Krooninen sairaus

tiivistelmä

Salinomysiini nostetaan toivoa olevan tehokkaita syöpälääkkeiden koska sen kyky voittaa apoptoosin-resistenssi useita syöpäsoluja. Äskettäin sen tehokkuutta suhteessa ihmisen maksasolusyövän (HCC) solut sekä

in vitro

ja

in vivo

osoitettiin. Kuitenkin vaikutusmekanismi jäi epäselväksi. Viimeisimmät tutkimukset sekaantunut häiriöitä hajoamisreitit of autophagy. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää vaikutukset Salinomysiini on HCC-autophagy ja primaarisia ihmisen hepatosyyttien (PHH) samoin vaikuttaa. Altistuksen jälkeen HCC solulinjojen HepG2 ja Huh7 vaihteleviin pitoisuuksia Salinomysiini (0-10 uM), kattava analyysi autophagic aktiivisuuden käyttämällä western-blottauksella ja virtaussytometrialla suoritettiin. Lääkkeen vaikutuksia analysoitiin asetuksissa autophagy stimulaation nälkään tai PP242-hoidon ja korreloi solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen, apoptoosin induktio, mitokondrioiden massa keskittymisen ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) muodostumiseen. Vaikutus apoptoosin induktioon ja solun toiminta PHH analysoitiin.

perustamisasiakirjan ja kannustanut autophagic toiminta molemmat tehokkaasti tukahdutettiin HCC mukaan Salinomysiini. Tämä esto liittyi toimimattomia mitokondrioita kertyminen, lisääntynyt apoptoosi ja vähentynyt proliferaatio ja solujen elinkykyä. Vaikutukset Salinomysiini oli annoksesta ja ajasta riippuvaisia ​​ja voivat helposti saataisi farmakologinen ja geneettinen inhibitio HCC-autophagy yksin. Salinomysiiniä altistuminen PHH aiheutti ohimenevää synteesin toiminta ja solujen elinkelpoisuus ilman apoptoosin. Lopuksi todettakoon, että tiedot viittaavat siihen, että salinomysiini estää loppuvaiheissa HCC-autophagy, mikä heikentää kierrätystä ja kertymistä huonosti mitokondrioiden lisääntynyt ROS-tuotannon, jotka kaikki liittyvät apoptoosin induktion.

Citation: Klose J , Stankov MV, Kleine M, Ramackers W, Panayotova-Dimitrova D, Jäger MD, et al. (2014) esto Autophagic Flux Salinomysiini Tulokset syövän vaikutusta maksasolukarsinoomassa solut. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10,1371 /journal.pone.0095970

Editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2014; Julkaistu: 09 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Klose et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Heidelberger Stiftung Chirurgie ja Gesellschaft der Freunde für Chirurgie (JK), KFO 250 (GB, MVS), Rebirth EXC 62/1 (GB), ja Else Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV; 2010_A49). Tekijät myöntävät rahoitustukea Deutsche Forschungsgemeinschaft ja Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg sisällä rahoitusohjelman Open Access Publishing. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

salinomysiini (Sal) on polyeetteri antibiootti laajalti käytetty anticoccidial siipikarjassa [1] ja ravintolisä märehtijöiden ja sikojen rotu [2], [3], koska sen antimikrobisen aktiivisuuden. Äskettäin potentiaalia Sal kuin solunsalpaajaksi on selvitetty [4]. Gupta et ai. osoitti yli 100-kertainen tehokkuus Sal verrattuna paklitakseli tappaa rintasyövän kantasoluja hiirissä [5]. Myöhemmin, teho Sal kasvainsoluja vastaan ​​sai vahvistusta useissa syöpäsolulinjoissa eri alkuperää, sisältäen kiinteitä ja ei-kiinteä maligniteettien [6] – [9]. Sal edustaa myös lupaava ehdokas hoitoon sappiteiden maligniteettien kuin osoitettu HCC

vitro ja

in vivo

[10]. Olemme myös osoittaneet, äskettäin, että Sal on mahdollista rikkoa apoptoosin-resistenssin ihmisen kolangiokarsinooma (CC) soluja [11]. Kuitenkin tarkka vaikutustapa Sal kuin syöpälääkkeen on edelleen epäselvä. Useat mekanismit, kuten esto Wingless-tyyppinen (Wnt) /β-kateniinin reitin [12] tai aktivoitumista tavanomaisen kaspaasi ajettu apoptoottisia reittejä [13] on ehdotettu. Viime aikoina, uusi mekanismi vastuussa syövän vastaisen vaikutuksen Sal, joissa lääkeaineen-välitteisen muuttaminen syöpäsolun autophagic aktiivisuuden ehdotettiin. Autophagy on kierrätystä reitti säilynyt proteiineja, soluelimiin tai soluvauriot. Kasvainsoluissa autophagy oletetaan edistää eloonjäämistä. Riippuen kokeellinen järjestelmä, joko estäminen [14] tai aktivointi [15] – [17] Sal tämän solun hajoamisreitit on raportoitu.

