Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti, on viiden vuoden eloonjäämisaste oli ainoastaan ​​15%. Syöpä estäjä PP2A (CIP2A-proteiinia) on ihmisen onkoproteiinia estävä PP2A monissa ihmisen syöpäsairauksia. Kuitenkin myös CIP2A-proteiinia voi olla uusi lääke tavoite keuhkosyöpä on pitkälti epäselvä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Normaali ja pahanlaatuinen keuhkojen kudoksia olivat peräisin 60 keuhkosyöpäpotilaita peräisin Etelä-Kiinassa. RT-PCR: llä, Western-blottauksella ja immunohistokemiaa käytettiin arvioimaan ilmentymisen CIP2A-proteiinia. Huomasimme, että joukossa 60 potilasta, CIP2A-proteiinia oli havaittavissa tai erittäin alhainen paratumor normaaleissa kudoksissa, mutta dramaattisesti koholla Tuumorinäytteissä 38 (63,3%) potilaista. CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen oli yhteydessä tupakointi. Hiljentäminen CIP2A-proteiinia siRNA inhiboivat ja klonogeeniset aktiivisuus keuhkojen syöpäsoluja. Kiehtovan, löysimme luonnollinen yhdiste, rabdocoetsin B joka erotetaan perinteinen kiinalainen lääkekasvi Rabdosia coetsa, voivat aiheuttaa alas-säätely CIP2A-proteiinia ja inaktivaation Akt-reitin, ja estävät proliferaatiota ja indusoi apoptoosin erilaisissa keuhko- syöpäsoluja.

Johtopäätökset /merkitys

havainnot viittaavat vahvasti siihen, että CIP2A-proteiinia voisi olla tehokas tavoite keuhkosyöpä lääkekehityksen ja terapeuttinen potentiaalit CIP2A-proteiinia-kohdentamisaineita aihetta jatkotutkimuksiin.

Citation: Ma L, Wen ZS, Liu Z, Hu Z, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) yli-ilmentyminen ja pienimolekyylisiä laukeavan alassäätely CIP2A-proteiinia in Lung Cancer. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10,1371 /journal.pone.0020159

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 tammikuu 2011; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 31, 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Key Program for Basic Research (973, 2010CB529201), Key Project of Knowledge Innovation Program Kiinan Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 ja KSCX2-YW-R-235), The National Natural Science Foundation of China (81071930, 30871110), National merkittäviä tieteellisiä ja teknologisia ohjelma Drug Discovery (2009ZX09103-101), sekä tieteen ja teknologian suunnittelu projekti Guangzhou (2009Y-C011-2). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lähes 1,5 miljoonaa ihmistä oli diagnosoitu keuhkosyöpä ja 1,4 miljoonaa ihmistä arvioitiin kuolee siihen vuonna 2007 [1]. Kaksi suurta keuhkosyöpään ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). Noin 85% keuhkosyövässä ovat NSCLC, jotka voidaan jakaa kolmeen suureen histologisia alatyyppejä: okasolusyöpä, adenokarsinooma, ja iso-cell carcinoma. SCLC edustaa noin 15% keuhkosyövässä [2]. Tupakointi aiheuttaa kaikenlaisia ​​keuhkosyöpään, mutta eniten vahvasti sidoksissa SCLC ja squamous-cell carcinoma; adenokarsinooma on yleisin potilailla, jotka eivät ole koskaan savustettu [2]. Nykyinen hoito määräytyy histologinen keuhkosyövän ja vaiheessa diagnoosi, kuten leikkaus, platina dubletti terapiassa, sädehoito ja täsmähoitoihin. Valitettavasti ennuste keuhkosyöpään on huono kanssa vain 15% viiden vuoden yleinen eloonjäämisaste kaikissa vaiheissa yhdistetyn [1]. Siksi on kiireesti tunnistaa tehokkaampia molekyylikohteista ja uusia kohdistettuja hoitomuotoja keuhkosyöpä.

