Krooninen sairaus

tiivistelmä

heterogeenisuus kasvainsolujen ja niiden väärentäminen aikana sairauden kehottaa tarve reaaliaikaisesti luonnehdinta yksittäisten tuumorisolujen parantaa arviointia hoitovaihtoehtoja. Uuden sukupolven hoitomuodot usein liittyy erityisiä geneettisiä muutoksia ajo tarpeen määritellä geneettiseen syöpäsoluja. Tässä esitämme mikrofluidilaitetta rinnakkaisia ​​yhden solun koko genomin monistamisen (pscWGA), jolloin saatiin riittävän kopioita yhden solun genomiin koetin läsnäolon hoidon tavoitteet ja taajuus sen esiintyminen joukossa kasvainsoluja. Yksittäiset solut ensin kiinni ja pantiin kahdeksan rinnakkaista Vahvistinyksiköt. Seuraavaksi solut hajotettiin sirulle ja niiden DNA monistettiin peräkkäisten käyttöön omistettu reagenssien samalla sekoittaen aktiivisesti avulla integroidun painikkeen-venttiilejä. Reaktio tilavuuden toiminnan scWGA 23.85 nl, ja alkaa 6-7 pg DNA sisältyvät yhteen soluun, noin 8 ng DNA saatiin jälkeen WGA, jotka edustavat yli 1000-kertainen vahvistus. Monistetut tuotteet yksittäisistä rintasyövän solut kerättiin laitteesta joko suoraan tutkia vahvistus spesifisten geenien qPCR tai uudelleen DNA: n monistaminen saada riittävästi materiaalia koko genomin sekvensointi. Meidän pscWGA laite tarjoaa riittävän DNA yksittäisistä soluista heidän geneettinen karakterisointi, ja epäilemättä mahdollistaa automaattisten näytteen valmistelua varten yhden syöpäsolun genomin kartoitus.

Citation: Yang Y, Swennenhuis JF, Rho HS, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) Parallel Single Cancer Cell Whole Genome Amplification käyttäminen Button-Valve Assisted Sekoitus Nanoliter Chambers. PLoS ONE 9 (9): e107958. doi: 10,1371 /journal.pone.0107958

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 16 elokuu 2014; Julkaistu: 18 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus on rahoitettu NanoNextNL, mikro ja nanoteknologian yhteenliittymä hallituksen Alankomaiden ja 130 kanssa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus on rahoitettu NanoNextNL, mikro ja nanoteknologian yhteenliittymä yritysten, yliopistojen, tietämyksen laitokset ja yliopisto terveyskeskukset. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

luonnehdinta kasvaimia, ilmaus erityisiä proteiineja tai geenejä tavallisesti tarjotaan läsnä tai poissa, esimerkiksi ER + tai ER-, HER2 + tai Herman, ja EGFR mutaatio läsnä tai poissa. Tämä määritys on merkittäviä seurauksia välitöntä terapeuttista päätökset ja alistaa potilaiden tiettyihin hoitoihin. Esimerkiksi potilaat, joiden syöpäsolut on vahvistus ErbB2 (Her2) geeni todennäköisimmin hyötyvät Her2 kohdistaminen huumeita kuten Trastutsumabi. [1] Valitettavasti kasvaimet ovat paljon monimutkaisempi: ekspressiotasot voivat vaihdella laajasti sisällä kasvain ja voivat muuttua aikana sairauden. [2] – [4] Esimerkiksi, somaattiset mutaatiot voivat olla läsnä vain pieni joukko kasvaimen [5] ja kasvaimen solut voivat olla resistenttejä liittyy geneettisiin muutoksiin. Osoittaakseen läsnäolo ja laajuus heterogeenisyys kasvainsoluissa analyysissä yksisoluvaiheessa tasoa tarvitaan ei menetä tätä tärkeää tietoa [5] – [7].

