Krooninen sairaus

tiivistelmä

ksenoqraftit ihmisen peräsuolen syöpä (CRC) in immuuni-hiirillä on suuret mahdollisuudet nopeuttaa tutkimuksen tuumoribiologiassa ja hoito. Arvioimme -ksenografteja perustettu NOD /SCID /IL2Rγ-null hiiret ensisijaiselta tai etäpesäkkeitä 27 potilaalla on CRC arvioida niiden kapasiteetin laajentamiseen kasvainsolut

in vitro

tutkimuksia sekä arvioida kuinka uskollisesti he kertasi transkription profiilia niiden vanhempien kasvaimia. RNA-seq analyysi vanhempien ihmisten CRC kasvaimia ja niiden johdannainen ksenografteissa osoittaneet toistettavia transkription ominaista muutosten ihmisen kasvaimen hiiren ksenograftin siirtyminen. Useimmissa mutta ei kaikissa tapauksissa ihmisen strooman, verisuoniston ja hematopoieettiset tekijät otettiin järjestelmällisesti korvattiin hiiren analogeilla kun syöpä komponentti jatkui. Kun perustettu ksenografteja, ihmisen CRC soluja, joita voitaisiin levittävät sarjasiirteillä pysyi kopiointia vakaana. Kolme histologisesti epätyypillinen ksenograftien perustettu potilailta vatsakalvon etäpesäkkeitä, sisälsi runsaasti ihmisen peruskudoselementeistä ja verisuonten lisäksi ihmisen kasvainsoluissa. Transcriptomes Näiden sekoitettu kasvain /strooman ksenograftien ei muistuttavat läheisesti niiden vanhempien kasvaimia, ja yrittää levittää tällaisia ​​ksenografteissa sarjasiirteillä epäonnistuivat. Pysyvää ilmentymistä lukuisten geenien aiemmin tunnistettu etusija tavoitteita immunoterapiassa havaittiin useimmissa ksenograftin suvusta. Poikkeava ilmentyminen CRC ihmis- geenejä, jotka tavallisesti vain ilmaistu hematopoieettisten soluissa havaittiin myös. Tuloksemme viittaavat siihen, että ihmisen CRC solut laajennettiin hiiren ksenografteissa on erinomainen apuväline tutkimuksissa kasvaimen Immunobiology ja kohdistettuja hoitomuotoja, kuten immunoterapia, vaan myös tunnistaa mahdolliset rajoitukset.

Citation: Chou J, Fitzgibbon MP, mortales C-LL, Towlerton AMH, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) Fenotyyppiset ja transkription Fidelity on potilaasta peräisin Colon Cancer vierassiirrännäiset immuuni-hiirillä. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10,1371 /journal.pone.0079874

Editor: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 26 syyskuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Chou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkijatohtorin sisään syöpäimmunologian päässä Irvington Institute of Cancer Research Institute (JC) (www.cancerresearch.org), J. Orin Edson rahasto Immunotherapy, kliininen tutkijan palkinto Translational Research (# 1007475) alkaen Burroughs Wellcome Fund (EHW) (www.bwfund.org), avustusta puolustusministeriön (W81XWH-12-0349) (MPF ja MWM) (cdmrp.army.mil), sekä avustuksia NCI /NIH: SAIC sopimus # HHSN261200800001E (MPF ja MWM), U01 CA176270 (MWM ja EHW), ja P30 DK56465 (B. Torok-Storb) (www.nih.gov). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tuoretta toistoleikattiin primaarinen ja metastaattinen kolorektaalisyövissä (CRC) [1], [2], kuten monissa muissa ihmisen hematologisia ja kiinteitä kasvaimia, voidaan vahvistaa vierassiirrännäiset immuuni-hiirissä, kuten NOD /

SCID Twitter /IL2Rγ – /- (NSG) kanta ja levittävät pitkäaikainen kautta sarjasiirteillä. CRC ksenografteissa tarjota houkutteleva malli järjestelmä, jossa opiskella tuumoribiologiassa ja hoito. Toisin kuin CRC solulinjoja perustettu tuoreista kirurgisen kudoksista usein menettävät tärkeitä ominaisuuksia niiden vanhempien ihmisten kasvaimia, kun ne ovat sopeutuneet, ja on tuotettu,

in vitro

kulttuuri, potilaasta peräisin CRC ksenografteissa jäljentää monet fenotyypin ja genotyypin ominaisuudet vanhempien kasvainten, josta ne ovat peräisin, [1] – [17]. Analyysi potilaasta johdettujen CRC ksenografteissa on syvästi edennyt ymmärrystämme kasvain arkkitehtuuri, heterogeenisyys, ja muut olennaiset näkökohdat tuumoribiologiassa. CRC ksenografteissa myös erinomaiset mahdollisuudet käyttää mallijärjestelminä sisään tutustua hoito kemoterapia-aineiden [9] – [13], [17] sekä uudet muodot kohdennettujen CRC käsittely kuten immunoterapia [11], [17], [18]. Lisäksi kyky lisääntyä ihmisen CRC immuuni-hiirissä, voivat tarjota uusiutuvaa CRC-solujen käytettäväksi

in vitro

tutkimuksissa.

