Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-syöpäsolujen fosforyloitu proteiineja olemassa ohimenevästi, tulossa de-fosforyloitiin erityisiä fosfataasien jotka päättyvät eteneminen signalointireittien. Vuonna syöpiä, vaarantunut fosfataasiaktiivisuus ja /tai ilmentymisen tapahtua ja edistää kasvaimen fenotyypin. Ei-reseptori-fosfataasin, PTPN13, on viime aikoina kutsuttu oletetun tuumorisuppressori. Se laski ilmentyminen rintasyövässä korreloi pieneni eloonjäämiseen. Tässä osoitamme, että PTPN13 säätelee uuden signaalikompleksin rintasyövässä koostuu ErbB2, Src, ja EphrinB1. Tietääksemme tämä signalointikompleksiin ei ole aikaisemmin kuvattu. Samanaikainen immunosaostus ja lokalisointi tutkimukset osoittavat, että EphrinB1, joka on PTPN13 alustaan, vuorovaikutuksessa ErbB2. Lisäksi onkogeenisen V660E ErbB2-mutaatio parantaa tämän vuorovaikutuksen, mutta Src välittää EphrinB1 fosforylaation ja myöhempää MAP Kinase signalointia. Vähentynyt PTPN13 toiminto lisää entisestään signalointi. Yhdistyksen onkogeenin kinaasien (ErbB2, Src), signalointi transmembraani- ligandia (EphrinB1) ja fosfataasi tuumorisuppressori (PTPN13) viittaavat siihen, että EphrinB1 voi olla merkityksellinen terapeuttinen tavoite rintasyöpiä kätkeminen ErbB2-aktivoivia mutaatioita ja laski PTPN13 ilmaisua.

Citation: Vermeer PD, Bell M, Lee K, Vermeer DW, Wieking BG, Bilal E, et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, Src ja PTPN13 signalointikompleksiin säätelee MAP kinaasisignaloinnin ihmisen syövissä. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10,1371 /journal.pone.0030447

editori: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Kanada

vastaanotettu: 04 elokuu 2011; Hyväksytty: 16 joulukuu 2011; Julkaistu: 18 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Vermeer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat 7R01DE018386-03 National Institutes of Health /National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus ja valtion Etelä-Dakota Translationaalinen Cancer sub-palkinnon 3SB161. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ErbB2 (Her2) vahvistus /yli-ilmentymisen esiintyy 20-30% rintasyövistä seurauksena aggressiivinen kasvain käyttäytymisen ja huonon ennusteen [1], [2]. ErbB2 aktivointi hetero-dimerisaatio muiden perheenjäsenten tai homo-dimerisaatio itsensä kanssa (kun ekspressoidaan korkeilla tasoilla) aloittaa solunsisäisiä signaaleja, jotka kulminoituvat monien geenien transkription säätelemiseksi lisääntymistä, eloonjääntiä, erilaistumista, invaasio ja metastaasi. Tällä tavoin ErbB2 avainasemassa orchestrating aggressiivisen rintasyövän ominaisuuksiin [3]. Eteneminen kohdennettujen hoitomuotojen, kuten trastutsumabi, joka on humanisoitu anti-ErbB2-vasta, eloonjäämistä Her2 rintasyöpäpotilaiden [4], [5]. Kuitenkin useimmat potilaat eivät reagoi trastutsumabille (62-74%), kätkeminen

de novo

vastarintaa; ne, jotka eivät vastaa hyötyä suuresti lisääntynyt todennäköisyys elossa viiden vuoden tai jäljellä kasvainta. Valitettavasti 25% näistä alunperin vastaaville potilaille myöhemmin epäonnistua hoitoa [6] – [9]. Kuten

de novo

vastus, johtavia reittejä hankittu trastutsumabille vastuksen edelleen epäselviä [10], [11]. Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut ymmärtämisessä rooli ErbB2 rintasyövän taudin alkamisen ja etenemisen, ylivoimainen vastus trastutsumabille hoito viittaa siihen, että ylimääräinen signalointi polkuja olemassa, jotka kiertää ErbB2-vasta-välitteisen saarto. Luonteenomaiset Näitä reittejä ja, mikä tärkeintä, proteiineja, jotka käynnistävät ne, määrittelee uusia kohteita terapeuttiselle interventiolle jotka voivat uudelleen herkistää Her2 potilaiden trastutsumabille ja parantaa selviytymistä.

Lisäksi vahvistus /yli-ilmentymisen, polymorfismit in ErbB2 kodonissa 655 (sisällä transmembraanidomeeni) liittyvät lisääntynyt rintasyövän kehitystä joissakin populaatioissa, mikä viittaa siihen, että muutokset ErbB2 koodaava sekvenssi voi olla myös toiminnallista seuraukset liittyvät syöpään [12] – [14]. ErbB2 koodaussekvenssit voivat vaikuttaa järjestöjen kanssa kumppanin proteiinien ja siten vaikuttaa ErbB2 välittämän solunsisäisen signaloinnin. Siten kuten trastutsumabi vastus, tunnistaa nämä reitit ovat kriittisiä määriteltäessä hoitoja, jotka estävät tai kiertää niitä, parantaa selviytymistä.