syöpä estäjä PP2A (CIP2A-proteiinia) on ihmisen onkoproteiinia joka stabiloi c-Myc estämällä proteiinifosfataasi 2A (PP2A ) -välitteisen defosforylaatiota MYC seriinin 62 [3]. Lisäksi hajoamisen estoon c-Myc, CIP2A-proteiinia näyttää säänneltävä positiivista palautetta silmukka c-Myc edistämällä toistensa ilme [4]. CIP2A-proteiinia yli-ilmentynyt ihmisen kaulan ja pään karsinoomat, paksusuoli-, rinta-, ja mahalaukun syövän, ja korreloi käänteisesti taudin tulos mahasyövän [3] – [7]. Kuitenkin myös CIP2A-proteiinia voisi olla uusi lääke tavoite syöpiä ei ole täysin tutkittu, ja antituumorivaikutuksen of CIP2A-proteiinia-kohdentamisaineita vielä tunneta laajalti. Olemme tutkineet ilmentymistä CIP2A-proteiinia keuhkosyövän ja seulottiin lyijy-yhdisteiden, jotka voivat kohdistaa CIP2A-proteiinia [8]. Tässä osoitamme, että CIP2A-proteiinia selvästi yliaktiivista keuhkosyöpä kasvaimissa verrattuna potilaaseen toisiaan vieressä normaali keuhkojen kudoksia, ja ilmoittaa, että luonnollinen yhdiste, joka laukaisee downregulation CIP2A-proteiinia esiintyy merkittävää antituumorivaikutus in NSCLC solulinjoissa.

Tulokset

CIP2A-proteiinia yli-ilmentyy in keuhkosyöpää ja liittyy tupakointiin

Testasimme ilmentyminen CIP2A-proteiinia on proteiini tasolla ei-pahanlaatuisten ja pahanlaatuisten solujen, ja totesi, että CIP2A-proteiinia oli hyvin ilmaistu keuhkosyövän solulinjoja (A549, H1975, 95D ja L78) verrattuna normaaliin ihmisen alkion keuhkojen fibroblasteja (HLF ja MRC5) ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEpiC) (kuvio 1A). Sitten analysoimme CIP2A-proteiinia 60 keuhkosyöpä näytteitä potilaista tuli Etelä-Kiinassa, joiden lähtötason ominaisuudet lueteltiin taulukossa 1. Osoitimme, että CIP2A-proteiinia oli yli-ilmentynyt 38 (63,3%) kasvain näytteistä määritettiin western blottauksella (kuvio 1 B). Kuitenkin 60 potilaan sovitettu viereisen normaalin keuhkojen kudoksiin, CIP2A-proteiinia ei ollut havaittavissa 57 (95%) näytteistä, ja on heikosti ilmaistu 3 (5%) näytteistä, jossa sen ekspressio oli paljon pienempi kuin kasvaimen näytteitä samoista potilaista . Näytteissä 2 potilailla, joilla on tulehduksellinen pseudotumor, CIP2A-proteiinia ei havaittu sekä pseudotumor ja viereisen keuhkojen kudoksiin (kuvio 1C). Immunohistokemia määritys vahvisti, että CIP2A-proteiinia oli dramaattisesti kohotettu korkeampaan immunoreaktiivisuus pisteet Tuumorinäytteissä 26 ulos 39 potilasta (66,7%) testattiin (kuvio 1 D). MRNA tasolla,

CIP2A-proteiinia

oli yli-ilmentynyt keuhkojen kasvain kudoksiin verrattuna normaaleihin keuhkojen kudoksiin 39 58 (67,2%) potilaista testattiin (kuvio 1E). Yhdessä CIP2A-proteiinia dramaattisesti koholla keuhkosyöpä kasvain näytteissä verrattuna pariksi normaaliin keuhkojen kudoksia.

(A): Western blot-analyysi CIP2A-proteiinia ihmisen keuhkosyövän soluja (A549, H1975, 95D ja L78), alkion keuhkojen fibroblastisolut (HLF ja MRC-5), ja normaaleihin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEpiC). (B): Western blot analyysit CIP2A-proteiinia proteiinin ensisijainen keuhkokasvaimia (T) ja viereisten normaali keuhkojen kudoksiin (N). β-Actin käytetään latauskontrollina. Edustavia Tulokset esitetään ja numerot kutsutaan yksittäisille potilaille. (C): Western blot analyysit CIP2A-proteiinia proteiinin tulehduksellinen pseudotumor (P) ja viereisen normaalin keuhkojen kudoksiin (N). β-Actin käytetään latauskontrollina. (D): Kuvat ovat (vasen paneeli) ja pisteet (oikea paneeli) Immunohistokemian värjäytymisen CIP2A-proteiinia ilmentyminen ensisijainen keuhkokasvaimia (T) ja viereisten normaali keuhkojen kudoksiin (N). (E): RT-PCR-analyysit

CIP2A-proteiinia

mRNA ensisijainen keuhkokasvaimia (T) ja viereisten normaali keuhkojen kudoksiin (N).

GAPDH

käytetään latauskontrollina. Edustavia Tulokset esitetään ja numerot kutsutaan yksittäisille potilaille.

CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen liittyy tupakointiin

Analysoimme korrelaatio CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen ja jotkut ennusteeseen viittaavia muuttujia. Tiedot osoittivat, että CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen keuhkosyövässä korreloi merkitsevästi histologinen tyyppi okasolusyöpä (p = 0,003) ja miessukupuoli (p = 0,008) (taulukko 1), joka osoitettiin vahvasti linkittää tupakointi [2], [ ,,,0],9]. Lisäksi meidän tiedot osoittavat selvästi, että korkea ekspressio CIP2A-proteiinia liittyi tupakoitsija potilailla (p = 0,004). Ei merkittävää eroa CIP2A-proteiinia tilan havaittiin mukaisesti patologinen vaiheessa (p = 0,639) ja iän (0,082) (taulukko 1). Yrittäessään selventää merkittävimmät liittyvät tekijät CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen, monimuuttujakalibrointiin analyysit suoritettiin, ja monimuuttuja regressioanalyysimme (taulukko 2) osoittivat, että tupakointi oli ainoa merkittävä muuttuja liittyy CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen keuhkosyöpä (p = 0,008 ).

nitrosamiini 4- (methylnitro-samino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanoni, tai nikotiinia johdettu nitrosamiini ketoni (NNK), on tärkein ainesosa tupakansavun karsinogeeni, joka systeemisesti indusoi kasvaimia keuhkojen rotilla, hiirillä ja hamstereita ja myös merkittävä rooli keuhkojen syövän synnyn [10], [11]. Sitten tutkittiin, NNK voisi suoraan aiheuttaa säätelyä CIP2A-proteiinia tai ei. Tehdä tämän, HBEpiC (kuvio 2A) ja BEAS-2B (kuvio 2B) keuhkoputken epiteelisolut altistettiin NNK ilmoitetuilla pitoisuus ilmoitettuina ajankohtina, hajotettiin, ja Western blot suoritettiin ekspression analysoimiseksi CIP2A-proteiinia. Tulokset osoittivat, että hoito NNK on 0,1-10 uM jopa 18 päivää ei häiritse CIP2A-proteiinia ilmentyminen (kuvio 2, A ja B). Tässä tutkimuksessa emme testata pitkän aikavälin vaikutus NNK- on CIP2A-proteiinia ilmaisun

in vitro

tai

in vivo

.

(A): HBEpiC soluja käsiteltiin jossa NNK eri pitoisuuksina ilmoitettu ajankohtina, ja western blot suoritettiin analysoida CIP2A-proteiinia ilmentyminen. (B): BEAS-2B-soluja käsiteltiin NNK merkityillä pitoisuuksina ilmoitettuina ajankohtina, ja Western blot suoritettiin analysoida CIP2A-proteiinia ilmentyminen. 0,05% ja 0,1% DMSO: ta käytettiin liuottimena ohjaus, joka vastaa 5 μΜ ja 10 μΜ NNK, vastaavasti.

CIP2A-proteiinia tarvitaan keuhkosyöpään solujen kasvu ja muuttuminen

CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA käytettiin arvioimaan sen roolit keuhkosyöpää synnyssä, ja tulokset osoittivat, että verrattuna negatiivisen kontrollin (NK), CIP2A-proteiinia hiljentäminen (kuva 3A) johti eston klonogeeniset aktiivisuuden A549-solut, havaitaan pesäkkeitä muodostuminen ( Kuvio 3, B ja C) ja pehmeä agar pesäkemuodostusta (kuvio 3, D ja E) määritykset [3]. Näitä ilmiöitä varmistettiin tulosten CIP2A-proteiinia hiljentäminen vuonna L78 soluissa (kuvio S1, A-E). Seuraavaksi A549-soluja transfektoitiin NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA (kuvio 3F), ja injektoitiin subkutaanisesti oikean ja vasemman sivun 8 nude-hiirten vastaavasti, ja kasvainten tilavuudet arvioitiin kahden päivän välein [12]. Mielenkiintoista, CIP2A-proteiinia-specific siRNA esti merkittävästi kasvaimen kasvua verrattuna NC-siRNA (kuva 3, G kautta I). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että CIP2A-proteiinia on välttämätöntä keuhkosyöpä lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen, ja se voisi olla tehokas terapeuttinen kohde.