erot ihmisen CRC kasvainten ja niiden johdannainen ksenografteja, on kuitenkin olemassa. Merkittävin on johdonmukainen havainto, että CRC ksenografteissa tukevat hiiren sijasta ihmisen, strooman [7], [9], [15], [16]. Näin ollen CRC ksenografteissa tarjoavat mahdollisuuden arvioida transcriptome ihmisen karsinoomasolut erillään niiden tukeminen ihmisen strooman. Syvä transkription analyysi CRC ksenograftien voi siis tukea tulkinnan kanssa julkaistun transkription analyysejä tuoreeltaan resektoitiin ihmisen CRC kasvaimia, jotka edustavat molempia ihmisen strooman ja karsinooman [19], [20]. Se, missä määrin vuorovaikutuksessa hiiren strooman ja verisuoniston vaikutteita transkriptionaalinen profiilin ihmisen kasvainsolujen ksenograftissa ei ole tutkittu tasalla menetelmiä, jotka sallivat yksiselitteinen syrjiä ihmisen selostukset johdettu kasvainsoluista ja hiiren selostukset johdettu strooman ja verisuoniston. Siksi sitoutui kattavan tutkimuksen morfologia ja transkription profiileja paneelin Ksenograftien perustettu NSG hiiriä juuri toistoleikattiin primaarinen ja metastaattinen ihmisen paksusuolen syövissä, arvioida uskollisuus, jolla ksenografteissa kertasi transkription profiileja ja ainutlaatuisia molekyylitason ominaisuudet vanhempien ihmisen kasvaimissa, josta ne on johdettu. Transkription analyysi suoritettiin RNA-seq, jolla voidaan määrittää ihmisen tai hiiren alkuperä selostukset suurella varmuudella. Arvioida vakautta näiden ominaisuuksien kautta sarjasiirteillä, me myös suorittaa yksityiskohtaisen transkription analyysi vierassiirrännänmallissa linjaa, joka perustettiin yhdestä ensisijaisen ihmisen paksusuolen kasvain ja on sen jälkeen lisättyjen kautta kymmenen sukupolvea NSG vastaanottajia. Olemme todenneet, että ksenotransplantaatio ihmisen paksusuolen kasvainten on ominaista toistettavissa biologiset ja transkription muutoksia, jotka luonnehtivat ihmisen hiiren siirtyminen, joka useimmissa tapauksissa valikoida kopiointia vakaan kasvaimen väestön tukee hiiren strooman ja verisuoniston. Lisäksi tunnistimme geeni asetetaan selektiivisesti ilmaistaan ​​epiteelin (karsinooma) tai peruskudoskomponentit CRC ksenograftien.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kirurginen näytteitä ensisijainen tai metastasoituneen kolorektaalisyövän saatiin de-tunnistaa rahoittajien yhteistoiminnallisen Human Tissue Network (CHTN, Vanderbilt University, Nashville, TN), tai aiheet hoidettavasta yliopistossa Washington (UW) Medical Center (Seattle, WA), joka antoi kirjallisen tietoinen suostumus protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Review Board of UW /Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) Cancer Consortium. Tutkiminen ihmisnäytteillä suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suositusten löytyy Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals, 8

painos (National Research Council, National Academies Press). Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea FHCRC. Kaikki Leikkaus suoritettiin tribromietanoli anestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