Vaikka hallitseva pro-onkogeenisiä Toimivat kuten kuvattiin ErbB2 kinaasi rintasyövän esiintyy usein kiinteässä kasvaimia, muutokset fosfataasien ikään esiintyä ja toimivat tuumorisuppressoreilla. Esimerkiksi, ei-reseptoriproteiinityrosiinikinaasien fosfataasi, PTPN13 (tunnetaan myös nimellä FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E, PTP-BL on hiiren homologi) [15] – [17] on hiljattain kutsuttu oletetun tuumorisuppressori. PTPN13 on multi-moduulin, joka sisältää fosfataasi. Sen viisi PDZ proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen domeenit välittävät yhdistysten monissa solun proteiinien ja siten, viittaavat siihen, että PTPN13 mutaatiot voivat muuttaa erilaisia ​​solutoiminnoille [18], [19]. PTPN13 mutaatiot ovat itse asiassa havaittu peräsuolen [16], pään ja kaulan [20] ja maksan syövät [17], [21]. Tärkeää on, vähentynyt PTPN13 ilmentyminen rintasyövässä korreloi vähentynyt eloonjäämiseen [22]. Lisäksi olemme aikaisemmin havainneet, että vähentynyt PTPN13 ilmaisu synergizes aktivoitu ErbB2 transmembraani- mutaatio (mNeuNT) lisätä kasvaimen kasvua ja invaasiota

in vivo

[23]. Vaikka ihmisillä vahvistus /yli-ilmentymisen ErbB2 on onkogeenisten, eläimille aktivoivat transmembraani- ErbB2 mutaatioita tarvitaan kasvaimen kasvua. Siten meidän

in vivo

hiirikokeissa joutua käyttämään mNeuNT, konstitutiivisesti aktiivinen transmembraani- ErbB2 mutaatio. Kuitenkin havainto, että ihmisen ErbB2 polymorfismit voivat vaikuttaa rintasyövän esiintyvyys ehdottaa, että tutkimusta läpäisevien aktivoivia ErbB2 mutaatioita eläimillä (ilman vahvistusta /yli-ilmentyminen) saattaa osoittautua hyödylliseksi yhteydessä ihmisten sairauksien. Vaikka tutkimus Zhu

et al.

Ehdottaa, että PTPN13 säätelee ErbB2 toiminto suoraan de-fosforyloimalla ErbB2 signaali verkkotunnuksen [24], emme ole havainneet, että meidän järjestelmä viittaa siihen, että PTPN13 ja aktivoitu ErbB2 yksinään ei voi tili parannetun loppupään signalointi, kasvaimen kasvua ja invaasiota meidän julkaistuissa tutkimuksissa [23]. Siksi arveltu, että ylimääräisiä määritteet toimia oman PTPN13 /ErbB2 synergiaa havaittu. Olemme lisäksi perusteltu, että PTPN13 fosfataasisubstraattitablettia kanssa signalointi kapasiteetti voi olla yksi tällainen ehdokas molekyylin. Näin ollen, olemme analysoineet EphrinB1 [25].

EphrinB1 kuuluu perheeseen ligandeja, jotka sitovat ja aktivoivat Eph-reseptorin tyrosiini- kinaasien. Efriini ligandit ovat ainutlaatuisia, sitovat ja aktivoivat signaloinnin sukulaisamideillaan reseptorit, ja itse tulossa fosforyloituu ja aloittamaan oman signalointikaskadien. Tämä Efriini erityispiirre on nimeltään ”käänteinen” signalointi. ”Reverse” signalointi seuraavan Ef reseptorin sitoutuminen muodostaa perinteisen signalointireitille. Kuitenkin Efrii- ovat irrallisia niiden yhdistysten ja signalointi tapahtuu seuraavat ei-Ef reseptorivuorovaikutuksiin [26], [27]. Tämäntyyppinen Efriini signalointi on kuin perinteistä.

Koska EphrinB1 on fosfataasisubstraattiliuos on PTPN13, vähentynyt PTPN13 ilmaisu tai toiminnallisia PTPN13 mutaatioita (jotka molemmat esiintyvät kiinteitä kasvaimia) todennäköisesti johtavat kasvaneeseen EphrinB1 fosforylaatioon ja myöhemmät signalointia. Yhteydessä rintasyövän jossa vähentynyt PTPN13 ilmaisu korreloi huono selviytyminen, määritellään polut aktivoituvat puuttuessa PTPN13 voi tunnistaa kriittisiä kohteita terapeuttiselle interventiolle ja parantaa selviytymistä. Niinpä arveltu, että synergiaa lasku PTPN13 ja lisääntynyt ErbB2 aktivointi, joka ajaa kasvaimen kasvun ja invaasion välittyy kautta EphrinB1, ja lisäksi, että EphrinB1-välitteistä signalointia parannettu rintasyöpiä, joilla on heikentynyt PTPN13 ilme. Tässä kuvaamme uudenlainen yhdistyksen välillä ErbB2 ja EphrinB1. Expression of aktivoitu ErbB2 mutantti tai yli-ilmentyminen villityyppisen ErbB2 (kuten Her2 rintasyöpiä) sekä vähentynyt PTPN13 ilmentymistä tai toimintaa, ei vain vahvistaa kompleksin muodostumisen vaan myös johtaa EphrinB1 fosforylaatioon ja niihin liittyvien alavirran signalointia. Tässä raportissa, me kuvaamaan tätä monimutkaista, välitetyt signaalit siitä, ja sen merkitys rintasyövän. Lisäksi osoitamme, että tämän monimutkaisen on olemassa muilla epiteelisolujen ja viittaavat siihen, että signalointi kompleksista näyttelee toiminnallista roolia muissa kiinteiden kasvainten samoin.

