Krooninen sairaus

tiivistelmä

suuri haaste Onkologia ja farmakologian on kehittää tehokkaampia ja vähemmän myrkyllisiä lääkkeitä, jotka vähentävät kasvaimen kasvua ja parantaa selviytymistä keuhkosyöpäpotilaita. Salinomysiiniä on polyeetteri antibiootti käytetään tappaa gram-positiivisia bakteereja kuten mykobakteerit, alkueläimiä kuten Plasmodium falciparum, ja loiset vastuussa siipikarjan tauti kokkidioosia. Tämä vanha aine on nyt vakava syövän lääke-ehdokas, joka selektiivisesti estää syöpäsolujen kasvun kantasoluja. Olemme tutkineet vaikutus salinomysiinin eloonjäämiseen, pesäkekasvun, muuttoliike ja invaasion eriytetyn ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä linjojen LNM35 ja A549. Salinomysiininatrium aiheutti pitoisuudesta ja ajasta riippuva väheneminen elinkelpoisuutta LNM35 ja A549-solut kautta kaspaasi 3/7 liittyvien solukuolemareittiin. Vastaavasti salinomysiiniä (2,5-5 pM 7 päivää) laski merkittävästi kasvua LNM35 ja A549 pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Etäpesäke on tärkein kuolinsyy liittyvät keuhkosyöpään. Tässä yhteydessä salinomy- indusoi ajasta ja pitoisuudesta riippuva esto solumigraation ja invaasiota. Olemme myös osoittaneet ensimmäistä kertaa, että salinomysiini indusoi selvästi ekspression lisääntymisen pro-apoptoottista proteiinia, NAG-1, joka johtaa inhibitioon keuhkoissa syöpäsoluinvaasiota mutta ei solujen selviytymiseen. Nämä havainnot tunnistaa salinomysiinin on lupaava uusi terapeuttinen aine keuhkosyöpään.

Citation: Arafat K, Iratni R, Takahashi T, Parekh K, Al Dhaheri Y, Adrian TE, et ai. (2013) estovaikutus Salinomysiini Cell Survival, Colony Growth, Migration, ja Invasion of Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 ja LNM35: osallistuminen NAG-1. PLoS ONE 8 (6): e66931. doi: 10,1371 /journal.pone.0066931

Editor: Ramon Andrade de Mello, Porton yliopisto, Portugali

vastaanotettu: 16 joulukuu 2012; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2013 Julkaistu: 21 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Arafat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Terry Fox rahastosta Cancer Research (SA ja TA) ja osittain UAEU-National Research Foundation rahasto SA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä on yksi korkeimmista kuolleisuus maailmassa. Kemoterapeuttisten aineiden käytössä keuhkosyöpään ovat epätyydyttäviä johtuen liittyvän tehon puutteen, lääkeresistenssin ja co-sivusuunnassa myrkyllisyys. Kohdennettu hoitojen valituille potilasalaryhmissä muodostavat huomattavaa edistystä hoidossa keuhkosyövän. Kuitenkin yli 50% keuhkosyövässä ei ole mitään erityistä geneettinen profiili ja eivät siten ole hyviä ehdokkaita täsmähoitoihin. Näistä edistysaskeleista huolimatta nykyiset hoidot keuhkosyöpään voi pidentää käyttöikää kuukautta, mutta eivät paranna sairautta [1]; [2]; [3].

Salinomysiini on polyeetteri antibiootti käytetään tappaa gram-positiivisia bakteereja kuten mykobakteerit, protazoans kuten Plasmodium falciparum, ja loiset vastuussa siipikarjan tauti kokkidioosia. Se on myös yleisesti syöttää märehtijöille parantaa ravinteiden imeytymistä ja rehun tehokkuus [4]; [5]. Tämä vanha aine on nyt vakava syöpälääkettä ehdokas [6]; [7]. Ensinnäkin, se on osoitettu, että salinomysiini estävät selektiivisesti rintakasvaimeen kantasoluja, viittaa siihen, että sitä voidaan käyttää syöpälääkkeenä [8]. Salinomysiiniä tunnistettiin myös selektiivinen estäjä leukemia kantasolujen, osteosarkooma kantasolut sekä haimasyövän kantasolujen [9]; [10]; [11].

