Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tromboosi on yleinen munasarjasyöpä. Kuitenkin vuorovaikutus verihiutaleiden kanssa munasarjasyövän soluja ei ole tarkasteltava kriittisesti. Ongelman ratkaisemiseksi selvitettiin verihiutaleiden vuorovaikutusta eri munasarjasyövän solulinjoissa erilaisilla metastaattinen potentiaali [HIO-80, 59m, SK-OV-3, A2780, A2780cis]. Verihiutaleet kiinni munasarjasyöpäsoluja merkittävimmät tarttuvuus 59m solulinjassa. Munasarjasyöpäsoluja aiheuttaman verihiutaleiden aktivaation [P-selektiinin ekspression] annoksesta riippuvaisella tavalla, ja merkittävimmät havaittu aktivaatio vasteena 59m solulinjassa. Verihiutaleiden antagonistit [cangrelor, MRS2179, ja apyraasia] esti 59m solun aiheuttama aktivointi viittaa P2Y12- ja P2Y1- reseptorivälitteisten mekanismi verihiutaleiden aktivaation riippuvainen vapautuminen ADP 59m soluja. A2780 ja 59m solujen voimistua PAR-1, PAR-4, ja TxA2 reseptorivälitteisten verihiutaleaktiviteettia, mutta ei vaikuttanut ADP, adrenaliini, tai kollageenin aiheuttama aktivointi. Analyysi geenin ilmentymisen muutoksia munasarjasyöpäsoluja käsittelyn jälkeen pestyjä verihiutaleita tai verihiutaleiden releasate osoitti hienoisia, mutta voimassa ylössäätely anti-apoptoottisen, anti-autophagy angiogeneesiä, pro-solukierron ja aineenvaihdunnan geenejä. Siten munasarjasyöpäsoluja erilaisilla metastaattista potentiaalia kiinni ja aktivoi verihiutaleiden differentiaalisesti samalla sekä verihiutaleiden ja verihiutaleiden releasate välittävät pro-selviytymisen ja angiogeneesiä signaalit munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Egan K, Crowley D, Smyth P , O’Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) Verihiutaleiden adheesio ja jyvästen häviäminen Pakotettava Pro-Survival ja angiogeneesiä merkinanto in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10,1371 /journal.pone.0026125

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: toukokuu 10, 2011; Hyväksytty: 20 syyskuu 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Egan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan Science Foundation Ireland [SFI] osana Biomedical Diagnostics Institute [BDI-2 tiede- Excellence and Technology (CSET)]. KE tuetaan kansallisen Biophotonics ja Imaging Platform, Irlanti, ja rahoittama Irlannin hallituksen tutkimuspuiteohjelmalla kolmansissa tason instituutiot, Cycle 4, National Development Plan 2007-2013. DC tukee Health Research Board (Irlanti) Scholars Ohjelma: molekyylilääketieteen – From Genes toimiakseen. BF ja LMcE tukee Emer Casey Foundation, Irlanti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien naisilla [1]. Se on yleisin gynekologisen maligniteetti ja sillä on korkein kuolemanriskin tapaukselta suhde kaikkien gynekologisia maligniteetteja. Köyhä eloonjäämisaste on seurausta myöhäisessä vaiheessa diagnooseista. Useimmat potilaat ovat oireettomia ennen kuin sairaus on metastasoitunut [2]. Leviämisen munasarjasyöpä on katsottu tapahtuvan ensisijaisesti vatsakalvon [3]. Kuitenkin ruumiinavaus ja kuvantamistutkimukset [4], sekä näyttöä siitä, onko mikrometastaasien luun aspiraateissa alkuvaiheen munasarjasyöpä potilaille [5] mukaan hematogenous etäpesäke on yleisempää kuin aiemmin on ajateltu.

aikana hematogenous levittäminen, kyky kiertävien tuumorisolujen vuorovaikutuksessa verihiutaleiden uskotaan edistävän niiden selviytymistä sisällä verenkiertoa ja siten helpottaa etäpesäke. Prekliininen eläinkokeet ovat osoittaneet, että farmakologisesti [6] tai geneettisesti [7] indusoima trombosytopenia, samoin kuin vioista verihiutaleiden toimintaa [7] – [10] ovat yhteydessä alentuneeseen etäpesäkkeitä. Vuorovaikutus syöpäsolujen kanssa verihiutaleiden uskotaan antavan useita etuja, jotka edistävät onnistunut etäpesäke, mukaan luettuna suojelu immunologisen pahoinpitelystä ja kiertäminen immuunivalvonnan [11], [12], vapauttamista kasvun, angiogeenisen, ja verisuonten läpäisevyyttä tekijät aikana aktivointi ja degranulaatio [13].

tromboosi ja trombosytoosi ovat yleisiä komplikaatioita munasarjasyöpä ja jotka liittyvät huonoon ennusteeseen [14] – [16], jossa korostetaan verihiutaleiden patologian munasarjasyöpä. Kuitenkin vuorovaikutus verihiutaleiden ja munasarjasyövän soluja ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa pyrittiin luonnehtimaan vuorovaikutus verihiutaleiden kanssa munasarjojen soluista, käyttäen normaalia munasarjan solulinjassa [HIO-80] ja munasarjasyöpäsoluja linjoihin eri biologiset ominaisuudet ja metastaattisen potentiaalin [59m, SK-OV-3, A2780, ja A2780cis].

