Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

maksasolusyövän (HCC) on yleisimmin esiintyviä ensisijainen maksasyövän ja sijoittuu viidenneksi useimmin esiintyvä syöpä, yleistä, ja kolmanneksi yleisin syy syöpäkuolemista , maailmanlaajuinen. Tällä hetkellä tehokkaita terapeuttisia vaihtoehtoja HCC ovat rajalliset; Näin ollen, ennuste näille potilaille on huono. Tavoitteenamme tässä tutkimuksessa oli tunnistaa uusi kohde vasta-hoitoa vastaan ​​HCC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme Western blot ja virtaussytometria ja immunosolukemiallisten analysoi tutkimaan sääntelyn FGFR1 ilmaisu interferoni-α /β useissa ihmisen maksan syöpäsolulinjoja. Lisäksi testasimme tehoa yhdistetty hoito anti-FGFR1 monoklonaalinen vasta-aine ja interferoni-α /β on hiiren ksenograftimallia ihmisen HCC. Huomasimme, että interferoni-α /β indusoi ilmentymisen FGFR1 ihmisen HCC solulinjoissa, ja että anti-FGFR1 monoklonaalinen vasta-aine (mAb) kohdistaminen indusoituneen FGFR1 voi tehokkaasti estää kasvua ja selviytymistä HCC-solujen

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi, interferoni-α, anti-FGFR1 mAb ja perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC: t) aiheutti merkittävän antituumorivaikutus

in vitro

.

Päätelmät

tulokset viittaavat siihen, että yhdistetty käyttö anti-FGFR1 ainetta ja interferoni-α /β on lupaava lähestymistapa hoitoon HCC.

Citation: Sasaki S, Ishida T, Toyota M, Ota A, Suzuki H, Takaoka A, et al. (2011) interferoni-α /β ja Anti-fibroblastikasvutekijäreseptori 1 monoklonaalinen vasta-aine torjumista maksasyöpäsolut in vitro ja in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10,1371 /journal.pone.0019618

Editor: Young Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 09 lokakuu 2010; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2011; Julkaistu: 09 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Sasaki et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen painopistealueisiin alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology (17016060 on KI ja TI); Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) Japan Society for Promotion of Science (21590853 SS); Grant-in-tuki kartoittava tutkimus päässä Japanin Society for Promotion of Science (17659218 SS ja KI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: A. Ota, M. Maeda, T. Seito ovat työntekijöitä Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja muut tutkijat.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on kaikkein yleisesti esiintyviä ensisijainen maksasyövän ja riveissä kuin viidenneksi useimmin esiintyvä syöpä, yleistä, ja kolmanneksi yleisin syy syöpäkuolemista, maailmanlaajuisesti [1]. Tällä hetkellä leikkaus, ihon läpi hoitoja kuten etanoli injektio ja radiotaajuisen ablaatio, ja transkatetri- hoitomuotoja, kuten valtimoiden chemoembolization työskentelee hoidossa HCC. Nämä lähestymistavat voivat valikoivasti poistaa ja tappaa syöpäsoluja, mikä tekee niistä hyödyllisiä ohjaus paikallisen kasvaimen; mutta ne eivät riitä parantamaan ennustetta HCC potilaita, koska tauti helposti uusiutuu johtuen verisyntyisiä etäpesäkkeitä (esim intrahepaattinen etäpesäke ja verisuonten tunkeutumisen) tai uusien HCCs (multisentrinen syövän synnyn). Näin ollen 1 vuoden ja 3 vuoden eloonjäämisluvut HCC ovat vain 36% ja 17%, vastaavasti [2]. Heikkoudet Nykyisen HCC hoidot ovat puutteellisia esto multisentrinen Karsinogeneesin vaikeuksia valvoa intraportaalisen soluttautumista, ja kyvyttömyys estää huononeminen maksan toimintaa tai edistää sen palauttaminen. Siten uusien hoitojen, jotka parantavat ennustetta HCC potilaiden ja jota voidaan käyttää myös iäkkäille ja pitkälle potilaat olisi erittäin toivottavaa.

kohdistaminen solunpintamolekyylien käyttäen mAb syntymässä strategia syövän hoidossa, ja mAb: t vastaan ​​syöpään liittyvien pinta-molekyylit, kuten EGFR, HER2 ja CD20 on onnistuneesti käytetty [3], [4], [5]. Kuitenkin ilmentyminen solun pinnalla antigeenisiä molekyylejä on usein heikkoa ja heterogeenisiä, mikä estää tehokkaasti kohdentaminen kasvaimia [6], ja tähän mennessä vain muutamia kokeilu- tutkimukset, joissa tutkitaan ilmentymistä HCC liittyviä antigeenejä on suoritettu [7].