liikenne- ja käsittely Kudosnäytteiden

Juuri toistoleikattiin etäpesäkekasvainten ja /tai primaarikasvaimen kolorektaalisyövän yksilöitä saatu CHTN (23 ainutlaatuinen potilasta, 24 yksilöt) tai paikallisesti (27 ainutlaatuinen potilasta, 33 yksilöt) pantiin liikenteen väliaineeseen, joka koostui DMEM /F12-väliaineessa (Hyclone), jota oli täydennetty 10 ug /ml siprofloksasiini (Bayer), 1% penisilliini /streptomysiiniä ( 10000 U /ml penisilliiniä, 10 mg /ml streptomysiiniä) (Invitrogen), ja 0,5 ug /ml amfoterisiini B: tä (Invitrogen). Ne kuljetettiin yön yli jäillä käsittelemiseksi seuraavana päivänä (CHTN kasvaimet) tai kuljetetaan tunnin käsittelyä samana päivänä (UW kasvaimia). Pieni annos kutakin kasvainten oli flash jäädytetty tai sijoittaa RNAlater (Life Technologies) ja asetettiin formaliiniin. Tasapaino kunkin kasvaimen huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (Invitrogen), pelkistetään sitten yksisolususpension kautta mekaaninen hajotus ja entsymaattisen digestion yli 1-2 tuntia DMEM /F12-pohjainen liikenteen, jota oli täydennetty 4,66 ug /ml hepariinia natriumia (Sigma), 2% B27 lisä (Invitrogen), ja 5% KnockOut seerumi vaihto (Invitrogen), 1 mg /ml kollagenaasi I (Sigma), 0,1 mg /ml hyaluronidaasia ja 0,1 mg /ml DNaasi I: tä (Worthington Biochemical) . Digestoidut solut pestiin entsyymi-elatusaineella ja suspendoitiin uudelleen 30-50 ui Matrigel (BD Biosciences), ennen injektiota.

Ensisijainen ksenografteja todettiin injektoimalla yhden solun suspensiot (1 x 10

4-2 × 10

6 solua) valmistettiin kolorektaalisyövän yksilöitä joko munuaiskotelon [21] (N = 14 ainutlaatuista potilasta) ja /tai ihon alle kyljissä (n = 46 potilasta) 6-12 viikon ikäinen mies tai naispuolinen sublethally γ-säteilytettyjä (250 cGy 20 cGy /min) NSG hiiret esille Fred Hutchinson Cancer Research Centerissä. Väli kirurginen resektio ja hiiri injektio oli 24-30 tuntia paksusuolen kasvainten saatu CHTN ja 3-6 tuntia kasvainten saadaan paikallisesti. Viisi hajotettua kasvainnäytteet rikastettiin CD133

+ solut ennen injektiota, käyttäen magneettisia helmiä konjugoitu anti-CD133-vasta-aine (Miltenyi Biotec) kohti valmistajan ohjeita. Hiirillä asteittain laajentuvan kasvainten annettiin selvitä vasta kasvaimet saavuttivat halkaisija 2 cm, ne ilmenevät merkkejä kärsimystä tai niiden kärsimästä 20% laihtuminen, jolloin ne lopetettiin kasvainten satoa. Paloja korjattu ksenografti otettiin heti flash jäädytetty tai sijoitetaan RNAlater, sijoitetaan formaliiniin myöhempää histologiaa, ja sijoitetaan kuljetuselatusaineeseen ja käsitellään identtisellä tavalla kuin alkuperäinen ihmisen kasvaimen varten sarjasiirteillä toiseen NSG isännän.

immunohistokemia ja Mikroskopia

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut kudososat resektoitiin paksusuolen syövän näytteitä tai ksenografteja valmistettiin mikroskopia värjäämällä hematoksyliinillä ja eosiinilla, tai vasta-aineita HLA (HLA) luokan I (MBL Corporation) karsinoembryonaaliselle antigeeni (CEA) (Novus), sytokeratiini 20 (CK20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), epiteelin adheesiomolekyyli (EPCAM) (Novus), E-kadheriinin (Cell Marque ), Ohjelmoitu Death-1 (PD1) (Cell Marque), vimentiinistä (Dako), fibronektiinin (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), ja CD3 (Novacastra) kohti valmistajan ohjeiden. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit tehtiin kullekin vasta-aineelle. Objektilasit katsellaan Nikon E800 Eclipse mikroskoopilla, ja kuvat hankittiin Olympus Magnafire SP kamera ja Magnafire ohjelmistot (Optronics).

virtaussytometria

Yksittäinen solususpensio valmistettiin vierassiirrännänmallissa johdettu alkaen D61540.T2 värjättiin Qdot 525 nanocrystal (Invitrogen) elävien ja kuolleiden solujen erilaistumiseen, fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-PD-1-vasta-ainetta (BD Biosciences), ja fykoerytriiniin (PE) konjugoidulla anti-CTLA-4- vasta-ainetta (BD Biosciences). Tiedot hankittiin sijoitukset FACSCanto II virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja analysoitiin Kaluza ohjelmisto (Beckman Coulter).