Ensinnäkin, tutkittiin verihiutaleiden kiinnittyminen munasarjasyöpäsoluja staattisissa olosuhteissa sen määrittämiseksi, onko liima vuorovaikutus verihiutaleiden ja munasarjasyövän solujen olemassa. Toiseksi arvioitiin kyky munasarjasyöpäsoluja saamaan aikaan verihiutaleiden aktivoitumista ja degranulation [P-selektiinin ilmentymisen]. Todettuaan, että verihiutaleet kiinni munasarjasyöpäsoluja, ja munasarjasyöpä solut kykenevät indusoimaan verihiutaleiden aktivoitumista ja degranulaation, seuraavan kerran arvioidaan geenin ilmentymisen muutoksia, jotka transcriptome tasolla munasarjasyöpäsoluja käsitelty verihiutaleiden tai verihiutaleiden releasate. Tuloksemme osoittavat ero vuorovaikutukset verihiutaleiden ja munasarjasyövän solulinjoissa, ei ainoastaan ​​verihiutaleiden adheesion ja aktivaation, mutta myös geenin ilmentymisen muutoksia syöpäsoluja käsitellään pestyjä verihiutaleita tai verihiutaleiden releasate. Useita vuorovaikutuksia esiintyy verihiutaleiden ja munasarjasyöpäsoluja liittyy tekijöitä vapautuu verihiutaleiden ja syöpäsolujen sekä suoraan verihiutaleiden-munasarja solu vuorovaikutuksia. Tämä vuorovaikutus johtaa pro-selviytymisen, angiogeneesiä signaalin munasarjasyöpäsolu.

Methods

Ethics selvitys

Verenkeruu Tämän tutkimuksen hyväksyi Royal College of kirurgien Irlannissa eettinen komitea ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta lahjoittajilta, ennen flebotomiasta.

reagenssit

kaikki reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich [St Louis, MO, USA] ellei toisin mainita. Kollageeni [liukeneva vasikka iho], adenosiini-5′-difosfaatti, Adrenaliinia, ja arakidonihappo saatiin henkilötiedot [Horsham, PA, USA]. Alexa Fluor-488-leimattua -falloidiinia Calcein AM, ja fibrinogeenin saatiin Invitrogen [Carlsbad, CA, USA]. Fykoerytriini [PE] -leimatun anti ihmisen P-selektiini [hiiri-IgG], PE-leimattu hiiren IgG-isotyyppiä ohjaus, ja PE-leimattua anti-ihmis CD42a [hiiri-IgG] vasta-aineet hankittiin BD Pharmingen [San Diego, CA, USA].

solulinjat

valikoima munasarjojen morisolulinjoja epiteelin alkuperä valittiin sisällytettäväksi tässä tutkimuksessa munasarjan epiteelin syövät ovat yleisimpiä histologinen tyyppi. HIO-80 [lahja Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA] tarkoittaa ei-tuumorigeeninen ihmisen normaaleja munasarjan epiteelin solulinja, joka on kuolemattomiksi transfektiolla plasmidilla, joka koodaa SV40: n suuren T-geenin. HIO-80-soluja ylläpidetään 01:01 seos medium 199 ja MCDB-105, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,2 IU /ml rekombinantti ihmisen insuliini suosittelemia Fox Chase. 59m [Euroopan kokoelman soluviljelmissä (ECACC), Salisbury, UK] edustaa kasvaimia ihmisen munasarjan epiteelin syövän endomet- tyyppiä selkeitä solun komponentteja, joka eristettiin alun perin askites of 65-vuotiaan potilaan metastasoitunutta munasarjasyöpä. 59m-soluja ylläpidettiin DMEM, 1 g glukoosia /l, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä suosittelemia ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] edustaa kasvaimia ihmisen munasarjan epiteelin adenokarsinooma, joka eristettiin alun perin askitesnesteestä 64-vuotiaan potilaan, joilla oli metastaattinen munasarjasyöpä. SK-OV-3 viljeltiin McCoyn 5A-media, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia [Invitrogen, Alankomaat], 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä suosittelemia ATCC. A2780 [ECACC, Salisbury, UK] on johdettu munasarjojen vakavien epiteelin kasvainkudoksen käsittelemättömässä potilaalle. Sisplatiini kestävä solulinja A2780cis kehittäneet krooninen altistuminen emo sisplatiinin herkän A2780 lisäämään sisplatiinin. Molemmat solulinjat pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä suosittelemia ECACC. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin standardiolosuhteissa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Verihiutaleiden valmistelu