Interferonit (IFN: t), joita käytetään laajasti hoidettaessa neoplasioita ja virustaudit, ekspression tehostamiseksi useiden solun pinnan molekyylejä sekä

in vitro

ja ksenograftin kasvaimen mallit [8], [9 ]. Induktio geenin ilmentymisen IFN on monimutkainen ilmiö, johon liittyy aktivaatio kohdegeenien kautta fosforylaation tilastot JAK-kinaasin [10]. Lisäksi, IFN-proteiinit voivat indusoida interferoni säätelytekijöiden (IRFs) ja transkriptiotekijöitä, jotka sitten indusoivat geenit osallistuvat apoptoosiin ja immuunivastetta [11]. IFN käytetään jo hoitoon useimmat hepatiittipotilailla, ja niiden vaikutukset ehdottavat kohdistaminen solunpintamolekyylien indusoi IFN voi olla hyödyllinen strategia hoitoon HCC. Tavoitteenamme tässä tutkimuksessa oli käyttää HCC solulinjoja ja hiiren ksenograftimallia ihmisen HCC tutkimaan muutoksia geenien ilmentyminen aiheuttama IFN ja tunnistamaan potentiaalisia vasta-hoitoa. Tulosten perusteella näyttää IFN-α /β-indusoidun fibroblastikasvutekijäreseptori 1 (FGFR1) voisi olla uusi terapeuttinen kohde hoidettaessa HCC.

Tulokset

induktio FGFR1 ilmentymisen IFN α /β HCC ksenografteissa

geenien tunnistamiseksi säädelty IFN HCC-soluissa, olemme suoritetaan microarray-analyysin avulla valmistettua cDNA kasvaimia kasvatettiin SCID-hiirissä ihonalaisesti HepG2-soluissa, ihmisen maksan syöpäsolu linja. Tulokset mikrosiruanalyysi on esitetty yhteenvetona kuviossa 1A. Niistä geenit ajan säätelee IFN oli

FGFR1

, joka koodaa reseptorityrosiinikinaasia. Reaaliaikainen PCR-analyysi vahvisti induktion

FGFR1

transkription sekä IFN-α: n ja IFN-β (kuvio S1), ja korotusten FGFR1 proteiinia havaittiin HepG2, Huh-7 ja CHC4 soluja (kuvio 1 B D). Sitten käytetään immunohistokemiallisella värjäyksellä tutkia jakelua IFN-α /β-indusoidun FGFR1 sisällä kasvaimia ja totesi, että tasot FGFR1 lisättiin solu- kalvon ja sytoplasmassa HCC-solut (kuvio 1 E).

A Yhteenveto geenien aiheuttama IFN-α maksan syövän solulinjoissa ja HepG2-ksenografteissa. Geenien ilmentymistä indusoi IFN-α tutkittiin käyttäen DNA-array-analyysi, ja ilmentyminen

FGFR1

havaittiin indusoitua voimakkaasti. B, Western blot, joka osoittaa IFN-α /β-indusoitua FGFR1 ihmisen maksan syöpäsoluja. Suhteelliset proteiini tasot esitetään alla. C, virtaussytometrinen analyysi, joka osoittaa IFN-α /β-indusoitua FGFR1 ihmisen maksan syöpäsoluja: musta, ei-vasta-aine; vihreä, ei IFN; Vaaleanpunainen, IFN-α; Sininen, IFN-β. D, Western blot, joka osoittaa ajan kuluessa FGFR1 ilmaisun käsittelyn jälkeen IFN-α /β. Immunoblottauksia suoritettiin käyttäen yhteensä lysaatit HepG2-ksenografteissa. E, IFN-α /β-indusoidun FGFR1 ilmentymisen leikattiin kudoksissa HepG2-ksenografteissa. FGFR1 värjättiin käyttäen anti-FGFR1 vasta-aine.