On raportoitu, että useita erilaisia ​​syöpälääkkeitä, kuten gamma-säteilytyksen, sytotoksiset lääkkeet, NSAID: t, merkittävästi lisätä ilmentymistason NSAID-aktivoitu-geenin, NAG-1 [12]. NAG-1, joka tunnetaan myös nimellä Macrophage estävä sytokiini (MIC-1), ja kasvun ja erilaistumisen factor-15 (GDF-15), on transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) super-perhe, joka voi välittää indusoiman apoptoosin ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet soluissa, jotka eivät ekspressoi syklo-oksigenaasi [13]; [14]. Yleisesti, NAG-1 toimii tuumorisuppressoriproteiinia inhiboimalla kasvaimen kasvun ja apoptoosin indusoimiseksi alkuvaiheessa syöpä ja useat tutkimukset osoittavat, NAG1 induktion olla mukana solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [15].

nykyinen tutkimus selvittää vaikutuksia salinomysiinin eloonjäämiseen, pesäkekasvun, muuttoliike, ja hyökkäys eriytetty ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut LNM35 ja A549 sekä mahdolliset vaikutukset NAG-1 näistä vaikutuksista.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen keuhkosyöpäsoluissa LNM35 [16] ja A549 ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK). Kaikki alustat on täydennetty antibiooteilla (penisilliini 50 U /ml; streptomysiiniä 50 ug /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Biowest, Nouaille, Ranska). Salinomysiini ostettiin Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska).

Solujen elinkelpoisuus

Solut ympättiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille . 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin vielä 24 ja 48 h: n eri konsentraatioilla salinomysiini (0,1-50 uM) kolmena kappaleena. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin 0,1% DMSO (lääkkeen ajoneuvo). Vaikutus salinomysiinin solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega Corporation, Madison, USA), joka perustuu määrällisesti ATP, joka viestittää läsnäolo metabolisesti aktiivisia soluja. Luminoiva signaali mitattiin käyttäen GLOMAX Luminometer järjestelmään. Tulokset esitettiin suhteessa elinkelpoisuus (%) vertaamalla salinomysiini-käsiteltyjen solujen kanssa DMSO-käsiteltyjen solujen elinkelpoisuus, jonka oletetaan olevan 100%.

kaspaasi 3/7 aktiviteetti

solut ympättiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevylle ja käsiteltiin salinomysiini (10 ja 50 uM) 24 tunnin ajan, kolmena kappaleena. Ohjaus solut altistettiin DMSO pitoisuutena, joka vastaa n salinomysiinin käsiteltyjä soluja (0,1% DMSO). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin käyttämällä luminoivaa kaspaasi-Glo 3/7 iinianalyysikitissä noudattamalla valmistajan ohjeita (Promega Corporation, Madison, USA). Kaspaasi-reagenssia lisättiin ja levyä sekoitettiin ja inkuboitiin 2,5 tuntia huoneenlämpötilassa. Luminesenssi mitattiin käyttäen GLOMAX Luminometer järjestelmä.

Soft agarissa pesäkkeiden kasvun määrityksessä

kerros agarille, joka sisälsi 1 ml: n 2,4% matalassa lämpötilassa sulavassa Noble-agar liuotetaan tislattuun veteen kaadettiin kuoppiin 6-kuoppaisen soluviljelylevyn astia ja annettiin kovettua 4 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Toinen kerros (2,9 ml), joka sisälsi 0,3% alhaisen sulamispisteen Noble-agar liuotetaan kasvualustaa, joka sisälsi soluja (5 x 10

3 solua /ml) laitettiin päälle ensimmäisen kerroksen ja annettiin kovettua 4 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten siirtää ne kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 30 minuutista 1 tuntiin. Kasvualustaan ​​(2 ml), lisättiin sen päälle toisen kerroksen, ja soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 14 päivää ja sitten sitä käsiteltiin vielä 7 päivää kanssa salinomysiini (2,5 ja 5 uM). Ohjaus solut altistettiin 0,1% DMSO: ta. Elatusaine vaihdettiin kahdesti viikossa. Lopussa kokeen, pesäkkeet värjättiin 1 tunnin ajan 2% Giemsa tahra, ja inkuboitiin PBS: ssa yön yli poistamaan ylimäärä Giemsa tahra. Pesäkkeet kuvattiin ja teki. Tulokset esitettiin suhteessa pesäkkeiden (%) vertaamalla salinomysiinin käsiteltyä pesäkkeet kanssa DMSO-käsitellyn pesäkkeitä, pesäkkeet, joiden oletetaan olevan 100%.

