käsiteltyjen näytteiden. GSNO hoito vähensi myös pohjapinta tasot fosforyloitua muotoa Akt, STAT3 ja p42 /44 A2780 ja SKOV3- solujen linjat (Fig. 4). Ei-aktiivinen ohjaus (hapettunut GSNO) ei ollut vaikutusta kasvutekijän aiheuttamaa signalointia, mikä viittaa spesifisyys GSNO vaimentamiseen HB-EGF aiheuttama signalointi ja mahdollinen mekanismi, jonka GSNO välittää vaimennus solujen kasvua, muuttoliike ja invaasion OvCa solujen

in vitro

.

A2780 (A) ja SKOV3 (B) solut maljattiin, seerumia yli yön ja käsiteltiin S-nitrosoglutathione (GSNO, 0,5 mM) tai ei-aktiivinen ohjaus (hapetettu GSNO; 0,5 mM) läsnä ollessa tai poissa ollessa HB-EGF: ää (50 ng /ml) eri ajanjaksoja (5-20 min). Solut kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ja käsitellään havaitsemiseksi eri signalointimolekyylien, mukaan lukien pSTAT3 (Tyr705), Pakt (Ser473) ja p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) käyttäen spesifisiä vasta-aineita Cell Signaling (Danvers, MA). Yhteensä STAT3, Akt, p42 /44 ja β-aktiini käytettiin yhtä suuri kuormitus. Blots edustavat kahta itsenäisesti kokeiluja.

anto suun GSNO vaimentaa kasvaimen kasvua ja parantaa sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden

in vivo

Sen määrittämiseksi, jos GSNO voisi vaimentaa kasvaimen kasvua

in vivo

, A2780-soluja (2 x 10

6) PBS istutettiin intraperitoneaalisesti on 6 viikkoa vanha nainen karvattomia hiiriä perustamiseen kasvaimia. Hiiret jaettiin kahteen hoitoryhmään. Ensimmäinen ryhmä (käsittelemätön) annettiin 100 ui PBS ajoneuvon letkuruokinnalla. Toinen ryhmä sai GSNO suun kautta PBS: ää (100 ui) annoksella 1 mg /kg kehon painoa päivittäin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät (Fig. 5A). Lopussa 4 viikkoa, hiiret tapettiin, ja kasvaintaakka oli selvästi tutkittiin, leikattiin ja punnittiin. Päivittäinen anto GSNO vähensi vatsan ympärysmitta (p 0,01) (kuvio. 5B), osoituksen kasvaintaakkaa kuljetettavaa vatsakalvon. GSNO myös vähensi kasvaimen kasvua (p 0,001) vatsaonteloon A2780 laakerin nude-hiiriin verrattuna ajoneuvon (PBS) käsitellyssä ryhmässä. Keskimääräinen painot irrotettiin kasvaimista olivat noin 68% vähemmän GSNO (3,35 ± 0,52 gm) käsitellyissä hiirissä verrattuna hoitamattomiin hiiriin (7,91 ± 0,412 g) (Fig. 5C). Kuten aikaisemmin ilmoitettiin Shaw et al [12] ja meille [4], intraperitoneaalisesti A2780 solut muodostivat lähinnä kiinteiden kasvainten ja esittelyyn munasarja-erityistä etäpesäkkeitä (kuvio 5D, alapaneeli). Munasarja liittyvä kasvain massat GSNO käsitellyissä hiirissä olivat paljon pienempiä kuin käsittelemättömän hiirissä (Fig. 5D). Lisäarvioimiseksi elinkelpoisuutta kasvain, nekroottisen ja elinkelpoinen kasvaimen koko määritettiin hematoksyliinillä ja eosiini värjätään kohdat. Suhde elävien kasvaimen koko on yhteensä kasvaimen koko laskettiin suurin yksiulotteinen halkaisija, kuten on kuvattu menetelmissä. Kuten on esitetty kuviossa 5E, ksenografteissa peräisin GSNO käsitellyistä hiiristä oli huomattavasti vähemmän kannattavaa kasvaimen kokoa (p 0,001) ja lisääntynyt nekroottinen alueilla verrattuna ksenograftien peräisin käsittelemättömän hiirillä. Vaikka oli laskeva havaittiin mitoosi ja alus laskee ja GSNO käsiteltyjen hiirten kasvainten, emme voineet havaita merkittävää muutosta (kuvio. 5F-G). Kaiken Tutkimuksemme viittaa vahvasti siihen mahdollisuuksia nitrosylating aineen lieventämisessä kasvuun OvCa

in vivo

(Fig. 5).