Tulokset

PTPN13 Loss tapahtuu epiteelisyövissä

vähentynyt PTPN13 ilmaisu korreloi vähentynyt eloonjäämiseen rintasyövässä [22]. Mietimme, onko tämä korrelaatio esiintyneitä kaikenlaisia ​​rintasyöpiä tai jos se oli tarkoitettu tiettyyn alatyypin. Niinpä olemme analysoineet geeniekspressiovektoria matriisin 200 alkuvaiheen rintasyöpiä ja 7 normaalia rintojen näytteitä PTPN13 erityistä huomiota alatyypin spesifisyyden. Vaikka Her2, Luminal A, Luminal B rintasyöpiä ja normaalin rintakudoksen näytteitä näihin suhteellisen suuria PTPN13, pohjapinta-like (BL) kasvaimet ilmentävät huomattavasti vähemmän PTPN13 mRNA: ta (kuvio 1A, p = 0,00044 pohjapinta vs. normaali). Vertailuja muihin alatyyppeihin normaalin rintojen eivät olleet merkittäviä. Vaikka PTPN13 mRNA-tasot Her2, Luminal A ja Luminal B rintasyöpiä ei ole erilainen kuin normaali rinta, tiedot eivät poista sitä mahdollisuutta, että PTPN13 toiminnallisia mutaatioita esiintyy näitä alatyyppejä, jotka voivat johtaa fenotyypin samanlainen kuin sen puuttuessa.

(A) Suhteellinen PTPN13 mRNA ilmentymistä PTPN13 vuonna molekyyli- tunnettu rintojen kasvaimia. Basal-like (BL) rintasyöpä PTPN13 ilmentyminen väheni suhteessa normaaliin rintojen (p = 0,00044 pohjapinta vs. normaali). (B) Western blot analyysi rintasyövän solulinjoissa. MDA-MB231, MDA-MB468, HCC1143, HCC1954 ovat rintasyöpä solulinjat BL rintasyöpä ominaisuudet. BT474 solulinja on Her2 /ErbB2 yli-ilmentävät rintasyöpää ominaisuudet. MCF7 ja T47D ovat rintasyöpä solulinjoissa luminaaliselle ominaisuuksia. HEK293-solut yli-ilmentävät PTPN13 toimi positiivisena kontrollina. (C) BL rintasyövän solulinjat MDA-MB231 ja MDA-MB468, jotka ekspressoivat matalia tai korkeita PTPN13, vastaavasti, analysoitiin western-blotilla. (D) HEK293-soluissa stabiilisti tippuu alas varten EphrinB1 (sh EphrinB1) tai kontrolli analysoitiin western blot. (E) MDA-MB468-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti, jossa shRNA plasmidin kohdistaminen PTPN13 (shPTPN13) tai ei-äänenvaimennusjärjestelmiä shRNA konstrukti (Non-hiljentämisen) ja analysoitiin western blot varten ilmoitettu proteiineja. (F) HaCaT soluja, ihmisen keratinosyyttisolulinjaa, ja UM-SCC84 soluihin, HPV-negatiiviset pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjassa, vakaasti tippuu alas varten PTPN13 (sh PTPN13) tai ohjauslinjat analysoitiin western blot. (G) HaCaT solut stabiilisti tippuu alas varten PTPN13 (sh PTPN13) tai yli-ilmentävät HPV16 E6 proteiini (PHV16 E6) tai kontrolli analysoitiin western blot fosforyloidun EphrinB1, fosforyloitu Erk1 /2, yhteensä Erk1 /2, ja GAPDH.

tutkittiin myös PTPN13 proteiinin ilmentymistä alatyyppi on määritelty rintasyövän solulinjat [28]. Vaikka PTPN13 ilme vaihteli solulinjat, kolme neljästä on BL testatuista solulinjoista esillä lähes poissa PTPN13 proteiinia (kuvio 1 B). BL kasvaimet käsittävät heterogeeninen ryhmä syöpiä, mutta yleensä aggressiivisia kasvaimia, joilla on huono ennuste [29]. Siten meidän havainnot ovat yhtäpitäviä Revillion

et al

vastaavuusvaihe laski PTPN13 ilmaisun ja huono kokonaiselossaolo [22]. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että menetys PTPN13 ilmaisun vaikutuksia kasvaimen fenotyypin ja viittaavat siihen, että PTPN13 on rooli säätelyssä epiteeliproliferaation, muuttoliike ja /tai hyökkäyksen BL rintasyöpä.