Kehittäminen anti-FGFR1 monoklonaalinen vasta

Olemme kehittäneet uusia anti-FGFR1 mAb: t immunisoimalla BALB /c-hiirten kanssa FGFR1 ekspressiovektorilla . Kuusi tunnistavien vasta-aineiden FGFR1 eristettiin hiiristä, joista kaksi, nimetty A2C9-1 ja A2D11-1, osoitti vahvaa affiniteetti ELISA-ja karakterisoitiin edelleen. Liike-analyysit, solunulkoinen domeeni FGFR1 kovalenttisesti kytketty CM-5-sensorisirun alhaisella tiheydellä (215 vaste yksikköä FGFR1), jonka jälkeen määritettiin Kd-arvot A2C9-1 ja A2D11-1 on 209 nM ja 7,03 uM (kuvio S2A). Näin A2C9-1 voimakkaimmin affiniteettia FGFR1. Virtaussytometrinen analyysi vahvisti, että A2C9-1 reagoi FGFR1 (kuvio 2), ja Western blot-analyysi osoitti molekyylipainon ektooppisesti ilmaisi FGFR1 olevan noin 115 kDa (kuvio S2B).

virtaussytometrianalyysin esittää ilmentymistaso FGFR1 ja spesifisyys A2C9-1 mAb. Vasen: kaaviot esittävät saadut tulokset lysaatit NIH3T3-solut, joihin M19B2 cDNA käyttöön (kontrolli). Oikea: kaavioiden tuloksia lysaatit NIH3T3-soluissa, joihin täyspitkän FGFR1 cDNA otettiin käyttöön.

Anti-FGFR1 mAb: t inhiboivat HCC solujen kasvua in vitro

Seuraava tutkitaan vaikutukset A2C9-1 ja A2D11-1 mAb: t kasvuun maksan syöpäsolujen (kuvio 3). IFN-α osoitti jonkin antituumoriaktiivisuus maksasyöpäsolut, ja heikon kasvun suppressio havaittiin kun A2C9-1 tai A2D11-1 lisättiin viljelmiin ilman IFN-α. Toisaalta, hoito yhdistelmällä A2C9-1 ja IFN-a vähensi merkittävästi solujen eloonjäämistä, verrattuna hoitoon, jossa IFN-α yksinään (

P

= 0,01) (kuvio 3). Vaikutus A2D11-1 yhdistelmänä IFN-α ei ollut suurempi kuin vaikutus IFN-α yksin.

kuvaajan, eloonjäämisaste joukossa viljeltyjä HepG2 HCC-soluissa on esitetty pystyakselilla, ja inkubaatioaika antamisen jälkeen osoitti lääkkeiden on esitetty vaaka-akselilla. PBS on negatiivinen kontrolli. Symbolit ja pylväät edustavat keskiarvoja ± SD. Huomaa, että hoito yhdistelmällä A2C9-1 ja IFN-a vähensi merkittävästi solujen eloonjäämistä, verrattuna hoitoon, jossa IFN-α yksinään (

P

= 0,01).

Effects ja A2C9-1 ja ilman IFN-α in hiiren ksenografti kasvain malli

seuraavaksi testasimme antituumori- vaikutuksia anti-FGFR1 mAb hiiren ksenograftimallissa ihmisen HCC (kuvio 4A ja B). Hoidetuilla hiirillä vain A2C9-1 tai IFN-α, kasvainten ei eronnut kontrolliryhmän annettiin PBS: ää. Kuitenkin hoito IFN-α + A2C9-1 oli estävä vaikutus kasvaimen kasvuun, mutta poistaminen ei ollut tilastollisesti merkittävä. Lopuksi, käsitellyillä hiirillä IFN-α + A2C9-1 + PBMC: t (perifeerisen veren mononukleaarisia soluja), oli merkittävä antituumorivaikutus, verrattuna ryhmiin, jotka saivat PBS: llä (p = 0,026), INF-α (p = 0,03) , A2C9-1 (p = 0,014), PBMC: (p = 0,022) tai IFN-α + PBMC: t (p = 0,007). Itse asiassa, kasvain katosi 2 4 koe-eläimistä. Aikana kokeiden emme ole havainneet sytotoksisuus normaalia maksasolujen (tuloksia ei ole esitetty). Histologinen analyysi osoitti selvästi tunkeutumisen mononukleaaristen solujen jäljelle jääneiden kasvainsolujen kudoksiin hiirillä, joita hoidettiin IFN-α + A2C9-1 + PBMC: itä, mutta mitään tällaista tunkeutumisen havaittiin kasvaimen kudoksissa hiiret muissa ryhmissä (kuvio S3).