RNA-seq Näytteen valmistus ja sekvensointi

RNA uutettiin näytteistä käyttämällä RNeasy Plus Mini tai AllPrep RNA /DNA-sarjat (QIAGEN). Laatu RNA arvioitiin Agilent 2100 Bioanalyzer. Näytteet, joissa RNA eheyden numero (RIN) on suurempi kuin 7 laimennettiin 50 ng /ul sekvensointiin kirjaston kanssa valmisteltava TruSeq Näytteen valmistelu Kit (Illumina). Alkaen noin 1 ug kokonais-RNA: ta, mRNA: ta eristettiin oligo-dT-capture helmiä, sitten hajanainen ja muunnetaan cDNA: random heksameeri-pohjustettu käänteistranskriptio ja toisen juosteen synteesi. Tuloksena cDNA pilkottiin sonikoimalla ja kokovalikoitu varten molekyylien -300 bp. Ligaatio viivakoodilla sekvensointi adapterit Sitten suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. CDNA-näytteet tehtiin multiplex sekvensointi, jolla on yhdestä neljään näytettä kaistaa kohti, on Illumina HiSeq 2000, jolloin saatiin 50 bp: n pariksi-pään sekvenssejä. Tämä prosessi tuotti välillä 54,6 M ja 367,0 M-sekvenssit kulkee oletuksena Illumina laadunvalvonta suodattimia.

kvantitatiivinen PCR

Kryosäilötyt soluja P2726.Ov prosessoitiin Dead Cell poistosarja (Miltenyi Biotec) ja sitten lajitellaan EPCAM

– ja EPCAM

+ jakeiden magneettisten helmien konjugoitu ihmisen EPCAM-spesifistä vasta-ainetta (Miltenyi Biotec). RNA uutettiin kunkin fraktion, ja cDNA valmistettiin käyttäen oligo-dT ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita päässä First Strand cDNA Synthesis kit (Roche). 5′- ja 3′-alukkeina varten kvantitatiivinen PCR (qPCR) suunniteltiin käyttäen joko qPrimerDepot [22] tai Primer-BLAST [23] (taulukko S1 File S4). Standard SYBR Green (Roche) qPCR suoritettiin ABI Prism 7900HT havaitsemiseen käytettiin geenin transkriptien. Fluoresenssin tiedot analysoitiin LinRegPCR [24], ja arvioitu alkaa pitoisuus (N

0) kunkin geenin normalisoitui vastaan ​​taloudenhoito geeni

GAPDH

. Ihmisen alkuperä PCR amplikonien peräisin -ksenografteissa varmistettiin dissosiaatiokäyrä analyysi.

RNA-seq Data Analysis

Kunkin näytteen kaikki pariksi lukee kulkee laadun Filtterit käsiteltiin kanssa Tophat splice- tietoinen lyhyen lukea aligner [25]. Sillä ksenografti näytteiden käytimme yksinkertaista konservatiivinen suodatusstrategia erottaa ihmisen lukee, jotka johtuvat Siirto tehty ihmisen kasvainsolut, hiireltä lukee odotetaan näytteet tukevat hiiren kudosta. Tässä strategiassa Tophat käytettiin yhdenmukaistaa lukee sekä ihmisten (hg19) ja hiiren (mm9) viite genomin kokoonpanot. Lukee joka vastasi ihmisen genomin kanssa paremman äänenlaadun (vähemmän mismatching emästä) olivat säilyneet kuin ihmisen lukee. Ne, jotka vastasivat hiiren genomin kanssa paremman äänenlaadun jäivät kuin hiiren. Lukee matching molemmat genomit yhtä Fidelity sijoitettiin kolmanteen ”epäselvä” luokka ja ei käsitellä. Mahdollistamiseksi hyödyllinen vertailu ihmisen kasvainnäytteestä (ilmaiseksi rakentaminen kontaminoivista hiiren sekvenssit) ja johdettu ksenografteissa, käsittelimme ihmisen näytteet läpi saman suodatuksen putki. Alle 0,2% lukee näistä yksinomaan ihmisen näytteet virheellisesti merkitty alkuperämaaksi hiiri, mikä viittaa siihen, että suodatus strategia on alhainen luokitteluvirheen nopeudella. Taulukossa 1 on yhteenveto sekvensointi tuotto, jotka vaihtelevat vähintään 5 Gt yli 30 Gt per näyte, sekä prosenttiosuus lukee kunkin näytteen luokiteltu ihmisen, hiiren tai epäselvä. Sekvensointitiedot ovat saatavilla NCBI Sequence Lue Archive (liittymistä #: SRP028952).