Näin Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli todentaa syöpälääkkeen ominaisuudet Sal koskevat HCC ja valottaa sen vaikutus pro-selviytymisen mekanismi autophagy näistä syöpäsoluja. Koska pro-apoptoottinen vaikutus Sal on ehdotettu säästää hyvänlaatuinen soluihin [9], me edelleen olivat kiinnostuneita sen vaikutusta ensisijaiseen ihmisen hepatosyyttien (PHH). Olemme osoittaneet, että Salinomysiini tuntuu tukahduttaa loppuvaiheissa HCC-autophagy, mikä johtaa heikentynyt kierrätys- ja kertymistä huonosti mitokondrioiden lisääntynyt ROS-tuotannon ja apoptoosin induktion. Lisäksi alennetaan tilapäisesti solun funktion PHH altistumisen jälkeen Salinomysiini osoitettiin.

Materiaalit ja menetelmät

Salinomysiini

Sal ostettiin Sigma-Aldrich ja liuotetaan DMSO . Kantaliuokset varastoitiin -20 ° C: ssa. Lääkeainepitoisuudet olivat alueella samanlaisten

in vitro

kokeiluja [10], [11], [14].

Maksasolukasvute- eristäminen

eristäminen ensisijaisen ihmisen hepatosyyttien (PHH ) suoritettiin 2-askeleelta kollagenaasiperfuusiolla tekniikkaa aiemmin raportoitu [18] (ks olevat tiedot). Kaikki kudosten luovuttajia antoivat kirjallinen lupa koekäyttöön maksan mallin. Protokolla hyväksyi eettisen komission Hannover Medical School.

Soluviljely

Ihmisen HCC solulinjat HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), tilausnumero HB-8065) ​​ja Huh7 [ ,,,0],19] viljeltiin DMEM: ssä (PAA), johon oli lisätty 10% FCS, penisilliini (50 U /ml) ja streptomysiiniä (50 mg /l) (Invitrogen). Elatusaine vaihdettiin joka 48. tunti. Sillä autophagy tutkimuksissa sekä solulinjoja ylläpidettiin täydennetyssä ATCC-muotoiltu EMEM kuten aiemmin on kuvattu [20]. Perustettiin inhibiittorit ja aktivaattorit autophagy käytettiin pitoisuuksina aiemmin raportoitu analogisella

in vitro

kokeet: 3 MA (0,4-10 mM), LY294002 (0,8-20 uM), vinblastiini (0,5-10 uM), nokodatsoli (0,5-10 uM), PP242 (5 uM), klorokiinin (CQ) (5-100 uM) ja ammoniumkloridia (ACH) (1-20 mM) [21]. Fysiologinen induktio autophagy on suoritettu käyttämällä HBSS, joka sisälsi 6 mM glukoosia (nälkiinnityskasvatusaine).

Vasta eristettyjä PHH kanssa elinkelpoisuus 90% ympättiin kollageenilla päällystetyille 6- ja 96-kuoppalevyille 1,5 ja 0,05 x 10

6 elävää solua /kuoppa, vastaavasti, ja viljeltiin käyttäen Williamsin Medium E aikaisemmin kuvatulla [18]. Seuraavat altistuminen vaihtelevia konsentraatioita Sal (0-10 uM) ja 24/48 h, niitä viljeltiin edelleen normaalia väliaineen vielä 5 päivää. Medium vaihdettiin päivittäin. Supernatantit ja kiinnittyneet solut kerättiin analyysiä varten päivinä 1/3/5.

Solun elinkelpoisuus

PHH ja ihmisen HCC soluja tutkittiin

in vitro

solujen elinvoimaisuuden CellTiter 96AQueous Yksi ratkaisu Cell Proliferation Assay (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lisäksi solukuolema myös analysoitiin propidiumiodite (PI) syrjäytyminen määritys ja virtaussytometrialla. Vaihtoehtoisesti apoptoosin analysoitiin muutoksia solujen FSC vs. SSC dot plot kuten aikaisemmin on kuvattu [20].