, edustaja kuvia kasvain köynnöksen SCID hiirillä. B, kuvaaja, koot kasvainten kussakin ryhmässä (n = 4 hiirtä ryhmää kohti) on esitetty pystyakselilla ja kulunut aika käsittelyn jälkeen osoitti huumeiden ja solut on esitetty vaaka-akselilla. Symbolit ja baarit ovat keskiarvoja ± SD. C, Tuumoritilavuudet käsittelyn jälkeen ilmoitetuilla huumeiden ja soluja. PBS on negatiivinen kontrolli. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD.

IFN tehostaa kertymistä anti-FGFR1 mAb kasvaimiin

varmistamiseksi edelleen, että havaitut regressio -ksenografteissa liittyvän hoidon A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680-konjugoitu A2C9-1 ruiskutettiin häntälaskimoiden kasvainta kantavien SCID-hiirissä, jonka jälkeen kohdentaminen tuumoriin A2C9-1 arvioitiin samoilla eläimillä eri ajankohtina käyttäen optista molekyylipainon kuvantamisjärjestelmä (kuvio 5A ja B). Hiirillä esikäsitelty IFN-α, A2C9-1 valikoivasti ja aikariippuvainen kertynyt sisällä kasvaimia välisenä aikana 24 h 192 h kuluttua sen annon. Sitä vastoin vain erittäin vähäisiä määriä mAb havaittiin ohjaus hiirillä, joille annettiin A2C9-1 + PBS: ää. Meillä on myös vahvistanut, että ei kertynyt Alexa Fluor 680-konjugoitu kontrollivasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty). Näyttää siis siltä, ​​että IFN-α parantaa kertyminen anti-FGFR1 mAb

in vivo

, todennäköisimmin jopa säätelystä FGFR1.

, SCID olivat ksenosiirrettyjä 1 x 10

6 HepG2-solut, jonka jälkeen 50 ug Cy5-konjugoidulla A2C9-1 mAb suonensisäisesti häntälaskimoon. Hiiriä, sitten kuvataan nukutuksessa. B, aikakäyrä Cy5-signaalin voimakkuuden.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että FGFR1 voi toimia uutena kohteena vasta-hoidon HCC. Tarkemmin sanottuna yhdistettynä hoito IFN-α /β ja anti-FGFR1 mAb (A2C9-1) osoittivat vahvaa kasvua tukahduttava vaikutus ihmisten HCC-soluissa

in vitro

ja

in vivo

. Viisi isoformit transmembraanisen reseptorin FGFR (FGFR1-4 ja FGFR5 /1 I) tiedetään ilmaistaan ​​nisäkkäissä [12]. Kukin koostuu kolmesta ekstrasellulaarisen immunoglobuliinin kaltaista domeenia, transmembraanidomeeni, ja kaksi solunsisäistä tyrosiinikinaasi domeenien. FGF sitoutuu FGFR kautta kaksi immunoglobuliinin kaltaista domeenia (II ja III). Aikana FGFR ilme, vaihtoehtoinen silmukointi

FGFR

selostukset tuottaa useita silmukoitumisvariantit eri kudos- ligandi erityispiirteet [13]. Niistä, FGFR1 on osoitettu ilmentyvän HCC ja sen tiedetään edistää HCC vasteena syöpää stimulaation [14]. FGFR1 ei ilmenny noncancerous hepatosyyteissä. FGFR1-välitteinen signalointi on osallisena syöpäsolujen kasvua ja tunkeutumista, sekä angiogeneesiin [15], joka on jo tavoite syövänvastaisen hoitoja [16]. Lisäksi aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, kohonnut ilmentyminen FGFR ligandien, mukaan lukien FGF1 ja FGF2, perusterveydenhuollossa HCC kudoksissa ja maksan syöpäsolun linjat [17], [18], [19], [20], mikä viittaa vahvasti siihen FGF signalointi on keskeinen rooli kehityksessä HCC. Nämä ominaisuudet tekevät FGFR1 houkuttelevan molekyylikohteena hoitoon HCC.