Haavan paranemista motiliteetin määritys

LNM35 ja A549-soluja kasvatetaan kuuden hyvin kudosviljelymaljoille, kunnes konfluentteja. Viljelmiä inkuboitiin 10 min Moscona puskurilla. Kaapia tehtiin läpi yksisolukerroksena muovisella pipetin kärki 1 mm halkaisijaltaan. Sen jälkeen maljat pestiin kahdesti ja inkuboitiin 37 ° C: ssa tuoreessa RPMI, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia läsnä ollessa tai poissa ollessa ei-toksisia pitoisuuksia salinomysiini (0,1-0,5 uM) ja A549 ja salinomysiini (0,05-0,1 uM ) ja LNM35 soluja. Ohjaus solut altistettiin 0,1% DMSO: ta. Alareunassa puolella kuhunkin maljaan kahden mielivaltaisen paikoissa, jotka on merkitty, missä leveys haava mitattiin käännettyä mikroskooppia (tavoite x 4). Motiliteettia ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM mittausten ero 0, 6, 24 ja 30 h sen jälkeen, kun haava.

Matrigel invaasiomääritys

invasiivisuuden keuhkosyöpä solut LNM35 käsiteltiin kanssa salinomysiiniä (+0,05-+0,1 uM) ja A549-soluja käsiteltiin salinomysiinin (0,1-0,5 uM) testattiin käyttämällä BD matrigeelin Invasion Chambers (8-mikrometriä huokoskoko BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut (1 x 10

5 solua 0,5 ml: ssa median ja osoitettu pitoisuus on salinomysiinin) ympättiin yläkammiot järjestelmän, pohja kuopat järjestelmän täytettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia chemo-houkutin, ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 24 tuntia. Ohjaus solut altistettiin 0,1% DMSO: ta. Ei-tunkeutuva solut poistettiin yläpinnan suodattimen pumpulipuikolla. Solut, jotka ovat siirtyneet kautta matrigeelin kiinnitettiin 4% formaldehydiä, värjättiin DAPI ja laskettiin 25 satunnaisessa aloilla mikroskoopilla. Määritys suoritettiin kahtena ja toistettiin kolme kertaa kvantitatiivisen analyysin. Tulokset esitettiin suhteessa invasiivisuus (%) vertaamalla salinomysiini-käsiteltyjen solujen kanssa DMSO-käsiteltyjen solujen hyökkäys, jonka oletetaan olevan 100%.

PCR-monistus ja NAG-1-mRNA: n

eristäminen kokonais-RNA soluista suoritettiin käyttäen Maxwellin 16 Research System (Promega) ja kokonais-RNA-puhdistuskittiä (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuus ja puhtaus RNA-näytteet määritettiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä (A260) ja suhde absorbanssi 260 nm: ssä ja 280 nm: n (ND-1000, NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA).

Gene Expression analyysi suoritettiin käyttäen kahta vaihetta RT-PCR-reaktiossa. Ensinnäkin Kokonais-RNA muunnettiin cDNA käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Integrated Gulf Biosystems, Dubai, UAE # 4374966) lopulliseen pitoisuuteen 50 ng RNA: 20 ul PCR-reaktiossa 10 × RT-puskuria 2,0 ui , 25 x dNTP Mix (100 mM) 0,8 ui, 10 × RT Random Primers 2,0 ui, MultiScribe ™ käänteiskopioijaentsyymin 1,0 ui, RNaasi-inhibiittori 1,0 ui, nukleaasivapaa vesi 3.2 ui. Käänteiskopiointi suoritettiin Veriti lämpösyklilaitteessa (Life Technologies), käyttäen seuraavia parametreja: 25 ° C: ssa 10 minuuttia, 37 ° C: ssa 120 min, ja 85 ° C: ssa 5 min. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-määritystä varten kiinnostavan geenin suoritettiin kolmena rinnakkaisena on Fast ABI Prism 7900HT sekvenssi tunnistusjärjestelmä (Life Technologies) käyttäen, ennalta Taqman geeniekspression määritystä NAG-1 (GDF15 Life Technologies # Hs00171132_m1) ja Human hypoksantiinia fosforibosyylitransferaasi (Hprt1 rRNA) kuin endogeeninen kontrolli (Life Technologies # 4326321E). Laimennetusta cDNA, 4 ui (20 ng) käytettiin templaattina 10 ul: singleplex PCR-reaktiossa, joka sisälsi 2 x TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix, o AmpErase ® UNG (5 ui) (Life Technologies # 4352042), 20 x TaqMan® Gene Expression Assay (0,5 ui), RNaasi vapaa vesi 0,5 ui. PCR lämpökäsittelyyn parametrit ajettiin Fast-tilassa seuraavat 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 20 s ja sen jälkeen 40 sykliä 95 ° C 1 s ja 60 ° C: ssa 20 s. Tulokset alun perin analysoitiin ABI Prism 7900HT SDS-ohjelman v2, 4, kaikki jäljellä olevat laskelmat ja tilastollinen analyysi suoritettiin SDS RQ Manager 1.1,4 ohjelmisto käyttäen 2-ΔΔCt menetelmä, jossa suhteellisen kvantifioinnin RQmin /RQmax luottamusta asetettu 95%