PTPN13 menetys kasvaa fosforyloitu EphrinB1 ja Erk1 /2

PTPN13 viisi PDZ verkkotunnuksia välittävät yhdistysten monien proteiinien, kuten EphrinB1 [19]. Sitoutumisen PTPN13 de-fosforyloi EphrinB1 sulkien käänteinen signalointi [18], [19]. Testata vaikutukset pienenivät /menetetty PTPN13 on EphrinB1 fosforylaation, tutkimme kahta BL rintasyövän solulinjoissa: MDA-MB231, jotka ilmentävät lähes huomaamaton PTPN13 proteiinia, ja MDA-MB468, jotka ilmentävät endogeenista PTPN13-proteiinia (kuvio 1 B). Kuten odotettua, pieni PTPN13 ilmaisu (MDA-MB231) korreloi lisääntynyt EphrinB1phosphorylation kun endogeenisen PTPN13 ilmaisu (MDA-MB468) korreloi alhaisen fosfo-EphrinB1 (kuvio 1 C). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä EphrinB1 ollessa PTPN13 fosfataasin substraattia, ja viittaavat siihen, että vähentynyt PTPN13 ilmentyminen BL rintasyövän solulinjat lisää fosforylaation EphrinB1.

Koska EphrinB1 n kyky signaloida, olemme edelleen kysytään fosforyloitiin EphrinB1 korreloivat lisääntynyt loppupään signalointi. Molecular analyysi BL rintakarsinoomissa osoittaa, että monet geenituotteiden BL klusterin liittyy MEK /Erk aktivointia, jolloin päätimme analysoida fosforylaation tilan Erk1 /2 näissä BL solulinjoissa [30] – [33]. Huomasimme, että vähentynyt /poissa PTPN13 ilmaisu (MDA-MB231) korreloi lisääntynyt fosforylaatiota Erk1 /2 (kuvio 1 C); vaikka endogeeninen PTPN13 ilmaisu (MDA-MB468) korreloi vähentynyt Erk1 /2 fosforylaatio. Nämä tiedot viittaavat siihen, että EphrinB1 aktivointi (fosforylaatio) signaaleja MAP Kinase kautta. Tämän testaamiseksi me vakaasti tippuu alas EphrinB1 HEK293-soluissa, jotka on valittu johtuen niiden helppous transfektion suhteessa rintasyövän solulinjoissa. Knock-down of EphrinB1 johtaa näkyvästi vaimennus fosforyloidun Erk1 /2 (kuvio 1 D) yhdenmukaisia ​​EphrinB1 välittämää Erk1 /2 aktivointi. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että puuttuminen PTPN13 tulokset tiiviimpään EphrinB1 aktivointia ja samanaikaista Erk1 /2 fosforylaation.

Koska uuden testin, endogeeninen PTPN13 oli lyhytaikaisesti tippuu alas MDA-MB468-solut (shRNA välittämä , shPTPN13). Ennustetusti PTPN13 knock-down lisääntynyt fosforylaatioon EphrinB1 sopusoinnussa PTPN13 sääntelyä EphrinB1 fosforylaation (kuvio 1 E) [25]. Lisäksi lisääntynyt EphrinB1 liittyy ErbB2 lysaateista shPTPN13 soluista viittaa siihen, että fosforyloitu EphrinB1 osakkuusyritysten helpommin ErbB2 verrattuna fosforyloitumaton EphrinB1. Yllättäen PTPN13 knock-down ei vaikuttanut Erk1 /2 fosforylaation, mikä viittaa siihen, että joko EphrinB1 ei signaloida MAP Kinase väylän MDA-MB468-soluja tai että sen signalointi moduloidaan näissä soluissa kautta ylimääräisiä (vielä määrittelemätön) komponentteja.

Edellinen yrityksistä laboratoriossamme yliekspressoivat PTPN13 ovat hävinneet sen lisääntynyt ilmentyminen johtaa solukuolemaan, mikä rajoittaa kykyämme analysoida sen loppupään vaikutuksia [34]. Siksi emme voineet testata vaikutukset yli-ilmentävien PTPN13 MDA-MB231-solut, joista puuttuu endogeeninen ilme. Ottaen kuitenkin huomioon sen vaikuttaa edullisesti EphrinB1 fosforylaatioon rintasyöpäsoluissa, me arveltu, että vähentäminen PTPN13 ilmentyminen tai toiminta voi olla yhteinen ja, mikä tärkeintä, keskeinen muutos muissa epiteelisyövissä. Voit testata tätä käsitettä, koputimme alas PTPN13 ihmisen keratinosyyttisolulinjaa (HaCaT solut) ja analysoitiin sen vaikuttaa signaaliajan. Vähentynyt PTPN13 ilmaisun todellakin parannettu EphrinB1 ja Erk1 /2 fosforylaation (kuvio 1 F, HaCaT). Samoin knock-alas PTPN13 pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjassa, UM-SCC84, lisännyt EphrinB1 ja Erk1 /2 fosforylaation (kuvio 1 F, UM-SCC84). Tärkeää on, aiemmat tutkimukset keskittyivät ihmisen papilloomaviruksen (HPV) -associated pään ja kaulan alueen syövät osoittavat, että HPV16 E6 onkoproteiini sitoo ja tavoitteet PTPN13 hajoamiselle [34], [35]. Täten HPV-positiivisten solujen toimi ylimääräisenä testi funktio PTPN13 vuonna solusignalointi yhteydessä