tutkimiseksi genomin yhden solun käytettäessä laaja ja luotettava tapa, koko genomista on monistettava säilyttäen alkuperäisen edustus geenien suorittaa loppupään analyysi kuten koko genomin sekvensointi [6] – [8], array vertaileva genomin hybridisaatio (aCGH) [9], [10] tai reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) [11], [12]. Tällä hetkellä kaikki nämä tekniikat vaativat kymmeniä nano-grammaa muutamaan mikro- grammaa materiaalin koko genomin. Useita siirtymä monistus phi 29 polymeraasi on yksi houkutteleva lähestymistapa yhden solun koko genomin monistamisen jatketaan vakiolämpötilassa. [13] DNA: n monistuksen käyttäen phi29 entsyymillä on se etu, että se voi tuottaa pitkän DNA-juosteet ( 10 kb) suuria määriä (jopa 1~2 ug) suhteellisen lyhyessä ajassa (2 tuntia). [14] – [16] kuitenkin erittäin alhainen pitoisuus DNA löytyy yksittäisen solun genomi on edelleen suuri tilavuus WGA seosta (20-50 ui) aiheuttaa usein ei-spesifinen monistuminen ja vahvistusta harhat. [17] – [19] Lisäksi, lajittelu ja manipulointi yksittäisten solujen suorittaa yhden solun analyysi voi olla hyvin haastavaa, ja kukin manipulointi voi johtaa menetykseen materiaalia. Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) [8], [20], mikromanipulaatiota [10], [11], laser kaapata mikrodissektion (LCM) [9], [21] ja DEP Array [22], [23] ovat kaikki olleet hakenut yhden solun eristämistä, mutta käsittely solujen DNA: n saamiseksi jatkoanalyysille (esim lyysi, nukleiinihappojen eristäminen ja monistus) ei ole tai sitä ei voida integroida. Toisaalta, mikrofluidistiikan ja microfabricated rakenteet mahdollistavat yhden solutekniikan samalla helposti kytketty yhteen soluun analyysin vaiheessa. [24] – [26] Lisäksi mikrofluidistiikka esittelee avain-etu WGA, koska reaktiot tapahtuvat huomattavasti pienempiä määriä kuin käytettäessä perinteistä pipetointia ja mikroputkea (pico-l versus mikro- litraa). Tämä etu on erityisen korostettu WGA yksittäisten bakteerisolujen avulla reaktion tilavuutta 60 nl johti vähäisempään taustalla ja korkeammasta tasosta vähemmän vahvistus bias [27].

mikrofluidilaitteet, sekoitus tapahtuu luonnollisesti passiivisella diffuusiolla . Erityisesti diffuusio suurten molekyylien, kuten phi29 polymeraasi kestää kauemmin kuin pienemmät molekyylit ja rajoittaa luotettava ja reaktion nopeutta mikrofluidilaitteissa. Rotary mikseri on käytetty nopeuttaa tätä sekoitustoiminnasta mikrofluidilaitteissa. [28], [29] kuitenkin kokoa näiden rakenteiden rajoittaa useita rinnakkaisia ​​reaktoreita, jotka voidaan sijoittaa yhteen laitteeseen ja näytteen seos on kuljetetaan toiseen reaktoriin seuraavaan vaiheeseen analyysin. Lisäksi, pinta-ala reaktorissa, on paljon suurempi, mikä voi lisätä näytteen menetys kysymyksiä takia kiinni on kanavan seinät. Vaihtoehtoisesti venttiili rakenteita voidaan toteuttaa jatkuvana reaktoriin aktiivista sekoittuminen reagenssien.

Täällä esittelemme mikrofluidilaitetta rinnakkaisia ​​yksisoluisia WGA. Esittely- laite, 8 rinnakkaista reaktiota kammiot on suunniteltu ja testattu ladata kahdeksasta erillisestä syöpäsolujen myöhemmin hajotettiin alkalisissa olosuhteissa, jota seuraa neutralointi vaiheessa ja WGA. DNA yksittäisistä soluista monistettiin käyttäen phi29 polymeraasilla ahtaissa PDMS kammion alavirran sirun analyysi. Painike venttiili-avusteinen sekoittaminen saavutetaan WGA yksittäisten kasvainsolujen reagenssin määrä -20 nl verrattuna 20 ui perinteisten WGA reaktioita.

E. coli

DNA ensin käyttää mallina järjestelmän mukauttamiseksi WGA käyttäen phi29 polymeraasia, minkä jälkeen yksittäiset solut rintasyöpään solulinjojen kasvaimen scWGA. Laatu on-chip monistettu DNA arvioitiin qPCR kohdistui 10 eri geeniä.