Expression of pro-apoptoottista proteiinia, NAG-1

LNM35 ja A549-soluja siirrostettiin 100 mm: n annoksia 3 x 10

6 solua /malja 24 tuntia ja kasvavien pitoisuuksien kanssa of salinomysiiniä (1-50 uM) vielä 24 tunnin ajan. Ohjaus solut altistettiin 0,1% DMSO: ta. Solun kokonaisproteiinista eristettiin käyttäen RIPA-puskuria (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1% nonidet P-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 0,5% proteaasi-inhibiittoreita cocktail, 1% PMSF, 1% fosfataasinestäjällä cocktail) alkaen ohjaus ja käsitellyt solut. Kokosolulysaatissa otettiin talteen sentrifugoimalla 14000 rpm: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa liukenemattoman materiaalin poistamiseksi, ja 30 ug proteiineja erotettiin SDS-PAGE-geeli NAG-1 ilmentymisen (Cellular Signaling Technology, MA, USA). Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle, blokattiin 5% rasvattoman maidon ja tutkittiin NAG-1 (1:200) ja β-aktiini (1:1000) vasta-aineita, yön yli 4 ° C: ssa. Blotti pestiin, altistettiin toissijainen vasta-aineilla ja käyttäen ECL-järjestelmää (Pierce).

vakaiden NAG-1 hiljentäminen keuhkojen syöpäsoluja ja sen vaikutukset estämällä solujen elinkelpoisuuden ja invaasiota aiheuttama salinomysii-

A549-soluja ympättiin tiheydellä 20000 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille, kun läsnä on seerumin ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Solut transfektoitiin kolmella eri mallit SMARTvector 2,0 Lentivirusvektorikonstruktit shRNA hiukkasia kohdistaminen NAG-1 tai SMARTvector 2.0 Non-kohdistaminen Kontrollihiukkaset (Dharmacon Thermo Scientific, USA), joka sisälsi puromysiiniresistenssigeenin valintaa ja GFP tunnistamiseen Positiivisten kloonien ja altaat klooneja. Valinta solujen stabiilisti ilmentävien NAG-1 shRNA ja Control shRNA alkoi 72 tuntia transfektion jälkeen valmistajan ohjeiden (Dharmacon Thermo Scientific, USA). Lyhyesti, kasvualusta imettiin pois soluista ja korvattiin tuoreella valinta alustalla, joka sisälsi 10 ug /ml puromysiiniä. Puromysiinin sisältävä väliaine korvattiin välein 2-3 päivää tuoreeltaan valmistetun selektioelatusaineessa, ja valinta vakaan soluja, jotka ilmentävät NAG1-shRNA tai Control shRNA valmistui noin 4 viikkoa alkamisesta valintaa. Useita klooneja ja altaat kloonit laajennettiin, ja GFP-positiivisten altaat klooneja analysoitiin western-blot tutkia ilmentymistä NAG-1-hoidon jälkeen salinomysiini 5 uM. Seuraavaksi tutkimme invasiivisuus ja elinkelpoisuuden A549 soluja, jotka ilmentävät NAG1-shRNA tai Ohjaus shRNA vastauksena salinomy-.

Tilastot

Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SEM lukumäärästä kokeita. Ero kokeellisia ja ohjaus arvot arvioitiin ANOVA seurasi Dunnettin post-hoc monivertailutestillä. P 0,05 osoita merkitsevää eroa.

Tulokset

Salinomysiini estää keuhkosyövän solujen elinkelpoisuuden

altistuminen LNM35 (kuva. 1A) ja A549 (kuvio. 1 B) solujen salinomysiiniä pitoisuudet (0,1-50 uM) 24 tai 48 tunnin vähentynyt solujen elinkelpoisuutta pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. IC

50 pitoisuudet 24 tunnin olivat välillä 5-10 uM salinomysiinin molemmille solulinjoissa. 48 tunnin kuluttua hoidon, IC

50 pitoisuudet laskivat välillä 1,5-2,5 uM salinomysiini 90%: n inhibition solujen elinkelpoisuuden sekä solujen pitoisuus 50 uM.