Verta saatiin terveiltä luovuttajilta, jotka eivät olleet lääkkeitä tiedetään vaikuttavan verihiutaleiden toimintaan vähintään 10 päivää. Veri kerättiin laskimosta läpi 19 gaugen perhosneulaa ilman puristusside, jotta vältetään verihiutaleiden aktivoitumisen. Verihiutaleet valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, valmistamiseksi runsaasti verihiutaleita sisältävä plasma [PRP], veri kerättiin ruiskuun, joka sisälsi 3,2% trinatriumsitraattia antikoagulanttina [10% tilavuus /tilavuus, sitten sentrifugoitiin 170 g: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Valmistamiseksi pesty verihiutaleita, verta kerättiin Acid-sitraatti-dekstroosi [ACD: 38 mM sitruunahappoa, 75 mM natriumsitraatti, 124 mM D-glukoosia] antikoagulanttina [15% vol /vol]. Veri sentrifugoitiin 170 g: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. PRP tehtiin happamaksi pH-arvoon 6,5 ACD, ja PGE

1 [1 uM], lisättiin, jotta vältetään verihiutaleiden aktivaation sentrifugoinnin aikana. Verihiutaleet pelletoitiin sentrifugoimalla 720 g: ssä 10 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin ja verihiutaleiden pelletti suspendoitiin uudelleen JNL puskurissa [130 mM NaCI, 10 mM natriumsitraatti, 9 mM NaHCO

3, 6 mM D-glukoosia, ja 0,9 mM MgCl

2, 0,81 mM KH

2PO

4, ja 10 mM Tris, pH 7,4] pitoisuuteen 2,5 x 10

8 /ml ja täydennetty 1,8 mM CaCl

2.

Verihiutaleiden adheesiomäärityksellä

verihiutaleiden adheesiota määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, munasarjan soluja siirrostettiin 96-kuoppaiselle levylle [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Saksa] konsentraationa 5 x 10

4 /ml, ja kasvatettiin, kunnes konfluentteja. Pesty verihiutaleita [1,5 × 10

8 /ml] esiladattu Calcein AM [2 ug /ml] annettiin tarttua soluihin 45 minuuttia 37 ° C: ssa. Yhteenlaskettu fluoresenssi [485/535 nm] kuoppaa kohti mitattiin käyttäen Wallac 1420 Victor2 ™ -monileimalukijaa [Perkin Elmer, Waltham, MA., USA] levynlukijaa. Levy pestiin kolme kertaa 100 ml JNL lisättiin kuhunkin levyn kuoppaan, ja jäljelle jäänyt fluoresenssi luettiin. % Verihiutaleiden adheesio laskettiin [jäljellä fluoresenssi – tyhjä] /[yhteensä fluoresenssi – tyhjä] x 100. Verihiutaleiden tarttuminen munasarjan soluihin kuvattiin fluoresenssimikroskopialla. Kun solut olivat konfluentteja, irrotetaan 7 mM EDTA Dulbeccon PBS: ssä, pestiin kaksi kertaa ja suspendoitiin uudelleen JNL täydennetty 1,8 mM CaCl

2. Soluihin [1 x 10

5 /ml] inkuboitiin BSA-päällystettyihin poly-L-lysiiniä dia 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen tarttuvuus, pestään verihiutaleita [50 x 10

6 /ul] lisättiin dia ja inkuboitiin 45 minuuttia 37 ° C: ssa. Näytteet kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja permeabilised 0,1% Triton X-100. Verihiutaleet ja munasarjojen solut värjättiin Alexa Fluor-488 falloidiinia [41,25 nM,] 15 minuutin huoneenlämmössä. Verihiutaleita erityisesti värjättiin fykoerytriinillä leimatulla anti-humaani-CD42a-vasta-ainetta [1,25 ug /ml] 2 tuntia 37 ° C: ssa. Objektilasit kiinnitettiin ja kuvattiin fluoresenssimikroskopialla.

Verihiutaleiden aktivointi

kyky munasarjasyöpäsoluja indusoimaan verihiutaleiden aktivaatioon (P-selektiinin ekspressio) arvioitiin virtaussytometrian perustuvan määrityksen muokattu Nylander ym [19]. Kun reaktion kokonaistilavuus 100 ui, 10 ui PRP: tä inkuboitiin munasarjasyöpäsoluja [0-1,5 x 10