viruksen

-välitteistä syöpä. Niinpä olemme analysoineet aiemmin tunnettu hiiren nielurisojen epiteelisolujen vakaasti ilmaisu HPV16 E6- tai niitä vakaasti tippuu alas varten PTPN13 [34], [35]. Todellakin, HPV16 E6 ilme tehostetun EphrinB1 ja Erk1 /2 fosforylaatio, sopusoinnussa vähentynyt /menetetty PTPN13 ilme. Lisäksi knock-alas PTPN13 hiiren nielurisojen epiteelisolujen osoitti samanlainen vaikutus (shPTPN13, kuva 1G). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vähentynyt PTPN13 ilmentyminen parantaa EphrinB1 ja Erk1 /2-fosforylaation epiteelisoluissa. Havainto, että suuren riskin HPV virukset ovat kehittyneet mekanismi poistaa solujen PTPN13, edelleen korostaa PTPN13 sääntelytehtävistä kriittinen solun signalointireitteihin. Tiedot viittaavat siihen, että PTPN13 ilmentyminen voi olla mielenkiintoista arvioida monilla, ellei kaikissa, kiinteät kasvaimet.

ErbB2 co-immunosaostumissa ja lokalisoituu EphrinB1

Edellä olevat tiedot viittaavat siihen, että vähentynyt /menetetty PTPN13 lisää EphrinB1 aktivointi joita voidaan sitten moduloida alavirtaan fosforylaatiota Erk1 /2. Meidän laboratorio on aiemmin osoittanut, että vähentynyt /menettänyt PTPN13 synergoi ErbB2, voimistamaan MAP kinaasisignaloinnin [23]. Niinpä pohti EphrinB1 fosforylaation ja tuloksena Erk1 /2 signalointi tapahtuu ErbB2-välitteisen, ei-tavanomaisella tavalla. Siksi kysyimme EphrinB1 kumppaniaan ErbB2 ja valmistunut rasaostamalla ja kolokalisaation tutkimuksia. Olemme havainneet, että EphrinB1 ja ErbB2 co-sakka (kuvio 2A) lysaateista peräisin rintasyövän solulinjoissa sekä HaCaT-soluja. Mielenkiintoista, knock-alas PTPN13 vuonna HaCaT soluissa (shPTPN13) tehostettu avattava of EphrinB1 ErbB2, jälleen viittaa siihen, että fosforyloitu EphrinB1 osakkuusyritysten helpommin ErbB2 kuin fosforyloitumaton tilassa. Lisäksi kaikissa tapauksissa monenlaisen EphrinB1 purettiin ErbB2 (kuvio 2A nuolet). Me spekuloida nämä bändit edustavat erilaisia ​​fosforyloituu muodoissa, ehdottivat Xu

et al

. Heidän tutkimuksessaan, mutaatio EphrinB1 tyrosiinitähteiden johtaa tiettyyn menetys EphrinB1 bändejä viittaa siihen, että nauhojen ilmeistä western blot edustavat fosforyloitua muotoja proteiinia [36]. Vaihtoehtoisesti bändit voivat edustaa glykosyloimattoman tai huonontunut EphrinB1 ehdottivat Makarov

et al

[37]. Vaikka identiteetti näillä taajuuksilla on määrittelemätön tässä tutkimuksessa eri EphrinB1 vasta todentaa sen samanaikainen immunosaostus ErbB2 (tuloksia ei ole esitetty). Tärkeää on, vaikka vaihtelevia määriä ErbB2 purettiin kaikissa lysaatit testattu (sopusoinnussa niiden eri ErbB2 ilmaisun), saman määrän EphrinB1 liittyi siihen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että on olemassa raja määrään EphrinB1 joka assosioituu ErbB2; lisää ErbB2 ilmaisua ei johda lisääntyneeseen EphrinB1 -alueella. Nämä tiedot viittaavat siihen, että vuorovaikutus on tarkoin säädeltyä.