kokeelliset menetelmät

Chip Fabrication ja laitteen valmistaminen

mikrofluidilaitteet oli valmistettu monikerroksinen pehmeä litografia tekniikkaa. [30], [31] Ensimmäinen maski malleja valmistettiin CleWin ohjelmisto (WieWeb ohjelmisto, Hengelo, NL) ja painettu 5 ”natronkalkkilasista naamio generaattori LBPG Heidelberg DWL200 (Heidelberg Instruments Mikrotechnik GmbH). Master muotit valmistettu valoresistikalvo perustuva fotolitografiatekniikalla. Positiivinen fotoresistillä (AZ 40 XT, MicroChem Corp.) oli spin-pinnoitettiin 4 ”piikiekon, ja kuvioitu käyttäen fotolitografiaa. Luotettavan toiminnan mikroventtiilit, poikkileikkauksen muoto mikro- pääasiassa nestevirtauskomponenttien kanavat pyöristetty kuumentamalla muotti 140 ° C: ssa yhden minuutin ajan kehityksen jälkeen. Ylimmän fluidic kerros tuotettiin kaatamalla kovettumattomalle PDMS (GE RTV 615, elastomeeri: ristiinkytkijää = 05:01) muottiin saavuttaa paksuuteen 7 ± 0,5 mm. Pohja ohjaus kerros tehtiin kehruupäällystämällä kovettumattoman PDMS (elastomeeri: ristiinkytkijää = 20:1) päälle isäntä muotti 2500 rpm 1 minuutin ajan. Saatu paksuus ohjaus paksuus oli 25 ± 2 um. Fluidisen ja valvonnan tasoja kovetettiin 45 min ja 30 min, vastaavasti, 80 ° C: ssa. Fluidistorioskillaattorin kerros irrotettiin muotista ja reiät suulta oli lävistetty 25 gaugen punch (Syneo Co., Angleton, TX, USA). Sen jälkeen, fluidi- kerros kohdakkain ohjaus kerros käyttäen kohdistusmerkit on molempien kerrosten stereomikroskoopin alla, ja linjassa kerrokset sidotaan paistoa 80 ° C: ssa 60 min. Sitoutunut kerrokset kuoritaan sitten pois muotista, ja reiät valvontaa satamissa lävistettiin. Lopuksi monikerroksinen PDMS laite oli peitetty ennalta puhdistettu lasilevyllä (Fisher Scientific, Landsmeer, Alankomaat) ja pidettiin uunissa 80 ° C: ssa 12 tunnin ajan parantaa tarttuvuutta. Ennen käyttää laitteita esipinnoitettiin johtamalla BSA-liuosta (0,5 mg /ml) kanavien läpi 20 minuutin ajan. BSA ratkaisut työnnettiin ulos ilmaa.

Whole Genome Amplification

Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) käytettiin WGA. Lyysi (400 mM KOH, 10 mM EDTA, 100 mM DTT: tä), neutralointi (0,4 ml 1 M HCI: a ja 0,6 ml 1 M Tris · HCl, pH 7,5), ja työntämällä puskureita (1X Tris-EDTA, 0,2% Tween -20) esiteltiin omistettu läpivientien laitteen. Monistusreaktio suoritettiin koskevasta AmpliSpeed ​​slide cycler (Advalytix AG, Munich, Saksa) 2 tunnin setti 34 ° C: ssa. Monistuksen jälkeen näytteet kerättiin yksittäisten vahvistimien ja siirrettiin PCR-levylle, jota seuraa inaktivointivaiheen 65 ° C: ssa 10 min. Uudelleen vahvistus on-chip monistetaan näytteitä, 17 ui WGA seosta lisättiin 1 ui on-chip monistetun näytteen perusteella valmistajan protokollan ja reaktio suoritettiin 30 ° C: Bio-Rad CFX 384 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA,) 70 min. Tätä seurasi inaktivointivaiheen 65 ° C: ssa 10 min.

kvantitointi ja Arviointi

qubit 2,0-fluorometri ja Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Breda, Alankomaat) käytettiin määrittämään dsDNA. Reaaliaikainen SYBR green qPCR käytettiin määrällisesti kohde-spesifisen DNA. Sillä

E.coli

WGA, alukkeet vasten pienen alayksikön (SSU), 369 bp, 16 S rRNA käytettiin pitoisuutena 500 nM. Yhden syöpäsolun vahvistus, alukkeet on suunniteltu pien- alayksikköä GAPDH (12p3), erbB2 (17p12), CCND1 (11q13), Myc (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), URB2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), P53 (17p13.1), TRAM1 (8q13.3) ja PAK1 (11q13-q14) käytettiin pitoisuutena 500 nM.

Soluviljelmä ja valmistaminen

rintasyöpä solulinja, SKBR-3 (ATCCHTB-30) ja MCF-7 (ATCCHTB-22) soluja, viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Alankomaat), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamiinilla (Sigma Aldrich), 1% penisilliini-streptomysiini (Sigma Aldrich) 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä. Ennen kokeita, solut värjättiin CellTracker Orange CMTMR (Molecular Probes, Breda, Alankomaat) 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja irrotettiin 0,05% trypsiini /EDTA: a (Gibco, Paisly, UK). Sen jälkeen solut pestiin kerran elatusaineella ja suspendoitiin uudelleen PBS-liuosta.

Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) B

SKBR-3 ja MCF-7-soluja viljeltiin ja kerättiin, kuten edellä on kuvattu. Molemmat solulinjat kiinteitä suspensiossa käyttämällä Carnoy fiksatiivi (Metanolia (Fisher Scientific, Loughborough, UK): Etikkahappo (Merck, Hohenbrunn, Saksa), 03:01) ja putosi tavalliselle objektilasille. Dioja annettiin kuivua 30 minuutin ajan ennen kuin inkuboitiin 15 min 2 x SSC: tä (20x SSC = 3 M natriumkloridia (Merck), 0,3 M natriumsitraatti (Merck), pH 7,0), 0,5% Igepal (Sigma Aldrich), minkä jälkeen kalvot olivat dehydroitiin etanolia (70%, 85%, 100%) yhden minuutin ajan kutakin. 3.5 ul Her2 /neu (ErbB2) (Kreatech, Amsterdam, NL) koetin sekoitus levitettiin dioja seuraa Ø12 mm peitelevy (Thermo Scientific, Breda, NL). Sen jälkeen, kun reuna peitelevy suljettiin kumisella sementin (Kreatech), koettimet ja tavoite denaturoitiin 10 min 76 ° C: ssa ja annettiin hybridisoitua 16 h 37 ° C: ssa. Hybridisaation jälkeen peitelasit poistettiin ja tiukka pesu levitettiin käyttäen 0,4X SSC, 0,3% Igepal 72 ° C: ssa 2 min. Huuhdottiin 5 min 2 x SSC 0,1% Igepal ja dehydroitiin etanolia (70%, 85%, 100%), 1 min. Objektilasit lopulta asennettu DAPI /mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää (Kreatech).

Tulokset ja keskustelu

Laitteen karakterisointi

Suunnittelu ja toimintaperiaatteet rinnakkaisten yhden solun WGA laite havainnollistetaan Kuva 1. laite sisältää 8 Vahvistinyksiköt 6 läpivientien (avaa sininen ympyrä) ja 10 toimipistettä (siniseksi ympyrät) (kuvio 1A), ja se koostuu kahdesta kerroksesta, fluidivoimaan kerros (sinisellä) ja ohjaus- kerros (vuonna punainen ja pinkki). Kukin vahvistus yksikkö (katso kuvio 1 B) koostuu kolmesta pyöreä kammiota (1,2 nl) ja yksi neliö kammio (20,25 nl). Sulku- venttiilit (punaisella) käytetään pneumaattisesti ja mahdollistaa molempien manipulointia solujen ja lastaus ratkaisuja. Sekoitus- venttiilit (vaaleanpunainen), joka sijaitsee keskellä kolme pyöreää kammiot toimivat samalla tavalla. Pääkanava on kolme sisääntuloa varten vastaavien käyttöönoton solususpension lyysipuskuria ja neutralointi puskuri, joka on liitetty multiplek- kanavia työntää sisältöä 8 yksittäisten vahvistimien vastakkaisella puolella. WGA tuotteet voi noutaa 8 yksittäisessä ulostulossa tekoaltaat. Laitteen käyttöaikaa prosessi on esitetty kuvassa 1C, jossa väriaineet otettiin käyttöön laitteen visualisointi tarkoituksiin, ja kuvaamisen mikroskoopilla. Sininen väriaine edustaa WGA seos, oranssi väriaine solususpension, vihreä väriaine lyysipuskuri, punainen väriaine neutralointiin puskurin ja purppuraväriä työntöosan puskuria. Ensin sinistä väriainetta käytettiin täyttämään kaikki suorakaiteen kammiot. Seuraavaksi oranssi väriaine lastattiin pääkanava ja työnsi kahdeksan ensimmäisen pyöreä kammioita. Sama operaatio suoritettiin vihreän ja punaisen värit. Lopuksi liuos läsnä kolme pyöreää kammiot ja sinisen väriaineen neliön kammioon sekoitettiin. Reagenssit sekoitettiin saavutettiin ohjauksen yhteydessä kolmen painikkeen venttiilit, ja tämä operaatio menettely on esitetty elokuva (elokuva S1). Sillä scWGA, käytimme painiketta venttiiliohjauksen vain WGA reaktiovaiheessa kuviossa 1 (C-j). Koska alhaisen Reynoldsin luku löytyy mikrofluidinen kanavien sekoitus tapahtuu kun passiivisen diffuusion. Parantaa sekoittamalla tehokkuutta DNA: n monistamiseen, painike-muoto venttiilit yhdistettiin suljetussa vahvistimien laitteen, keskellä kolme pyöreän kammiota. Paineistetaan kolme painiketta venttiilit peräkkäin auttaa sekoittamalla reagenssit pyöreästä yleinen kammioita. Sekoitustehokkuutta Napin venttiilien ensin arvioitiin sekoittamalla testeissä käytetään sinisen värin väriainetta. Kun neliö WGA kammio täytettiin sininen väri väriaine, kolme pyöreää kammiot täytettiin MiliQ vettä ja sulkuventtiilin avattiin välillä pyöreän yleinen kammioita. Sitten, painike venttiilit avataan ja suljetaan peräkkäin tietyllä taajuudella. Tarkkailemalla sekoittaminen värit sekvenssin alun ja lopun painike venttiilien optimoitiin. Pääset sekoituksen tehokkuutta, kirkkaus arvo ensimmäisen ympyrän kammion kirjattiin sekoituksen aikana alueella merkitty punaisella ympyrällä viiva kuviossa 2A. Aika täydellinen sekoittuminen diffuusion ainoastaan ​​havaittiin olevan noin 30 minuuttia, kun taas painike venttiilin avustamina ja sekoittamalla 2 Hz: paljon nopeammin ja kesti vain noin 4 min, kuten on esitetty kuviossa 2B. Sekoituksen lopettamisen asetettiin siten, että kirkkauden arvo mitataan Image J ohjelmisto ensimmäisessä kammiossa saavutti 110 (sininen väri) päässä 220 mitattuna läpinäkyvä MilliQ. Lennosta venttiilit testattiin taajuuksilla välillä 0,1 ja 30 Hz 5 min ja sekoittamalla tulokset on esitetty kuviossa 2C. Sekoitus tehokkuus laski alle 0,5 Hz ja yli 5 Hz, ja vähintään 4 min venttiiliohjauksen tarvittiin optimaaliseen sekoituksen. Koska molekyylipaino vaikuttaa molekulaarisen diffuusion kertoimen ja koska molekyylipaino ruoan väri väriaine on huomattavasti pienempi kuin phi29 polymeraasia (MW 68000), käytettiin myös rodamiini konjugoitu dekstraani (MW 70000) ja akridiinioranssi leimatun DNA arvioida sekoittuminen laitteessa fluoresenssimikroskopialla. Sekoitus oli todellakin hitaampi verrattuna ruoan väri väriaine ja saatiin päätökseen noin 20 min 1 Hz. (Kuva S1).