6 /ml,] läsnä ollessa PE-leimattua anti-ihmis P-selektiini-vasta-aine [1,25 ug /ml] tai sopivaa isotyyppikontrolli [1,25 ng /ml]. Kaikki inkuboinnit suoritettiin huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Reaktio lopetettiin sitten 1 ml: lla JNL puskuria ennen analysointia virtaussytometrisesti. Näytteet analysoitiin käyttäen BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Aito, CA, USA] 1 tunnin kuluessa. Instrumentti asetettiin mittaamaan koko [sirontamittari, FSC], rakeisuus [sivusironta, SSC] ja solujen fluoresenssi. Käyttämällä log FSC vs. log SSC dot plot, kaksiulotteinen analyysi portti vedettiin noin verihiutaleiden väestö, ja fluoresenssin histogrammi [log FL2 vs. count] saatiin 10000 verihiutaleiden tapahtumia jokaisesta näytteestä. Data analysoitiin käyttämällä CellQuest Pro -ohjelmisto ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena verihiutaleiden, jotka olivat P-selektiinin positiivinen suhteessa isotyyppikontrolli.

eristäminen verihiutaleiden releasate

Pesty verihiutaleita [2,5 x 10

8 /ml] stimuloitiin sekä TRAP [trombiinireseptori aktivoiva peptidi, 20 uM], ja kollageeni [190 ug /ml] ja sekoitettiin henkilötiedot PAP-4 valonläpäisy aggregometrillä [Horsham, PA, USA] 37 ° C: ssa 15 minuutit. Verihiutaleiden yhteenlaskettu sentrifugoitiin 720 g: ssä 10 minuutin ajan. Supernatantti imettiin pois ja suodatettiin ruiskun läpi suodattimen, jossa on 0,22 um: n PVDF-kalvolle poistaa Verihiutalemikropartikkeleista.

MTT-määritystä

optimoimiseksi pitoisuus verihiutaleiden releasate kasvainsolujen altistumisen, sarja MTT Soluproliferaatiomäärityksiä [Roche Diagnostics Oy, Iso-Britannia] suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden määrittää suurin pitoisuus, joka voitaisiin soveltaa soluihin ilman haittavaikutuksia solujen kasvua tai selviytymistä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille 2 x 10

4 solua /kuoppa ja viljeltiin 24 tunnin ajan, jotta solujen kiinnittymistä. Kun on kiinnitetty levyihin, kasvua imettiin pois ja solut lyhyesti pestiin 200 ul: pre lämmitettiin PBS. Sitten solut altistettiin sarjalaimennoksia verihiutaleiden releasate 1:10 1:10,000 koko media, seerumivapaassa tai JNL puskuria voidaan optimoida keskittymän voidaan käyttää myöhemmissä geeniekspression perustuvat tutkimukset.

Pestään verihiutaleiden /verihiutaleiden releasate altistumisen geenin ilmentymisen analyysi

optimaalinen pitoisuus verihiutaleiden releasate [määritettiin MTT] levitettiin solulinjojen ja tasot apoptoosin verrattiin soluja kasvatetaan koko media vain käyttäen Roche Apodirect TUNEL /Propidiumjodidia kit. Koska 1:1000 laimennus verihiutaleiden releasate kokonaan elatusaineeseen havaittiin olevan korkein pitoisuus verihiutaleiden releasate täysin mediaa ei vaikuttanut solujen kasvuun /elinkelpoisuuden kaikkien solulinjojen ja sittemmin osoitettu johtavan mitään merkittävää eroa apoptoosin verrattuna kasvatettujen solujen koko media pelkästään todettiin, että se oli sopiva jatkaa tätä keskittyminen. Ottaen huomioon, että verihiutaleiden releasate valmistettiin identtisiä pestiin verihiutaleiden valmisteista 1:1000 laimennus verihiutaleiden releasate suoraan ilmoittaa käytön 1:1000 laimentamisen pestiin verihiutaleet vertaileva tutkimus. Optimaalinen pitoisuudet verihiutaleiden releasate ja pestään verihiutaleet [1:1000] suspendoitiin kokonaan elatusaineet ja levitetään viljellyt solut 75 cm

2 pulloissa kolmena kappaleena. Solut altistettiin releasate tai pestään verihiutaleet 6 tuntia, minkä jälkeen kokonais-RNA uutettiin soluista. Transcriptome analyysi suoritettiin käyttäen Affymetrix Human eksoni Arrays.

RNA

Solut pestiin lyhyesti PBS: ssä, trypsinoitiin ja sentrifugoidaan supernatantin. RNA uutettiin käyttäen RNeasy mini kit [Qiagen Ltd., West Sussex, UK] mukaan valmistajan protokollaa. RNA määrä arvioitiin käyttäen Nano-Drop ND-1000 -spektrofotometri [Wilmington, USA] ja laatua Agilent Bioanalyser 2100 ja RNA 6000 Nano mikrofluidinen siru määritys [Santa Clara, USA]. RNA säilytettiin -80 ° C: ssa.