Eksponentiaalisesti kasvavat LNM35 (A , C) ja A549 (B, D) soluja käsiteltiin ajoneuvon (0,1% DMSO) tai osoitetut pitoisuudet salinomysiini. Vasemmassa paneelissa edustaa 24 h altistumisen, kun taas oikea paneeli edustaa 48 tuntia altistuksen. Elävät solut määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Induktio kaspaasi 3/7 aktiivisuus analysoitiin LNM35 (E) ja A549 (F) soluja käsiteltiin 24 h salinomysiini (10 ja 50 uM), normalisoidaan elinkykyisten solujen lukumäärä kuoppaa kohti ja ilmaistuna kertainen induktio verrattuna kontrolliryhmässä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. * Merkittävästi erilainen P 0,05, ** Merkittävästi erilaiset P 0,01, *** Merkittävästi erilaiset P 0,001.

kaspaasi-3/7 välttämätöntä apoptoottisen solukuoleman polkuja ja analysoitiin LNM35 ja A549-soluja käsiteltiin 24 h salinomysiini (10-50 uM), ja normalisoitiin solujen määrä kuoppaa kohti. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus lisääntyi yli 17-kertaisesti LNM35 soluissa (kuvio. 1 C) ja 12-kertaisesti A549-solut (kuva. 1 D), altistuminen salinomy- 50gM. Tämä osoittaa, että salinomysiinin indusoi solukuoleman kautta kaspaasi 3/7 liittyvien reitin.

Salinomysiini heikentää pesäkkeen kasvua pehmeässä agarissa

Salinomysiini esti voimakkaasti LNM35 (Kuva. 2A, 2C) ja A549 ( Kuvio. 2B, 2D) pesäkkeen kasvua pehmeässä agarissa pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

LNM35 (A) ja A549 (B) soluja kasvatettiin tiheyteen 5000 solua /kuoppa pehmeässä agarissa väliaineessa 6-kuoppaisille levyille. 14 päivän jälkeen, muodostivat pesäkkeitä käsiteltiin 7 päivää eri pitoisuuksilla salinomysiini (2,5 ja 5 uM). Lopussa pesäkkeet värjättiin Giemsa ja teki. Edustavia kuvia muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa välillä LNM35 (C) ja A549 (D) valokuvattiin.

Salinomysiini heikentää keuhkosyöpäsolua muuttoliikettä ja invaasiota

Keuhkosyöpä potilailla on suuri riski kehityksen etäpesäkkeiden alkaen soluvaelluksen primaarikasvaimen, mikä johtaa paikalliseen kudosinvaasio ja tuloa imunesteen tai verisuonet ja lopuksi kolonisaatio kaukaisten elimiin. Kyky salinomysiinin vähentää solumigraatiota tutkittiin käyttäen haavan paranemista malli. Salinomysiiniä vähensi solujen migraation LNM35 (kuva. 3A) ja A549 (kuvio. 3B) solut pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Samoin salinomysiiniä heikentynyt hyökkäys LNM35 (kuva. 3C) ja A549 (kuvio. 3D) solujen Matrigel invaasiomääritys. Salinomysiini inhibitio solumigraatiota ja matrigeeliä hyökkäys tapahtui ilman merkittävää vähentämistä solujen elinkelpoisuuden (kuvio. 1).

Haavat käyttöön LNM35 (A) ja A549 (B) konfluentteja mono-kerrosta viljellään, kun läsnä tai poissa (valvonta) salinomysiinin (0,05-0,5 uM). Keskimääräinen etäisyys, että solut kulkivat reunasta kaavittu alueen 6, 24, ja 30 h 37 ° C: ssa mitattiin sokkona, käyttämällä käännettyä mikroskooppia. C) LNM35 soluja inkuboitiin 24 h: n läsnä tai poissa ollessa salinomysiini (+0,05-+0,1 uM). D) A549-soluja inkuboitiin 24 h läsnä ollessa tai puuttuessa salinomysiini (0,1-0,5 uM). Solut, jotka tunkeutunut osaksi Matrigel pisteytettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

Salinomysiini indusoi NAG-1-mRNA: n ja proteiinin ekspression

Ensinnäkin, A549-solut altistettiin eri pitoisuuksilla salinomysiini ( 0,5-10 uM) 2 ja 24 h uutettiin kokonais-RNA ja arvioitiin NAG-1-mRNA: n ilmentymisen. Kuten kuviossa 4A on esitetty, salinomysiinin indusoi merkitty ajasta ja pitoisuudesta riippuvainen induktio NAG-1-mRNA: n ilmentymisen, jolla on kymmenen kertainen lisäys saavutetaan 24 tunnin altistuksen jälkeen 10 uM salinomysiini (kuvio. 4A). Seuraavaksi LNM35 ja A549-solut altistettiin eri pitoisuuksia salinomysiini (1-50 uM) 24 tunnin ajan ja koko proteiinien arvioitiin NAG-1 ilmentymisen. Sekä LNM35 ja A549-soluja, salinomysiinin indusoi merkittävästi konsentraatiosta riippuvaisen induktio NAG-1-proteiinin ilmentymistä (kuvio. 4B).