Gene tason lukea laskee luotiin ihmisen ja hiiren kohdistettu lukee käyttäen HTSeq paketti (http: //www huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Lue lukumäärät generoidaan htseq-count käsikirjoituksen jokaisen ihmisen ja hiiren geenilokuksesta unioni on RefSeq ja UCSC KnownGenes kokoelmia, jotka liittyvät ihmisen hg19 ja mm9 kokoonpanot. Lukee täysin sisällä mitään eksonin geeni -mallin katsoneet, että geeni. Luku- laskee kullekin geenille normalisoitiin jakamalla ne kokonaismäärä lukee, miljoonina, saatu kyseisen näytteen.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin R ympäristössä tilastollisiin computing ja Microsoft Excel. Valvomatta hierarkkinen klusterin analyysi geenien ilmentyminen tietojen suoritettiin käyttäen R ympäristön tilastollisiin tietojenkäsittely. Paketti Edger 3.0.2 [26] on käytetty geenien tunnistamiseksi, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kahden tai useamman näytteen. Tagwise dispersiot laskettiin kunkin geenin käyttäen yleistä lineaarista mallia menetelmällä, ja todennäköisyys osamäärätesti laskettiin parien välillä näytteen sarjaa. Geenit vääriä löytö hinnat 0,05 kuluttua Benjamini-Hochberg säätö [27] monimuuttujille määriteltiin ilmentyvät eri. Yli- tai aliedustettuina geenin sarjaa joukossa ilmentyvät eri geenit tunnistettiin R paketti goseq 1.10.0 [28], jossa kanoninen polku ja kemiallisia ja geneettisiä häiriöitä geeni settejä Molecular allekirjoitukset Database (MSigDB) v3.0 [29] . Wallenius kuin Keski hypergeometrisen jakelu menetelmää käytettiin lähentää jakeluun geeniperimä jäsenten keskuudessa differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

Kasvaimen kasvukäyrät sovitettiin yhtälöön kanssa kahdentumisaika määritelty ja hyvyyttä mitataan determinaatiokerroin R

2. Kahden pyrstö Fisherin testiä käytettiin vertailua kategorisen datan kahden ryhmän välillä, kun kaksisuuntaisella Studentin t-testiä käytettiin vertailua määrällisiä tietoja kahden ryhmän välillä.

Tulokset

Experience jossa Generating ja lisäysaineistoa CRC ksenoqraftit

etuna ksenotransplantaatio on, että se mahdollisesti tarjoaa menetelmän levittämään CRC soluihin loputtomiin ja uskollisesti jäljittelee alkuperäistä vanhempien ihmisten kasvain. Olemme pyrkineet kehittämään protokolla, joka tehokkaimmin saavuttaa tämä tavoite. Sublethally säteilytettyä NSG hiiriin injektoitiin yksisolususpensioi- valmistettu kasvainnäytteestä ilman pitkittynyt välissä

in vitro

kulttuuri, joka voisi mahdollisesti valita päätöksen muuttamiseksi ei esiinny alkuperäisessä ihmisen kasvain. Yhteensä 33 57 kirurgisista näytteistä saatuja 27 ulos 50 yksittäisille potilaille joko Paikallista ja /tai metastaattinen CRC (taulukko S2 File S4) on onnistunut kuin ksenografteissa.

Aluksi injektio CRC kasvainsolujen rikastettu ennen istutusta varten soluja, jotka ilmentävät otaksuttu CRC kantasolu markkeri CD133

+ verrattiin injektio irtotavarana, lajittelemattoman kasvainsolut perustamiseksi ksenografteissa koska entinen on liittynyt suurempi todennäköisyys siirteen [1], [2] . Aina kun mahdollista, maksimimäärä CD133

+ – lajitellut solut tai irtotavarana, lajittelemattoman saatujen solujen kasvain injektoitiin annoksella enintään 2 x 10

6 solua. Vaikka injektio 1 x 10

4 CD133

+ – lajitellut solut oli joissakin tapauksissa riittää perustamisesta ksenograftin (taulukot S2 ja S3 File S4), kokonaismäärässä siirteen varten CD133

+ – lajitellaan solut eivät olleet merkittävästi parempi kuin irtotavarana, lajittelemattoman solut (2/5 vs. 25/45, vastaavasti). Koska molemmat CD133