Proliferaatiomääritys

HepG2 ja Huh7-soluja viljeltiin 1 x 10

3 /hyvin väliaineessa yksin tai 1-10 uM Sal 96-kuoppalevyillä 24 tuntia. Viimeisen 16 tunnin viljelyn soluja pulssitettiin 1 uCi

3H-tymidiinin ja sisällyttäminen havaita β-counter kuten aikaisemmin on kuvattu [11].

anneksiini V analyysit

HepG2 ja Huh7-solut analysoitiin apoptoosin altistuksen jälkeen 1-10 pM Sal 24 h soveltaen anneksiini-V apoptoosin detektioreagenssipakkaus (BD Biosciences) valmistajan ohjeiden kuten aikaisemmin on kuvattu [11].

Constructs ja retrovirusinfektion

plasmidit pBabe-puro mCherry-EGFP-LC3B ja pBABEpuro GFP-LC3 (N # 22418 ja 22405), suunnitellut, Jayanta Debnath [21], saatiin Addgene. Solujen transduktio ja valinta suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20], [22]. Geneettinen inhibitio autophagy saavutettiin käyttämällä

ATG7

shRNA välittämää kaataa (Santa Cruz). Ei-spesifinen shRNA (kontrolli) sekä copGFP sovellettu mukaisesti valmistajan ohjeiden (Santa Cruz). Transduktio suoritettiin käyttäen lentivirus- partikkeleita, jopa viisi erillistä ekspressiorakenteet kuten muualla on kuvattu [20]. Transduktioteho kvantitoitiin useissa GFP-positiivisten solujen ja yleensä ylitti 94% lopussa puromysiiniselektion.

Analyysi salinomysiini-välitteisen vaikutuksia HCC autophagic toimintaa

Autophagic osastojen ( pre-autophagosomes, autophagosomes ja autophago-lysosomeihin) edustavat välikomponentteja dynaamisesta huonontumisprosessista ja niiden kokonaismäärä tiettynä ajankohtana määräytyy dynamiikka niiden luominen ja hajoaminen [23]. Teimme tutkimukset, jotka mittaavat autophagic vuon Uusimpien ohjeiden [23]. Autophagic flux viittaa koko prosessin autophagy lastin toimitus ja myöhemmin autolysosomal hajoamista. Mittaus autophagic flux mahdollistaa syrjiä induktio ja myöhäinen eston autophagosome kypsymisen koska molemmat on ominaista lisääntynyt läsnäolo autophagosomes [23], [24]. Muuntaminen GFP-LC3-I GFP-LC3-II määritettiin western blottauksella käyttämällä anti-LC-3B vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) [23]. Autophagic vuon arvioitiin kertymistä vahingoittumattomia GFP-LC3-II jälkeen esto autophagosomal hajoamisen avulla ACH. Densitometria LC3-II bändejä suoritettiin käyttäen LabImage1D Software (Kapelan Bio-Imaging Solutions) ja normalisoitu optinen tiheys (OD) aktiinin [24]. Lisäksi, autophagic vuon HCC solulinjoissa analysoitiin muutosten havaitseminen yhteensä solujen GFP-LC3 tai mCherry-GFP-LC3 signaali käyttäen virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, lisääntynyt autophagic vuon vastaa progressiivinen toimituksen GFP-LC3 on autolysosomes heikentymisen ja signaalin katoaminen. Lisäksi esti autophagic flux merkitsee pienentää GFP-LC3 katoaminen ja koska konstitutiivisen solun tuotannon havaitaan lisääntyneen solun kokonais-signaalin [20]. Analyysi tehtiin LSR-II (BD Biosciences). Autophagic vuon määritettiin myös käyttäen Cyto ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) valmistajan ohjeiden kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Tämä määritys perustuu spesifisen väriaineen, joka selektiivisesti värjää autophagic osastoja. Autophagic vuon näin on määrällisesti kertymistä autophagic osastojen perus- tai aktivoitu olosuhteissa (HBSS- tai PP242-inkubointi) jälkeen lukkiutuvat autophagolysosomal hajoamiselle CQ tai ACH. Se lasketaan vähentämällä Cyto ID MFI-arvo Näytteen ilman SA /ACH päässä Cyto ID MFI arvo näytteen ja SA /ACH jokaisen kunnon kaavalla: ΔMFI Cyto ID = MFI Cyto ID (+ CQ /ACH) – MFI Cyto ID (-CQ /ACH).