Solut altistettiin eri pitoisuuksia salinomysiini, ja kokonais-RNA uutettiin sen jälkeen 2 ja 24 tuntia ja analysoitiin NAG-1 mRNA: n ekspression A549-soluja (A) ja 24 tunnin kuluttua proteiinin ilmentymistä sekä A549 ja LNM35 soluja (B).

NAG-1 hiljentäminen kumota anti invasiivisia vaikutus salinomysiinin

Kuten on esitetty kuviossa 5A, hiljentämisen NAG-1 (NAG-1-shRNA1) käänteinen induktion NAG-1-proteiinin ekspression hoidon jälkeen 5 uM salinomysiini. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahden muun mallit shRNA (NAG-1-shRNA2 ja NAG-1-shRNA3) (tuloksia ei ole esitetty). Selektiivisyys Tämän hiljentäminen vahvisti se, että ei ole vaikutusta NAG-1-proteiinin ilmentymistä ei havaittu soluissa, jotka on transfektoitu shRNA ohjaus hiukkasten (valvonta-shRNA) verrattuna ei-transfektoiduissa soluissa. Hiljentäminen NAG-1 induktio käyttäen kolmea eri malleja NAG-1-shRNA (1, 2 ja 3) ei vähentää kykyä salinomysiinin indusoimat A549 solukuolemaa (kuvio 5B), mutta täysin päinvastainen anti-invasiivinen vaikutus salinomysiini (kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että NAG-1 välittää anti-invasiivisen, mutta ei solukuolemaa vaikutus salinomysiini.

hiljentäminen NAG-1 tukahdutti lisääntyneen ekspression NAG-1 indusoi salinomysiini (A ) ilman vaikutusta inhibitio A549-solujen elinkelpoisuuden aiheuttama salinomysiini (B) johtaa täydelliseen tukahduttaminen on anti-invasiivisen potentiaalin salinomysiini (C).

keskustelu

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä maailmassa ja on myös korkein kuolleisuus. Oli 1610000 keuhkosyöpää (12,7% kaikista syövän taakka) vuonna 2008 1,38 miljoonaa kuolemaa (18,2% kaikista syöpäkuolemista) samana vuonna [17]. Valitettavasti huolimatta kehitys molekyylibiologian keuhkosyöpään, parantunut diagnoosi ja jopa optimaalinen kohdistettuja hoitomuotoja, nykyinen protokollia Keuhkosyövän hoidossa ovat vielä riittämättömiä tuottamaan selkeitä ja jatkuvaa kliinistä hyötyä ja parantamiseen keuhkosyöpäpotilaiden pysyy onnistu. Potilaat kehittävät usein vastustuskyvyn nykyistä täsmähoitoihin huumeet ja nämä lääkkeet ovat myös erittäin kalliita ja ei ole saatavilla useimmissa keuhkosyöpäpotilaita maailmassa [18].

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutus salinomysiiniä kaksi eriytetyn ihmisen ei-pieni keuhkosyöpä solut (LNM35 ja A549) selviytymistä, pesäkekasvun, muuttoliikkeen ja invaasion ja mahdollista roolia NAG-1 syöpää torjuvia vaikutuksia salinomy-.

salinomysiini ( 0,1-50 uM) vähensi elinkelpoisuus LNM35 ja A549 erilaistuneita soluja on pitoisuus-aika-riippuva ja kaspaasi-liittyvä tavalla. Nämä tulokset ovat linjassa aiemmin julkaistut tulokset osoittavat, että pieninä pitoisuuksina salinomysiinin estävät elinkelpoisuuden rintasyövän kantasolujen, leukemia kantasolut, osteosarkooma kantasolut, sekä haimasyövän kantasolujen [8]; [9]; [10]; [11]. Valmistelun aikana tämän tutkimuksen, toinen ryhmä osoitti syövän vastaisen toiminnan salinomysiinin

in vitro

vastaan ​​kantasolun väestöryhmästä A549-soluissa [19]. Vahvistamaan tämän syövän vastaisen vaikutuksen salinomysiinin, tutkimme sen vaikutus kasvuun perustettu pesäkkeitä. Osoitimme, että seitsemän päivän hoidon alhainen pitoisuus salinomysiinin voimakkaasti esti LNM35 ja A549 pesäkkeen kasvua pehmeässä agarissa. Nämä tulokset

