Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustat

Peritoneaalidialyysi hyökkäyksen paksusuolensyöpä on tärkeä ennustetekijä. Peritoneaalisille invaasio voidaan objektiivisesti tunnistaa periotoneal joustava laminal invaasiota (ELI) käyttämällä elastica tahra, ja syöpä microenvironment muodostaman vatsakalvon invaasio (CMPI) voidaan myös havaita. Tapaukset, joissa ELI useammin näyttää kaukainen etäpesäke ja toistumisen. Siksi CMPI saattavat edustaa tiettyä miljöö, joka helpottaa syövän etenemiseen. Patologinen ja biologisten tutkimusten CMPI voi valaista tätä mahdollisesti erottuva syöpä microenvironment.

Methods

Analysoimme aluekohtaisia ​​kudossiruina määrittää patologisia piirteitä CMPI, ja lisätyistä subperitoneal fibroblasteja (Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ) ja limakalvon alaista fibroblasteissa (SMFs) ihmisen koolonin kudokseen. Biologisia ominaisuuksia ja tulokset geeniekspressioprofiili analyysejä verrattiin ymmärtää paremmin vatsakalvon hyökkäyksen paksusuolensyöpä ja miten tämä voi muodostaa erityisen mikroympäristön kautta vuorovaikutuksessa Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet. Hiiri ksenograftikasvaimissa, johdetaan yhteistyössä injektio syöpäsolujen joko Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs, perustettiin arvioida niiden aktiivisemmin kasvainprogression ja etäpesäkkeitä.

Tulokset

Havaitsimme, että fibroosia alfa sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ilmentyminen oli merkittävä patologinen piirre CMPI. Erot lisääntymistä ja geeniekspressioprofiili analyysissä todettiin Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs olivat erillisiä populaatioita, ja että Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet oli ominaista korkeampi ilmauksia soluväliaineen (ECM) -associated geenejä. Lisäksi verrattuna SMFs, Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet osoittivat vaihtelevampi muutoksen geeniekspressioiden syövän jälkeen solun väliaine stimulaatiota. Gene ontologia analyysi paljasti, että Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet erityisiä voimistunut geenejä rikastettiin aktiini-sitovia tai supistuvien liittyvien geenien kuten α-SMA koodausta ACTA2. Hiiren ksenograftikasvaimissa johdetaan co-injektion syöpäsolut alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä osoitti parannuksen kasvaimen kasvua, metastaasia, ja kapasiteetti kasvainten muodostumista verrattuna, jotka on saatu co-injektion syöpäsolujen ja SMFs.

Päätelmät

CMPI on erityinen mikroympäristön, ja vuorovaikutus Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja syöpäsolujen sisällä CMPI edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

Citation: Kojima M, Higuchi Y, Yokota M, Ishii G, Saito N, Aoyagi K, et ai. (2014) Human Subperitoneal Fibroblast ja Cancer Cell vuorovaikutus luo mikroympäristölle joka parantaa syövän etenemiseen ja Metastasis. PLoS ONE 9 (2): e88018. doi: 10,1371 /journal.pone.0088018

Editor: Soroku Yagihashi, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 27 syyskuu 2013; Hyväksytty: 02 tammikuu 2014; Julkaistu 4 helmikuuta 2014

Copyright: © 2014 Kojima et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat JSPS KAKENHI lupanumeroon 24590458, ja apurahan 3rd aikavälin Kattava 10 vuoden strategia Cancer valvonta (23-a-3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka kasvaimen koko on merkittävä ennustetekijä monissa syövissä, ennusteen ruoansulatuskanavan syöpä ei kerrostunut eikä kasvaimen kokoa vaan kasvaimen leviäminen [1]. Vatsakalvon invaasio kolorektaalisyövässä on raportoitu olevan vahva ennustetekijä, mutta tämä termi ei ollut hyvin määritelty, ja havaitseminen ja diagnoosi menetelmät on kyseenalaistettu [2] – [4]. Viimeaikaiset patologinen raportit ovat osoittaneet, että elastica tahra, jossa korostetaan vatsakalvon elastisen kerroksen lähelle periotoneal pintaa, on hyödyllinen tavoite havaitsemiseen vatsakalvon hyökkäystä. Me ja muut ovat todenneet, että vatsakalvon invaasio määritelty kasvaimen invaasio pidemmälle vatsakalvon joustava lamina (elastinen laminal invaasio: ELI) on vahva ennustetekijä jotka voivat vaikuttaa tuleviin pT kriteerejä unionissa International Cancer valvonta (UICC) TNM luokittelu [5] – [7]. Vatsakalvon on hyvin ohut kalvo, 500 um, ja vatsakalvon elastisen kerroksen vallitsee tällä kalvo. Taajuus synkroninen etäpesäke ja toistumisen lisätään 2-4 kertaa, kun kasvain tunkeutuu tähän kapeaan tilaan [5]. Nämä tulokset voi ehdottaa, että kasvaimen etenemistä ja etäpesäkkeiden tekemistä helpottaa syövän mikroympäristölle muodostama vatsakalvon invaasio (CMPI). Laajuus CMPI voidaan tunnistaa käyttämällä elastica tahra, ja patologiset ominaisuudet CMPI voidaan myös määrittää.