. Kaaviokuva koesuunnittelun. Lyhyesti, A2780 munasarjasyövän solulinja injektoitiin intraperitoneaalisesti nude-hiirissä ja S-nitrosoglutathione (GSNO) annettiin suun kautta päivittäin päivästä 3 annoksella 1 mg /kg kehon painoa loppuun tutkimuksen. Fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) annettiin ajoneuvoon. B. Vähentynyt vatsan ympärysmitta GSNO käsiteltyjen hiirten verrattuna vehikkelillä hoidettuihin ryhmiin mitattuna viikolla 4 (** p 0,01 käsitellyissä verrattuna ajoneuvoon). C. Vähentynyt poistetun kasvaimen painot GSNO käsiteltyjen hiirten verrattuna vehikkelillä hoidettuihin viikolla 4 (*** p 0,001 käsitelty verrattuna ajoneuvoon). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD 10-14 yksittäisten eläinten. D. Edustavia morfologiset kuva syöpäkasvaimen ja kasvaimen liittyy munasarja ajoneuvojen ja GSNO käsitellyillä hiirillä. E. mittaukset elinkelpoisen tuumorin koko GSNO vs PBS-käsitellyistä hiiristä, kuten on kuvattu menetelmissä (*** p 0,001 käsitellyissä verrattuna ajoneuvoon). F. Kreivi mitoosi soluissa ja G. lasken CD31-positiiviset suonet per HPF (X400) in GSNO vs PBS: llä käsiteltyihin hiiriin, kuten on kuvattu menetelmät), laskee tehtiin 5 aloilla 3 eri kasvainten kustakin ryhmästä. NS; ei-merkitsevä käsitelty verrattuna ajoneuvoon.

tarkemmin, onko yhdistelmä GSNO sisplatiinin voisi parantaa sytotoksista vaikutusta kasvaimissa. Näin ollen, sen jälkeen, kun injektio A2780 soluissa, 2 sarjaa hiiriä hoidettiin päivittäin suun kautta GSNO (1 mg /kg kehon painoa) ja sisplatiinia (viikoittain vatsaonteloon sisplatiinin päivinä 7, 14 ja 21) yksinään. Yhdistelmähoitoa varten, yksi sarja hiiriä käsiteltiin GSNO ja sisplatiinin, kuten kuviossa 6A. Sekä GSNO ja sisplatiinia olivat merkittävästi vähentää tehokkaasti kasvaimen kasvun ja massan monoterapiana A2780 laakerin hiirissä (Fig. 6B). Kuitenkin yhdistelmähoito oli tehokkaampi inhiboimaan kasvaimen kasvua verrattuna monoterapiaan kummankaan lääkkeen. Yhdistelmä sisplatiinin (4 mg /kg kehon painoa) ja GSNO (1 mg /kg kehon painoa) (2,08 ± 0,18 g) (Fig. 6B) vähensi merkittävästi tuumorin kasvua verrattuna joko GSNO (3,54 ± 0,35 g) tai sisplatiinin hoito yksinään (3,15 ± 0,34 gm) tai käsittelemättömiä hiiriä (6,9 ± 0,66 g). Kasvaimen tilavuus pienennettiin ~90% useimmissa hiiriä käsiteltiin yhdistelmällä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistämällä GSNO kanssa sisplatiinihoitoon on merkittävästi vähentää tehokkaasti kasvaimen kasvua käytettäessä OvCa hiirimallissa.