(A) Western blot-analyysi ihmisen keratinosyyttisolulinjaa, HaCaT solut (kontrolli sekä soluja tippuu alas varten PTPN13), ja rintasyövän solulinjoissa ( MCF7, BT474, HCC1953) immu- (IP) ErbB2 ja immunoblotattu (IB) varten EphrinB1. Kalvo uudelleen testattiin ErbB2. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B)

En face

konfokaali kuvia HaCaT solujen immunolocalizing pinta ephrinB (vihreä) ja yhteensä ErbB2 (punainen). Ytimet vastavärjätään DAPI (sininen). Mittakaava 20 um. (C) Western blot analyysi rintasyövän solulinjoissa: T47D, BT474 ja MCF7. (D) HEK293-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko villityypin PTPN13 tai C /S PTPN13 mutantti analysoitiin Western blot. (E) HEK293-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko eGFP yksinään tai yhdistelmänä EphrinB1, ErbB2 (villityypin tai mNeuNT), ja PTPN13 (villityypin tai C /S-mutantti) ja analysoitiin western blot. (F)

En face

konfokaali kuvia transfektoitu E käsitellään immunolokalisoinnissa fosforyloidun ephrinB (vihreä) ja ErbB2 (punainen). Nuclei vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittakaava 20 um.

Co-immunovärjäys endogeenisen ErbB2 ja endogeenisen, pinta ephrinB vuonna HaCaT soluissa osoittaa, että ErbB2 ja ephrinB kolokalisoituvat at solu-solu liittymissä (kuvio 2B). Surface ephrinB paikallistettiin on korjaamatta, unpermeabilized solut käyttäen EphB1-Fc. EphB1-Fc on kimeera, joka koostuu ekstrasellulaarisen alueen EphB1 reseptorin (a sukulais ephrinB-reseptori) on fuusioitu ihmisen IgG:

1. Siten EphB1-Fc sitoutuu pintaan ilmaistuna ephrinB ligandeja. Nämä yhteisvaikutukset ovat sitten detektoida käyttämällä anti-ihmis-IgG-FITC: llä ja solut analysoitiin konfokaalimikroskopialla. Siten, vaikka pinta värjäytyminen ei ole spesifinen EphrinB1alone, se viittaa siihen, että ephrinB proteiinit kolokalisoituvat kanssa ErbB2. Yhdessä immunosaostus tiedot, nämä tiedot viittaavat siihen, että EphrinB1 kumppaniaan ErbB2.

merkityksen arvioimiseksi ErbB2 /EphrinB1 vuorovaikutus rintasyövässä, me analysoida tarkemmin: BT474, Her2 (ErbB2) solulinja; T47D, joka on luminal solulinja korkean ErbB2 ilmaisun; MCF7, toinen luminal solulinja alhaisen ErbB2 ilmaisun (kuvio 1 B). Mielenkiintoista, sekä T47D ja MCF7-solut ilmentävät lähes huomaamaton PTPN13, kun taas BT474-solut ilmentävät endogeenistä PTPN13 (kuvio 1 B). Immunosaostus ErbB2 seurasi western blot-analyysi EphrinB1 näyttävät toteen tehostetun EphrinB1 yhteistyössä IP T47D-soluissa, jotka korreloivat korkeampi fosforyloidun EphrinB1. Tämä havainto on johdonmukainen aiempien tulosten mukaan fosforyloitu EphrinB1 osakkuusyritysten helpommin kanssa ErbB2. Lisäksi T47D solut osoittavat vahvaa fosforylaatiota Erk1 /2, joka oli havaitsematon BT474 ja MCF7-solut (kuvio 2C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että rintasyövän solulinjoissa alhainen /poissa PTPN13 ilmaisun, ja korkea ErbB2 ilmaisun, EphrinB1 fosforylaatio on kohonnut on sen yhdessä ErbB2 ja korreloi parannetun Erk1 /2 fosforylaatio. Tiedot viittaavat lisäksi siihen, että ei ole vaikutusta Erk1 /2 fosforylaatiota shPTPN13 MDA-MB468-soluissa (kuvio 1 E) voi johtua liian ErbB2 ilmaisun ja /tai kompleksin muodostumisen EphrinB1.

mNeuNT lisää kompleksin muodostumiseen ja signalointi

Koska ErbB2 on tyrosiinikinaasin ja EphrinB1 fosforylaatio aloittaa käänteinen signalointi, mietimme onko ErbB2 fosforyloi EphrinB1. Kun lisäksi otetaan huomioon se vaikuttaa edullisesti EphrinB1 fosforylaatioon, me arveltu, että PTPN13 säätelee tätä aktivointia. Tämän tutkimiseksi, sekä villityypin PTPN13 (PTPN13

paino) sekä fosfataasi nolla mutantin (PTPN13

C /S) testattiin. Lisäksi aiempien havainnot osoittavat, että konstitutiivisesti aktiivinen ErbB2 transmembraani- mutantti (V660E vastedes kutsutaan mNeuNT) synergoi menetys PTPN13 ja lisää MAP Kinase signalointia ja invasiivisen kasvun taas villityypin (endogeenisten) ErbB2 ei [23]. Näin ollen sekä mNeuNT ja villityypin ErbB2 (paino- ErbB2) testattiin myös. Koska niiden alhaisen endogeenisen ilmentymisen PTPN13, helppous transfektion ja vankan ilmentymisen transfektoiduissa PTPN13, HEK293-solut käytetty näihin tutkimuksiin (kuvio 2D). Näissä kokeissa HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi ErbB2 (joko villityypin tai mNeuNT), villityypin EphrinB1 ja PTPN13 (joko villityypin tai C /S-mutantti) ja analysoitiin western blot.