Yksi suuri ongelma vasta-hoidon syöpää vastaan ​​on heikko ja heterogeeninen ilmentyminen solun pinnan antigeenejä. Tämän ongelman ratkaisemiseksi, tutkimme geenien ajan säätelee IFN HCC ksenografteissa. Olemme havainneet, että ekspressio FGFR1 indusoi IFN-α /β ja että käsittelemällä HCC-solujen IFN-α /β ja anti-FGFR1 mAb estää tehokkaasti kasvua ja selviytymistä HCC-soluissa. Siten yksi syy riittävästi terapeuttista vaikutusta syöpälääkkeiden kohdistaminen FGFR1 näyttää olevan se, että, ilman induktio, ilmentäminen FGFR1 syöpäsolujen ei ole riittävä tehokkaan hoidon. Tämän mukaisesti ajatuksen, meidän immunohistokemiallinen analyysi osoitti ilmaisua FGFR1 olevan hyvin pieni käsittelemättömästä HCC-soluissa. Erityisesti kasvutekijän reseptorin (EGFR) on myös ajan säätelee IFN- [21], ja tämä säätely ylöspäin EGFR on ratkaiseva tekijä taustalla herkkyyttä vaikuttaa syöpäsolujen anti-EGFR-vasta-aine terapia [22]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, hoidon IFN ja vasta-aine voi olla tehokas terapeuttinen strategia vastaan ​​erityyppisiä syöpiä.

molekyylitason mekanismia, jolla IFN-α /β indusoi FGFR1 ilmaisua ei tunneta. On tunnettua, kuitenkin, että antituumori- ja antiviraaliset vaikutukset IFN kuuluu muutoksia transkription säätelyyn eri geenien [23], ja että IFN-indusoituvia geenejä sisältävät interferoni-vaste-elementin (ISRE) niiden promoottorialueiden [24]. Käyttämällä transkriptiotekijän hakuohjelma, olemme tunnistaneet useita oletetun ISREs 5 ’UTR: FGFR1, viittaa siihen, että FGFR1 voisi olla suora kohde tyypin I IFN (tuloksia ei ole esitetty). Lisätutkimuksia on tarpeen määrittää tarkasti, miten interferoni indusoi FGFR1.

Emme myöskään vielä täysin ymmärrä molekyylitason mekanismi, jonka meidän vasta-kohdistuu sen kasvaimen vastaisen vaikutuksen, vaikka on useita mahdollisuuksia. Monet kasvaimeen ilmaistuna tavoitteita terapeuttisten vasta-aineet ovat kasvutekijäreseptoreina. Esimerkiksi, anti-EGFR-vasta-aineita, mukaan lukien Setuksimabia, on osoitettu estävän kasvutekijän signalointi estämällä ligandin sitoutumisen reseptoriin, tai estää reseptorin dimeroinnin [25]. On erittäin todennäköistä, että A2C9-1 estää kasvainsolujen kasvua samanlaista menettelyä kohdistamalla IFN aiheuttama FGFR1. On myös raportoitu, että vasta-aineen sitomiseksi ja kasvutekijän reseptoriin johtaa sisäistämisen vasta-aine-reseptori monimutkainen, ja alas-säätely alavirran signalointia [26]; Olemme kuitenkin havainneet A2C9-1 aiheuttama sisäistämisen syöpäsoluissa (tuloksia ei ole esitetty). Kolmanneksi vasta-aineet kasvutekijäreseptorit myös aiheuttaa kasvua estävä vaikutus kautta immuunijärjestelmää [27]. Tässä esimerkiksi, osoitimme, että IFN-α /β parantaa pinnan ilmentyminen FGFR1, ehkä mahdollistaa syövän vastainen vaikutus, joka perustuu vasta-aineesta riippuva soluvälitteinen sytotoksisuus mukana sitoutumisen anti-FGFR1 mAb reseptoriin. Tulokset Meidän

in vivo

kokeessa, jotka osoittavat PBMC: t että antituumorivaikutukset A2C9-1 on yhdenmukainen sen ajatuksen kanssa, että tämä vasta-aine voimakkaasti stimuloi vasta-aineesta riippuva soluvälitteinen sytotoksisuus.