kudoksen mikrosiru helpottaa arvioinnin proteiinin ilmentymisen suuri määrä kudosta lohkojen yhdestä näytteestä, ja aluekohtaisia ​​kudossiruina on raportoitu olevan käyttökelpoisia tutkia määrättyjä kasvaimen alueilla suuret ikäluokat [8]. Sen jälkeen, kun määritys CMPI käyttämällä elastica tahra, kudoksen ydin voidaan saada tällä alalla ja vertailu ominaisuudet kasvaimeen alueet voidaan myös suorittaa. Tämä prosessi voi mahdollistaa arvioinnin tärkeitä biologisia ilmiöitä tässä syövän mikroympäristössä.

Viimeaikaiset edistysaskeleet syöpätutkimuksessa on perustettu käsite syövän microenvironment joka edistää kasvaimen aloittamista invaasio, ja etäpesäkkeiden [9]. Vaikka syöpä microenvironment koostuu monenlaisia ​​soluja, käyttö aluekohtaisten kudossiruina voivat sallia keskittyä kennokomponenteista jotka luonnehtivat CMPI. Lisäksi jos nämä solu komponentteja voidaan viljellä päässä histologisesti vastaava subperitoneal alue, biologinen tutkimus valottaa tämän otaksuttu syöpää edistävää mikroympäristölle voidaan suorittaa.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten peräsuolen syöpä ennuste vaikuttaa vatsakalvon hyökkäystä. Olemme rakennettu alue-spesifisen kudoksen microarray järjestelmä määrittää ominaisuus solun komponenttien CMPI. Seuraavaksi viljelty erityinen fibroblastien osapopulaatioiden päässä limakalvon alaista ja subperitoneal kerrokset ihmisen paksusuolen seinään. Biologisia ominaisuuksia ja geenin profiilit submukosaalisen fibroblastien (SMFs) ja subperitoneal fibroblasteissa (Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet) tai ilman syövän-cell-väliaine (CCCM) stimulaation verrattiin. Myöhemmin rakensimme ksenograftikasvaimissa samanaikainen injektio syöpäsolujen joko Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs. Tutkimuksemme ehdotti uutta ehdokas syöpää edistävää microenvironment paksusuolen syövän ja selvitetty Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ratkaisevina pelaajia parantamiseksi syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden.

Potilaat ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus hyväksyttiin National Cancer Center Hospital East Institutional Review Board (nro: 19-021). Kirjallinen yleisen suostumuksen käyttää biologinen materiaaleja tutkimukseen saatiin jokaisen osallistujan ennen kudoksen hankintaa. Eläinkokeet hyväksynyt eläinten eettisen komitean National Cancer Center Hospital East (K11-032).

Potilastiedot ja havaitseminen ELI

neljä sataa peräkkäisen potilaalla on TNM luokittelu (5

painos) pT3 ja pT4a paksusuolen syöpä [10], leikkauspotilaiden välillä 1996 ja 2003 National Cancer Center Hospital East, otettiin. Käyttämällä elastica tahra tunnistimme 173 tapauksia ELI ja edelleen tutkittiin näissä käyttämällä aluekohtaisia ​​kudossiruina [5], [8]. Niistä 173 tapauksissa ELI, 107 olivat pT3 ja 66 olivat pT4a.

rakentaminen Area-Specific kudossiruina

Valaistaan ​​patologiset ominaisuudet CMPI paksusuolen syövän kudosta, määrittelimme syöpä microenvironment seuraavasti: (a) CMPI on kasvain raja vatsakalvon invaasiota ja (b) syövän microenvironment muodostama limakalvon alaista invaasio (CMSI) on limakalvon alaista invasiivisia kasvain raja (kuvio 1A) [5]. 2-pisteen kudos microarray jälkeen määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Jokainen kasvain alue oli merkitty musteella histologinen dia; yhden kudoksen ydin, halkaisija 2 mm saatiin jokaisesta syövän mikroympäristön ja siirretään vastaanottajalle lohkoon käyttäen Tissue Microarrayer (Azumaya, Tokio, Japani). 24 tapauksessa, riittämätön syöpäkudoksessa saatiin CMPI. Kuitenkin riittävä kudos saatiin 149 tapauksessa; nämä analysoitiin histologisesti ja immunohistokemiallisesti (katso materiaalit ja menetelmät S1, ja taulukko S1).