Ohjaus lysaatit (eGFP) osoittavat, että EphrinB1 yhteistyössä immunosaostumia ErbB2 mutta EphrinB1 ei ole fosforyloituu ja Erk1 /2 ei ole aktivoitu (kaista 1, kuvio 2E). Expression of ei villityypin (kaista 2, kuvio 2E) eikä C /S PTPN13 (kaista 4, kuva 2E) muuttaa näitä parametreja, kun läsnä on yli-ilmentynyt p- ErbB2 ja EphrinB1. Sitä vastoin ilmaus mNeuNT kanssa EphrinB1 kasvattaa paitsi määrää EphrinB1 kanssaan, mutta johtaa myös EphrinB1 ja Erk1 /2 fosforylaatiota (kaistat 3 ja 5, kuvio 2E). HEK293-solut ekspressoivat vähän endogeenista ErbB2 (tuloksia ei ole esitetty); Lisäksi anti-ErbB2-vasta hyödynnetään immuuni sademäärä tunnistaa sekä villityyppistä ErbB2 ja mNeuNT. Siten vaikka co-IP tutkimuksia ei voi erottaa EphrinB1 liittyy endogeenisen ErbB2 tai mNeuNT, tiedot tukevat vahvasti yhdistys mNeuNT. Vaikka olemme aiemmin osoittaneet, että mNeuNT ilmentyminen yksin lisää Erk1 /2-fosforylaation [23], meidän havainto, että ilmentyminen PTPN13

C /S ei kykene vähentämään EphrinB1 ja Erk1 /2 fosforylaatio, viittaa siihen, että EphrinB1-välitteisen käänteisen signalointia myös myötävaikuttaa Erk1 /2 fosforylaation (kuvio 2E, kaista 5, nuolet). Lisäksi, ekspression villityypin PTPN13 (kaista 3, kuvio 2E), mutta ei C /S PTPN13 mutantti (kaista 5, kuvio 2F), määrä vähenee fosforyloidun EphrinB1 ja P-Erk -1/2, sopusoinnussa myös EphrinB1 fosforylaation vaikuttavat MAP-kinaasi-signalointia.

Nämä biokemialliset tiedot vahvistettiin immunopaikantamisessa tutkimukset fosforyloidun ephrinB (kuvio 2F, vihreä) ja ErbB2 (kuvio 2F, punainen). Vain ilmaus mNeuNT tuloksia fosforyloidun ephrinB läsnä solun pinnalla (kuvio 2F, paneelit 3 ja 4, keltainen osoittaa ilmaisu kolokalisaation fosforyloidun ephrinB ja ErbB2). Lisäksi ainoastaan ​​villityypin PTPN13 määrä vähenee fosforyloidun ephrinB solun pinnalla (kuvio 2F, vertaa keltainen ja vihreä välillä paneelit 3 ja 4). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, 1) mNeuNT kumppaniaan EphrinB1 ja tämä yhdistys on parannettu EphrinB1 fosforylaatio, 2) fosforyloitu EphrinB1 korreloi fosforylaatiota Erk1 /2 ja 3), jotka PTPN13 de-fosforyloi EphrinB1 tässä yhteydessä.

mNeuNT yhteistyössä immunosaostumia ja aktivoi Src

ErbB2-välitteisen signaloinnin tapahtuu suoraan sen kinaasiaktiivisuuden tai sen rekrytointi Src osaksi signalointikompleksiin [38]. Lisäksi sen jälkeen, sitoutuminen sitä vastaavan Eph-reseptorin, Src fosforyloi EphrinB1 [25]. Koska sekä Villityypin ErbB2 ja mNeuNT sisältävät villityyppisen tyrosiinikinaasialueeseen, me arveltu, että tehostettu EphrinB1 fosforylaatiota ja MAP kinaasisignaloinnin ilmeistä yhteydessä väheni /menetetty PTPN13, sisältää Src. Niinpä lähdettiin alun perin, onko Src kumppaniaan ErbB2, ehdottivat kirjallisuudesta [38]. HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi villityypin ErbB2 tai mNeuNT ja testattu. Vaikka yhteistyössä IP aktivoitujen Src villityyppiseen ErbB2 oli lähes mahdoton havaita, aktivoitu Src liittyy mNeuNT (kuvio 3A). Anti-aktivoidun Src vasta-aine tunnistaa Src tyrosiini 416 (pSrc-Y416) kun fosforyloitua, sivusto, joka edistää Src-vaikutuksen [39], [40]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että mNeuNT assosioituu aktivoidun Src.

