Krooninen sairaus

tiivistelmä

erittäin synkkä ennuste haimasyövän (PC) johtuu ainakin osittain puute varhaisen diagnoosin. Siksi tunnistaminen ilmennetty eri geenien moniportaisuudesta tumorigeneesin PC on erittäin kiinnostava. Esillä olevassa tutkimuksessa, joka on 7,12-dimethylbenzanthraene (DMBA) aiheuttaman PC kautta luotiin Sprague-Dawley rottia. Geeniekspression profiilin seulottiin käyttäen oligonukleotidia microarray, jonka jälkeen reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) ja immunohistokemiallisella värjäyksellä validointi. Kaikkiaan 661 differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin vaiheissa haiman syövän synnyn. Mukaan GO luokitusta, nämä geenit olivat mukana useiden molekyyli- reittejä. Käyttämällä kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi analyysi, normaali haima, akuutti ja krooninen haimatulehdus, Panin varhain ja kehittyneet haimasyövän olivat täysin syrjitty. Lisäksi 11 upregulated ja 142 vaimentua geenit (koettimet) löytyivät Mann-Kendall trendi Monotone testi, joka osoittaa homologiset geenit rotan ja ihmisen. QRT-PCR ja immunohistokemia-analyysi CXCR7 ja UBe2c, kaksi tunnistettu geenejä, vahvisti mikrosirulla tuloksia. Ihmisen PC solulinjoissa, knockdovvn CXCR7 alensivat muuttoliikettä ja invaasiota. Yhdessä meidän data tunnistaneet useita lupaavia merkkejä ja terapeuttisten kohteiden PC perustuvat kattavaan seulontaan ja systeemisen validointi.

Citation: Guo JC, Li J, Yang YC, Zhou L, Zhang TP, Zhao YP (2013) oligonukleotidi Microarray Tunnistaa Genes ilmentyvät eri aikana tuumorigeneesin DMBA-indusoitu Haimasyöpä rotilla. PLoS ONE 8 (12): e82910. doi: 10,1371 /journal.pone.0082910

Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 elokuu 2013; Hyväksytty: 29 lokakuu 2013; Julkaistu: 23 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat tutkimusta varten erityisrahaston kansalaisten hyvinvoinnin teollisuudelle terveyden, translationaalinen tutkimus varhaisen diagnoosin ja kokonaisvaltaista hoitoa haimasyövän (numero 201202007). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on ihmisen kiinteiden pahanlaatuinen kasvain erittäin huonon ennusteen [1]. Useat kliiniset ja patologiset tekijät PC on tunnistettu, mukaan lukien T vaiheessa imusolmuke /etäinen etäpesäke, hiilihydraattiantigeeniä (CA) 19-9 taso ja hermoa /intraneural invaasio; kuitenkin, mitkä tekijät vaikuttavat ennusteeseen PC epäselviä [2], [3], [4], [5]. Lisäksi, molekyyli tapahtumia patogeneesiin liittyvien ja etenemistä PC, kuten Kras mutaatio, on havaittu, kuten hot spot [1]. Kuitenkin lisää tutkimusta tarvitaan tunnistamaan solun tekijöitä, jotka vaikuttavat ennusteeseen.

Yksi suurimmista haitoista aiemmissa tutkimuksissa ihmisen näytteiden ja solulinjojen on vaikeus kerätä näytteitä kaikissa vaiheissa kasvaimien syntyyn. Siksi eläinmalleissa esittää ainutlaatuisia etuja tätä näkökohtaa. Kemialliset indusoijat PC ovat N-nitrosobis (2-oksopropyyli) amiini, atsaseriini, ja 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) [6], [7], [8], [9], [10]. Nämä mallit voivat aiheuttaa koko joukko Karsinogeneesin kautta pitkälle ja etäpesäke. DMBA on laajalti käytetty perustamiseen rotan PC mallit [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että asinussolut voi transdifferentiate on duktaalinen solujen kasvainten synnyssä prosessin DMBA-indusoidun PC rottamallissa [18]. Nykyään käsite ja merkitys asinussolujen ja ductal metaplasiaa (ADM) on vähitellen hyväksytty [19]. Aiemmat tutkimukset ovat tarkastelleet eri ominaisuuksia nämä PC malleja, kuten histologiset /histokemiallisia ominaisuuksia [11], [12], [14], runsasrasvaisen /runsaasti proteiinia ruokavalio edistäjänä syövän [13], glukoosiaineenvaihdunnan [15] , ja muutokset eri proteiineja [16]. Eräs tuore tutkimus suoritetaan proteomiikka-analyysi PC rottamallissa [17]. Toistaiseksi seulonta differentiaalisesti ilmentyvien geenien tässä mallissa ei ole raportoitu.