Affymetrix array

100 ng kokonais-RNA: sta ohjaus soluja ja soluja altistetaan pestiin verihiutaletta /verihiutaleiden releasate leimattiin käyttäen Ambion WT Expression Kit [ ,,,0],Ambion /Life Technologies, Austin, TX, USA] lukien merkintöjä ohjausobjektit Affymetrix Gene Chip Poly-A-RNA Ohjaus Kit. Ehdottivat Affymetrix /Ambion, jokaisessa vaiheessa näytteen valmistus protokollaa, etenemistä seurattiin käyttämällä sekä Agilent 2100 Bioanalyzer ja Nanodrop spektrofotometrillä. Laadunvalvonta [QC] tarvitaan arvioinnin ensimmäisen hoitojakson jälkeen RNA siivous, kun toisen vaiheen yhden säikeen cDNA siivous ja seuraavat ssDNA pirstoutumista. Valmistetut hajanainen ssDNA hybridisoitiin Affymetrix Human eksoni 1.0 ST Array 45 ° C: ssa 16 tunnin kuluessa Affymetrix protokollia heidän GeneChip- WT Terminal Labeling, GeneChip- Hybridisaatio Ohjaus ja GeneChip- hybridisaatio, pesu, ja Stain sarjat [Affymetrix, Santa Clara, USA] . Hybridisaation jälkeen sirut pestiin ja värjättiin käyttäen Affymetrix GeneChip- Fluidics Station sopivilla 64 muodossa määritysprotokollassa. Sen jälkeen värjäystä ja pesun vaiheet Affymetrix GeneChip- Scanner 3000 ja Affymetrix GeneChip- Operating Software käytettiin hallintaan ja käsittelyyn ilmaisua datan. Tiedot 45 eksonista paneelit edellytti array laadunvalvonnan suorittaa käyttämällä Affymetrix Expression Console. Kaikki hallintalaitteet olivat rajoissa ehdotti Affymetrix. Onnistuneen laadunvalvontastandardeja arviointi, siru data analysoitiin sitten perusteellisesti käyttämällä Biotique Systems XRAY analyysin ohjelmisto. Kukin solulinja tutkittiin kolmen eri olosuhteissa; lepää, solut, altistetaan verihiutaleiden releasate, ja solut altistettiin pestiin verihiutaleita. Kukin solulinja ja kunto tutkittiin kolmena kappaleena. Ohjelmistoa käytettiin vertaamaan kahta altistuminen ikäryhmien vastaan ​​lepää ohjaus ja geenit, joilla on positiivinen tai negatiivinen kertamuutos on suurempi kuin 1,5 ja merkitys p≤0.05 tutkittiin.

Fluidigm validointi

Geenien ilmentyminen validoitiin käyttäen Fluidigm korkea suoritusteho qPCR 48.48 dynaaminen array järjestelmä. Geenit näytetään merkittävimmät kertaiseksi muutoksia lisäksi geenien biologisesti relevantteja väyliä valittiin validointi. TaqMan® reaaliaikainen PCR-ilmentymisen määrityksiä käytettiin yhdessä Fluidigm n mikrofluidinen Biomark järjestelmässä. Näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja tuloksia verrattiin Affymetrix ekspressiotietojen. RNA käänteistranskriptio yksijuosteisen cDNA käyttäen High Capacity cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] vuonna 100 ul reaktioita. Reaktiot sisälsivät 10 ui puskuria [10 x], 4 ui deoksinukleotiditrifosfaatti [25 x], 10 ui satunnaisia ​​alukkeita [10 x], 5 ui multiscribe RT-entsyymin [50 U /ul], 21 ui nukleaasitonta vettä ja 50 ui uutettiin kokonais-RNA: [20 ng /ul]. Ennen Fluidigm, suurikapasiteettisten qPCR, ennalta vahvistusta vaihe suoritettiin seuraavat Fluidigm protokollat; 1 ml TaqMan-määritys kullekin kiinnostuksen kohteena olevien geenien tunnistettu XRAY analyysin ja endogeenisen valvonta yhdistettiin ja tehty lopulliseen tilavuuteen 100 ml 1 x TE-puskuria, pH 8,0. 1,25 ml kutakin näytettä lisättiin 2,5 ml Esivahvistin Master Mix [AB] ja 1,25 ml yhdistettiin määritys yhdistelmä, jolloin saatiin 5 ml: n reaktiotilavuudessa. Tämä seos lisättiin sitten siihen 14 monistussykliä 95 ° C, 15 sekuntia ja 60 ° C, 4 minuuttia, ennen kuin se laimennettiin 1:05 DNAasilla ja RNaasitonta H

20, jolloin saatiin lopullinen tilavuus on 25 ml: n pre- monistettu cDNA. Fluidigm analysoitiin käyttäen Fluidigm Real-Time PCR-analyysi ohjelmisto [ver3.02], jolloin saatiin suhteellinen kvantitointi arvot kalibroidaan normaalin [HIO-80] soluissa. Kertamuutoksia palannut Affymetrix analyysin piirrettiin ne lasketaan Fluidigm tietoja ja korrelaatio arvot laskettiin käyttäen Graph Pad Prism [ver 5.02].

epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon [EMT] ilmentymisen analyysi in verihiutaleiden verhosi /releasate käsitellyt solut

prosessi EMT on kriittinen metastaattisen kaskadin, helpottamalla solunjakautumisen verisuonistoon. RNA käänteistranskriboitiin yksijuosteisen cDNA käyttäen High Capacity cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] 100 ui reaktiot kuten edellä. Yhdistelmä ensisijaisen toimijoiden EMT prosessissa [20] ja muita geenejä tunnistettu laboratoriossamme niin olennainen EMT prosessin [tietoja ei ole esitetty] tutkittiin osana profilointia varten EMT vuonna munasarjasyöpäsoluja: Akt-1, ALDH1 A1, CDH1, PIK3CA, SNAIL1, SNAIL 2, TWIST 1, vimentiinistä, ZEB1, ZEB 2, TLR 4, MyD88 käyttäen TaqMan pohjamaali ja koettimet [Life Technologies /Applied Biosystems: geenin ilmentymisen määrityksissä] mukaan valmistajan ohjeiden. Expression tutkittiin verihiutaleiden ja verihiutaleiden releasate käsitellyt solut ja verrataan lepää munasarjasyöpäsoluja kaikille solulinjoissa [HIO-80, 59m, SK-OV-3, A2780 ja A2780cis]. Tulokset esitettiin graafisesti tulivuoren kuvaaja p-arvo versus kertainen muutos. Liittymistä määritys numerot geenejä tutkitaan esitetään alla:

GAPDH – Hs99999905_m1

AKT1 – Hs00178289_m1

ALDH1A1 – Hs00167445_m1

PIK3CA – Hs00180679_m1

SNAIL1 – Hs00195591_m1

SNAIL2 – Hs00950344_m1

ZEB1 – Hs01566407_m1

ZEB2 – Hs00207691_m1

TWIST – Hs00361186_m1

vimentiinista – Hs00958116_m1

CDH1 – Hs01023895_m1

Myd88 – Hs00182082_m1

TLR4 – Hs00152939_m1

tilastot

tiedot analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism 5.0 ohjelmisto [GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA]. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon.

Tulokset

Tartunta verihiutaleiden munasarjasyöpäsoluja staattista

Verihiutaleiden tarttuvuus munasarjasyövän solulinjoissa staattisessa olosuhteet kvantifioitiin perustuu fluoresoivan havaitsemiseen leimattuja verihiutaleita [Kuva 1A]. Verihiutaleiden tarttuminen A2780 [2,4 ± 0,2%, n = 8], A2780cis [3,0 ± 0,2%, n = 8] ja 59m [3,4 ± 0,3%, n = 8] soluja oli merkittävä verrattuna negatiiviseen kontrolliin BSA [1,0 ± 0,1%, n = 8]. Verihiutaleiden tarttuminen HIO-80 [1,8 ± 0,2%, n = 8] ja SK-OV-3 [1,3 ± 0,2%, n = 8] soluja ei ollut merkitsevä verrattuna BSA. Tarttumista kaikki 5 munasarjasyöpäsoluja oli alhaisempi kuin positiivisen kontrollin fibrinogeenin [5,9 ± 0,4%, n = 8]. Fluoresenssimikroskopialla kuvat osoittavat selvästi, verihiutaleiden adheesio munasarjasyövän solulinjoissa A2780 ja 59m [Kuvio 1B ja C]. Yhdenmukainen verihiutaleiden adheesiomääritystä kuva S1 osoittaa minimaalinen verihiutaleiden kiinnittyminen HIO-80 solulinjassa.

[A] Verihiutaleiden tarttuminen munasarjasyöpäsoluja kvantifioitiin perustuu fluoresenssidetektiota leimattujen verihiutaleiden. Verihiutaleiden tarttuvuus fibrinogeenin ja BSA käytettiin ± valvontaa [n = 8 + SEM, * = p 0,05 vs. BSA]. Fluoresenssimikroskopia kuvia tarttuvien verihiutaleiden A2780 [B] ja 59m [C] soluja staattista [edustaja n = 3]. Munasarjasyöpäsoluja ja verihiutaleet värjättiin aktiini [vihreää], verihiutaleita värjättiin nimenomaan CD42a [punainen /keltainen].

munasarjasyöpäsoluja aikaan verihiutaleiden aktivaatio annosriippuvaisesti

kyky munasarjasyöpäsoluja indusoida verihiutaleiden aktivaatiota kvantifioitiin virtaussytometrialla. Kasvavia pitoisuuksia munasarjasyöpäsoluja [0 – 1,5 x 10

6 solua /ml] lisättiin PRP ja verihiutaleiden aktivaatio arvioitiin perustuen P-selektiinin ilmentymisen. Munasarjasyöpäsoluja indusoi annoksesta riippuvaisen kasvu verihiutaleiden aktivaation [kuvio 2]. Kaksi metastaattinen munasarjasyövän solulinjoissa; SK-OV-3 [1,5 × 10