(A) Kaaviokuva laitteesta. Laite sisältää 8 Vahvistinyksiköt 6 sisääntulot ja 10 toimipistettä. (B) Suurennettu otetaan kaksi Vahvistinyksiköt. Sininen väri edustaa virtauskanavat, punainen väri edustaa valvontatasoilta varten sulkuventtiilit ja vaaleanpunainen väri edustaa ohjaus kerroksia painikkeen venttiilit. Vahvistinyksiköt koostuvat kolmesta pyöreä kammiota (1,2 nl) ja solususpensiota, lyysipuskuria, ja neutralointi puskuri ja yksi neliö kammio (20,25 nl) suunniteltu WGA seoksen. Sekoitusventtiilit sijaitsevat keskellä kolme pyöreän kammiota. (C) Laitteen toiminta prosessi. Kirkas-kentän kuvia vahvistinyksikön väri väriaineet osoittavat toiminnan prosessia. (A-j).

(A) Kirkas-kentän kuva vahvistinyksikön jossa neliö kammio on täytetty sinisellä värillä ja kolme pyöreää kammiota vedellä otettu t = 0. Average kirkkaus arvo ensimmäisen kammion (punainen ympyrä) seurattiin ajan funktiona sen jälkeen, kun venttiili avataan. (B) Sekoitus tehokkuutta painikkeen venttiilit. Mitatut keskimääräinen kirkkaus arvot ensimmäisessä pyöreä kammio sekoitusventtiili operation- merkitty mustalla ja sekoittamatta venttiilin toiminnan merkitty vihreällä. (C) sekoittaminen tehokkuuden testi eri taajuuksilla sekoitusventtiiliä toimintaa. Keskimääräinen kirkkaus arvot ensimmäisestä kammiosta mitattu 5 minuutin aikana.

Whole Genome Amplification on Chip

mukauttaminen WGA protokollan isoterminen DNA-monistuksella phi29 entsyymin päälle mikrofluidilaitetta suoritettiin käyttämällä

E.coli

koko genomin mallina näyte. Ensin

E.coli

DNA-liuosta (6 ng /ul) ladattiin pääkanava, ja sulkemalla venttiilit pääkanava tarkka tilavuus 1,2 nl voitaisiin mitata ja lastata ensimmäisessä kammioihin vahvistimien laitteen, joka vastaa DNA: n määrä (7,2 pg) havaittiin yhdessä syöpäsolun. Puskuriliuos (1X Tris · EDTA, 0,2% Tween 20) ajettiin läpi ensimmäiseen kammioon kunkin vahvistus yksikkö täyttää kolme pyöreää kammiota, huolehtien venttiilien välisen pyöreän yleinen kammiot kunnolla kiinni eristämään WGA mix kammiot. WGA mix myöhemmin tuotu suoraan tulo- kaikille neliö kammiot ennen reaktiota. Side venttiilit neliön kammioita erottaa yksittäisiä Vahvistinyksiköt. Avaamisen jälkeen sulkuventtiilit välisen pyöreän yleinen kammio, monistusreaktio seosta, joka koostuu phi29 polymeraasin, satunnaisia ​​heksameerejä ja dNTP torilla kammiossa ja