– ja CD133

+ solujen metastaattista CRC kasvaimista on mahdollista perustaa ksenografteissa [6], ja, jotta kaapata heterogeenisyys alkuperäisen ihmisen kasvaimen mahdollisimman paljon, päätös oli pyrkiä käyttämään lajittelemattomien CRC kasvain solujen siirto kaikissa myöhemmissä kokeissa. Vertasimme myös istutuksen syöpäsolujen alla munuaisten kapseli ihonalaisen implantaation ottaen julkaisuja korkeat siirteen CRC solujen jälkeen infra- munuaisten kapseli injektio [1]. Kun injektiota samanaikaisesti sama määrä CRC solujen samasta kasvaimen tehtiin kylki ja munuaiskotelon alle 3 eri hiiriä, tuloksena ihonalainen kasvaimet olivat paljon suurempia kuin ne, jotka on kehitetty munuaisissa. Lisäksi ihonalaisen soluja kylkeen liittyi korkeampi ksenograftin perustamisen kuin subkapsulaarista injektio (3/14 vs. 26/45,

p

= 0.03 kaksisuuntaisella Fisherin testiä) (taulukot S2 ja S3 File S4), ja siihen liittyi vähemmän sairastuvuutta ja varhainen kuolleisuus, jossa varhainen kuolemien ≤1 viikolla esiintyvät 14 30 hiirillä, jotka saivat subkapsulaarista injektioita ja 6 208 hiirillä, jotka saivat ihonalaisen implantteja yksin (

p

= 0,0001).

näiden alustavien huomioiden, ihonalaisen irtotavarana, lajittelemattoman CRC solut kylkeen käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa perustaa CRC ksenograftit. -ksenografteja Perustettu Tällä tavalla oli takautuvasti analysoitiin ominaisuuksia, jotka saattavat liittyä ensisijainen siirteen. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota siirteen menestystä ja kliinisen potilaiden ominaisuuksiin jolta kasvaimet saatiin (taulukko S4 File S4). Miespotilas sukupuoli liittyi suuntaus ylivoimainen siirteen (

p

= 0,06). Keskimääräinen solujen lukumäärä injektoidaan onnistunut ja epäonnistunut siirteen yrityksiä oli merkittävästi erilainen -1,2 x 10

6 (alue: 2 × 10

5-2 x 10

6) solujen onnistunut injektiot vs. 8,8 × 10

5 (alue: 1 x 10

4-2 x 10

6) in epäonnistuneita (

p

= 0,04).

Serial -ksenografteja perustetaan 18 26 ensimmäisen sukupolven, 11 pois 14 toisen sukupolven, ja 8 pois 8 kolmannen sukupolven ksenografteissa. Joitakin -ksenografteja ei siirrostaa johtuu pienestä koosta (≤1 mm halkaisijaltaan), odottamaton hiiren kuolema ennen kasvaimen sato, tai toimimattomuudesta vastaanottajan NSG hiirillä. Niistä 26 ensimmäisen sukupolven ksenografteissa jolle sarja siirrostamalla yritettiin, jotka olivat osoittaneet räjähdysmäinen kasvu osoitti korkeampaa toimivasti siirtyviin toisen sukupolven kuin ne, jotka eivät (16/20 vs. 2/6, vastaavasti,

p

= 0,05), eikä yksikään ksenograftien joka epäonnistui osoittamaan eksponentiaalista kasvua voidaan menestyksekkäästi kuljetettiin yli toisen sukupolven. Kaikki ksenografti linjat, jotka siirrostettiin kuin toisen sukupolven tuotti huomattavan kasvaimien 5 mm, ja se voi kasvaa suurinta sallittua kasvaimen koko 2 cm. Yksi ensisijainen paksusuolen kasvain (D55949) ja yksi etäpesäkekasvainten (P2726) olivat molemmat sarjatuotantona istutetut läpi 10 sukupolville. Monistus- ihmisen kasvainten solujen määrä mahdollistama ksenografti oli useimmiten vähintään 50-kertaiseksi alkuperäisestä solusta annos jokaisen sukupolven, joka mahdollistaa tehokkaan ja nopean laajenemisen CRC soluja.