(A) Schema syöpä microenvironment muodostama vatsakalvon invaasio (CMPI) ja syöpä microenvironment muodostama limakalvon alaista invaasio (CMSI) määritellään (a) invasiivisia edessä vatsakalvon invaasiota ja (b) limakalvon alaista invasiivisia eteen, vastaavasti. (B) jakautuminen fibroosin ihmisen paksusuolisyöpäkudoksessa. Tummanharmaa palkit osoittavat asioiden lukumäärä fibroosia yli 50% ytimen kunkin kasvaimen alueelle, ja vaaleanharmaa palkit osoittavat asioiden lukumäärä ilman laajaa fibroosia. Core näytteitä CMPI oli suurempi taajuus merkittyjä fibroosia kuin teki kairausnäytteitä kanssa CMSI (

P

0,01). (C) Distribution of α-SMA ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän kudosta. CMPI osoitti korkeampia α-SMA ilmaisuja kuin nähdään CMSI (

P

0,01). (D) Distribution of CD3-positiivisten solujen ihmisen paksusuolisyöpäkudoksessa. Numerot CD3-positiivisten solujen eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä CMPI ja CMSI. (E) Distribution of CD68-positiivisten solujen ihmisen paksusuolen syövän kudosta. Numerot CD68-positiivisten solujen eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä CMPI ja CMSI. (F) Distribution of CD31-positiivisia suonia ihmisen paksusuolisyöpäkudoksessa. Lukumäärät CD31-positiivisia suonia ei ollut merkitsevää eroa CMPI ja CMSI. Tulokset (B) esitetään tapaukselta numeroita, ja ne, (C-F) esitetään keskiarvona ± SD 149 tapausta (**

P

0,01).

Antibodies, Regents ja immunohistokemia

vasta, reagenssit, ja immunohistokemiallinen menettelyt on kuvattu Materiaalit ja menetelmät S1 ja Taulukko S2.

Evaluation of aluekohtaisia ​​Tissue Microarray Osiot

korkean resoluution slide kuvat hankittiin kaikista kudoksesta ytimet hematoksyliini-eosiinilla (HE) ja immunohistokemia värjäys käyttäen NanoZoomer 2,0-HT dia skanneri (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japani). Kaikki ytimet tutkittiin käyttämällä katsoja ohjelmisto (NDP näkymä: Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japani). Kun fibroosin pinta-alan yli 50% koko kudoksen ydin, jossa on 2 mm: n halkaisija, kun H.E värjäys, se määriteltiin positiiviseksi merkitty fibroosi. On immunohistokemiallinen värjäys, hot spotteja kanssa CD3-, CD31- ja CD68-positiivisia soluja tai alukset on valittu siirrettäväksi katsoja ohjelmisto, niin kuvan x20 suurennus (0,51 mm

2) otettiin, ja tallennetaan JPEG . Positiivisia soluja tai alusta laskettiin kunkin kuvan käyttämällä morfometrisiin ohjelmistoa (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japani). Lisäksi alue korkein alfa sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ilmentyminen fibroblasteissa valittiin, sitten x20 suurennus (0,51 mm

2) kuva otettiin, ja tallennetaan JPEG-muotoon. Suhde α-SMA positiivinen alue kuvan laskettiin käyttämällä morfometristä ohjelmistoa, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Α-SMA ilmentymistä normaalissa lihaskudoksessa, määritettynä vertaamalla sarja H.E dia, ei arvioitu. HE ja immunohistokemiallisella värjäyksellä tiedot CMPI verrattiin että CMSI valaista histologiset ominaispiirteet CMPI.

Ensisijainen soluissa ja solulinjoissa

Submukosaalinen kudosta saatiin sigmasuolessa kudoksesta yli 5 cm kaukana kasvain. Koolonkudoksessa leikattiin lihaksiston kerroksen luminaalipuolella, ja lamina propria ja limakalvo kudokset saatiin. Seuraavaksi lamina propria oli pesty pois saamiseksi limakalvon alaista kudosta. Subperitoneal kudosta saatiin sigmasuolessa suoliliepeen yli 5 cm: n etäisyydellä kasvaimen käyttämällä toimivien pinseteillä ja saksilla. Nämä kudokset pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin 5% trypsiiniä 20 minuuttia, 3 kertaa. Supernatantti sentrifugoitiin metallilla lautasella, ja limakalvon alle fibroblastit (SMFs) ja subperitoneal fibroblasteissa (Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet) saatiin ja kasvatettiin sitten ja ylläpidetään MF-väliaineessa (Toyobo, Tokio, Japani) [12]. Kaikki kokeet suoritettiin solujen 8 kohtia.