E.coli

DNA pyöreän kammioissa alkoi diffundoitua ja olivat aktiivisesti sekoittaa avulla painikkeen venttiilien käynnistetään 1 Hz. 2 tunnin jälkeen näytteet työnnetään geelilatauspuskuria pipetin kärki sijoitetaan ulostulossa kanavan lisäämällä 5 ui työntää puskuria tuloaukosta, ja sisältö pipetin kärjen sen jälkeen kuljetetaan PCR levy. Inaktivoinnin jälkeen kerättyjen näytteiden 65 ° C: ssa 10 minuutin ajan, qPCR kohdistaminen SSU 16 S rRNA toteutettiin laadun tarkistamiseksi monistetun tuotteen. Reaaliaikaista qPCR käyrät käyttäen kuusitoista näytteitä 1 ui on-chip monistettu DNA on esitetty kuviossa 3 (vihreät viivat), ja ne vastaavat keskimäärin Cq on 14,77 ± 0,55 (n = 16). Vertailun, neljätoista näytteitä 6 ng /ul DNA-liuosta 1,2 nl kammion analysoitiin ilman vahvistusta. Ne edustavat mustat viivat kuviossa 3, ja johti keskimäärin Cq arvon 23.43 ± 0,02 (n = 14). Suurempi määrä alkaa DNA osoittavat myöhemmin Cq arvon RT-qPCR ja ero Cq-arvojen (ΔCq) voidaan mitata ero määrän näytteiden välillä perustuu standardin käyriä. ΔCq Näytteiden ilman vahvistusta ja näytteet monistamisen jälkeen oli noin 9. Siksi qPCR kohdistaminen SSU 16 S rRNA johti kohdespesifinen DNA monistamisen 512 kertaiseksi (2

ΔCq = 2

9, 100% tehokkuus). Samanlaiset kokeet suoritettiin ilman sekoittamalla painikkeella venttiilit johti keskimäärin Cq arvo 20,18 ± 2,07 (n = 7), mikä osoittaa selvästi se etu, että aktiivisen sekoituksen monistamis- vaiheen aikana (kuvio S2).

Real- aika qPCR käyrät kohdistaminen SSU 16 S rRNA yksittäisten kerättyjen näytteiden laitteesta. On-chip monistetaan näytteitä edustettuina vihreä käyrät (n = 16), kun taas kontrolli näytteitä ilman vahvistusta esitetään mustina käyrät (n = 14).