Mitokondrioiden massa

Mitokondrioiden massa määritettiin virtaussytometrialla käyttäen MitoTracker Green FM (MTR vihreä) värjäys mukaan valmistajan ohjeita (Molecular Probes), kuten aiemmin on kuvattu [26].

reaktiivisen hapen (ROS) B

ROS määritettiin virtaussytometrialla soveltamalla 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’ , 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti, asetyyli esteri (CM-H2DCFDA) värjäys mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen), kuten aiemmin on kuvattu [20].

aspartaatti-ALAT vuoto ja urean muodostuminen

kuten toimenpiteen aste soluvaurioita aktiivisuuden aspartaatti-(ASAT) määritettiin PHH kulttuureissa. Lisäksi ureaa muodostuminen indikaattorina solujen toimintaa tutkittiin. Molemmat parametrit havaittiin viljelmäsupernatanteista standardoitu entsyymiaktiivisuuden määrityksiä (Roche Molecular Diagnostics) suorittaman Keskuslaboratorioliiketoiminnan Hannover Medical School.

Albumiini synteesi

synteesi albumiinin PHH arvioitiin käyttäen Ihmisen albumiini ELISA kvantitointi Set (Bethyl Laboratories) kuten on aiemmin kuvattu [27].

In vitro

morfologia

morfologia PHH kiinnitetty kollageenipäällysteisiin levyillä käsitelty /ilman Sal arvioitiin päivittäin koko kulttuuri aikana käyttäen faasikontrastimikroskopiaan.

Immunofluoresenssikoe

PHH viljeltiin kollageenilla päällystetty kammio dioja 5 x 10

4 solua /kammio. Seuraavat 24 h inkuboinnin vaihtelevilla Sal (0-10 uM) tai Fas-ligandin (FasL) positiivisena kontrollina (1 ug /ml), värjäys apoptoosia varten suoritettiin käyttäen M30 Cytodeath kit (TECOmedical GmbH) valmistajan ohjeiden ohjeet.

tilastollinen

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 20.0 ja GraphPadPRISM 4. Mann-Whitneyn-U-testiä, Opiskelijan t-testi ja ANOVA Dunnettin post-hoc-analyysi oli sovellettu asianmukaisesti. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä kanssa p 0,05. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

tulokset

Altistuminen Salinomysiini vähentää merkittävästi solujen elinkelpoisuus ja lisääntyminen HCC-solujen apoptoosin induktio

vahvista syövän vastaisen vaikutuksen Sal ihmisen HCC-soluissa, tutkimme solujen elinkykyä seuraavat huumeiden hoitoon. Tämän, HepG2 ja Huh7 solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia Sal (1-10 uM) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen analyysillä käyttäen MTS-määritystä. Kasvain solujen elävyyden todellakin väheni merkittävästi huumeiden pitoisuus on yli 2 uM Sal (Fig. 1A). Seuraavaksi vaikutus soluproliferaatioon HCC-solujen määritettiin

3H-tymidiinin-sisällyttämisen jälkeen 24 tunnin inkubointi aineen kanssa. Kuten on osoitettu kuviossa 1 B, solujen lisääntyminen oli merkittävästi alentunut molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla. Tämä vaikutus oli havaittavissa altistumisen jälkeen melko maltillista annoksella 2 uM Sal. Korkeampi lääkeainepitoisuudet lähes kokonaan vähentynyt proliferaatio ihmisen HCC-soluissa.

HepG2 ja Huh7 solut altistettiin kasvavia konsentraatioita salinomysiini (1, 2, 5 ja 10 uM) 24 tunnin ajan. (A) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä; suuret pitoisuudet Salinomysiini johti merkittävästi vähentynyt elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa (n = 5). (B) HCC-solut paljasti vähensi lisääntymistä altistuksen jälkeen Salinomysiini osoituksena vähentynyt

3H-Tymidiininotto. (C) pieninä pitoisuuksina salinomysiini (vasen paneeli, yhtenäinen viiva) johti heikko kasvu apoptoottisten solujen käsittelemättömiin soluihin verrattuna (pisteviiva overlay). Suuret pitoisuudet selvästi aiheuttaman apoptoosin (oikea paneeli, kiinteä viiva). Tulokset esitetään tyypillinen scatter-g anneksiini-V

+ – soluja tai tiivistää keskiarvoja ± SD n = 4 itsenäisestä kokeesta (D). * P 0,05, ** p 0,01.

analysoida tarkemmin, onko Sal aiheuttaman apoptoosin näissä solulinjoissa. Kuten osoitettu kuvissa 1C + D, havaitsimme annosriippuvainen nousu anneksiini-V

+ solujen altistuksen jälkeen Sal HepG2-soluissa. Vuonna Huh7 soluissa merkittävä apoptoosin löydettiin Sal pitoisuuksien ja yli 2 uM. Apoptoosin induktio Sal oli tehokkaampi HepG2 kuin Huh7 soluissa (25,3% vs. 14,3%).