Tässä tutkimuksessa tavoitteenamme oli seuloa ilmennetty eri geenien PC käyttämällä DMBA-indusoidun PC rottamallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Aikuisille Sprague-Dawley (SD) rottia antamat Experimental Animal Center, Pekingin unionin Medical College Hospital, Peking, Kiina. Rottia standardiolosuhteissa, kuten taudinaiheuttajista vapaa ympäristö ja vapaasti ruokaa ja juomavettä. Kaksikymmentäneljä tuntia virtsanäytteet kerättiin metaboliahäkkeihin, jossa vain vettä, mutta ei ruokaa annettiin. Instituutioannissa Animal Care ja käyttö komitean Pekingin unionin Medical College Hospital erikseen hyväksy tätä tutkimusta ja käyttöä rottia. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

perustaminen DMBA-indusoidun PC rotissa

DMBA-indusoitu PC kautta luotiin vuonna uros- SD-rottia mukaan edellisessä menetelmä [14]. Kaikkiaan 75 rottaa jaettiin kokeellisia, ohjaus ja huijausta ryhmiä. DMBA tai NaCl kiteitä (5 mg) käytettiin rottia koe- ja kontrolliryhmissä, vastaavasti, kun taas mitään ainetta sovellettiin huijausta ryhmässä. Koe- ja kontrolliryhmissä, rottia tapettiin 7 päivää, 2 viikkoa, 1 kuukausi ja 3 kuukautta istutuksen jälkeen. Viisi rottaa lumeryhmä tapettiin 1 kuukausi. Ryhmittely kaikki rotat on esitetty taulukossa 1.

RNA uuttaminen ja Microarray Analysis

Kokonais-RNA uutettiin -80 ° C pakastetut haiman kudosnäytteitä kerätään kaikkina ajankohtina käyttäen RNeasy mini -kittiä (Qiagen, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA näytteen konsentraatio ja puhtaus tutkittiin ja arvioitiin optisen tiheyden mittauksia 260/280 nm: ssä käyttäen NanoDrop Spektrofotometri ja agaroosigeelielektroforeesilla. Yksityiskohtaiset mittaustiedot ja laadun arviointi on esitetty taulukossa 2. SuperScript II käänteistranskriptio (Invitrogen, USA), GeneChip- Kit (Affymetrix, USA) ja One-Cycle Target merkintöjen ja valvonnan reagenssit (Affymetrix) käytettiin myös analyyseissa . Hybridisaatio suoritettiin käyttäen GeneChip Rat Expression Set 230 (Affymetrix), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Geenien ilmentyminen analyysit suoritettiin käyttäen Affymetrix Rat Genome 230 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Sekvenssejä käytetään suunnittelussa array valittiin GenBank, dbEST ja RefSeq. Gene siru 230 A sisältää yhteensä 15166 koetinsarjojen edustavat noin 4700 tunnettujen rotan geenit ja 10460 annotoimaton ilmenevän geenin osiksi. Hakunumerolla GEO on GPL1355.

Quantitative Reverse-transkriptio polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen SuperScript II käänteistranskriptio (Invitrogen, USA). TaqTM R-PCR SYBR Green I (Takara, Tokio, Japani) käytettiin PCR: ään. Monistaminen vaiheet olivat seuraavat: 95 ° C 30 s (pre-denaturaatio), ja 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 61 ° C: ssa 31 s. Beta-aktiini nimettiin sisäisen valvonnan. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. Alukkeita luetellaan taulukossa 3.

immunohistokemia ja Värjäys arviointi

Vasta-aineita CXCR7 ja UBe2c ostettiin lomakkeen R 0,05.

Tulokset

onnistunut perustaminen DMBA-indusoidun PC rotissa

Akuutti haimatulehdus havaittiin rotilla (7 päivää istutuksen jälkeen) sekä koe- ja kontrolliryhmissä. Haiman intraepiteliaalisten neoplasia (Panin) oli läsnä 6 ulos 15 rotat (40%) koeryhmässä 2 viikon kuluttua istutuksen, kun taas mitään PC todettiin rotilla kontrolliryhmässä. Yksi kuukausi ja 3 kuukautta istutuksen jälkeen, 12 ulos 15 (80%) ja 14 ulos 14 (100%) rottia koeryhmässä vastaavasti kehitetty PC (Fig. 1A, 1 B). Neljä rottia 3 kk ryhmä kehitti ohutsuolen etäpesäke tai maksan etäpesäke (Fig. 1 C, 1D). Kuitenkin, PC oli poissa rotilla kontrolliryhmiin. PC muodostamisnopeudella koeryhmässä oli korkeampi kuin kontrolliryhmässä (

P

0,05). Yksi rotta kuoli ennen päätepistettä (3 kk), joka aiheuttaa kuolleisuus oli 6,7% (1/15).