histologia CRC kasvaimia ja niiden johdannaiset ksenograftien

Useimmat ensimmäisen sukupolven ksenografteissa osoitti vaihtelevasti rauhas morfologia kanssa hyvin määritelty epiteelin ja peruskudoskomponentit muistuttava vanhempien ihmisen kasvaimista (PHTs), josta ne on johdettu (kuviot 1 ja Kuva S1 Kuva S2). Homogeeninen ilmentyminen ihmisen luokan I (major histocompatibility complex MHC) havaittiin kaikissa CRC kirurgisista näytteistä arvioitiin tässä tutkimuksessa, riippumatta niiden johto primaarikasvaimista tai toistuva /etäpesäkeleesioita. Ilmentyminen ihmisen luokan I MHC ensimmäisen sukupolven ksenografteissa, mutta osoitti kaksi erillistä kuvioita. Kaikki ensimmäisen sukupolven ksenografteissa johdetut koolontuumoreissa, ja kaikki kolme näistä peräisin toistuva /etäpesäkeleesioita osoitti homogeenisen ilmentymistä ihmisen luokan I MHC että epiteelin komponenttien mutta ilman ilmaisua peruskudoskomponentit (kuviot 1 ja Kuva S1 Kuva S2 ), mikä viittaa siihen, että strooman näissä ksenografteissa oli peräisin hiirestä, kuten aiemmin on raportoitu [7], [9]. Nämä ksenografteissa tullaan nimitystä ksenografteja (CXS). Sen sijaan ensimmäisen sukupolven ksenografteissa peräisin kolmesta eri potilasta (P2726, P2750, ja P2825) olivat pääasiassa strooman morfologiassa ja osoittivat ilmentymistä ihmisen luokan I MHC sekä niiden epiteeli- ja peruskudoskomponentit, joka osoittaa, että strooman näissä ksenografteissa oli ainakin osittain koostuu ihmisen solujen (kuviot 1 ja kuvio S3). Kaikki kolme näistä potilaista oli vatsakalvon leviäminen heidän sairautensa. Nämä strooman ksenografteja (SXS) olivat peräisin vatsakalvon etäpesäkkeet potilaiden P2750 ja P2825 sekä pahanlaatuiset vesivatsat nesteen potilaan P2726, mistä jonka munasarjojen etäpesäke useita CX suvusta tyypillisiä ihmisen tuumorin /hiiren strooman koostumus myös luotu. Immunohistokemiallinen värjäys vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ihmisen vimentiinin, joka on strooman proteiini, varmisti runsaasti ihmisen vimentiinista kolmen SXS, kun taas värjäämällä ihmisen E-kadheriinin-spesifisiä vasta-aineita osoittivat, että epiteelikasvainsolut käsittää murto-osa soluista näissä SXS ( Kuvioissa 1 ja kuvio S3).

Jokainen rivi (A) – (C) käsittää mikrokuvia kudosleikkeiden yhdestä vanhempien ihmisten kasvainten tai hiiren ksenografti. (A) Vasen sarake: kudosleikkeiden värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H + E). Myöhemmät sarakkeita, vasemmalta oikealle: kudosleikkeiden värjättiin HLA-luokan I (HLA-ABC), epiteelin merkki E-kadheriinin mesenkymaaliset merkki vimentiinistä, endoteelimerkkiaineelle PECAM1, ja T-solujen markkeri CD3. Rivit, ylhäältä alas, esittävät histologinen piirteitä vanhempien ihmisten kasvainten D61540, P2726, ja P2750, pariksi heidän ensimmäisen sukupolven ksenografteissa. Histologia strooman-vallitseva ksenografti kehitetty P2726 askitesnesteestä on myös esitetty viidennen rivin; valkoinen nuoli E-kadheriinin mikrovalokuva tässä rivi osoittaa pieni painopiste syöpäsoluja. Arrowheads että PECAM1 micrograph varten P2750.Tu.X1 ksenograftissa osoittavat alueet PECAM-1-immunoreaktiivisten soluissa. Kaikki kuvat saatiin 200x suurennuksella. White mittakaavajana vasemmassa yläkulmassa micrograph edustaa 200 um.

immunohistokemia (IHC) osoitti myös, että vasculatures on CXS ja SXS, koska niiden peruskudoselementeistä, olivat erilaiset alkuperää. Osajoukko vanhempien ihmisten kasvainten pariksi ensimmäisen sukupolven ksenografteja tutkittiin ekspressiota ihmisen verihiutaleiden endoteeli- soluadheesiomolekyyli (PECAM-1, CD31), joka ilmentyy selektiivisesti ihmisen endoteelisoluissa ja osajoukot hematopoieettisten solujen. Immunoreaktiivisuus ihmisen PECAM-1 havaittiin kaikissa PHTs, odotetusti, mutta ei niiden johdannainen CXS. Molemmat SXS kuitenkin osoittivat ilmentymistä ihmisen PECAM-1, vaikka jakautuminen ihmisen PECAM-1-immunoreaktiivisten solujen SXS oli jonkin verran epäsäännöllisiä ja ei täydellisesti kerrata jakelu tällaisten solujen, jotka on tyypillisesti havaittu PHTs ( Kuvioissa 1 ja kuvio S3). Läsnäolo Ihmisen strooman vuonna SXS mutta sen puuttuminen CXS heijastui samankaltaista ihmisen CD3 ilmaisua. IHC paljasti, että CXS eivät yleensä sisällä soluja, jotka on värjätty vasta-aineilla ihmisen CD3 ja CD8, sopusoinnussa menetys ihmisen soluttautua CD3

