Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimet sisältävät pienen populaation syövän kantasoluja (CSC) ehdotetaan olevan vastuussa kasvaimen ylläpitoon ja uusiutumisen. Aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1) aktiivisuus on käytetty toiminnallinen kantasolujen markkerina eristää CSCS eri syöpätyyppejä. Tässä tutkimuksessa käytettiin Aldefluor® määrityksessä ja fluoresenssia-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) eristämiseksi ALDH1

korkean soluja viiden ihmisen sarkooma solulinjoja ja yhden ensisijaisen kordooma solulinjassa. ALDH1

korkea solut vaihtelevat 0,3% (MUG-Chor1) 4,1% (SW-1353) on aidatulla soluja. Immunohistokemiallinen värjäys, analyysi kloonin muodostumisen tehokkuutta, ja xCELLigence mikroelektroniikan anturiteknologia paljasti, että ALDH1

korkea soluja kaikista sarkooma solulinjoista ovat lisääntynyt proliferaationopeus verrattuna ALDH1

alhainen soluja. Tutkimalla tärkeitä säätelijöitä kantasolujen biologian, reaaliaikainen RT-PCR tiedot osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä c-Myc, β-kateniinin, ja SOX-2 vuoden ALDH1

korkea väestön ja merkittävä korkeamman ABCG2. Tilastollinen analyysi tiedot osoittivat, ettei ALDH1

korkea solujen SW-982 ja SW-1353 osoitti suurempi vastustuskyky yleisesti käytetty kemoterapia-aineiden, kuten doksorubisiinin, epirubisiinin ja sisplatiinin kuin ALDH1

alhainen soluja. Tämä tutkimus osoittaa, että eri sarkooma solulinjoissa, korkea ALDH1 aktiivisuutta voidaan käyttää tunnistamaan solujen alapopulaation, tunnettu siitä, että huomattavasti korkeampi leviämisen määrä, lisääntynyt pesäkkeitä muodostava, lisääntyneen ilmentymisen ABC transporter geenien ja stemness markkereita kontrollisoluihin verrattuna. Lisäksi parannettu lääkeresistenssi on osoitettu.

Citation: Lohberger B, Rinner B, Stuendl N, Absenger M, Liegl-Atzwanger B, Walzer SM, et ai. (2012) aldehydidehydrogenaasi 1, potentiaalinen Marker syövän kantasolut Human sarkooma. PLoS ONE 7 (8): e43664. doi: 10,1371 /journal.pone.0043664

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 23 elokuu 2012

Copyright: © Lohberger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki Medical University of Graz (START avustus), OeNB avustus (# 14356) ja ”EccoCell” avustus kiittävät. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solupopulaation eniten kasvaimia on heterogeeninen suhteessa sen leviämisen kapasiteetti ja kyky aloittaa kasvainten muodostumista immuuni-hiirillä. Syöpä kantasolujen (CSC) on määritelty solun sisällä kasvain, joka hänellä on kyky itse uudistaa ja tuottaa heterogeeninen suvusta syövän solut, jotka käsittävät kasvaimen [1], [2]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että CSCS olemassa erilaisissa ihmisen kasvaimissa, kuten hematopoieettiset maligniteetit, aivokasvaimia, rintasyöpä, ja gastroenterologian syöpä [3], [4], [5], [6].