Salinomysiini estää autophagic vuon ja johtaa autophagic alustaan ​​kertymistä

vaikutuksen arvioimiseksi Sal autophagy HCC-soluissa, soluja viljeltiin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM Sal 15 h ja ilman ACH viimeisen 1 h. Puolikvantitatiivinen western blot-analyysi osoitti, Sal-indusoitu kasvu LC3-II (Fig. 2A), joka väittää, vastaan ​​Sal-estoa alkuvaiheessa autophagosomal muodostumista. Sen sijaan tämä voi vastata joko tehostetun autophagosome sukupolven lisääntyneen autophagic toimintaan tai tukahdutetaan autophagosome kypsymisen [23]. Käsittelemään tätä kysymystä ja arvioimaan autophagic flux Western blot arvioimme kertymistä LC3-II bändi jälkeen ACH välittämää tukos autophagolysosomal hajoamista. Kertyminen LC3-II band laskettiin vähentämällä densitometrinen intensiteetti näytteen ilman ACH näytteestä ACH kunkin ehdon (kontrolli 3,6-1,0 = 2,6; Sal 3,7-1,6 = 2,1). Vähentynyt kertyminen LC3-II bändi lisäyksen jälkeen ACH Sal-käsitellyissä viljelmissä (2,6 2,1) ehdotti lääke välittämää tukahduttaminen autophagic flux (Fig. 2A). Samanlainen väheneminen autophagic vuon havaittiin seurauksena vinblastine- ja nokodatsoli-välitteisen suppression autophagosome kypsymisen (

tuloksia ei ole esitetty

).

HepG2 ja Huh7 solut altistettiin eri pitoisuuksilla salinomysiini (0,5, 2 ja 8 uM) eri ajankohtina ja analysoitiin aktiivisuuden autophagy. (A) immunoblottianalyysi LC3-I ja LC3-II-isoformit (up) kanssa densitometria kvantitatiivinen analyysi (alaspäin) HepG2-soluissa paljasti Sal aiheuttama LC3-II-kertymistä estämällä autophagic vuon osoituksena alennettu LC3-II -accumulation lisäyksen jälkeen ACH. (B) Basic ja PP242 aktivoituva autophagic vuon Huh7 soluissa (mustat palkit). Hoidon autophagy estäjien 3mA (2 ja 10 mM), ACH (5 ja 20 mM) tai CQ (5, 20 uM) 24 tunnin ehkäisee PP242 aktivointi autophagic vuon. (C) esto autophagic vuon Huh7 soluissa jälkeen shRNA välittämää knockdovvn ATG7. (D + E) Vähentynyt kertyminen autophagic osastojen jälkeen tukkeutuminen autophagolysosomal hajoamista ACH osoittaa vähentää autophagic vuon HepG2 (D) ja Huh7 (E) käsiteltyjä soluja Sal 24 tuntia. Vieressä pylväsdiagrammeja edustaja histogrammeja kuvattu. Kaikki kokeet esitetään keskiarvona ± SD n = 3 itsenäistä koetta. * P 0,05; ** P 0,01, *** p 0,001.

Ennen kuin voimme arvioida Sal HCC autophagic flux, me validoitu flow-sytometrinen seuranta solunsisäisen liikevaihdon autophagic osastot HCC-soluissa [25], [28]. Autophagy aktivointi PP242 johti selvään kasvuun autophagic flux (Fig. 2B). Lisääminen autophagy estäjät, kuten 3-MA, ACH tai CQ johti laskua autophagic muutostilassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttäen rapamysiini tai nälkään (

tuloksia ei ole esitetty

) ja vahvistanut sovellettavuus määritys HCC-soluissa. Vihdoin jättää pleiotrooppisia vaikutuksia farmakologisen inhibiittorit, me todennettujen autophagic flux mittaus Cyto ID käyttäen autophagy-erityisiä shRNA välittämää knockdovvn

ATG7

(Fig. 2C).

Seuraavaksi halusi arvioida vaikutusta Sal HCC: n autophagic muutostilassa. HepG2-soluja viljeltiin, kun läsnä oli Sal (0,5, 2 ja 8 uM) 24 tunnin ajan ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna. Sal huomattavasti vähentää autophagic vuon aikaa ja annoksesta riippuen, jopa silloin, kun autophagy indusoitiin PP242 (Fig. 2D). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin käyttämällä Huh7 soluja (Kuva. 2E) ja vaihtoehtoisten aktivointi rapamysiinillä tai nälkään (

tuloksia ei ole esitetty

).