(A) Haiman kasvain 1 kuukauden ryhmä. (B) Haiman kasvain 3 kuukauden ryhmään. (C) Ohutsuoli etäpesäke kyhmyt haiman kasvain. (D) Maksa etäpesäke kyhmyt haiman kasvain.

histologisia muutoksia arvioitiin käyttäen HE värjäystä ja valomikroskoopilla. Normaali haima (Fig. 2A), akuutti haimatulehdus (Fig. 2B), krooninen haimatulehdus (Fig. 2C), Panin 2a (Fig. 2D), Panin 2 (Fig. 2E), Panin 3 (Kuva. 2F), hyvin eriytetty PC (Kuva. 2G) ja huonosti eriytetty PC (Fig. 2 H) havaittiin.

(A) Normaali haima (alkuperäinen suurennos x 60). (B) Akuutti haimatulehdus (alkuperäinen suurennos x 150). (C) Krooninen haimatulehdus (alkuperäinen suurennos x 150). (D) Panin 1a (alkuperäinen suurennos x 60). (E) Panin 2 (alkuperäinen suurennos x 150). (F) Panin 3 (alkuperäinen suurennos x 60). (G) Hyvin eriytetty PC (alkuperäinen suurennos x 60). (H) Huonosti erilaistunut PC (alkuperäinen suurennos x 60).

ilmennetty eri geenejä rotan DMBA-indusoidun PC Malli

yhteensä 661 differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin normaalissa haima kontrolliryhmään ja koeryhmään (taulukko 4). Mukaan GO luokitus, geenit olivat mukana erilaiset toiminnalliset ryhmät ja useita biologisia prosesseja, kuten kaasun siirtoa, hiilihydraatti aineenvaihduntaa, antigeenin käsittely ja esittäminen (Fig. 3A). By kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi analyysi, normaali haima, akuutti ja krooninen haimatulehdus, Panin ja varhainen ja kehittyneen haimasyövän näytteet täysin syrjitty (Fig. 3B). Oli 11 voimistunut geenejä (koetin) ja 142 vaimentua geenit (koetin) Mann-Kendall trendi Monotone testi (

P

0,05) (Fig. 3C). Top 20 voimistunut ja vaimentua geenien DMBA 3 kuukautta ryhmä, jonka ekspressiotasoja muuttivat kaksinkertaiseksi verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,01) on esitetty taulukossa 5. Lisäksi homologiset geenit rotan ja ihmisen eri vaiheissa rottamallissa onnistuneesti seulottiin (taulukko 6, Fig. 3d).

(A) GO luokitus osoittaa geenien eri molekyyli- funktioluokista. (B) Kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi analyysi. (C)

P

arvot Mann-Kendall trendi Monotone testi. (D) homologiset geenit rotan ja ihmisen eri vaiheissa rottamallissa.

validointi ilmentyvät eri geenien

Valitsimme kolme differentiaalisesti ilmentyvien geenien, CXCR7, ATP6v1g2 ja UBe2c, jatkotutkimuksiin. Ensiksi, tutkimme niiden ilmaisun profiileja qRT-PCR. ACt arvot CXCR7 vähitellen laski, yhdessä pitkäaikaisen DMBA hoito (

P

0,05) (taulukko 5), mikä osoittaa upregulated ilme. Ei ollut merkittäviä eroja ATP6v1g2 ja UBe2c (

P

0,05) (taulukko 7). Käyttämällä immunohistokemia kautta patologi diagnoosi ja vahvistuksen, merkittävästi parannettu CXCR7 ja UBe2c ilmaisun havaittiin yhdessä etenemistä PC rotilla (

P

0,05) (taulukko 8, kuviot. 4).

(alkuperäinen suurennos x 200). (A), (C) Normaali rotan haima, HE värjäystä. (B), (D) rotan PC, HE värjäystä. (E), (G) Normaali rotan haima, CXCR7 immunohistokemia värjäytymistä. (F), (H) Rat PC, Ube2c immunohistokemia värjäystä.

Vähentynyt Migration ja Invasion jälkeen transfektointi CXCR7 siRNA in PANC-1 ja SU86.86 solulinjat

Expression of CXCR7 onnistuneesti vaimentua kahdessa ihmisen PC solulinjoista, PANC-1 ja Su86.86 (Fig. 5A), transfektion jälkeen CXCR7 siRNA, verrattuna transfektion ohjaus siRNA. Merkittävät erot solumigraatioon ja invaasio havaittiin CXCR7 siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna kontrolliin soluihin (P 0,05) (kuviot. 5B ja 5C).

(A) knockdovvn CXCR7 siRNA transfektiolla. (B) Migration transfektion jälkeen CXCR7 tai valvonnan siRNA. (C) Invasion transfektion jälkeen CXCR7 tai valvonnan siRNA.