soluliman aldehydidehydrogenaasit (ALDHs) ovat ryhmä entsyymejä, jotka osallistuvat hapettamalla monenlaisia ​​solunsisäisiä aldehydejä niiden vastaavat karboksyylihapot [7]. Niistä opinnäytetyöt entsyymejä, ALDH1 on arveltu tärkeä rooli hapetus alkoholin ja A-vitamiinia ja syklofosfamidin chemoresistance. Ginestier et ai. [8] osoitti, että ALDH1 oli merkki normaalien ja pahanlaatuisten ihmisen rintarauhasen kantasolujen ja ennustaja huonon kliinisen tuloksen syöpäpotilaista. Korkea ALDH1 aktiivisuus on käytetty määrittelemään kantasolukkoa monissa syöpätyyppejä mukaan lukien ihmisen multippelimyeloomaa akuutti myelooinen leukemia [8], haimasyöpä [9], ja rintasyövän [10]. Siksi ALDH1 toiminta voisi olla käyttökelpoinen yhteinen merkki pahanlaatuiseen kantasolukkoa [11]. Epäonnistuminen syövän kemoterapiaan voi tapahtua lisäämällä ulosvirtaus kemoterapeuttisten aineiden, mikä vähentää solunsisäisiä lääkkeen pitoisuutta ja sen seurauksena lääkeaineen epäherkkyyden. ABC kuljettajat on kyky viedä monia sytotoksisten lääkkeiden ja viimeaikaisten tutkimusten mukaan syövän kantasolujen fenotyyppi liittyy korkean tason ilmentymisen ABCG2 transporter [12], [13], [14].

tässä tutkimuksessa käytimme Aldefluor® määrityksessä ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) eristämiseksi ALDH1

korkea soluja viiden ihmisen sarkooma solulinjojen ja yksi äskettäin perustetun kordooma solulinjassa. Analysoimme ALDH1

korkea solujen

in vitro

niiden kannan uudelleen kapasiteetti, kyky muodostaa klooneja, solujen lisääntymistä ominaisuuksia, ilmaus kantasolujen merkkiaineiden ja ABC kuljettajat, ja niiden monilääkeresistenssiin valmiuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Kaikki ihmisen sarkooma solulinjoja (SW-684, SW-872, SW-982, SW-1353, ja TE-671 saatiin CLS ( Eppelheim, Saksa) ja niitä viljeltiin Dulbecco-modifioitua Eagle-elatusainetta (DMEM-F12), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug amfoterisiini B. MUG-Chor1 soluja viljeltiin IMDM: ssä /RPMI 1649 (04:01) (PAA, Pasching, Itävalta), jota oli täydennetty 1% L-glutamiinia ja 1%: sen (PAA). Kaikki solujen inkubointi suoritettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO2 ja viljelmiä tarkastettava Mycoplasma. Viljelymediumista ja täydennykset ostettiin GIBCO®, Invitrogen (Darmstadt, Saksa).

Fluoresenssi versus sirontamittari osoitettiin tiheys blot maasta (A ) DEAB kontrollisoluja ja (B) ALDH1-ilmentäviä soluja (kutsutaan ALDH1

korkea). (C) ALDH1 ilmentyminen% aidatulla soluista. Eniten ALDH1

korkea solujen edustaa SW-684-solut (1,77 ± 0,9%, n = 12), SW-982-solut (2,23 ± 1,0%, n = 11), ja SW-1353-solujen (2,69 ± 1,3%, n = 8). (D) Kahden viikon kuluttua viljeltiin ALDH1

suuren kannan syntyy aiempaa suurempi huomioon ALDH1

korkea soluja. (E) Parannettu ALDH aktiivisuus osoitettiin myös Western blot.

Aldefluor® määritys ja erottaminen ALDH1

+ solupopulaation FACS-analyysi

Aldehydi (ALDH) entsyymin aktiivisuus elinkelpoisten solujen määritettiin käyttäen fluorogeenisen värin perusteella Aldefluor® määrityksessä (Stem Cell Technologies, Grenoble, Ranska) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1 x 10

6 /ml solut suspendoitiin Aldefluor® määrityspuskuriin, joka sisälsi ALDH substraattia (BODIPY-aminoasetaldehydi) ja inkuboitiin 45 min 37 ° C: ssa. Kuten viite-ohjaus, solut suspendoitiin puskuriin, joka sisälsi Aldefluor® substraatin läsnäollessa diethylaminobenzaldehyde (DEAB), erityinen ALDH1 estäjä. Kirkkaasti fluoresoiva ALDH1 ilmentävien solujen (ALDH1

korkea) havaittiin vihreän fluoresenssin kanava (520-540 nm) FACSAria (BD Biosciences, San Diego, CA) ja analysoitiin käyttäen FACS DIVA ohjelmistoa (BD Biosciences ). Poissulkemiseksi käyttökelvottomaksi soluja propidiumjodidi (PI, Sigma Aldrich, Wien, Itävalta) lisättiin lopulliseksi pitoisuudeksi 2 ug /ml.