in vitro

ovat linjassa muihin tutkimuksiin, jotka osoittavat, että salinomysiinin estää rintasyövän, osteosarkooma, haimasyöpä, sekä maksasyövän kasvu hiirillä [8]; [10]; [11]; [20]. Annokset salinomysiinin käytetään näissä

in vivo

tutkimukset olivat välillä 4 ja 8 mg /kg /IP, jotka ovat pienempiä kuin LD

50 annosta salinomysiini, joka oli 18 mg /kg intraperitoneaalisesti ja 50 mg /kg suun kautta [4]. Kaikki yhdessä viittaavat siihen, että salinomysiinin voi olla pätevä ja turvallinen solunsalpaajaksi ja lisätutkimuksia vaikutusten arvioimiseksi pieni annos salinomysiinin on LNM35 ja A549 kasvaimen kasvua

in vivo

nude-hiirissä.

nykyisessä tutkimuksessa vain korkein pitoisuus salinomysiini (50 uM) oli kykenee indusoimaan kaspaasi 3/7 johtaa solukuolemaan sekä keuhkosyövän soluja LNM35 ja A549. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​meidän äskettäin julkaistu teos osoittaa, että suuri pitoisuus salinomysiinin (50 pM) indusoi aktivointi kaspaasi 3/7 ja PARP pilkkominen johtaa apoptoosin rintasyöpäsolujen MDA-MB-231 [21]. Kuitenkin molemmat tutkimukset keuhkosyöpään solujen ja aiemmin julkaistu tutkimus rintasyövästä soluissa osoittaa, että pieniä pitoisuuksia salinomysiinin (≤10 uM) aiheutti enemmän soluproliferaation inhibointi sijaan solukuoleman [21]. Samoin on osoitettu, että salinomysiinin estää proliferaatiota ja incudes apoptoosin ihmisen maksasyövän [20].

Syöpä etenemistä liittyy kumoamista normaalin valvonnan, joka rajoittaa solumigraatioon ja invaasio, joka lopulta johtaa etäpesäkkeitä. Koska etäpesäkkeet ovat merkittävä kuolinsyy syöpäpotilailla, uusien hoito-ohjelmia, jotka vähentävät invaasio ja etäpesäkkeiden on erittäin tärkeää syövän hoidossa. Tässä yhteydessä olemme osoittaneet, että salinomysiinin indusoi erittäin merkitsevä ajasta ja pitoisuudesta riippuva esto solumigraation ja invaasiota

in vitro

kahden eriytetty keuhkosyövän solulinjat LNM35 ja A549. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että salinomysiinin estää selektiivisesti rintasyövän kantasoluja etäpesäkkeitä

in vivo

[8] ja eturauhassyövän solumigraatio

in vitro

[22].

syövän molekyylitason vaikutusmekanismi salinomysiinin on tutkittu useissa tutkimuksissa. Tässä yhteydessä on osoitettu, että salinomysiini on tehokas syövän vastainen aine, joka indusoi apoptoosia ihmisen syöpäsoluja riippumaton tuumorisuppressoriproteiinia p53 ja kaspaasien aktivaation [9]. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä meidän Tuore tutkimus osoittaa, että salinomysiinin merkittävästi vähentynyt elinkelpoisuutta villityypin p53 MCF-7 ja T47D sekä mutantti p53 MDA-MB-231 ja T47D ihmisen rintasyövän solulinjoissa in ajasta ja pitoisuudesta riippuva käytöstavat [21]. Se on myös osoittanut, että salinomysiini laukaisee apoptoosin PC3 syöpäsolujen nostamalla solunsisäisiä ROS tasolla, mikä translokaation Bax-proteiinin mitokondrioita, sytokromi c vapautumista, aktivointi kaspaasi-3, ja lohkaisu PARP [23]. Salinomysiiniä indusoi myös kaspaasi riippuvainen solu- kuoleman RKO, SW480 ja SW620 koolonkarsinoomasoluissa [24]. On myös osoitettu, että salinomysiinin on tehokas estäjä osteosarkooman kantasolujen sekä lymfaattinen leukemia solut osittain läpi alas-säätely Wnt /μ-kateniinin itseuudistumisen polku [10]; [20]; [25]. Toinen tutkimus osoitti, että salinomysiinin esti eturauhasen syöpäsolun kasvua vähentämällä aldehydidehydrogenaasille ja Nukleaaritekijä-μB toimintaa [22]. Samoin on osoitettu, että salinomysiini estää Akt /NF-KB-reitin, joka johtaa apoptoosin sisplatiinin resistenttien munasarjasyöpäsoluja [26]. On myös osoitettu, että salinomysiini indusoi autophagy paksusuolen ja rintasyövän soluihin [24]. Lisääntynyt fosforylaation DNA-vaurioita liittyvien proteiinien (esim. PH2AX, p53BP1, pBRCA1, pChk1) proteiinit osoittaa suurempaa DNA-vaurioiden ja vahinkojen [27]. Salinomysiiniä lisää DNA säikeen katkoksia ja indusoi fosforylaation DNA-vaurioita liittyvä proteiini, H2AX [28].