. Kaaviokuva koesuunnittelun. B. Kumulatiivinen leikattiin kasvaimen paino yksittäisistä hiiristä 4 viikkoa S-nitrosoglutathione (GSNO; 1 mg /kg kehon painoa) (paneeli 2), sisplatiinia (4 mg /kg kehon painoa) (paneeli 3) ja GSNO (1 mg /kg kehon painoa) ja sisplatiinia (4 mg /kg kehon painoa) yhdistelmä (paneeli 4). Sisplatiini annettiin 3 kertaa intraperitoneaalinen reitti päivänä 7, 14 ja 21 tuumorin injektiot. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD 7 yksittäisten eläinten. *** P 0,001 yhdistelmä GSNO + sisplatiini hoidetussa ryhmässä verrattuna hoitamattomiin tai sisplatiinilla yksinään käsitelty ryhmä; ** P 0,01 GSNO hoidetussa ryhmässä verrattuna käsittelemättömän ryhmän; * P 0,05 sisplatiinin hoidetussa ryhmässä verrattuna käsittelemättömän ryhmän; # P 0,05 yhdistelmä GSNO + sisplatiini ryhmässä verrattuna GSNO yksin ryhmä.

GSNO indusoi nitrosylation of STAT3

Koska GSNO on nitrosylating agentti ja tiedetään välittävän posttranslational prosessi S-nitrosylation proteiineja, mikä johtaa modulaatio niiden toimintaa [13]. Olemme tutkineet vaikutus GSNO on nitrosylation eri endogeenisiä proteiineja, joiden tiedetään olevan nitrosyloidut ja keskeisten toimijoiden OvCa kuten Akt, p65 ja EGFR [14] – [17].

tarkastella nitrosylation erilaisten proteiinien käytimme hienostunut biotiini-kytkin määritys. Pohjapinta taso nitrosyloidut proteiineja voitiin havaita vaihtelevat 250-35 kd molekyylipaino OvCa soluissa (kuvio. 7A, kaista 1). GSNO hoito voimisti nitrosylation endogeenisen proteiinien käsiteltyjen solujen kanssa GSNO (0,5 mM), 2 tuntia (Fig. 7A, kaista 2). Spesifisyys nitrosylation voidaan saavuttaa jättämällä pois lisäämällä HPDP-biotiini aikana biotiini-kytkin määrityksessä. Kuten kuviossa 7A, kaista 3 laiminlyönnistä HPDP-biotiini vaiheessa täysin tukossa havaitsemiseen nitrosylation endogeenisten proteiinien, korostaa spesifisyyden nitrosylation menetelmän laboratoriossamme. Olemme edelleen validoitu induktion nitrosylation mukaan GSNO tarkkailemalla varten nitrosylation jo raportoitu signalointia proteiinien liittyy syövän etenemiseen, kuten munasarjojen. GSNO hoito indusoi nitrosylation p65, Akt ja EGFR odotetusti (Fig. 7B). Olemme edelleen havainneet ainutlaatuinen havainto STAT3 meneillään nitrosylation upon GSNO hoitoon (Fig. 7B, C). Voit varmistaa, että STAT3 on nitrosyloidut, STST3 immunosaostettiin jälkeen biotiini-kytkin määritys käyttämällä spesifistä vasta-ainetta ja immunoblotattu anti-biotiini-HRP. Samanlainen havainto STAT3 meneillään nitrosylation upon GSNO hoito nähtiin. Nämä sarjaa kokeita osoittavat selvästi uutta sääntelyä STAT3 by s-nitrosylation. Tutkimaan edelleen, jos tämä ilmiö ei rajoitu pelkästään yhteen soluun tyyppi, käsittelimme eri OvCa solulinjojen A2780, C200 ja SKOV3 kanssa GSNO ja hapettunut GSNO kontrollina. 2 tunnin inkubaation kokosolulysaattia käsiteltiin havaitsemiseksi fosforylaation tilan STAT3. Kuten on esitetty kuviossa 7D, GSNO hoitoon poistivat tai vähensivät tyrosiinifosforylaation kaikissa OvCa solulinjoissa vaikuttamatta STAT3 tasoilla. Hapetettu GSNO ei vaikuttanut pSTAT3 tasot missä tahansa solulinjoista. Samanlaisissa koeolosuhteissa, tutkimme nitrosylation of STAT3 käyttäen biotiini kytkimen menetelmällä. GSNO käsittely lisäsi yhteensä nitrosylation useiden proteiinien matalasta korkeaan moolimassat verrattuna käsittelemättömiin ja hapetetaan GSNO käsiteltyjen näytteiden, kuten ilmenee kuviossa 7E. Samanlainen malli havaittiin nitrosylation of STAT3 viittaa siihen, että GSNO välittämä kasvu nitrosylation of STAT3 on yleinen ilmiö kaikissa OvCa solulinjoissa.