WGA kasvainsolujen

osoittaa toteutettavuus geneettisen karakterisointi yksittäisten kasvainsolujen mikrofluidilaitetta käytimme soluja rintasyöpäsolulinja SKBR-3 ja MCF-7. Koska määrä DNA (6-7 s) sisälsi yhden solun sisällä on liian alhainen suoran tarkastelua kokoonpanonsa, koko genomista monistettiin edellä kuvatulla tavalla. Pääkanava morfologiaa ja immunofenotyyppi solujen voidaan tutkia ja tarkistettuaan, että solut sopii meidän valintakriteerit yksittäiset solut voidaan siirtää ensimmäiseen kammioon Vahvistinyksiköt. Solususpensio ja SKBR-3 ja MCF-7-solut värjättiin CellTracker Orange ruiskutettiin pääkanava, ja tunnistimme solujen tehtävä jatkoanalyysiin niiden fluoresenssivärjäysreagenssia ja morfologia, kuten koko ja muoto. Latauksen jälkeen yksittäisten solujen ensimmäiseen kammioon vahvistinyksikön, ilma työnnettiin tyhjentää pääkanava. Kuten multipleksoidun viivoja on kytketty pääkanava jokaisen rivin voidaan avata erikseen käyttämällä yhdistelmä venttiilit ja vain solut kohteisiin voidaan käsitellä edelleen. [32] Kuvia on SKBR-3 solun vahvistusasteen kammiossa on esitetty kuvioissa 4A B. Kun solu siirretään vahvistinyksikön toiseen, lyysipuskuria lisättiin, kuten on esitetty kuviossa 1C, annostellaan sulkemalla venttiilit, ja työnnetään käyttäen 1X Tris · EDTA, 0,2% Tween-20 sekoittaa sitä solun . Mukautua tilavuus venttiilin ensimmäisen ja toisen ympyrän kammiot avattiin ja lyysi tapahtui kahden ensimmäisen kammiota 10 min diffuusion. Samoin, neutralointi puskuri otettiin käyttöön ja neutralointi tapahtui kolmen ympyrän kammiota, myös 10 minuuttia perustuu diffuusioon. Venttiiliohjauksen sekoittamiseen ei ollut tarpeen hajotukseen ja neutralointi kuin diffuusio aika välillä 2 tai 3 pyöreä kammioita oli riittävän nopea suorittaa reaktio. Todellinen solujen lyysin tarkkailtiin mikroskoopilla. WGA Seos ladattiin neliön kammioihin käyttämällä erillisiä suulta, ja sen jälkeen, painike venttiilit toimivat 1 Hz aikana 2 tuntia reaktion sekoittua solulysaattiin ja WGA seoksen, ja DNA: n monistamiseen. Noin 8,27 ng DNA: ta saatiin on-chip vahvistusta, ja koska yhden solun sisältää 6-7 pg DNA: ta, yli 1000-kertaista monistumista saavutettiin. Validointi template-spesifisen DNA suoritettiin qPCR kohdistamalla GAPDH-geenin lokus kuin korjauksilla GAPDH ei ole raportoitu molemmissa solulinjoissa. Rintasyöpä solulinja SKBR-3 ja MCF-7 käytettiin osoittamaan erot ErbB2-geenin monistaminen. Kuvio 4C esittää reaaliaikaisesti qPCR käyrät GAPDH kuusi yksittäistä SKBR-3-soluja (mustat käyrät) ja kuusi yksittäistä MCF-7-solut (vihreä käyrät), analysoitiin käyttäen kahta eri laitetta. Cq arvot GAPDH vahvistus määrällisesti perustuu Standardikäyriä 23.22 ± 0,6. Tämä merkitsi sitä, että 33% kokonaismäärästä DNA, mitattuna Qubit määrityksessä, oli templaatti-riippuvainen tuotteen. Kuvioissa 4D ja E FISH kuvia hybridisaation jälkeen erbB2-koettimia (punainen) ja sentromeerin kromosomin 17 (vihreä) on SKBR-3 ja MCF-7-solujen on esitetty. Kun taas 2 kappaletta kromosomi 17 ja 2 kopiota ErbB2-geenin havaittiin MCF-7-solu, neljä kappaletta kromosomi 17 ja 10 kopiota ErbB2-geeni löydettiin SKBR-3-solu. Seuraavaksi sama analyysi suoritettiin käyttäen scWGA meidän mikrofluidilaitetta käyttäen ErbB2: erityisiä qPCR, yksittäisten SKBR-3 ja MCF-7-soluissa. Kuten kuviossa 4 F, keskiarvoistettu erbB2-Cq-arvo monistettu DNA yksittäisten SKBR-3-soluissa oli 24,95 ± 0,68 (n = 6) vastaan ​​29,80 ± 1,96 (n = 5) yksittäisten MCF7-soluissa, kun taas GAPDH Cq-arvo sekä solulinjat oli 23,22 ± 0,6 (n = 12), on esitetty kuviossa 4C. Alempi Cq mitattu arvo SKBR-3-soluissa korreloi hyvin useita kopioita ErbB2-geenin noudatettava FISH (kuvio 4D), mikä viittaa siihen, että on-chip WGA seurasi qPCR tiettyjä geenejä voidaan käyttää määrittämään, onko vai ei geeni monistetaan.

(a) kirkkaan kentän mikroskooppi kuva yhden SKBR-3 solu eristetään mikrofluidinen kammiossa, sulautui fluoresenssin kuva. (B) fluoresenssin kuva yhden SKBR-3 solu värjätään CellTracker Orangen mikrofluidistiikkaan kammiossa. (C ja F) qPCR kohdistaminen GAPDH ja erbB2-geenit on-chip monistetun DNA määristä ja ominaisuuksista käyttäen 1 ui sirulla monistetaan näytteitä (5 ui) yksittäisistä SKBR-3 (n = 6) ja MCF-7 (n = 6) templaatteina. (C) Reaaliaikainen qPCR käyrät GAPDH-geenin monistamisen. Monistettu DNA yhden SKBR-3 esitetään käyttämällä mustaa käyriä kun taas yhden MCF-7-solujen edustettuina vihreä käyriä. Kynnys linja on harmaa. (D ja E) Kuvia fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) ErbB2 koettimilla (punainen) ja sentromeeriantigeenin kromosomin 17 antureista (vihreä) tietyn SKBR-3 (D) ja MCF-7 (E). Tumat värjättiin Hoechst (sininen) (F) Cq arvot ErbB2 geenin rasiakuvaaja. Cq arvot ErbB2 edustivat musta laatikko SKBR-3 (n = 6) ja punainen laatikko MCF-7 (n = 5, * Cq 1 näyte puuttuu vuoksi PCR virhe). (25% -75%: □, mediaaniarvo: -, Keskiarvomittari: □, Min /Max: °, Valikoima Min /Max: I).