NSAID-aktivoitu geeni (NAG-1, GDF-15, ja MIC-1) indusoi useiden apoptoosia indusoivat aineet paksusuolen, eturauhasen, ja keuhkosyövän soluihin [15]; [29]. NAG-1 oli mukana synergistinen apoptoosin induktio yhdistetyn hoidon Natriumsalisylaatin ja PI3K /MEK1 /2-estäjät A549 ihmisen keuhko- adenokarsinoomasolua [30]. NAG-1 ekspressiotasot lisätä merkittävästi syöpäsoluissa, seerumin ja /tai selkäydinnesteestä etenemisen aikana ihmisen erilaisiin aggressiivisia syöpiä, kuten kallonsisäinen aivokasvaimet, melanooma, gastrointestinaaliset, haiman, peräsuolen, eturauhasen, rinnan, ja keuhkojen epiteelin syövät . Kliinistä merkitystä, parannettu NAG-1 ilmentyminen on korreloi positiivisesti huonon ennusteen ja potilaan eloonjääminen [29]; [30]; [31]; [32].

Oletimme, että NAG-1 on osallisena syövän vaikutuksia salinomysiinin ja osoitimme ensimmäistä kertaa, että salinomysiinin indusoi selvästi ajasta ja pitoisuudesta riippuva induktio NAG-1 ilmentymisen . Olemme myös selvästi osoitettu, että NAG-1 vaikuttaa inhibitioon keuhkoissa syöpäsoluinvaasiota mutta ei solukuoleman induktioon, välittyy salinomysiini. Sen sijaan se on raportoitu, että NAG-1 ilmentyminen liittyi invasiivisia mahasyövän solulinjan fenotyyppi ja voivat aiheuttaa lisääntynyt mahalaukun syöpäsoluinvaasiota

in vitro

[33].

on osoitettu, että salinomysiini tehokkuuden parantamiseksi gemsitabiinin hävittämiseksi haimasyövän [11]. Salinomysiiniä myös herkistää rintasyöpäsolujen vaikutuksille doksorubisiinin ja etoposidin hoitoa lisäämällä DNA-vaurioita [28]. Samassa yhteydessä yhdistelmähoito oktreotidin muutettu paklitakselin aktiivinen kohdistaminen misellejä ja salinomysiinin passiivinen kohdistaminen misellejä hoidon parantamiseksi rintasyövistä kautta hävittämiseksi rintasyövän soluja yhdessä rintasyövän kantasolujen [34]. Samoin yhdistelmähoito trastutsumabiannoksen ja salinomysiinin oli ylivoimainen yhden hoidon kunkin lääkkeen hoidossa HER2-positiivisten rintasyövän soluja sekä rintasyövän kantasolujen [35]. Olemme äskettäin raportoitu

in vitro

, että salinomy- pystyi myös voimistaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on 4-hydroksitamoksi- ja frondoside A rintasyövän MCF-7 ja MDA-MB-231 vastaavasti [21]. Rakennus Näiden edellä mainittujen tulosten ja tietäen kliinisistä tutkimuksista että yksittäinen aine hoidot harvoin aiheuttaa kliinistä hyötyä syöpäpotilaille, ja että yhdistelmähoidot ovat tavallista välttämättömiä tehokasta kasvainten hoitoon, tutkimme terapeuttinen etu yhdistelmä sisplatiinin, (a ensilinjan hoitona keuhkosyöpä), jossa salinomy- sekä LNM35 ja A549-soluja. Valitettavasti, huomasimme, että sisplatiini ei pystynyt parantamaan eston keuhkotuumorisolulinjoissa elinkelpoisuus indusoimaa salinomysiini (Attoub et ai, julkaisematon data).

nykyinen havainto tunnistaa salinomysiinin on lupaava uusi terapeuttinen aine, ei ainoastaan ehtyminen syövän kantasoluja, vaan myös eriytetty keuhkokasvaimia.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Katarina Hostanska Institute for täydentävän lääketieteen; University Hospital Zurich, Sveitsi tarjoamiseksi A549-soluja.