(A): Western blot-analyysi CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymisen A549-soluja 72 h transfektion jälkeen negatiivinen ohjaus (NC) tai CIP2A-proteiinia-erityisiä siRNA. (B ja C): Litteä levy klooni muodostumisen määritys, klonogeeniset aktiivisuutta A549-solut 72 tuntia transfektion jälkeen NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (B): edustava kevyt miscroscopy kuvia. (C): n kvantitointi pesäkkeitä laskentaa. Näkyy on keskiarvo + SD neljästä itsenäisestä kokeesta. (D ja E): Soft agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys A549-soluja, jotka on transfektoitu NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (D): edustava kevyt miscroscopy kuvia. (E): n kvantitointi pesäkkeitä laskentaa. (F): Western blot-analyysi CIP2A-proteiinia proteiinin A549-soluja, jotka on transfektoitu NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA: ssa 72 tuntia. (G): Nude-hiiret injektoitiin subkutaanisesti A549-soluja, jotka on transfektoitu NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (H): kasvain kasvukäyrä esitetyssä kokeessa (G). Esitetty on keskiarvo + SD keskimääräisen kasvaimen tilavuutta. (I) Kuva ksenograftikasvaimissa saatu hiirillä on esitetty (G). * P 0,01, Studentin t-testillä.

Rabdocoetsin B on CIP2A-proteiinia kohdistus luonnollinen yhdiste

Keskeisenä tavoitteena oli löytää uuden lääkkeen tavoitteita ja antaa lyijy-yhdisteitä lääkekehitykseen. Me seulottiin CIP2A-proteiinia-pien- molekyylien analysoimalla niiden vaikutuksia CIP2A-proteiinia ilmaisun, ja tunnistaa luonnollinen yhdiste uutetaan kiinalainen lääke kasviperäisten Rabdosia coetsa, rabdocoetsin B [13], [14] (kuvio 4A), voisi downregulate CIP2A-proteiinia on proteiini tasolla klo 5-20 uM A549-soluja (kuvio 4B). Vuonna H1975 soluissa, Rabdocoetsin B myös käynnistänyt downregulation CIP2A-proteiinia 5 10gM (kuvio 4C). Analysoimme mekanismi CIP2A-proteiinia down-regulation aiheuttama Rabdocoetsin B, ja totesi, että rabdocoetsin B estivät merkittävästi transkription CIP2A-proteiinia annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4D), arvioidaan reaaliajassa RT-PCR: llä.

(A): rakenne rabdocoetsin B. (B): A549-soluja käsiteltiin rabdocoetsin B (RdB) eri pitoisuuksilla 48 tunnin ajan. Western blotteja käytettiin ekspression havaitsemiseksi CIP2A-proteiinia proteiinin (ylempi paneeli) ja CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin ja normalisoidaan β-aktiinin ilmentymistä (alempi paneeli) (C): H1975-soluja käsiteltiin rabdocoetsin B eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Western blotteja käytettiin ekspression havaitsemiseksi CIP2A-proteiinia proteiinin (ylempi paneeli) ja CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin ja normalisoidaan β-aktiinin ilmentymistä (alempi paneeli) (D): A549-soluja käsiteltiin rabdocoetsin B eri pitoisuuksilla 48 tunnin ajan, ja mRNA: n ilmentymisen on

CIP2A-proteiinia

analysoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä.

Rabdocoetsin B inhiboi CIP2A-proteiinia-moduloidun fosforyloidun Akt

maksasyövän soluissa, CIP2A-proteiinia up-regulation fosfo-Akt (Pakt) ja vähentää Akt liittyviä PP2A aktiivisuutta, kun taas hiljentäminen CIP2A-proteiinia uudelleen aktivoi PP2A [15]. Koska Akt on konstitutiivisesti aktiivinen keuhkosyövän soluihin ja edistää solujen eloonjäämistä ja kestävyys kemoterapiaa ja säteily [16], [17], tutkimme vaikutus CIP2A-proteiinia on Pakt keuhkosyövässä. Osoitimme, että CIP2A-proteiinia hiljentäminen erityisten siRNA johti alas-säätely Pakt muttei Perk, PCNA, β-kateniinin, EGFR tai Src (kuvio 5A). Sitten tutkittiin, rabdocoetsin B voisi ilmentymisen moduloimiseksi Pakt, ja totesi, että hoito rabdocoetsin B 5 10gM myös alassäädetty Pakt A549 (kuvio 5B) ja H1975 (kuvio 5C) soluja. Olemme lisäksi osoitti, että H1975 soluissa upon rabdocoetsin B 10 uM, CIP2A-proteiinia oli merkittävästi vaimentua 6 12 tuntiin ja tuli havaita 48 h (kuvio 5D), kun taas Pakt aleni 18 h (kuvio 5D). Nämä tulokset vahvistettiin vuonna A549-soluja käsiteltiin rabdocoetsin B (kuvio 5E), mikä osoittaa, että tämä yhdiste voi estää CIP2A-proteiinia-Akt-reitin keuhkosyöpä.