(A) HEK293-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko villityypin ErbB2 tai mNeuNT ja analysoitiin western blot. (B) HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi yhdistelmä EphrinB1, mNeuNT, ja PTPN13 (villityypin tai C /S-mutantti), käsiteltiin tai ei PP2 ja analysoitiin western blot. (C) Transfektoitumattomat HEK293-solut käsiteltiin kasvavia annoksia saracatinib ja analysoitiin western blot ekspressiota endogeenisen aktivoidun Src, yhteensä Src, fosforyloitu EphrinB1 ja immunosaostettiin EphrinB1.

Src välittää EphrinB1 fosforylaation

sekä mNeuNT ja Src ovat kinaaseja, joista kumpikin voi fosforyloida EphrinB1. Lisäksi, mNeuNT edullisesti liittää aktivoidun Src (kuvio 3A). Sen vuoksi testasimme, onko aktivoitu Src (mieluummin kuin mNeuNT) välittää EphrinB1 fosforylaatio. HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi mNeuNT, EphrinB1 ja joko villityypin tai mutantti-(C /S) PTPN13 ja analysoitiin western blot. Yhdenmukainen nämä tiedot mNeuNT yhteistyössä IP aktivoidulla Src ja EphrinB1 fosforyloituu (kuvio 3B, kaista 1); PTPN13

C /S tehostaa EphrinB1 fosforylaatiota (kuvio 3B, kaista 3). Testata rooli Src in EphrinB1 fosforylaatio, transfektoituja soluja käsiteltiin PP2, tehokas Src-estäjällä. Xu

et al

aiemmin osoitettu, että käsittelemällä 1 uM PP2 tehokkaasti estää Src-välitteisen EphrinB1 fosforylaation taas käsittely 25 uM PP2 johtaa solun irtoaminen [36]. Näin ollen tässä tutkimuksessa tehokkuuden varmistamiseksi Src inhibition, soluja käsiteltiin 10 uM PP2 lyhyen aikaa (4 tuntia). Vuonna mNeuNT, EphrinB1 ja villityypin PTPN13 transfektoidaan lysaatit, PP2 hoito vähensi aktivoitua Src liittyy mNeuNT ja vaimentaa EphrinB1 fosforylaatiota (kuvio 3B, kaista 2). Lysaatit mNeuNT, EphrinB1 ja PTPN13

C /S transfektoidut solut samalla vaikuttanut PP2 viittaa siihen, että EphrinB1 fosforylaatio sisällä mNeuNT, Src, PTPN13 kompleksi välittyy kautta Src. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Src sijaan mNeuNT, fosforyloi EphrinB1 ja edelleen tukee julkaistusta kirjallisuudesta ja omien havaintojen että PTPN13 vastaa de-fosforyloivaa EphrinB1 tämän monimutkaisen.

PP2 on Src-perheen estäjä, estämällä aktivointi Lck, Fyn, Hck ja Src. Lisäksi, kokeet suoritettiin käyttäen PP2 käytetään HEK293-solut yli-ilmentävät PTPN13, ErbB2 ja EphrinB1. Niinpä enemmän selektiivisesti estää Src ja testata sen toiminta fosforylaatiota endogeenisen EphrinB1, analysoimme myös saracatinib (AZD-0530, tällä hetkellä kliinisissä kokeissa [41] – [44]) ei-transfektoiduissa soluissa. HEK293-solut käsiteltiin saracatinib (0, 0,25 uM tai 1,0 uM) ja analysoitiin western blot. Saracatinib hoito esti menes- tyksellisesti Src aktivointi ja annos-vaste oli selvä. Lisäksi suurimmalla annoksella, oli vähentynyt määrän EphrinB1 fosforylaation (kuvio 3C) vastasi rooli Src välittämisessä EphrinB1 fosforylaatiota.

EphrinB1 immunosaostumia ErbB2 tavalla, joka ei edellytä ekstrasellulaarista tai C-terminaalista PDZ motiivi

Tuloksemme viittaavat siihen, että sääntely ErbB2 /EphrinB1 kompleksi voi välittää signaaleja tärkeää rintasyövän. Koska ErbB2 ja EphrinB1 vuorovaikutuksessa, logiikka suunnittelu pienmolekyylisalpaajien estää niiden yhdistys voi olla terapeuttista arvoa. Siten ErbB2 ja EphrinB1 mutanttia määritellä verkkotunnuksia välttämätön ja riittävä niiden -alueella.

ErbB2 sisältää kaksi suurta ekstrasellulaarista domeenia jota nimetyt ligandia sitovien domeenien 1 ja 2. ErbB2 solunulkoisen mutanttien poistetaan joko ligandisitoutumisdomeeni 1 (Δ 1-174 LBD1) tai molemmat domeenit 1 ja 2 (Δ 1-487 LBD2) tuli. ErbB2: n PDZ sitova domeeni on poistettu kolmasosa mutantti (Δ 1251-1255 PDZBD) (kuvio 4A). Kaikki ErbB2 mutantteja, mukaan lukien täyspitkät villityyppisen proteiinin, olivat HA merkitty N-terminaaliseen päähän. Rakenteet transfektoitiin HEK293-solut ja analysoitiin menetys yhteistyössä IP endogeenisen EphrinB1.