immunohistokemiallinen analyysi käyttäen anti-Ki-67 leviämisen merkki paljasti vähentynyt proliferaatio tasolle (A) SW-1353 ALDH1

alhainen solujen ja verrattuna (B) SW-1353 ALDH1

korkea soluja. (C-E) Dynaaminen leviämisen käyrät ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen soluja ympättiin 10000 solua kuoppaa kohden mitataan xCELLigence järjestelmään.

harvenneiden Pitoisuus

vertaamaan harvenneiden kykyä sarkooma ALDH1

korkea solujen ALDH1

alhainen solujen

in vitro

, juuri lajitellaan soluja viljeltiin erikseen samoissa viljelyolosuhteissa. 2 viikon kuluttua solut uudelleen värjättiin Aldefluor® määrityksen ja analysoitiin uudelleen kautta FACSAria (BD Biosciences).

(A) kvantitointi kloonin muodostumisen tehokkuutta SW-684, SW-982, ja SW -1353 soluja. Tiedot viidestä itsenäisestä kokeesta osoittavat keskimääräistä pesäkelukua /kolo 14 päivän jälkeen. (B) edustaja pesäkettä muodostavaa yksikköä kaikista kolmesta solulinjoissa.

Western blot -analyysi

kokonaisproteiinia analyysiä varten solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCL pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 10% NP-40, 1% Triton-X ja proteaasi-inhibiittorit), inkuboitiin jäillä 10 min ja sentrifugoitiin 15000 rpm 15 minuutin ajan. Alikvootit proteiinin uutteita (20 ug) erotettiin 12% SDS-PAGE ja elektro-blotattiin 0,45 um Hybond ECL nitroselluloosa- kalvolle (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Membraani blokattiin 3% maitoa salpauspuskurilla 1 h ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kuten primaarisen vasta-aineen, kanin polyklonaalinen ALDH1 /2-vasta-aineen (# sc50385; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin. Suurimmat maksa isoformi ALDH1 lokalisoitu sytosolin tilaa, kun taas ALDH2 lokalisoitu mitokondrioita. Blotit kehitettiin käyttäen piparjuuren peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Dako, Wien, Itävalta) huoneenlämpötilassa 1 h ja SuperSignal® West Pico kemoluminesenssisysteemi Substraatti (Thermo Scientific, Rockford, IL), mukaisesti valmistajan protokollaa.

ilmaisu taso normalisoitui (ACk

t) ilmentymiseen mRNA GAPDH, ACTB ja HPRT-n sisäisenä kontrollina ja vastaaviin ACk

t (ΔΔC

t) kontrolleissa. Normalisoitu ilmentymisen tasoja (A) c-Myc, (B) β-kateniinin, ja (C) SOX-2 esitettiin. (D) ABCG2 oli korkeammin ilmaistu ALDH1

korkea kuin ALDH1

alhainen soluja, kun taas p-arvot (E) ABCA2 eivät olleet merkittäviä. (F) ALDH1

high SW-1353-soluissa osoitti myös aiempaa suurempi ilmaus ABCB1.

immunohistokemia

Jokainen 1 x 10

4 ALDH

high ja ALDH

alhainen soluja siirrostettiin polystyreeniä kulttuuri diat (BD Biosciences), kiinnitettiin 4% formaliinilla /PBS-liuosta, ja kuivattu nousevassa sarjassa alkoholia. Immunohistokemiallinen (IHC) tutkimukset käyttäen streptavidiini-biotiini peroksidaasi-kompleksi menetelmä suoritettiin käyttämällä vasta-ainetta vastaan ​​anti Ki-67 (klooni 30-9) kani monoklonaalinen primaarinen vasta-aine (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) käyttämällä BenchMark Ultra väline ( Ventana Medical Systems). Solut kuvattiin käyttäen Olympus BX51 mikroskooppi Olympus DP71 mikroskoopilla digitaalikamera. Värjätyt Levyt digitaalisesti skannattu ja positiiviset ja negatiiviset solut mittaamaan ImageScope ohjelmistoa (ImageScope Virtual Slide, versio 6.25, Aperio Technol., Vista, CA). Positiivisuus = N-positiivisia soluja /N koko solua.