(A): A549-soluja transfektoitiin NC tai CIP2A- erityiset siRNA 72 tuntia, ja ilmentyminen osoitetaan proteiinien havaittiin käyttäen Western-blotteja. (B ja C): A549 (B) ja H1975-solut (C) käsiteltiin rabdocoetsin B (RdB) ilmoitetuilla pitoisuuksilla 48 ja 24 h, vastaavasti, ja Western blotit suoritettiin analysoida proteiinien ekspression ilmoitettu. (D ja E): H1975 (D) ja A549 (E) soluja käsiteltiin rabdocoetsin B (RdB) ja ilmoitettuina ajankohtina, ja Western blot -analyysi suoritettiin vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ilmoitettu proteiineja. β-aktiini käytetään latauskontrollina.

vaikutukset Rabdocoetsin B keuhkosyöpäsoluissa

arvioitiin vaikutuksia rabdocoetsin B keuhkosyövän soluista, jotka ilmentävät laaja-tyypin (WT ) tai mutantti EGFR. Olemme osoittaneet, että rabdocoetsin B ilmeni merkittäviä sytotoksisia vaikutuksia A549, NCI-H1975, HCC827, SPC-A-1, GLC-82, L78 ja 95D keuhkosyövän solulinjat (kuvio 6, A ja B). Rabdocoetsin B indusoi apoptoosin A549-solut (kuvio 6C), jossa aktivointi Casp-8 ja Casp-9 ja lohkaisu PARP (kuvio 6D). Rabdocoetsin B aiheutti myös aktivointi Casp-8 ja Casp-9 ja lohkaisu PARP NCI-H1975-soluja (kuvio 6E). Nämä tulokset osoittavat, että rabdocoetsin B inhiboi proliferaatiota ja indusoi apoptoosin keuhkosyövän soluihin aktivoimalla endogeenisen ja eksogeenisen apoptoosin polkuja.

(A): Keuhkosyöpä soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Rabdocoetsin B (RdB) (maasta 1 uM 10 uM), ja solujen elinkyky mitattiin 48 h MTT-määritystä. (B): IC50 käsiteltyjen solujen rabdocoetsin B. (C): Rabdocoetsin B indusoi apoptoosia A549-solut, määritettiin virtaussytometrialla. (D ja E): Western blotit suoritettiin ekspression havaitsemiseksi apoptoosisäätelijät A549 (D) ja H1975-solut (E).

Keskustelu

CIP2A-proteiinia on auto- antigeeni [7], joka on yli-ilmentynyt ihmisen kasvainten [3] – [7], [18] – [21]. Peng [22] osoitti, että Amerikan-pohjainen potilailla, CIP2A-proteiinia lisääntynyt 61 72 (84,7%) keuhkosyöpä kudosnäytteet, joka on merkittävästi korkeampi kuin normaalissa keuhkojen kudoksissa (14,3%, 9/63). Äskettäin Dong et al [23] raportoi, että 29 potilaalla Pohjois Kiinasta,

CIP2A-proteiinia

yli-ilmentyy mRNA tasolla 24 tapauksessa (82,7%) Tuumorinäytteissä verrattuna niiden vastaavien normaalien kudosten; CIP2A-proteiinia proteiinia (havainnut immunohistokemiallisesti) on havaittu olevan yli-ilmentynyt 72,2% 90 keuhkosyöpään näytteitä ja korreloi huonon säilymisen. Testaamme CIP2A-proteiinia ilmentyminen 60 potilasta Etelä-Kiinassa [8], ja raportoivat, että CIP2A-proteiinia voimakkaasti lisääntynyt 63,3% (havaitaan western blottauksella) tai 67,2% (at mRNA tasolla) kasvaimen yksilöitä verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa (kuvio 1) .