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat DLD-1 ja Caco-2 saatiin American Type Culture Collection ja niitä kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO), joka sisälsi 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Palo Alto, CA).

proliferaatiomääritystä, immunosytokemiallinen värjäys, ja virtaussytometria-analyysi

Soluproliferaatiomäärityksiä immunosytokemiallisen värjäyksen ja virtaussytometria analyysit tehtiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät S1.

stimulointi Sidekudosmuodostussolujen Cancer Cell Medium

Aluksi, 1,7 x 10

4 /cm

2 fibroblastien ja DLD-1-soluja kasvatettiin erikseen DMEM, joka sisälsi 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 10% FBS: ää 48 tunnin ajan, ja sitten nälkiinnytettiin 24 tuntia. Seuraavaksi väliaine poistettiin fibroblastien, ja väliaineen nälässä DLD-1-soluja lisättiin fibroblastien 24 tuntia luoda fibroblastien syöpäsolujen-väliaine (CCCM) stimulaatio. Kontrollina fibroblasteja nälässä 48 tunnin ajan (saatiin fibroblastien ilman CCCM). Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs joko kanssa tai ilman CCCM arvioitiin käyttämällä immunosytokemialla tai geenin ilmentymisen analyysi. Koska arviointia varten immunosytokemialliset α-SMA ilme, alue korkein α-SMA ilmentyminen valittiin, sitten x20 suurennus (0,51 mm

2) kuva otettiin, ja tallennetaan JPEG-muotoon. Suhde α-SMA positiivinen alue kuvan laskettiin morfometrisiin ohjelmistoa (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japani).

geeniekspressioanalyysissä käyttäen Microarray

kolme sarjaa Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs joko kanssa tai ilman CCCM, joka on saatu 3 eri potilailla, käytettiin tässä tutkimuksessa. Käytimme GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Target cDNA tuotettiin 100 ng kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä käyttäen 3 ’IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Menettelyt kohde hybridisaatio, pesu ja värjäys signaalin vahvistus suoritettiin mukaan toimittajan protokollia. Taulukot skannattiin Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA), ja intensiteetti kunkin ominaisuuden array laskettiin käyttäen GeneChip- Operating Software, versio 1.1.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Keskimääräinen intensiteetti vakioidaan kohde intensiteettiä, joka asetettiin yhtä suuri kuin 1000, luotettavasti vertailla eri paneelit. Arvot olivat log muuttaneet ja mediaani keskitetty. Ohjelmat GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) käytettiin suorittamaan numeerisia analyyseja geenin valintaan.

Vieraslajisiirteen elinsiirtoja ja kasvaimen muodostumisen määritys

joko 1 x 10

6 paksu- syöpäsoluja Caco-2 tai DLD-1 yksin, tai joko 1 x 10

6 Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs, injektoitiin ihon alle (sc) takaosaan SCID-hiirten (8 -12viikko ikäinen; CLEA, Tokio, Japani). Kasvaintilavuudet laskettiin viikoittain kuten aiemmin on kuvattu [13]. Hiiret injektoitiin Caco-2 yksin tai joko Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs tapettiin 10 viikon jälkeen, ja ne ruiskutettiin DLD-1 yksin tai joko Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs tapettiin 8 viikon kuluttua, ja kasvainten painot arvioitiin. Kaukaisilla metastaattisen analyysiä, keuhko- ja maksakudosta poistettiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla ja analysointiin imusolmuke etäpesäke, niska ja imusolmukkeet rasvakudos poistettiin myös ja kiinteät; kaikki kudokset histologisesti tutkittiin. Käytimme 8 hiirtä kussakin ryhmässä.

Valaistaan ​​kapasiteetin fibroblastien parantaa kasvaimen muodostumisen, sarjalaimennoksia Caco-2 tai DLD-1 syöpäsolujen samalla yhteistyössä injektoitiin joko 1 x 10

6 SMFs tai Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet. Kasvaimen muodostumiseen arvioitiin 4 viikkoa injektion jälkeen. Käytimme 4 hiirtä kussakin ryhmässä.