6 solua /ml, 47 ± 10,2% verihiutaleiden P-selektiinin positiivisuus, n = 3] ja 59m [1,5 × 10

6 solua /ml, 51 ± 18% P-selektiinin positiivisuus n = 6] indusoi merkittävin verihiutaleiden aktivaation. Alhaisin verihiutaleaktivaatiota nähtiin vastauksena ei-metastasoituneen munasarjasyövän A2780 [1,5 × 10

6 solua /ml, 16,1 ± 5,2% P-selektiinin positiivisuus, n = 6]. A2780cis [sisplatiinilla kestävä tytär solulinjassa A2780] osoitti korkeampi verihiutaleaktivaatiota kuin sen emosolulinjan [1,5 × 10

6 solua /ml, 28,1 ± 12,2% P-selektiinin positiivisuus, n = 3]. Immortalisoidut normaalit munasarjaepiteelisoluilla linja HIO-80 indusoi myös verihiutaleiden aktivaatioon [1,5 x 10

6 solua /ml, 32,5 ± 7,8% verihiutaleiden P-selektiinin positiivisuus, n = 3], mutta vähemmässä määrin kuin 59m ja SK-OV-3-solut.

Verihiutaleiden aktivointi [P-selektiinin ilmentymisen] aiheuttama erilaisia ​​munasarjojen solulinjoissa laajalla pitoisuusalueella [0,1-1,5 × 10

6 /ml] mitattiin virtaussytometria, joka perustuu verihiutaleiden P-selektiinin pinnan ilmentymistä. Merkittävin verihiutaleiden aktivoitumisen yhteydessä vastauksena metastaattisen munasarjasyövän solulinjoissa SK-OV-3 ja 59m.

P2Y12 /P2Y1- reseptorin ja ADP /ATP-antagonistit estävät verihiutaleiden aktivaation indusoimaa 59m munasarjasyöpä solut

Koska 59m solujen aiheuttama merkittävin verihiutaleiden aktivaation, niitä käytettiin vaikutuksen testaamiseksi erilaisia ​​verihiutaleiden estäjien munasarjasyöpäsolujen aiheuttaman verihiutaleiden aktivaation. 59m munasarjasyöpäsoluja [1,5 x 10

6 solua /ml, vaste normalisoitiin 100% aktivoitumisen] lisättiin PRP esikäsitelty estäjien ja verihiutaleiden aktivaatio mitattiin virtaussytometrialla [P-selektiinin ekspression]. Inhibiittorien pitoisuuksia, valittiin perustuen alustaviin virtaussytometrialla ja verihiutaleiden aggregometrisen tuloksia, jotka osoittivat niiden olevan antagonistinen (tuloksia ei ole esitetty). Antagonisteilla Trombiini [hirudiini], integriinin αIIbβ3 [ReoProta ja RGDS peptidi], Cox-1 [aspiriini], ja kalsium [EDTA], ei ollut vaikutusta 59m solun aiheuttamaan verihiutaleiden aktivaation [Kuva 3]. Seuraavat hoidon P2Y12-antagonisti [cangrelor, 1 uM] mukaan P2Y1- antagonisti [MRS2179, 10 uM] tai ADP /ATP-aasi (apyraasia, 10 yksikköä /ml), verihiutaleiden aktivaatio, kun läsnä on 59m munasarjasyöpäsoluja oli merkittävästi vähentynyt [ ,,,0],1 uM Cangrelor – 92,4 ± 0,64% estäminen, p 0,001; 10 uM MRS2179 – 71,4 ± 10,52% inhibitio, p = 0,01; 10 yksikköä /ml apyraasia, 91,8 ± 3,7%: n inhibitio, p 0,001]. Tämä viittaa siihen, ATK riippuvainen mekanismi verihiutaleiden aktivaation 59m solut, mahdollisesti välittämä vapautumista ADP solujen niiden supernatantista [Kuva 3].

Tämä viittaa mekanismin verihiutaleiden aktivaation riippuu verihiutaleiden reseptoreihin P2Y12 ja P2Y1- sekä ADP julkaisi 59m soluja niiden supernatantista. Muita verihiutaleiden antagonistit, kuten hirudiini, EDTA, absiksimabin, RGDS, ja aspiriini ollut vaikutusta 59m solun aiheuttamaan verihiutaleiden aktivoitumisen.

munasarjasyöpäsoluja voimistaa TRAP [trombiinireseptori aktivoiva peptidi], PAR 4 agonisti, ja arakidonihappo aiheuttamaa verihiutaleiden aktivaatio annosriippuvaisesti