+ ja CD8

+ soluja niiden johdannainen ksenografteista. Hieman yllättäen, molemmat SXS kuitenkin, sisälsivät soluja, jotka ilmensivät ihmisen CD3 ja CD8 ja todennäköisimmin jäljellä ihmisen T-soluilla, jotka oli yhdessä injektoitu kasvaimeen soluympissä, itsepintaisesti SXS, ja tunkeutui ksenografteissa laajemmin TIL päässä PHT (kuviot 1 ja kuvio S3, ja dataa ei näytetty).

histologinen ominaisuudet toisen ja myöhemmän sukupolven CXS olivat yleisesti ottaen hyvin samanlaisia ​​kuin edellisen sukupolven CXS, josta ne on johdettu . Epiteelin komponentti useimpien CX suvusta ylläpitää vahvaa ilmaisua sekä EpCAM ja CEA kautta sarjasiirteillä, ja määrä ja jakauma ilmentävien solujen Ki-67 Samoin pysyi vakaana (kuvio S2A). Strooman ja verisuoniston näiden CX suvusta olivat johdonmukaisesti negatiivisia ilmentyminen ihmisen luokan I MHC (kuvio S2A), mikä viittaa siihen, että he olivat stabiilisti tuettu hiiren strooman ja verisuonia.

Global Transcriptional Analyysi Kolorektaalituumorien ja ksenoqraftit

RNA-seq käytettiin määrittämään ihmisen ja, vierassiirrännäisille, hiiren transkription profiileja 4 paksusuolensyöpä näytteet -2 primaareja kasvaimia ja 2 etäpesäkkeitä, 11 ksenografteissa perustettu näiden kasvainnäytteet, ja yksi näyte normaali paksusuolen vieressä yksi etäpesäkkeitä (P2750) (tiedostot S1 ja S2). Arvioida toistettavuus RNA-seq analyysi paksusuolensyöpä näytteiden ja niiden johdannainen ksenografteissa, vertasimme transkription profiilit puolikkaat jakaa kahtia ensisijaisen paksusuolen kasvaimen potilaan D61540. Tämä analyysi paljasti, tiukka korrelaatio (Pearson kerroin r = 0,985) välillä ekspressiotasoja kaikista ihmisen geenien kaksi puolikasta näytteen (kuvio 2A). Samantyyppinen tiukka korrelaatio (r = 0,975) välillä havaittiin transkriptionaalisen profiilit synkronisesti resektoitiin mutta ei-vierekkäisiä munasarja- ja omental etäpesäkkeiden potilaan P2726 (kuvio 2A).

sirontakaavioissa näyttää normalisoitu transkriptin määrä (in määrä per million) yksittäisten ihmisen geenien kahden näytteen, jotka on merkitty

x

– ja

y

-axes. Red ristit osoittavat konsensuksen taloudenhoito geeni [50]. Non-siivous geenit on merkitty violetti piireissä tai keltaisen kolmion: violetti ympyrät edustavat geenejä ilmaistu jollakin tasolla molemmissa näytteissä, ja keltainen kolmioita akselien edustavat geenejä ilmaistu yhdessä näytteessä, mutta ei muita. Pearsonin korrelaatiokerrointa kaikissa geenit kustakin Parittainen vertailu on merkitty mustalla yläpuolella vasemmassa yläkulmassa kullekin lohkolle; korrelaatio varten osajoukko taloudenhoito geenien merkitty punaisella. Lävistäjä rivi on paikoitellen kohtia, joille x = y. (A) Vertailu ilmentymisen taso ihmisen geenien puolikkaat jakaa kahtia ja peräsuolen kasvaimen D61540 (vasen paneeli) ja munasarjojen ja omental etäpesäkkeiden P2726 (oikea paneeli). (B) vertailu ilmaisun taso ihmisen geenien kolmessa vanhempien ihmisen kasvaimista (D61540.T2, P2726.Ov, ja P2750.Tu, vasemmalta oikealle) ja ensimmäisen sukupolven ksenografteja (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, ja P2750.Tu.X1). (C) Vertailu ihmisen geenin ilmentymisen tasoa epätyypillinen strooman-vallitseva ksenografti perustetaan P2750 ja sen ensimmäisen sukupolven ksenografti. (D) Mean kasvukinetiikka CXS (n = 5), jotka ovat peräisin munasarjojen ja omental etäpesäkkeet P2726 (P2726.Mets.X1) on merkitty mustat timantit yhdistetty lihavoitu viiva, verrattuna kasvun kinetiikka SX peräisin askitesnesteestä of P2726 (P2726.As.X1) merkitty harmaa neliöt liitetty harmaa viiva. Kaikki ksenografteja todettiin injektoimalla 2 x 10

6 solua kylkeen on NSG hiiri. Taulukko S1. Taulukko S2. Taulukko S3. Taulukko S4. Taulukko S5.