Tilastollinen analyysi

X

2 testi ja Opiskelijan

t

testiä käytettiin kudoksen microarray analyysi, soluproleferaatiomäärityksessä, ksenografti elinsiirrot, ja kasvaimen muodostumisen määritys.

P

0,05 määriteltiin tilastollisesti merkitsevä. Vuonna mikrosiruanalyysi, geenien ilmentyminen analysoitiin käyttämällä GeneSpring GX12 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Rivi tietoja tiivistetysti käyttämällä MAS5 ja normalisoidaan log transformaatio ja mediaani keskitys numeeristen analyysien geenien valintaa. Sillä pääkomponenttianalyysi (PCA), käytimme koetinsarjojen jotka luotettavasti ja vaihtelivat 3-kertaisesti yli globaalin mediaani vähintään 2 näytettä (noin 10%); analyysit suoritettiin käyttäen GeneSpring GX12. Differentiaalisesti ilmaisi koetinsarjojen käytetään valvotuissa hierarkkinen klusterointi valittiin perustuen

P

0,05 ja taita muutos (FC) 2.0.

P

arvot laskettiin käyttäen yksisuuntainen ANOVA Benjamini ja Hochberg FDR useita testaus korjauksen. Hierarkkinen klusterointi kanssa massakeskimääräinen sidos klusterointi suoritettiin käyttäen Cluster ja Puunäkymäikkuna ohjelmat (Michael Eisen, Stanfordin yliopisto genome-www.stanford.edu). Toiminnallinen merkinnästä klusterointi Gene ontologia Enrichment analyysi suoritettiin käyttäen DAVID ohjelmistoa, luokituksen tiukkuuden asetettu ”High”, ja merkittäviä klustereita valittiin perustuen Rikastusprosessista pisteet 2,0 ja

P

0,01 (Fisherin tarkka testi, kun Benjamini ja Hochberg FDR useita testaus korjaus) [14], [15].

tulokset

histologinen ominaisuudet ELI

Ei vain kasvainsoluja, mutta myös lajikkeiden stroomasolujen muodostavat erilliset syöpä mikroympäristön, ja jotkut edistää tuumorietäpesäke [9]. Ensin selvitetty merkittävät histologisia piirteitä CMPI valottaa ilmiöitä esiintyy tässä miljöössä käyttämällä aluekohtaisten kudossiruina. Kliinis ominaisuudet 149 tapauksessa käytetään on esitetty taulukossa S1. On H.E värjäys, löydettiin laaja fibroosia (yli 50%) useammin CMPI kuin nähtiin CMSI (kuvio 1 B). Suhde α-SMA positiivinen alue CMPI oli myös korkeampi kuin nähdään CMSI (kuvio 1C). Osuudet T-lymfosyyttien, makrofagien tai mikrosuonten arvioitiin käyttäen CD3, CD68 tai CD31, vastaavasti, eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä CMPI ja CMSI (kuvio 1D-F). Sekä CMPI ja CMSI, pullea kara-muotoinen fibroblastit olivat pääasiallinen lähde α-SMA ilmaisun, ja suhde onnistuneesti analysoitiin morfometrisiin ohjelmistoa (kuva 2A-D). Ottaen huomioon aikaisemmat tulokset, jotka osoittivat, että vatsakalvon invaasio määritelty ELI oli tiiviisti etäpesäkkeiden, me arveltu, että fibroblastien subperitoneal kerros voitiin sekaantunut paitsi näkyvä fibroosia ja aktivointia, vaan myös kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden. Päätimme sitten eristää fibroblasteja siitä subperitoneal kerros, joka histologisesti vastasi vatsakalvon hyökkäystä. Fibroblastit päässä submukosaalisen kerrosta käytettiin kontrolleina.

(A) Histologinen piirteet strooman komponentin CMPI. Sekä CMPI ja syövän microenvironment muodostama limakalvon alaista invaasio (CMSI), pullea kara-muotoinen fibroblastit olivat päälähde strooman. (B) merkittyjen α-SMA ekspressio havaittiin fibroblasteissa. (C) Suurempi suurennus selvemmin paljasti pullea kara-muotoinen fibroblasteissa. (D) Käyttämällä morfometrisiin ohjelmisto, me onnistuneesti havaita ja analysoida α-SMA ilme.

eristäminen ja karakterisointi ihmisen viljellyissä Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs

Aluksi arvioimme morfologiset ja biologiset ominaisuudet alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs normaalissa tilassa. Sekä viljellyissä ihmisen alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs osoitti vastaavia kara-muotoinen morfologiset ominaisuudet (kuvio S1A-B). Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs 3 potilasta voidaan viljellä myös yli 10 kohtia, lukuun ottamatta 1 SPF tapauksessa (tietoja ei esitetty). Immunosytokemia ja virtaussytometria osoitti saadaan alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs olivat yhdenmukaisia ​​fibroblasteissa (kuvio S1C-D). Löysimme heikko α-SMA ilmentyminen muutamissa Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs. Tuplaus aika Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs oli 79,9 tuntia ja 36,3 tuntia, vastaavasti, ja kasvu SMFs oli nopeampaa kuin Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (

P

0,05), joka ehdotti biologinen ero Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs ( Kuvio S1E).

geeniekspressioprofilointi vertailu alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs

arvioimiseksi fenotyyppiset erot alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs, geeni-ilmentymisen profiilit fibroblastien kanssa tai ilman CCCM stimulaation verrattiin. PCA paljasti 4 eri klusterit, riippuen niiden alkuperästä ja CCCM stimulaatio, joka voitti yksilöllinen vaihtelu (kuvio 3A ja B). Ohjattu klusterianalyysillä paljasti myös 4 eri klustereiden (kuvio 3C). Tämä osoitti fenotyyppiset erot fibroblasteissa sisällä paksusuolen seinään. Ja tämä ero riippui histoanatomical sijainnin. Lisäksi reaktio CCCM stimulaatio oli myös erilainen.

(A) Punainen on microarray profiilia SMFs kanssa CCCM stimulaatio, sininen on SMFs ilman CCCM stimulaatiota, vihreä on Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet kanssa CCCM stimulaation, ja hopea on Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ilman CCCM stimulaatiota. Kolmiulotteinen esitys pääkomponenttianalyysi (PCA) komponentti 1, 2, ja 3 (B) Kaksiulotteinen esitys PCA osat 1 ja 2 (ylempi) ja PCA osat 1 ja 3 (alempi). Fibroblastit muodostettu itsenäinen klustereita, riippuen histoanatomical päällä ja läsnäolon CCCM stimulaation. (C) Valvottu klusterianalyysillä fibroblasteissa paljasti myös erillisiä klustereita riippuen histoanatomical päällä ja läsnäolon CCCM stimulaation. (D) Gene ontologia analyysi ilmen- tymisen lisääntymisen geenien Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet verrattuna SMFs. (E) Gene ontologia analyysi geenien yläreguloituja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet kanssa CCCM stimulaation verrattuna SMFs kanssa CCCM stimulaatiota. Suurin osa geenien lisääntynyt ilmaisuja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jäivät jälkeen CCCM stimulaation; oli kuitenkin joitakin eroja, ja järjestys merkintä klusterien muutettiin jälkeen CCCM stimulaation.

Seuraavaksi vertasimme geeniekspressioprofiilien näissä fibroblasteissa ja ilman CCCM stimulaatio, erikseen (kuva 3D-E ). Tiedot Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ilman CCCM stimulaatiota rikastettiin geeni ontologian (GO) termejä ”soluväliaineen” ja ”proteiinipitoinen soluväliaineen”, joka muodostuu huomautus klusteri 1. Major expracellular matriisi (ECM) komponenttien kollageenien (COL1A1, COL4A1, COL4A2, COL5A1 ja COL16A1), laminiini tai fibronektiiniä kuuluivat tähän klusteriin. Lisäksi geeni-ilmentymisen liittyvät osat, jotka sitoutuvat ECM myös yläreguloituja alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja muodostettu merkintä klusterin 2. Huomautukset klusteri 3 on rikastettu GO liittyvät termit ”rakeiden” tai ”rakkuloiden” (kuvio 3D ja taulukko S3). Tämä tulos ehdotti geeniekspressioprofiili liittyy perustehtävänä fibroblasteissa on erilaiset Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs sisällä paksusuolen seinään. Top 20 geenit erittäin ilmaistu Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet myös useita ECM komponentteja. Liittyvien geenien fibrogenesis tai myofibroblastic erilaistumista FLI1 ja NOX4 havaittiin myös top 20 geenejä (taulukko S4). Muun erittäin ilmaistuna geenejä alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ilman CCCM stimulaatiota, löysimme koskettamalla sitä, SPARC tai COL4A1, joiden tiedetään olevan erittäin ilmaistaan ​​syöpä strooman; ja monet näistä ovat ennustavia tekijöitä [11], [16], [17].