Koska tromboosi on monimutkainen prosessi, johon liittyy useita agonistit

in vivo

, me seuraavaksi kysytään munasarjasyöpäsoluja moduloitu agonistia [TRAP, PAR 4 agonisti, arakidonihappo, ADP, epinefriini, ja Kollageeni] aiheuttamaa verihiutaleiden aktivoitumisen. Tämän selvittämiseksi arvioimme aktivaatio verihiutaleiden yhteistyössä inkuboitiin alhainen munasarjasyöpäsolu pitoisuudet ja matala agonistin pitoisuuksia. Verihiutaleiden agonistin pitoisuuksia, jotka antoivat ≤20% verihiutaleaktivaatiota [P-selektiinin ilmentymisen] käytettiin. Matalilla cellular pitoisuuksilla [0,5-1 x 10

5 solua /ml], 59m munasarjasyöpäsoluja voimistua PAR-1 [TRAP], PAR-4 [PAR4 agonistin] ja TxA2 reseptori [arakidonihappo] välittämän verihiutaleiden aktivaation [P -selectin ilmaisun], mutta ei vaikuttanut ADP, adrenaliini, tai kollageenin aiheuttama aktivointi [Kuva 4]. Esimerkiksi vasteena 1 uM TRAP ja 1 x 10

5 59m solua /ml, verihiutaleiden aktivaatio 44 ± 12,16% P-selektiinin positiivisuus [n = 3, kuvio 3], verrattuna 4,4 ± 1,6% P-selektiinin positiivisuus [1 x 10

5 59m solua /ml yksinään, n = 3] ja 5,1 ± 1,3% P-selektiinin positiivisuus [1 uM TRAP yksin, n = 3]. Toisaalta, vastauksena 1 uM ADP: n ja 1 x 10

5 59m solua /ml, verihiutaleiden aktivaatio 17,3 ± 6,2% P-selektiinin positiivisuus [n = 3, Kuvio 4] verrattuna 2,4 ± 1,4% [1 x 10

5 59m solua /ml yksinään, n = 3] ja 14,73 ± 5,3% [1 uM ADP yksin, n = 3]. Samanlaisia ​​tuloksia nähdään myös vasteena A2780-soluja [1-5 x 10

5 solua /ml], mutta korkeampi A2780 solujen konsentraatiot tarvitaan indusoimaan samanlainen vaikutus kuin 59m soluihin [tuloksia ei ole esitetty]. Tiedot osoittavat synergististä suhdetta PAR-1, PAR4, ja TxA2 reseptorivälitteisten verihiutaleaktiviteettia ja A2780 /59m aiheuttaman verihiutaleiden aktivaation. Tämä synergistinen vuorovaikutus on myös inhiboi P2Y12 antagonisti cangrelor [tietoja ei näytetty].

Aktivointi tapahtuu annoksesta riippuvaisella tavalla [n = 3, + SEM]. Pieninä pitoisuuksina, 59m [0,5-1 x 10

5 /ml], solut merkittävästi voimistua TRAP, PAR4 agonisti, ja arakidonihappo aiheuttamaa verihiutaleiden aktivaation [P-selektiinin ilmentymisen]. Tämä viittaa synergististä suhdetta PAR-1, PAR-4, ja TxA2 reseptorivälitteisten verihiutaleaktiviteettia ja 59m aiheuttamaa verihiutaleiden aktivoitumisen. Vastaavia tuloksia on nähty A2780-soluissa [1-5 x 10

5 solua /ml, tuloksia ei ole esitetty]

Expression erilaisia ​​analyysi munasarjasyövän käsiteltyjen solujen pestyjä verihiutaleita tai verihiutaleiden releasate käyttäen Affymetrix eksoni taulukot

Kaikki paneelit kulunut QC käyttäen Affymetrix QC ohjelmistoja. Biotiques X-Ray plug-in Microsoft Excel käytettiin kuulustella geenin ilmentyminen muuttuu hoitojen välillä ja solutyyppien [Taitto muutos 1,5 ja p 0,05]. Analyyttinen vaativuutta lievennetty kertamuutoksia of 1,5 mahtuu pieni mutta mielekäs biologinen vaihtelu [p 0,05], joka oli riippuvainen hoitoon. Taulukot 1, 2, 3, 4 esittävät geeni-ilmentymisen vaihtelut havaittiin soluissa, joita käsiteltiin verihiutaleiden releasate /pestiin verihiutaleita.

HIO-80-solut, hoidon jälkeen pestyn verihiutaleiden tai verihiutaleiden releasate, seitsemän geenit olivat merkitsevästi säädelty, joilla on eniten ero nähdään reaktiona pesty verihiutaleita. Voimistunut geenit koodaavat proteiineja, jotka liittyvät munasarjasyövän etäpesäkkeitä [SERPINB2 /PAI2], metabolinen toiminta [IDI1, PMM2] ja geenin ilmentymisen /transkriptio [PCGF6, ZNF267].

59m soluissa oli myös geenien ilmentyminen muuttuu hoidon jälkeen verihiutaleiden releasate ja pestään verihiutaleita. Biologisia prosesseja vaikutti mukana anti-autophagy, anti-apoptoottiset ja angiogeneesiä signalointireittien [TRAF2 CCL2, TNFAIP2, PDGFb].