Molemmat subopulations hoidettiin 0-5,0 uM doksorubisiinin, 0-5,0 uM epirubisiini, 1-100 uM sisplatiini, ja mitattiin 48 tunnin jälkeen. Keskiarvo ± SD kaikkien mittausten sovitettiin mukaan Hillin yhtälöä. Merkittäviä eroja yksittäisten pitoisuudet sisällytettiin käyriä.

xCELLigence System

xCELLigence DP laite Roche Diagnostics (Mannheim, Saksa) voidaan käyttää kvantitatiivisesti ja dynaamisesti seurata solu leviämisen reaaliaikaisesti [15]. Vastaavasti 1 x 10

4 tuoreeltaan lajiteltu ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen soluja ympättiin sähköisessä mikrotiitterilevyille (E-Plate ™, Roche Diagnostic) ja mitattiin 72 tuntia kanssa xCELLigence järjestelmän ohjeiden mukaisesti käyttäjän käsikirja. Soveltaminen matalan jännitteen (alle 20 mV) AC-signaali johtaa sukupolven sähkökentän, joka on vuorovaikutuksessa ionisen ympäristön sisällä kuoppiin E-levyt ja on differentiaalisesti moduloitu useissa solujen hyvin, solujen morfologia, ja vahvuus solujen kiinnittymistä. Solutiheys mittaukset suoritettiin neljänä rinnakkaisena, jossa ohjelmoidun signaalin havaitseminen 20 min välein ja normalisoitiin 6 h ajankohtana. Tietojen hankinta ja analysointi suoritettiin RTCA ohjelmiston (versio 1.2, Roche Diagnostics).

pesäkemuodostusta

Voit selvittää klooni muodostumisen hyötysuhde (TAE) lajitellun solujen

in vitro

, ALDH1

korkea, ALDH1

alhainen solujen ja unstained solut (kontrolli) laskettiin ja 200 solua kuoppaa kohti ympättiin kuudella kuoppalevyille. Kolmena rinnakkaisena käytettiin kussakin ryhmässä. Soluja viljeltiin DMEM-F12 lisäyksin 14 päivää, kiinnitettiin metanolissa 10 min ja värjättiin kristallivioletilla (Sigma Aldrich, Hampuri, Saksa). Klooni numero, joka koostui yli 50-solut laskettiin. TAE laskettiin kaavan mukaan: (klooni numero /kullattu solujen määrä) x 100.

Real-Time RT-PCR

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin MIQE kriteerit [16] määrittää suhteellinen ekspressio ABC transporter geenit ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ja ABCB1 /MDR1 ja stemness markkereita c-Myc, β-kateniinin, ja SOX-2. Kokonais-RNA eristettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajien suosittelemaa menetelmää. DNA hajotettiin 1 U DNaasia (Fermentas, St.Leon-Rot, Saksa) per ug RNA: ta. 1 ug RNA: ta käännetyn kirjoitettiin puhtaaksi käyttäen RevertAid cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina käyttäen Platinum SYBR Green Super Mix ROX (Invitrogen) päälle AB7900HT (Applied Biosystems, Invitrogen). Housekeeping geenit glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), β-aktiini (ACTB) ja hypoksantiinia (HPRT-n) toimi sisäisenä kontrollina, koska niiden pysyvä ekspressio eri kudoksissa. Taulukossa 1 luetellaan käytetyt alukkeet real-time PCR. Ilmaisu tasot laskettiin perustuen 2

-ΔΔCT menetelmä [17].