Suurin osa geenien lisääntynyt ilmaisuja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ilman CCCM stimulaatiota merkkiainetta oli myös läsnä ollessa CCCM stimulaation; oli kuitenkin jonkin verran eroja (kuva 3D-E taulukossa S5-6). GO analyysi Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet kanssa CCCM stimulaatio, järjestys merkintä klusterien muutettiin verrattuna nähdään Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ilman CCCM stimulaatiota. Joukossa 20 geenit, 13 geenejä säilytettävä ja 7 geenit korvattiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ero reaktion CCCM stimulaation välillä alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs. Olemassaolon alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä-geenit, jotka on voimistunut jälkeen CCCM stimulaation arvioitiin.

analysoitiin sitten nämä geenit vahvistaa biologisten ominaisuuksien alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä altistuksen jälkeen CCCM. Venn kaavio paljasti 193 yliaktiivista geenien Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja 59 SMFs jälkeen CCCM stimulaation. Näistä 51 olivat yleisesti voimistunut sekä Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja SMFs, 142 olivat Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet erityisiä, ja vain 8 olivat SMFs erityinen (kuva 4A). Sitten keskittyi myös vaimentua geenejä, ja löysi 215 Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja 146 vuonna SMFs. Näistä 138 olivat yleisesti vaimentua sekä alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä ja SMFs, 77 olivat alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä erityisiä ja vain 8 olivat SMFs erityisiä (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet osoittivat vaihtelevampaa muutos geenien ilmentyminen jälkeen CCCM stimulaation. GO aikavälin analyysi SPF-geenejä vaimentua jälkeen CCCM stimulaation ei paljastanut mitään huomautusta klusterin yli 3,0 rikastustoimenpiteen pisteet (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, GO aikavälin analyysi Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet-spesifisten geenien voimistunut jälkeen CCCM stimulaation paljasti, että termejä, kuten ”aktiini sitova”, ”tukirangan sitoutuva proteiini”, ”supistuvien kuituja”, ”LIM domain”, ”supistuvien kuituja osa”, ”sarkomeerin” ja ”myofibrilli” muodostetaan merkintä klusteri 1-3 (kuvio 4C). Useimmat näistä geeneistä oli tiedetään liittyvän solun supistumisen. Joukossa 20 geenit oli monia solun tukirangan tai contractility liittyviä geenejä. Yllättäen ACTA2 joka koodaa α-SMA säädeltiin voimakkaammaksi erityisesti Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jälkeen CCCM stimulaation (kuvio 4D). Tämä tulos vahvistettiin immunosolukemiallisella (kuvio 4E-F). Morfometrisiin analyysi immunosytokemiallisessa ilmaisu paljasti, että α-SMA ilmentyminen säädeltiin nimenomaan ja merkittävästi Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jälkeen CCCM stimulaation proteiinia tasolla (kuva S2,

P

0,05). Muuttuvat ylössäätely ja downregulation geenien jälkeen CCCM stimulaation oli merkittävä ominaisuus Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet. ACTA2 koodaus α-SMA sisällytettiin tähän Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet erityisiä ilmen- tymisen lisääntymisen geeniperimä. Syöpäliittynyt fibroblastit (valuuttalisiin) sisältyvät α-SMA-positiivisia aktivoitu myofibroblasteja. Yhdessä tulos aluekohtaisten kudossiruina, merkitty α-SMA ilmentyminen CMPI on riippuvainen herkkää luonnetta Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet, jotka voivat liittyvä ero syövän mikroympäristössä.

(A) Genes voimistuvan CCCM stimulaation . (B) Genes vaimentua mukaan CCCM stimulaatiota. (C) Top 3 huomautus klustereita geenien ontologian analyysi Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet-geenejä voimistuvan CCCM stimulaatiota. (D) Top 20 geenien voimistunut erityisesti Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jälkeen CCCM stimulaation. (E) immunosytokemi- α-SMA ilmentymisen SMFs jälkeen CCCM stimulaation. (F) immunosytokemi- α-SMA ilmentymisen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jälkeen CCCM stimulaation. α-SMA ilmentyminen säädeltiin nimenomaan Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet jälkeen CCCM stimulaation (katso myös kuva S2).

Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet Paranna kasvaimen kasvun etäpesäke ja kasvainten muodostumiselle Kyky voimakkaammin kuin tehdä SMFs

selvittämiseksi toiminnallisia eroja fibroblastien paksusuolen seinään, me pistetään paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa Caco-2 tai DLD-1 sc, yksin tai yhdessä joko Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet tai SMFs, SCID hiiriin. 7 viikon kuluttua injektio, kaikki hiiret osoittivat, kasvaimen muodostumisen. Kasvainten kasvua, jotka johtuvat syöpäsolujen injektoitiin yhdessä alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä kasvoi nopeammin kuin johtuvat injektion syöpäsolujen yksin tai co-injektion SMFs (kuvio 5A). Lopullinen painot kasvaimia, jotka johtuvat syöpäsolujen yhteistyössä injektoitu alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä olivat myös suuremmat kuin ne, jotka johtuvat injektion syöpäsolujen yksin tai co-injektion SMFs (kuvio 5B). Vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä, kasvaimia, jotka johtuvat yhteistyössä injektio DLD-1-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet useammin johtanut imusolmuke etäpesäke kuin teki ne on muodostettu yhteistyössä injektio DLD-1-solujen SMFs (kuvio 5C).