Yhteenvetona, olemme havainneet, että IFN-α /β indusoi ilmentymisen FGFR1 ja että käsittely IFN-α /β ja anti-FGFR1 mAb suppressoi HCC solujen kasvua

in vitro

ja

vuonna vivo

. Meillä on myös vahvistanut, että IFN-α /β parantaa kertymistä anti-FGFR1 mAb kasvaimiin. Tämä hoitokäytäntö selektiivisesti estää niiden kasvun HCC-solujen vaikuttamatta normaalien solujen, mikä viittaa siihen, että voitaisiin käyttää hoidossa HCC heikentämättä maksan alustavan suorituskykyä. Siksi ehdotamme, että tulokset voivat tarjota perustan uudenlainen lähestymistapa hoitoon HCC, joille ei ole olemassa tehokasta hoitoa tällä hetkellä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kokeellinen eläimet

Ihmisen maksan syöpäsolulinjoissa (HepG2, Huh-7 ja CHC4) saatiin Japanin Collection of Research Bioresources (Tokio, Japani) ja viljeltiin, kuten suositellaan. Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä 37 ° C: ssa ilmakehässä kostutetussa ilmassa, jossa oli 5% CO

2. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) eristettiin terveiltä vapaaehtoisilta Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Ruotsi) ja käytettiin efektorisoluina SCID-hiirissä. Kaikki rahoittajat edellyttäen kirjallinen lupa ennen kokoelma mukaisesti Helsingin julistuksen, ja kaikki protokollat ​​käyttävät ihmisen näytteet hyväksynyt Institutional Review Board of Sapporo Medical University. Koko PBMC: t (1 x 10

7) suspendoitiin 0,2 ml: aan RPMI 1640 injektoitiin intraperitoneaalisesti kuhunkin SCID hiiri. Kaikki eläinkokeet suoritettiin standardin mukaan eläinten hoidon ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean Sapporo Medical University.

mikrosiruanalyysi

mikrosiruanalyysi, HepG2-solut (1 × 10

6 solua) alun perin ksenosiirrettyjä vaikeasti sekamuotoisesti immuunivajavaisiin (SCID) hiiriä. Kolme viikkoa myöhemmin, kun tuloksena kasvain oli saavuttanut 6-7 mm: n halkaisija, IFN-α (OIF®; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima, Japani) injektoitiin ihonalaisesti annoksella 2000 U /hiiri. Näytteitä tuumori- kudosta kerättiin ennen ja 24 tuntia injektion jälkeen IFN-α. RNA uutettiin kerätyistä kudoksista käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen Superscript III (Invitrogen). CDNA saatettiin sitten reagoimaan käyttämällä Gene Navigator cDNA Array Filter-ihmisen syövässä (Toyobo, Osaka, Japani) ja altistetaan DNA erilaisia ​​analyysi käyttäen Fluor-S-Multi Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi

HepG2 (1 x 10

6 solua) soluja ihon alle ksenosiirrettyjä osaksi selkään SCID hiirillä. Kun inokuloitu kasvain saavutti 10 mm halkaisijaltaan, IFN-α (OIF®) tai IFN-β (Feron®, valmistaja Toray Industries, Inc., Tokio, Japani) annettiin laskimoon annoksena 2000 U /hiiri, ja näytteet kasvainkudoksen kerättiin 0, 1, 3, 8, 24 ja 48 tuntia antamisen jälkeen. Kokonais-RNA puhdistettiin näytteistä käyttämällä RNeasy Kit (QIAGEN, Hilden, Saksa), ja yhden juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Ruotsi) . Reaaliaikainen kvantitatiivinen analyysi tehtiin käyttämällä SYBR Green I (Roche, Basel, Sveitsi), jossa on LightCycier reaaliaikainen PCR systeemi (Roche). Tasot FGFR1 ja OAS1 (kontrolli) mRNA: n ekspression normalisoitiin ekspression GAPDH-mRNA: n. Primer sarjat FGFR1 (sense, 5′-GGA CGA TGT GCA GAG CAT CAA CTG-3 ’, anti-sense, 5′-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3′), OAS1 (sense, 5’-CAT CCG CCT AGT CAA GCA CTG-3 ’, anti-sense, 5′-CCA CCA CCC AAG TTT CCT GTA-3′) ja GAPDH (sense, 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3 ’, anti-sense , 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-TC-3 ’) syntetisoitiin Greiner Bio-One (Tokio, Japani).