Drug Herkkyys Pitoisuus

Lajittelu solut säädettiin tiheyteen 5 x 10

3-soluissa /100 ui ja inkuboitiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Solut altistettiin eri pitoisuuksia kemoterapeuttisten (doksorubisiinihydrokloridi, epirubisiinihydrokloridi, ja

cis

-diammineplatinum (II) kloridi (sisplatiini); Sigma Aldrich) 48 tuntia. Kemoterapeuttista lääkettä herkkyys määritettiin MTS-määritys (Promega, Mannheim, Saksa) noudattaen valmistajan ohjeita quatruplicates fotometrin avulla (Spektramax; BMG Labtech., Offenburg, Saksa) aallonpituudella 490 nm. IC

50-arvot määritettiin kasvun estäminen tiedot.

Tilastollinen analyysi

tulosmuuttujat ilmaistiin keskiarvona ± SD. Opiskelijan pariton

t

-testin ja tarkka Wilcoxonin testiä käytetään arvioimaan eroja ryhmien kanssa PASW tilastoihin 18 ohjelmisto (IBM Corporation, Somers, NY). Kaksipuolinen

P

-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. IC

50 käyrät sovitettiin mukaan Hillin yhtälöä (sigmoid, 3 parametrit). Graafinen data valmistettiin SigmaPlot® (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Tulokset

sarkoomasolulinjoja Näyttää Distinctive murto-osalla ALDH1

korkea Solut

Aldefluor® määritys on kehitetty havaita aktiivisuutta ALDH1 isoformin. Käytimme tätä määritystä seuraa FACS analysoitaviksi läsnäolon ja määrän ALDH1

korkea solupopulaatioiden viidessä ihmisen sarkooma solulinjojen ja yksi kordooma solulinjan [18].

Jos haluat määrittää merkkiaine ALDH1

korkea solujen DEAB säätökennoja käytettiin tarkkuuden varmistamiseksi analyysi. Edustaja SW-1353-soluja käsiteltiin läsnä ollessa ALDH1 inhibiittorin DEAB (kuvio 1A) tai värjättiin Aldefluor® reagenssin, jotka on määritelty ALDH1

korkea-soluja (kuvio 1 B). Lajittelu kokeita on suoritettu vähintään viisi kertaa kullakin solulinjassa. Määrä ALDH1

korkea solujen annetaan keskiarvo ± SD oli 1,77 ± 0,9% fibrosarkoomasolulinjoilla SW-684 (n = 12), 0,77 ± 0,4% että liposarkooma solulinjan SW-872 (n = 5) , 2,23 ± 1,0% että nivelkalvon sarkoomasolulinja SW-982 (n = 11), ja 2,69 ± 1,3% että kondrosarkoomasolulinjassa SW-1353 (n = 8) vastaavasti. Kordooma solulinja MUG-Chor 1 osoitti vain pieni osa 1,11 ± 0,5% ALDH1

korkea soluja (n = 9) (kuvio 1 C). Siksi keskityttiin kolmeen sarkoomasolulinjoja SW-684, SW-982, ja SW-1353 seuraavissa kokeissa. Vuonna harvenneiden määrityksessä ALDH1

suuren kannan syntyy tilastotieto merkittävä korkeampi huomioon 41.73 ± 18,5% (* p = 0,0039) ALDH1

korkea solujen SW-684-solut, 52,5 ± 8,75% (* p = 4,39 E-07) SW-982-solulinjassa, ja 31,7 ± 11,1% (* p = 0,0025) (n = 5) SW-1353 kondrosarkoomasoluissa (kuvio 1 D). Muita havaintomme tehostetun ALDH1 ilmaisun voitaisiin näyttää toteen Western blot -analyysillä (kuvio 1 E, taulukko 2).