(A, vasemmalla) Vieraslajisiirteen kasvaimen kasvua hiirissä injektoitiin DLD-1 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja yksinään (sininen viiva, 840,7 ± 112,6 mm

3 7 viikkoa), co-injektoitu DLD-1 solut ja limakalvon alaista fibroblastit (SMFs, punainen viiva, 1178,0 ± 177,6 mm

3 7 viikkoa), ja yhteistyö ruiskutettiin DLD-1-soluissa ja subperitoneal fibroblastit (Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet, vihreä linja, 1672,8 ± 214,7 mm

3 7 viikkoa). Erot kasvaimen tilavuuden välillä DLD-1-solut yksinään ja DLD-1-solujen alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä, ja välillä DLD-1-solut yksinään ja DLD-1-solujen SMFs olivat tilastollisesti merkitseviä (

P

0,05). (A, oikea) Vieraslajisiirteen kasvaimen kasvua hiirissä injektoitiin Caco-2 paksu- ja peräsuolisyövän pelkät solut (sininen viiva, 308,6 ± 127,7 mm

3 9 viikkoa), co-injektoitu Caco-2-solut ja SMFs (punainen viiva , 1363,1 ± 284,3 mm

3 9 viikkoa), ja yhteistyö ruiskutettiin Caco-2 ja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (vihreä linja, 2595,1 ± 349,5 mm

3 9 viikkoa). Erot Kasvaimen tilavuuden välillä Caco-2-solut yksinään ja Caco-2-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (

P

0,01), ja välillä Caco-2-solujen SMFs ja Caco-2-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (

P

0,05) olivat tilastollisesti merkitseviä. Ksenograftikasvaimissa johdettu co-injektio syöpäsolujen ja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet kasvoivat nopeammin kuin johdetut injektio syöpäsolujen yksin tai co-injektio syöpäsolujen ja SMFs. (B, vasen) Vieraslajisiirteen kasvaimen paino hiirillä ruiskutetaan DLD-1-soluissa yksinään 0,71 ± 0,11 g, co-injektoitu DLD-1-soluissa ja SMFs oli 1,27 ± 0,19 g, ja yhteistyö ruiskutettiin DLD-1-soluissa ja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet oli 1,82 ± 0,28 g 8 viikossa. Erot Kasvaimen painon välillä DLD-1-soluissa yksinään ja DLD-1-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (

P

0,01), ja välillä DLD-1-soluissa yksinään ja DLD-1-solujen SMFs (

P

0,05) olivat tilastollisesti merkitseviä. (B, oikealla) Vieraslajisiirteen kasvaimen paino hiirillä ruiskutetaan Caco-2-solut yksinään 0,53 ± 0,24 g, co-injektoitu Caco-2-solut ja SMFs oli 1,91 ± 0,34 g, ja yhteistyö ruiskutettiin Caco-2-solut ja Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet oli 3,66 ± 0,45 g 10 viikkoa. Erot Kasvaimen painon välillä DLD-1-soluissa yksinään ja DLD-1-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet (

P

0,01), välillä DLD-1-soluissa yksinään ja DLD-1-solujen SMFs (

P

0,05), ja välillä DLD-1-solujen Alustavia tarkastushavaintoja koskevat kirjeet ja DLD-1-solujen SMFs (

P

0,05) olivat tilastollisesti merkitseviä. Painot ksenograftikasvaimissa peräisin co-injektion syöpäsolut alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä olivat korkeammat kuin kasvaimia, jotka ovat peräisin injektion syöpäsolujen yksin tai co-injektion syöpäsolujen ja SMFs (vasen: DLD-1, oikea: Caco-2) . (C) Vaikka arvo ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä, ksenograftikasvaimissa johdettu co-injektion DLD-1-soluja ja alustavaa tarkastushavaintoa koskevaa kirjettä osoitti kaksi kertaa taajuus imusolmukkeiden etäpesäkkeiden (n = 4), verrattuna peräisin co-injektion DLD- 1-soluja ja SMFs (n = 2).