Osoitamme ensimmäistä kertaa, että CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen liittyy tupakointiin. Vuonna 60 keuhkosyöpäpotilaita tarkasteltu tässä tutkimuksessa, 28 36 (77,8%) tupakoitsija potilaista osoittavat lisääntyneen ekspression CIP2A-proteiinia kasvaimessa näytteissä verrattuna niiden viereiseen normaaliin yksilöitä, kun taas 10 24 (41,7%) nonsmoker tapauksista osoittavat sääteli CIP2A-proteiinia on proteiini tasolla (p = 0,004) (taulukko 1). Tällä hetkellä tupakointi on edelleen yleisempi miehillä (63%) kuin naisilla (3,8%) [24]. Me raportoimme tässä, että CIP2A-proteiinia yli-ilmentynyt 30/40 (75%) ja 8/20 (40%) miehillä ja naisilla potilailla (p = 0,008) (taulukko 1), vastaavasti. Lisäksi havaitaan, että CIP2A-proteiinia on kohonnut 17/19 (89,5%) potilailla, joilla on okasolusyöpä, kun taas 17/35 (48,6%) potilailla, joilla on adenokarsinooma on yli-ilmentynyt CIP2A-proteiinia (p = 0,003) (taulukko 1). Monimuuttuja regressioanalyysimme osoittaa selvästi, että tupakointi on ainoa merkittävä muuttuja liittyy CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen keuhkosyövän meidän ympäristössä (p = 0,008) (taulukko 2). Vaikka yleinen tupakointimäärään pohjoisessa ja Koillis aloilla on korkeampi kuin Etelä- ja Itä-Kiinassa, esiintyvyys ympäristön tupakansavulle altistumisen keskuudessa tupakoimattomien Pohjois Kiinassa on huomattavasti korkeampi kuin tupakoimattomien Etelä-Kiinassa [24], [ ,,,0],25]. Nämä voivat myötävaikuttaa ero CIP2A-proteiinia ilmentyminen potilaiden välillä meidän ympäristössä ja Dong raportissa [23]. Tupakansavu joka aiheuttaa noin 5-6 miljoonaa kuolemantapausta vuodessa ja 31% ja 6% kaikista keuhkosyöpäkuolemista keski-ikäisten miesten ja naisten osalta [26], voivat aiheuttaa geneettisiä ja epigeneettiset muutokset ja vähentää DNA korjauskapasiteettia [2]. Zhao et al [27] osoittivat äskettäin, että ihmisen mahalaukun solulinjoissa,

helikobakteeri

infektio voi aiheuttaa CIP2A-proteiinia ilmaisun kautta bakteeri onkoproteiinia CagA-aiheutti aktivointi Src ja MEK /ERK signaalien kulkureiteillä. Vaikka NNK (0,1-50 uM) ei upregulate CIP2A-proteiinia in HBEpiC ja BEAS-2B solujen noin 18 vuorokautta tutkimuksessamme (kuva 2), emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että NNK voi hämmentää ilmaus onkoproteiinia pidemmällä valotusaika luonnollisesti ja tämä hypoteesi takaa lisätutkimuksia.

CIP2A-proteiinia on kriittinen keuhkosyöpään solujen kasvua, koska CIP2A-proteiinia pudotus erityisillä siRNA aiheuttaa huomattavia soluproliferaation inhibointi ja muutos in vitro ja in vivo (kuvio 3 ja Kuva S1). Nämä tiedot osoittavat, että CIP2A-proteiinia voi olla houkutteleva kohde uusien anti-keuhkosyöpä lääkkeitä. Mielenkiintoista on, tunnistamme luonnollinen yhdiste rabdocoetsin B, voi alas-säädellä CIP2A-proteiinia proteiinin keuhkosyöpäsoluissa (kuvio 4, A-C) estämällä sen ilmentymistä mRNA tasolla (kuvio 4D). Tutkimukset osoittavat, että CIP2A-proteiinia voidaan säätää ylös Pakt [15], ja meidän tulokset vahvistavat, että CIP2A-proteiinia hiljentäminen voi vähentää Pakt (kuvio 5A). Me osoittavat lisäksi, että rabdocoetsin B estää myös Pakt (kuvio 5, B-E). Rabdocoetsin B estää niiden kasvun ja indusoi apoptoosia erilaisia ​​keuhkosyövän soluja (kuvio 6, A-E). Meidän data luodaan siten johtaa yhdisteen CIP2A-proteiinia kohdistamisen syöpähoidoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

käyttö näytteiden hyväksyi Institutional Review Board Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia ja The Cancer Hospital, Sun Yat-Senin yliopistossa. Kaikki kasvain ja vieressä normaali kudosnäytteet saatiin kirjallinen suostumus potilailta Cancer sairaalan, Sun Yat-Senin yliopistossa. RT-PCR-analyysi, kudosnäytteet jauhettiin nestemäisessä typessä jäähdytettyä laasti, RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen), ja RT-PCR-kokeet suoritettiin käyttämällä PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa) mukaan valmistajan protokollaa. Sekvenssit käytettyjen alukkeiden

CIP2A-proteiinia

ovat seuraavat: eteenpäin 5′-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 ’, _ käänteinen 5′-GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3’ [5].