Lopuksi haimme seuranta solunsisäisen LC3-vaihtuvuus [22] . Tätä varten käytimme HepG2 soluista jotka ilmentävät pysyvästi LC3-GFP. Inkubointi 3 MA (2 ja 10 mM), LY (2 ja 10 mM), nokodatsoli (2 ja 10 uM) tai ACH (0,8 ja 4 mmol) 7 h lukemiin kertymistä GFP-LC3 signaali, odotetusti (Fig . 3A). Nälänhätä lisäsi autophagic vuon havaitaan vähentynyt LC3-GFP signaalin ohjaus soluissa, mikä osoittaa enemmän hajoamista (Fig. 3A), vaikutus, joka katosi, kun farmakologinen autophagy estäjiä olivat läsnä (Fig. 3A). Seuraava HepG2-soluissa ilmentävät konstitutiivisesti LC3-GFP-fuusioproteiini viljeltiin ilman Sal 24 tuntia. Sal huomattavasti esti autophagic vuon havaita kertymistä totaalisoluproteiinia LC3-GFP-signaalin (Fig. 3B). Jälleen Sal vaikutuksista autophagic vuon olivat ajasta ja annoksesta riippuvaa ja helposti havaittavissa pitoisuuksissa aiemmin raportoitu aiheuttavan syöpälääkkeen vaikutuksia [10]. Suppressio autophagy on liittynyt toimimaton mitokondrioita kertymistä lisääntynyt tuotanto ROS [29], [30], mikä voi laukaista apoptoosin [29] – [32]. Niinpä analysoinut, Sal hoito oli mukana kertyminen mitokondrioiden massasta. Itse asiassa tuloksemme vahvistivat annoksesta riippuvan kertyminen mitokondrion massa (Fig. 3C). Lisäksi kertynyt mitokondriot näkyvissä merkkejä toimintahäiriön osoituksena lisääntynyt läsnäolo ROS tuotanto (Fig. 3d). Tärkeää on, farmakologinen ja geneettinen inhibitio autophagy HCC-soluissa täysin toisti Sal vaikutukset huonosti mitokondriot kertymistä, ROS tuotanto ja solujen elinkykyä. Tämän perusteella voimme päätellä, että Sal vaikutukset HCC-soluissa saattaa ainakin osittain välittyvän kyvyllään tukahduttaa autophagic flux (katso File S1 ja Fig. S1).

(A) esto perus- ja HBSS-aktivoitua autophagic vuon HepG2-soluissa jotka ilmentävät pysyvästi LC3-GFP käsiteltiin 3 MA (2 ja 10 mM), LY (2 ja 10 mM), nokodatsoli (2 ja 10 uM) tai ACH (0,8 ja 4 mmol) 7 h. (B) esto autophagic vuon HepG2-soluissa käsitelty Sal (0,5, 2 ja 8 uM) 24 tunnin (vasemmalla) edustava histogrammit (oikealla). (C) Flow-sytometrinen analyysi koko mitokondrion massasta käyttämällä MitoTracker Green (MTR vihreä) paljastaa kertymistä huonosti mitokondrioita. (D) Todisteet lisääntynyt ROS-tuotannon käyttäen CM-H2DCFDA (vasemmalla) edustava histogrammit (oikealla). Kaikki kokeet esitetään keskiarvona ± SD n = 3 riippumattoman kokeen. * P 0,05, ** p 0,01.

altistaminen PHH on Salinomysiini tuloksia ohimenevä väheneminen solujen toimintaa ja

in vitro

morfologialtaan mutta ei johda apoptoosiin

Perustuu raportteja, että Sal on anti-syöpä vaikutuksia kasvainsoluja vastaan ​​mutta aiheutti vähän apoptoosin ei-kasvainsoluissa ja se, että maksan merkitsisi kohde-elin hoitoon HCC, me seuraavaksi keskittyneet Sal vaikutuksesta ensisijainen ihmisen hepatosyyttien. Yleensä hoito pieninä pitoisuuksina Sal (1-2 uM) 24 tunnin ajan ei nimenomaisesti muuta PHH ulkonäkö (Fig. 4A). Kontrolliin verrattuna, maksasoluihin esiintyi hieman vaikuttaa epäsäännöllinen solukalvojen. Korkeammat pitoisuudet Sal (5-10 uM), vaikka osittain johti selvempi muutoksia: PHH osoitti merkkejä eheyden tuhoutuminen ja jopa menetys yhtymäkohta. Lisäinkubaatioon näiden viljelmien puuttuessa Sal johti täydellinen elpyminen PHH alttiina alhaisen ja keskitason annoksina enintään 5 uM. Sen sijaan sen jälkeen, kun on stimuloitu 10 uM Sal 24 tuntia ei ole valomikroskooppisella havaitseminen tehokkaan hyödyntämisen useimmissa tapauksissa. Inkubointi PHH 48 tuntia johti samankaltaista: hoidon pieninä pitoisuuksina aine aiheutti melko marginaalinen morfologiset muutokset taas suuremmat annokset puolestaan ​​voisi johtaa solun muutoksiin (Fig. 4A).