ALDH1

korkea Solut Näytä Korkeampi leviämisen ja kyky muodostaa klooneja

käyttäminen ImageScope ohjelmisto Ki-67 positiiviset ja negatiiviset solut kvantifioitiin jälkeen immunohistokemiallisella värjäyksellä. ALDH1

korkea soluja kaikista kolmesta solulinjoista on lisääntynyt leviämisen taso verrattuna ALDH1

alhainen soluja. Edustavia värjäys SW-982 ALDH1

korkea (kuvio 2A) ja ALDH1

pieni soluja (kuvio 2B) esitetään ja yhteenvetona taulukossa 2 (n = 5). Lisäksi ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen solujen erosivat merkittävästi logaritminen kasvunopeus mitataan xCELLigence-System (kuvio 2C-E).

Kuva 3A esittää klonogeeniset aktiivisuus ALDH1

korkea ja ALDH1

alhainen soluja. Tiedot viidestä itsenäisestä kokeesta osoittavat keskimääräistä pesäkelukua /hyvin 14 vuorokauden kuluttua ja kaikki arvot on lueteltu taulukossa 2. Klooni muodostuminen tehokkuus oli merkitsevästi korkeampi SW-1353 ALDH1

korkea solujen verrattuna vastaaviin ALDH1

pieni soluja ( * p = 0,0005). Kahden muun solulinjat nämä vaikutus voitaisiin myös osoittaa kuitenkin pienemmässä määrin. Mitä suurempi määrä siirtomaiden SW-684, SW-982, ja SW-1353 ALDH

korkea solut on esitetty (kuvio 3B).

mRNA Expression of ABCG2, c-Myc, β- kateniinin, ja SOX-2 yläreguloituja ALDH1

korkea solut

olivatko ALDH1

korkea soluja rikastetaan geenien ilmentymisen, jotka on oletettu avainosuudet kantasolujen biologiassa, kuten kuten c-Myc, β-kateniinin, ja SOX-2 [19]. Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti lisääntynyt ilmentyminen c-Myc on ALDH1

suuren kannan, kun taas lajittelemattoman säätökennoja (ctrl) ja ALDH1

alhainen soluja oli vain minimaalinen ilmaisu (kuvio 4A). Samoin hieman, mutta ei merkittävä kasvu ilmentymisen β-kateniinin, ja SOX-2: n ALDH1

suuri osa voitiin havaita (n = 6) (kuvio 4B-C).

suhteellinen ilmentyminen kolmen suuren lääkkeiden kantaja ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ja ABCB1 /MDR1 määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR (n = 5). Mielenkiintoista ALDH1

korkea väestön kaikista sarkooma solulinjojen osoitettiin, jossa tilastollinen merkitys, lisääntynyt ekspressiotasot ABCG2 verrattuna valvoa tai ALDH1

pieni soluja (kuvio 4D), kun taas p-arvo ABCA2 ollut merkittävä (kuva 4E). Lisäksi ALDH1

high SW-1353-solujen tilastotieto merkittävä korkeampi ilmentyminen ABCB1 (p = 0,0302) voitiin havaita (kuvio 4F). 2

-ΔΔCT arvot ja vastaava p-arvot on lueteltu taulukossa 2.

ALDH1

korkea solut näyttävät Enhanced Drug Resistance

Syöpä kantasolu hypoteesi ehdottaa, että ristiriita hoitovasteen ja potilaan eloonjäämisen todettiin useimmissa syöpätyypeissä heijastaa luontainen vastus syövän kantasoluja kemoterapiaa. Tutkia mahdolliset erot lääkeresistenssin ALDH1

korkea ja ALDH1

matalan lajiteltu SW-982 ja SW-1353-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia kolme yleisesti käytetty kemoterapia-aineiden jälkeen kahden viikon elvytysvaihe. ALDH1

high SW-982 soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 1,0 uM (p = 0,016) ja 5,0 uM (p = 0,001) doksorubisiinin merkittävästi noussut verrattuna ALDH1

pieni soluja (kuvio 5A). Käsittelemällä 1,0 uM epirubisiinia (p = 0,045) indusoi tehostettua lääkeresistenssin (kuvio 5B). SW-1353 ALDH1