. Havaitseminen biotinyloitu proteiineja sen jälkeen, kun biotiini-kytkin menetelmä läsnä ollessa tai poissa ollessa S-nitrosoglutathione (GSNO; 0,5 mM). Poisjättäminen biotiini-HPRT osoittaa spesifisyyttä S-nitrosylation biotiinilla-kytkimellä menetelmällä. B. havaitseminen nitrosylation erilaisten proteiinien kuten EGFR, p65, Akt ja STST3 in munasarjasyöpäsoluja upon GSNO hoitoa. C. STAT3 immunosaostettiin nitrosyloidut proteiinin lysaatista jälkeen biotiini-kytkin määritys ja sen biotinylaatio havaittiin anti-biotiini-HRP Western blot -analyysiä käyttämällä. D. A2780, C200 ja SKOV3-solulinjoja käsiteltiin GSNO (0,5 mM) tai hapetettua GSNO (0,5 mM), kontrollina 2 tuntia, minkä jälkeen immunoblot-analyysillä havaitsemiseksi tyrosiinifosforylaation STAT3 705 tähteen ja yhteensä STAT3. E. Samanlaisissa koeolosuhteissa kuin ”D”, A2780, C200 ja SKOV3- soluja käsiteltiin biotiinin kytkimen menetelmä havaitsemiseen STAT3. Näyte kaistalla 4 käsiteltiin GSNO kuin kaista 2, paitsi käsittelyn aikana biotiinin kytkin määritys; lisäämällä HPDP jätettiin pois. Ylempi paneeli esittää biotinyloitu proteiineja jälkeen biotiini-kytkin määritys. Nitrosyloidut STAT3 havaittiin vetämällä alas biotinyloitu proteiineja streptavidiiniagaroosia seurasi immunoblot-analyysillä käyttäen anti-STAT3 vasta-aine. Ala nauhat esittävät yhteensä tasot tulo STAT3 käsitellä biotiinin kytkimen määritystä.

GSNO nitrosylates STST3 ja vaikuttaa sen kykyyn sitoa DNA

Kun olemme todettu, että STST3 läpikäy nitrosylation viljellyissä soluissa olemme tarkemmin, onko STST3 voitaisiin nitrosyloidut

in vitro

ja jos se voi vaikuttaa sen DNA: ta sitova kyky. Tämän otimme kaksi lähestymistapaa, ensin meidän eristetty ydin- ote SKOV3, jolla on korkeampi pohjapinta tasoilla fosforyloitua muotoa STAT3 ja sillä on kyky sitoa STAT3 DNA sitova motiivi ilman stimulaatiota. Olemme inkuboitiin 20 ug tumauutetta (NE), jossa GSNO tai hapettuneen GSNO läsnä ollessa tai poissa ollessa DTT: ssa 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen DNA: ta sitovaa kykyä STAT3 tutkittiin inkuboimalla nitrosyloidut NE kanssa STST3 geelillä shift oligonukleotidien konjugoitu agaroosilla. Kuten kuviossa 8A GSNO käsitelty näyte osoitti nitrosylation of STAT3 kuin ilmeistä biotiinia kytkin määritys ja ei vedettävä alas STST3 geeli shift oligonukleotidien konjugoitu agaroosilla. Sisällyttäminen DTT näytteistä poistettiin GSNO välittämää nitrosylation of STAT3, jolloin sitoutuminen STAT3 sen DNA: ta sitova motiivi. STAT3 on myös osoitettu rekrytoida koaktivaattoriproteiinin mukaan lukien p300.