Yhden päivän inkuboinnin viljeltyjen PHH altistettiin kasvavia konsentraatioita salinomysiini (1, 2, 5 ja 10 uM) vaihtelevin valotuksen aikana (24 ja 48 tuntia, vastaavasti). (A) arvon alentuminen

in vitro

morfologian jälkikantotapauksessa olivat havaittavissa vain hoidon jälkeen suuria pitoisuuksia Salinomysiini (10 mM), kun taas käsittely jopa 5 uM Salinomysiini johti morfologisten toipuminen kulunut agentti. (B + C) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Salinomysiiniä hoitoa 24 (B) ja 48 (C) tuntia johti merkittävästi heikentynyt solujen elinkelpoisuuden päivänä 1 ja 3. Kun lisäinkubaatioon elpymistä solujen havaittiin kuten lisäämällä tuotantoa värillisen formazaan-tuote (n = 6) . (D + E) Cell vaurio PHH edustama AST julkaisu oli havaittavissa vain heti lääkealtistuksen (päivä 1) ja 10 uM Salinomysiini 24 (D) ja 48 (E) tuntia. Tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (n = 3). Meneillään inkubointia mukana tuskin mitattavissa AST julkaisu. * P 0,05, ** p 0,005.

vieressä tutkineet

in vitro

solujen elinkelpoisuus PHH käyttäen MTS-määritystä. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin heti lääkkeen altistuksen (päivä 1) sekä päivinä 3 ja 5 seuraava Sal-hoidon. Kuten on osoitettu kuviossa 4B, 24 h altistuksen merkittävästi alentunut solujen elinkelpoisuuden päivinä 1 ja 3 annoksesta riippuvalla tavalla. Raukeaminen huumeiden ja jatkuva inkubaatio johti lähes täydellistä toipumista PHH päivältä 5 (Fig. 4B). Stimulaatio Sal 48 tuntia johti samankaltaiseen annoksesta riippuvainen lasku solujen elinkelpoisuuden ja seuraavaa talteenottoa varten. Kuitenkin, viimeksi mainittu ei ollut niin riittävä, kuten havaittiin 24 tunnin kuluttua altistuksen (Fig. 4C).

Koska inkubointi PHH kasvavilla pitoisuuksilla Sal johti välivaiheen väheneminen solujen elinkelpoisuuden ja histomorphologic muutoksia, me olivatko muut merkkiaineiden soluvaurioita samoin voitu havaita. Kuviot 4D + E osoittaa, että vertailukelpoinen vuotaa AST todettiin kaikkien koeryhmään. Merkitty huippu AST-release vasta havaittiin päivänä 1 altistuttuaan 10gM Sal mutta ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä. Käynnissä inkubointi ilman Sal johti kohtalainen perus vapauttamaan AST kaikissa ryhmissä.

Seuraavaksi analysoidaan jos Sal-hoito heikentää toimintaa PHH. Tätä varten urea-muodostumista ja albumiini-synteesi huumeiden alttiina PHH määritettiin. Kuten osoitettu kuvioissa 5A + B eivät vaikuta merkitsevästi vaihtelua urea-muodostumisen jälkeen 24 h-stimulaation Sal. Sen sijaan seuraavat 48 h altistuksen annoksesta riippuvaista väheneminen urea-muodostuminen oli havaittavissa, erityisesti päivinä 3 ja 5, mutta ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (Fig. 5A + B). Albumiini-synteesin PHH alttiina Sal 24 tuntia on ominaista annosriippuvaista laskua päivänä 1 (Fig. 5C + D). Raukeaminen Sal aiheutti hidas elpyminen solun toiminnallisuutta jatkuva kasvu albumiini-tuotanto, mutta stimulaation jälkeen korkea huumeiden pitoisuuksia. Samanlainen mutta vieläkin selvempi vaikutus havaittiin 48 h-altistuksen. Jälleen jälkeen kulunut aineen jatkuvan – joskin paljon hitaammin – talteenotto PHH havaittiin (Fig. 5C + D).

toimivuus PHH hoidon jälkeen Salinomysiini analysoitiin urean muodostuminen ja albumiini synteesi. (A) 24 tuntia Salinomysiini altistuksen vaihtelevilla pitoisuuksilla ei liittynyt alentunut urean muodostuksen ollenkaan. (B) Sen sijaan, hoito 48 tunnin johti annoksesta riippuvaa vähenemistä urean muodostuminen päivinä 1, 3 ja 5 pääsemättä tilastollista merkittävyyttä. (C + D) Albumiini synteesi oli merkittävästi heikentynyt päivänä 1 stimulaation jälkeen Salinomysiini 24 ja 48 tuntia. Lisäinkubaatioon johti jatkuvaan elpyminen albumiinin synteesin ryhmissä 24 tunnin lääkkeelle altistumisen. Sitä vastoin hoito 48 tuntia aiheutti ainoastaan ​​kohtalainen elpymistä albumiinin synteesin (n = 3). * P 0,05, ** p 0,005.