korkea solut oli samanlainen merkittävä vaikutus käsittelyn jälkeen 5,0 uM doksorubisiinin (p = 2.77E-05) (kuvio 5D) ja 0,5 uM epirubisiinia (p = 0,039) ja 1,0 uM epirubisiinia (p = 0,021 ) (kuvio 5E). Käsittely sisplatiini aiheutti vain pieniä eroja ALDH1

korkea ja ALDH1

matalan SW-982 ja SW-1353-soluissa (kuvio 5C ja 5F). Vuonna fibrosarkoomasolulinjoilla SW-684 ei ole merkittäviä eroja ei voitu havaita. Keskiarvo ± SD kaikkien kokeiden sovitettiin mukaan Hillin yhtälöä. Vastaava laskettu IC

50-arvot on lueteltu taulukossa 2.

Keskustelu

Tämänhetkisen syövän kantasolujen (CSC) hypoteesi, ainoastaan ​​pieni subpopulaatio sisällä heterogeeninen kasvain väestö on pystyy aloittamaan uudelleen aloittamista kasvaimia. Käsite CSCS perustui havaintoon, että kun syöpäsolujen on paljon erilaisia ​​analysoitiin niiden proliferaatiopotentiaali erilaisissa määrityksissä

in vitro

ja

in vivo

, vain pieni osa soluista osoitti laaja leviämisen [20]. CSCS on tunnistettu erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [21], [22], [23]. Yksi widly hyväksytty tapa tunnistaa CSCS perustuu entsymaattiseen aktiivisuuteen aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1), myrkkyjä entsyymi, joka vastaa hapetuksen solunsisäisen aldehydien [8], [21]. On olemassa erilaisia ​​isoformeja ALDH. Aldefluor® määritys on kehitetty havaita aktiivisuutta ALDH1 isoformin. ALDH1 aktiivisuus osoitti lisätään CSCS ja sitä on käytetty eristämään CSCS eri syövistä [24], [25], [26]. Siksi ALDH1

korkea solujen näyttää useita piirteitä yleensä nähty CSCS, mukaan lukien kyky itseuudistumisen, sukupolvi eriytetty jälkeläisten, ja lisääntynyt ilmentyminen kantasolujen markkerigeeni. Tutkimuksessa CSC biologian perustuu siihen kykyä arvioida tarkasti CSC edustus syöpäsolun populaatioissa. Ehdottivat uudempia tietoja CSC edustus voi olla funktio solutyypin alkuperän, strooman microenvironment, kertynyt somaattiset mutaatiot ja vaihe pahanlaatuisten etenemisen saavutettu kasvaimeen [27], [28].

Toistaiseksi , että tällainen varsi kaltainen solupopulaation ihmisen osteosarkooma ja Ewingin sarkooma solulinjoja on perustunut ilmentymisen kantasolujen markkerigeeni sekä niiden kyky muodostaa sferoideja

in vitro

[29], [30], [31]. On ehdotettu, että tunnistaminen CSC voi luottaa yksinomaan puolella väestöstä (SP) lajittelua käyttämällä ulosvirtaus Hoechst 33342 väriainetta. Kuitenkin SP fenotyyppi ei ole esitetty kaikissa CSCS ja siellä voi olla muita puolustava järjestelmiä CSCS kiertää lääkehoitoja, joita ei voida tunnistaa Hoechst väriaine värjäystä [32]. Siksi valitsimme merkki ALDH1. Tuloksemme osoittavat, että kaikki viisi sarkoomasolulinja riveistään eri prosenttiosuus ALDH1

korkea soluja, joissa on suurin osuus fibrosarcoma, nivelkalvon sarkooma, ja kondrosarkoomasolun linjat. Pieni ALDH1 ilmentymistä ALDH

alhainen solujen western blot-analyysi voidaan selittää käyttö ALDH1 /2 ensisijainen vasta-aine. Lisääntyminen korko ja kyky muodostaa klooneja SW-684, SW-982, ja SW-1353 ALDH1