Western blot -määritys, kudos näytteet jauhettiin nestetypessä jäähdytettyyn laasti, kudos jauhe suspendoitiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM Na

3Vo

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, täydellinen proteaasiestäjäseostabletit) ja kirkastettiin sentrifugoimalla. Yhtä suuret määrät näytteitä erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle ja immunoblot-anti-CIP2A-proteiinia tai anti-β-aktiini-vasta-aine.

immunohistokemiallinen määritys ja pisteytys immunoreaktiivisuus suoritettiin, kuten on kuvattu [28]. Formaliini-, parafiiniin upotettujen keuhkosyöpä kudosnäytteiden (5 um), poistettiin parafiini ja lämpökäsiteltävä-epitooppisup- haku vaiheessa 2 min. H

2O

2 (3%) käytettiin estämään endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus 10 min. Sitten leikkeet pestiin PBS: llä. Kanin polyklonaalista anti-CIP2A-proteiinia vasta-aine levitetään liukuu laimennoksena 1:500 4 ° C: ssa yön yli. Detection saavutettiin kanssa immunohistokemia Kit (pv-6001) (Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd, Peking, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Leikkeitä väritetty 3, 3′-diaminobentsidiiniä (DAB) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, käsitelty ksyleenillä, ja asennettu. CIP2A-proteiinia proteiinin tasot pisteytettiin kuvatulla [29].

Agents

Rabdocoetsin B uutettiin Rabdosia coetsa professori Han-Dong Sun. 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (z-y1) -3, 5-di- phenytetrazoliumromide (MTT) hankittiin Amresco, Inc. (Solon, OH). PE anneksiini V-7AAD Apoptosis Detection Kit saatiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

Vasta

käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: anti-β-Actin (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12); anti-PARP, anti-fosfo-p44 /42 MAPK: n, anti-EGFR-, anti-Src ja anti-β-kateniinin (Cell signalointi), anti-CIP2A-proteiinia (2G10-3B5), anti-Pakt ja ATK (Santa Cruz Biotechnology) ; anti-ERK2 (Abcam); anti-PCNA (Abmart); anti-kani tai anti-hiiri-HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Pierce); Kaniinin polyklonaalista anti-CIP2A-proteiinia (Novus Biologicals, Inc.). Detektio suoritettiin käyttäen Chemiluminescent Western havaitseminen kit (Cell Signaling).

Soluviljely

keuhkosyöpä linjat NCI-H1975 ja A549 ja ihmisen alkion munuaisen HEK-293-solut on saatu American Tissue Culture Collection (ATCC) ja ihmisen alkion keuhkojen fibroblasti MRC-5-solut ostettiin Cell Resource Center, kiina Academy of Medical Sciences (Beijing). Normaalit ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEpiC, Luettelonumero: 3210) ostettiin ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Kalifornia). Ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinoomasolu linjojen L78 ja erittäin metastaattinen suuret keuhkosyöpä solulinjat 95D saatiin Cell pankin Kiinan tiedeakatemia (Shanghai), ja ihmisen alkion keuhkojen fibroblastien HLF solut hankittiin Kenqiang Instrument Co., Ltd ( Shanghai, Kiina). BEAS-2B keuhkoputken epiteelisolujen toimittivat professori Hongbin Ji Shanghai Institute for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. A549, HLF ja BEAS-2B-soluja viljeltiin Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä. HBEpiC soluja viljeltiin seerumivapaassa keuhkoputken epiteelisolujen Medium (BECM, Cat. No. 3211, ScienCell Research Laboratories), joka sisältää olennaisia ​​ja ei-välttämättömiä aminohappoja, vitamiineja, hormoneja, kasvutekijöitä ja hivenaineita. L78, 95D ja NCI-H1975-soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä. MRC-5-soluja viljeltiin MEM /EBSS väliaineessa, johon on lisätty ei-välttämättömiä aminohappoja, 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

arvio solujen lisääntymisen ja apoptoosin

Soluja käsiteltiin Rabdocoetsin B ilmoitetun pitoisuuden ja ajankohtina. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymistä. Externalization fosfatidyyliseriinin testattiin käyttämällä PE anneksiini V-7 AAD Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden.