geneettinen analyysi kuten sekvensointiin tai suurikapasiteettisten erilaisia ​​analyysi, suurempi määrä DNA (mikrogrammaa) ovat pakollisia. Arvioidaan sopivuutta uudelleen monistettujen tuotteiden geenien edustus, amplifioimme sirun 1 ui 5 ul-chip monistettu DNA yhdestä SKBR-3 solu 17 ui WGA mix, jota seurasi qPCR kohdentamalla 10 eri lokukseen koko genomin. Tästä päätämme 10 geeniä, jotka ovat kiinnostavia syövän tutkimusalalla ja sijaitsevat eri kromosomeissa. Amplifikaatiotuotteita Näiden geenien antaa tietoa edustus alkaa DNA monistetut tuotteet. 10 ng 8 uudelleen monistetaan kerätyistä näytteistä kaksi laitetta (4 näytettä per laite) verrattiin 10 ng genomista DNA: ta (gDNA) of SKBR-3. Kuvio 5A esittää variaatiokerroin (CV,%) Cq arvot 4 näytettä jokaiselle laitteelle esitetty vihreä ja mustat palkit varten 10 loci harkita. Keskimääräinen CV niille 10 geenejä olivat 3,8% ensimmäisen laitteen (vihreä) ja 2,9% toisena laitteen (musta), ja alle 7% vaihtelu havaittiin any10 geenien välillä näytteiden samassa laitteessa. ΔCq arvot yksittäisille 8 näytettä verrataan gDNA määritettiin 10 geenien (katso kuva 5B). Yksittäiset viivoilla kuviossa 5B vastaavat yhdessä reaktiossa siru. ΔCq vaihteli geenien, mutta kaikki 10 geenit monistettiin 10 ng scWGA näytteitä (n = 8). Kopiointi numerot kohdegeenien arvioitiin perustuen qPCR standardin käyrät gDNA. Harmaa palkit Kuvassa 5C edustavat kopiomääränä yksittäisten scWGA 10 ng DNA: ta, kun taas mustat palkit edustavat kopion määrä genomista DNA: ta 10 ng. Keskiarvoistetut kappale numerot 10 geenien 10 ng DNA: ta ovat: 128 kopioita ErbB2, 47 kappaletta CCND1, 140 kappaletta MYC, 201 kappaletta PRMT2, 213 kappaletta URB2, 1182 kopiota FGFR1, 42 kopiota P53, 348 kopiota TRAM1, 332 kappaletta PAK1, ja 513 kopioita GAPDH, mikä vastaa prosenttiosuudet edustus 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, ja 15,5%, vastaavasti. Viivästynyt Cq arvot ja tausta vahvistus johtivat vähemmän kopio geenimäärien verrattuna gDNA 10 ng. Koska sama tulos havaittiin, kun pieniä kopioita gDNA monistettiin, oletamme tämä harha on artefakti aiheuttama kaupallista pakkausta. Lisäksi fluoresenssipohjaiset DNA: n kvantifiointiin, uudelleen vahvistus, qPCR menettelyjä, ja kvantifiointi perustuu standardiin käyrät genomista DNA voi vaihdella tuloksia. Muut ei-isoterminen ja isoterminen DNA vahvistus menetelmiä voidaan toteuttaa meidän mikrofluidilaitetta vaikka reaktio volyymit ja reaktio vaiheet on mukautettava ja ei-isoterminen lämpötilan valvonta tulee käyttöön.

Cq-arvot 10 ng DNA: ta malleja määräytyvät SYBR green qPCR kohdistui 10 geenejä. (EN) variaatiokerroin (%) on Cq-arvot 4 näytettä monistettiin samalle sirulle. Näytteet 2 eri laitteiden kohdalla vihreänä ja mustat palkit. (B) Yksittäiset viiva edustaa yhtä monistettu näyte siru yhdestä solusta. Y-akseli edustaa delta Cq-arvot välillä 10 ng DNA: ta monistettiin siru yhden solun ja genomista DNA: ta. (C) Arvioitu kopio lukumäärät yksittäisiä näytteitä edustettuina harmaat palkit. (N = 8) mustat palkit edustavat arviolta kopio määrä genomista DNA: ta 10 ng.

Johtopäätökset

Täällä esitimme mikrofluidilaitetta varten rinnakkaisen yksittäisten solujen saamiseksi riittäviä määriä DNA: koko genomin monistamisen jatkoanalyysille. Button muotoinen kalvot toteutettiin sekoitusventtiilit, ja juokseva käynnistys näiden venttiilien tehostetun sekoitustehokkuutta.