Lopuksi olimme kiinnostuneita määritettäessä, ohimenevää PHH seuraavien 24 tunnin altistuminen Sal korreloi apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa 6, altistuminen Sal ei aiheuta apoptoosia näissä hyvänlaatuinen solujen toisin FasL-hoitoa.

Viljellyt PHH altistettiin kasvavia konsentraatioita salinomysiini (1, 2, 5 ja 10 uM) ja 24 tuntia. Apoptoosi havaittiin M30 Cytodeath kit. Käsittely Fas-ligandin (FasL) toimi positiivisena kontrollina. Värjäys PHH DAPI (sininen) ja M30 Cytodeath Kit (punainen) eivät osoittaneet induktioon apoptoosin PHH vaikka hoidon jälkeen suuria pitoisuuksia Salinomysiini. Sen sijaan, FasL selkeästi indusoi apoptoosia PHH.

Keskustelu

tiedot tukevat käsitystä, että Sal kohdistaa pro-apoptoottinen vaikutus HCC-soluissa inhiboimalla autophagic vuon, joka johtaa kertymistä huonosti mitokondrioita ja lisääntynyt ROS-muodostuksen. Koska kasvainsolut uskotaan kokea enemmän luontaista stressiä ja siksi niiden ennustetaan olevan erittäin riippuvainen autophagy hengissä [33] Tutkimuksemme voisi auttaa ymmärtämään, miksi Sal valikoivasti tappaa syöpäsoluja säästäen hyvänlaatuinen soluja. Tämä hypoteesi on täydennetty havainto, että altistuminen PHH Sal johtaa vain ohimenevää solujen toimintaa ilman merkittäviä vaurioita.

Koska HCC on kolmanneksi suurin syy syöpään [34] ja yleisin ensisijainen maksan maligniteetti rajoitetusti hoito-vaihtoehtoja etenkin pitkälle taudin [34], [35], innovatiiviset hoitomenetelmät ovat välttämättömiä. Potentiaali Sal hoitoon HCC oli ensin ehdotti työn Wang et al. jotka osoittivat proliferaation esto ja apoptoosin induktio HCC

in vitro

ja

in vivo

kuluttua lääkkeen altistuksen [10]. Leikellä tarkka vaikutustapa Sal keskityimme molekyylitason mekanismi Sal HCC. Käyttämällä HepG2 ja Huh7 solut ja kattavia kvantitatiivisia analyysejä pystyimme osoittamaan, että Sal estää autophagic vuon ihmisen HCC-soluissa. Seuraavat havainnot johtivat siihen johtopäätökseen, että Sal estoa autophagic flux voisi olla syynä apoptoosin HCC-soluissa. Ensin osoitti annoksesta riippuvaista kertymistä huonosti mitokondrioiden lisääntynyt ROS-tuotantoon. Poistaminen toimimattomia mitokondrioita ja siten vähentämään proapoptoottisten signaalit kuten sytokromi

c

vapautuminen pidetään olennaisena osana pro-selviytymisen mekanismi autophagy [36]. Huomattavaa on, että autophagy on toistuvasti osoitettu olevan ratkaiseva poistamista huonosti mitokondrioiden [31], [37]. Havaittavissa muutos mitokondrioiden massan ja ROS ilmestyi vasta esti huomattavasti autophagic vuon ja sitä seurasi massiivinen apoptoosin induktio ja solujen kuolemaan. Toiseksi, alle meidän koeolosuhteissa farmakologinen ja geneettinen inhibitio autophagy kokonaan toisti näitä tapahtumia. Vaikka otetaan huomioon, että lähes kaikki farmakologisen estäjien läsnä dalmatialaistäpläisiä useita reittejä [23], että geneettinen inhibitio johti analoginen muutos puoltaa sitä, että havaintomme ovat ainakin osittain välittyvät tukahduttaminen autophagic muutostilassa. Vaikutus Sal autophagy syöpäsoluissa keskustellaan parhaillaan kiistaa. Jangamreddy et ai. * P 0,05; ** P 0,01;