Keskustelu

Various muutoksia molekyyli polkuja tiedetään olevan tärkeä rooli taudin alkamisen ja etenemisen PC [1 ]. Kuitenkin yksi komplikaatioita perustuvissa tutkimuksissa ihmisnäytteillä on, että on kunkin taudin vaiheeseen ei voida helposti näy. Tässä suhteessa eläimen malleissa on ainutlaatuinen etu. Alalla PC tutkimuksen, suuret mallit ovat olleet DMBA aiheuttama ja siirtogeeniset mallit [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [22]. Tutkimuksissa on DMBA-indusoidun rotan mallissa eri DMBA annoksia ja hinnat PC kehitys on raportoitu [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Nykyisessä tutkimuksessa, joka perustui meidän aiemmin raportoitu menetelmä [14], saavutetaan tyydyttävä PC induktio tuloksia. Siksi nämä tulokset osoittavat perustamisen onnistuminen mallin.

mikrosirut ovat laajalti käytössä seulonnassa erilaisesti ilmaistu geenien PC [23], [24], [25], [26]. Kuitenkin, tämä tekniikka ei ole käytetty DMBA-indusoidun PC malli. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin geeniekspressioprofiili tässä PC rottamallissa. Affymetrix mikrosiruanalyysi tunnistettiin yhteensä 661 geeniä, jotka ovat differentiaalisesti ilmentyy normaaleissa haima kontrolliryhmään ja koeryhmään. Nämä geenit sisältyvät kriittiset edesauttanutta tärkeiden toimintojen aikana haiman tuumorigeneesin [27], kuten Kras, CDKN2A, Smad4, ja TP53. Nämä geenit upregulated tai vaimentua aikana haiman kasvainten muodostumisen kesto. GO luokitus, kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi analyysi ja Mann-Kendall suuntaus Monotone testi määritettiin lisää geenejä, mukaan lukien nm23, sykliini B1 ja FGFR3. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että nm23 liittyi metastaattista potentiaalia ihmisen PC solulinjojen [28]. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että nm23 ilmentyminen oli merkitsevästi erilainen normaali haima ja DMBA 1 kuukausi ryhmä, mikä viittaa siihen, että molekyyli voi myös olla mukana alkuvaiheessa patogeneesin PC. Vähän tietoa on saatavilla koskevat roolit sykliini B1 ja FGFR3 PC [23], [29]. Näin täällä, tarjoamme lisäksi todisteita siitä, että perustelee niiden osallistuminen tähän tautiin. Lisätutkimukset yksityiskohtaisiin mekanismeista niiden osallistumista PC tarvitaan.

Expression malleja kolme eri tavalla ilmaistuna geenejä, CXCR7, ATP6v1g2 ja UBe2c, arvioitiin qRT-PCR ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tulokset osoittivat vähitellen voimistuvan CXCR7 ilmaisu mRNA-tasolla, ja tehokkaita myönteisiä ilmaus CXCR7 ja UBe2c sekä pitkäaikainen DMBA hoitoon. Nämä havainnot enimmäkseen seurannut microarray data. CXCR7 aiemmin osoitettu olevan vaikutusta kasvuun, apoptoosin, invaasio /etäpesäke ja ennusteen monissa syövissä [30], [31], [32], [33]. Tuore tutkimus osoitti, että CXCR7 edistetään solujen kasvua PC [34]. Kuitenkin sen ennustetekijöiden merkitys PC yhä kiistanalainen [35], [36]. Rottamallissa ja ihmisen solulinjoja käytettiin kokeissa, yhdistys CXCR7 ja etenemisen sekä invasiivisia taipumus PC osoitettiin. Siksi edelleen mekanistinen tutkimukset molekyylitason tekijöitä PC arvoinen ovat aiheellisia.

UBe2c perustettiin liittyvän kasvun ja apoptoosin esto syöpäsoluissa, mikä pelissä rooli kasvainten synnyssä ja osoittaa potentiaalia olla biomarkkereiden sekä diagnoosi ja prognoosi [37]. Kuitenkin, UBe2c ei aiemmin tutkittu PC. Tässä tutkimuksessa, löysimme tehostettu positiivinen ilmaus UBe2c yhdessä pitkäaikainen DMBA hoitoon, mikä viittaa sen mahdollisen roolin etenemistä PC. Erityisesti UBe2c mRNA ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi, mikä osoittaa, että jälkeinen transkription sääntely saattaa liittyä muutoksia sen ilmaisun. Yksityiskohtaiset mekanistinen tietojen taustalla aktivointi vaaditaan.

Yhteenvetona tietomme löydetty useita mahdollisia merkkiaineiden PC perustuvat kattavaan seulontaa ja muita tarkastuksia.