Quantitative real-time PCR

Quantitative real- aika PCR suoritettiin CFX

TM96 Real Time System (Bio-Rad) käyttäen SYBR® Esisekoite Ex Taq ™ (Perfect Real Time) (Takara Code: DRR041) mukaan valmistajan ohjeiden. Alukkeet CIP2A-proteiinia ja Actin olivat seuraavat: CIP2A-proteiinia: eteenpäin sekvenssi, 5′-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 ’, käänteinen sekvenssi, 5′-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3′; Aktiini: eteenpäin sekvenssi, 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ’, käänteisessä järjestyksessä, 5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3’. Tasot CIP2A-proteiinia mRNA ilmaistiin suhteena verrattuna aktiinin perusteella CT-arvot.

siRNA määrityksissä

käyttäminen HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Crawley, UK) mukaisesti valmistajan protokollan, soluja transfektoitu 100 nM kaksijuosteisia siRNA oligonukleotidit [3]. SiRNA-sekvenssit olivat 5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 ’(CIP2A-proteiinia siRNA1), 5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′ (CIP2A-proteiinia siRNA2) [3], ja 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’(negatiivinen kontrolli (NC) siRNA).

klonogeeninen määritys

pesäkkeitä muodostumista, A549 tai L78 transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli tai CIP2A-proteiinia-spesifisiä siRNA ympättiin kolmena kappaleena päälle 35 mm: n levyille (300 solua per levy). Sen jälkeen, kun 14 päivää viljelyn, solut värjättiin Giemsa ja klooneja, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. Varten pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, solut suspendoitiin 1 ml: aan DMEM: ää (A549-solut) tai RPMI 1640 (ja L78-solut), joka sisälsi 0,3% alhaisen sulamispisteen agaroosia (Amresco, Solon, OH) ja 10% FBS: ää, ja maljattiin alhaalta, joka sisältää 0,6% agaroosia 35 mm plat (1000 solua /levy) kolmena kappaleena. 2-3 viikon kuluessa Viljelyn levyt värjättiin Giemsa ja pesäkkeet laskettiin valomikroskoopilla.

Hiirimallit

Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymien Animal Ethics komitean Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia, suostumuksella tunnus AEC2010070202. Kaikki hiiret käytettiin tässä tutkimuksessa kasvatettiin ja pidettiin tietyssä taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä. Nude-hiiriä (n = 8) injektoitiin subkutaanisesti A549-soluja (4 x 10

6), jotka on transfektoitu NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA otetaan oikean ja vasemman sivun vastaavasti, ja kasvaimen laskettiin, kuten on kuvattu [12].

tilastollinen

erot tietoryhmät arvioitiin merkitys käyttäen Student

t

-testin parittomien tietojen χ

2 testiä tai yksisuuntaisen varianssianalyysin ja Bonferroni post -testata. Kasvaimen tilavuus analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA ja riippumaton näytteen

t

testi ohjelmiston avulla SPSS 12.0 for Windows (Chicago, IL). Yhdistyksen välinen CIP2A-proteiinia korkealla ilmaisun ja kliinis ominaisuus arvioitiin käyttämällä joko χ

2 testiä tai Fisherin tarkkaa testiä, ja taaksepäin vaiheittaista monimuuttuja regressioanalyysimme suoritettiin tutkimaan merkittävimmät liittyvät muuttujat CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen säätämisen jälkeen . P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja tiedot esitettiin keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita.

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutukset CIP2A-proteiinia ehtyminen on L78 solujen kasvua ja trasnsformation. (A): Western blot-analyysi CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymisen L78 soluissa 72 tuntia transfektion jälkeen NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (B ja C): Litteä levy klooni muodostumisen määritys klonogeeniset aktiivisuuden L78 solujen 72 h kuluttua transfektion NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (B): edustaja valomikroskoopilla kuvia. (C): n kvantitointi pesäkkeitä laskentaa. Näkyy on keskiarvo + SD kolmen itsenäisen kokeen. (D ja E): Soft agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys L78 transfektoitujen solujen NC tai CIP2A-proteiinia erityisiä siRNA. (D): edustaja valomikroskoopilla kuvia. (E): n kvantitointi pesäkkeitä laskentaa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020159.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme professorit Zhu Chen, Sai- Juan Chen ja Zhen-Yi Wang Shanghai Institute of Hematologia niiden pitkäaikaista tukea. Kirjoittajat kiittää professori Jukka Westermarck Turun yliopiston, Suomen tarjoamiseksi pcDNA3.1-CIP2A-proteiinia konstruktio, ja professori Hongbin Ji Shanghai Institute for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia tarjoamiseksi BEAS-2B-soluja.