korkea solujen

in vitro

olivat huomattavasti korkeammat kuin ALDH1

alhainen soluja, sopusoinnussa ominaisuudet korkea ALDH1 aktiivisuus fenotyyppi muissa syöpäsoluissa [33], [34], mikä saattaa tarkoittaa, että ALDH1

korkea soluja sarkooma ovat osittain vastuussa tuumorimetastaasin ja toistuminen ja se olisi keskitettävä aikana syövän hoidossa. Koska c-Myc on hiljattain tunnustettu tärkeäksi säätelijänä kantasolujen biologiaan, se voi toimia linkkinä yhdistää maligniteetti ja ”stemness” [35]. Johdanto c-Myc muiden transkriptiotekijöiden (kuten SOX-2) generoi indusoi pluripotenttien kantasolujen erilaistuneita soluja [36]. Wnt /β-kateniinin signaloinnin tärkeä rooli ei vain syövän, mutta myös syövän kantasoluja [37]. Meidän kvantitatiivinen RT-PCR data osoitti lisääntynyt ilmentyminen c-Myc, β-kateniinin, ja SOX-2 vuoden ALDH1

suuren kannan, kun taas lajittelemattoman säätökennoja (ctrl) ja ALDH1

alhainen soluja oli vain vähäinen ilme.

ehdotettu mekanismi kemoterapia resistenssin syövän kantasoluja perustuu tehostetun ilmentymisen ATP-sitova kasetti (ABC) kuljetus proteiineja, jotka ovat vastuussa lääkevuoto-. Korkeampi ilmentyminen ABC liikenteen proteiinien kantasoluja verrattuna ei-kantasolujen johtaa suhteellisen vastus kantasolujen myrkyllisiä vaikutuksia kemoterapiaa huumeiden [12], [13]. Analysoimme mRNA ilmaus kolmen suuren lääkkeiden kantaja (ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ABCB1 /MDR1) ABC transporter perhe. Esillä olevassa tutkimuksessa, ABCG2 on yliaktiivista ALDH1

korkea solujen kaikkien kolmen sarkooma solulinjoissa. Lisäksi toinen ABC transporter ABCB1 /MDR1 havaittiin myös suuremmilla mRNA ekspressiotaso SW-1353 ALDH1

korkea solujen verrattuna ALDH1

alhainen soluja. Nämä geenit voivat olla vastuussa monilääkeaineresistenssi syöpäsolujen ja olisi ihanteellinen tavoitteita kliinisen syövän hoidossa.

Muita, ALDH1

korkea solut osoittivat lisääntynyttä resistenssiä yleisesti käytettyjen kemoterapeuttisten. ALDH1

korkea solujen SW-982 ja SW-1353 osoitti merkitsevästi pienempi herkkyys sekä doksorubisiinia ja epirubisiinia verrattuna ALDH1

alhainen soluja. Sisplatiini käsittely osoitti vain pieniä eroja. Yhdessä me menestyksekkäästi eristetty ALDH1

korkea soluja eri sarkooma solulinjoista käyttämällä Aldefluor® määritystä. ALDH1

korkea solut osoittivat

in vitro

merkittävästi korkeampi leviämisen nopeus, lisääntynyt klooni muodostumisen tehokkuutta, kohonnut ilmentyminen ABC kuljettajat ja stemness merkki, sekä lisääntynyt kemoterapeuttinen lääkeresistenssin verrattuna ALDH1

alhainen solujen .

Lopuksi, läsnä kantasolujen kaltaisten solujen lisääntynyt ALDH1 ilmaisu voisi olla yksi mahdollinen osallistujien kehittämiseen lääkeresistenssin sarkoomia. Lisätutkimuksia tarvitaan määrittelemään sarkooma kantasoluja ja mekanismit lääkeresistenssin, mutta ALDH1

korkea väestö voi toimia

in vitro

malli etsimään uusia terapeuttisia hoitovaihtoehtoja.

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Heike Kaltenegger ja Alexandra Novak erinomaisen teknistä tukea.