Western blot-analyysi

HepG2, Huh-7 tai CHC4 soluja inkuboitiin 48 h: n läsnä ollessa IFN-α tai IFN-β (1000 IU /ml), minkä jälkeen solut hajotettiin näytepuskurissa (50 mM Tris-HC1, pH 6,8, 6% 2-merkaptoetanolia, 2% SDS: ää, 0,004% bromifenolisinistä ja 10% glyserolia). Proteiinit näytteissä lysaattia erotettiin 7,5% polyakryyliamidigeelillä elektroforeesilla ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad Laboratories). Blokkauksen jälkeen kalvo 2% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, sitä inkuboitiin anti-humaani-FGFR1 vasta-ainetta (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 1 tunnin huoneen lämpötilassa. Sitten blotti kehitettiin 0,005% H

20

2-3, 3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia käyttäen immunoperoksidaasivärjäystä ABC-kitti (Vectastain ABC-kitti, Vector Labs, Burlingame, CA, USA).

virtaussytometria-analyysi

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia antamisen jälkeen IFN-α, ilmentäminen FGFR1 arvioitiin käyttäen virtaussytometriaa. Solujen suspensiota (4 x 10

5 solua /putki) pestiin 2 ml: lla pesupuskuria (0,2% naudan seerumin albumiinia, 0,1% NaN

3/10 mmol /L fosfaattipuskuroitu suolaliuos, pH 7,4) ja sentrifugoitiin 300

g

5 min 4 ° C: ssa, minkä jälkeen supernatantti poistettiin. Jäljellä oleva Solupelletti vahvistettu 0,25% paraformaldehydillä vähintään 15 min pimeässä huoneenlämpötilassa, pestiin kahdesti 2 ml: lla pesu- puskuria, inkuboitiin 1 h 70% metanolia 4 ° C: ssa, ja sitten pestiin jälleen. Ekspression tutkimiseksi FGFR1, kiinteän soluja inkuboitiin ensin anti-FGFR1-vasta-ainetta (1:100 laimennos) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kahdesti ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ml: ssa fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG jäissä pimeässä. Sen jälkeen, kun taas pesemällä solut kaksi kertaa, ne suspendoitiin 1 ml: aan pesupuskuria analysointia varten käyttäen FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).

Analyysi FGFR1 ilmentymistä ihmisen maksan syövän ksenograftien

HepG2 solut (1 x 10

6 solua) ksenosiirrettyjä SCID hiiriin. Kun tuloksena kasvaimen oli 10 mm halkaisijaltaan, IFN-α (OIF®) tai IFN-β (Feron®) annettiin intraperitoneaalisesti tai suonensisäisesti annoksella 100 U /g, ja 24 tuntia myöhemmin kasvaimen kudokset kerättiin. Western blot- ja immunohistokemiallinen analyysit suoritettiin sitten käyttäen anti-ihmis-FGFR1 vasta-ainetta (sc-121; Santa Cruz Biotechnology).

valmistaminen Anti-FGFR1 Antibody

polynukleotidi, joka koodaa aluetta, joka ulottuu aminohappo 1-822 ja FGFR1 ja SEQ ID NO. 1 monistettiin PCR: llä käyttäen täyspitkän FGFR1 (Accession No. NM_000604) templaattina käyttäen alukkeita nro 5′-3 [(SEQ ID NO. 3): 5′-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 ’] ja nro 3′ 3 [(SEQ ID NO. 4): 5’-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 ’]. Monistettu polynukleotidi insertoitiin pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ilmentämisvektorin konstruoimiseksi, joka annettiin immunisoiva antigeeni annoksella 50 ug /hiiri 50 ui tilavuus 1- tai 2- viikon välein. Antigeenin alkuimmunisoinnin sekoitettiin täydelliseen Freundin adjuvanttiin, kun taas antigeenejä toinen ja myöhempi antaminen sekoitettiin Freundin epätäydellisen adjuvantin kanssa. Perna monosyyttisoluilla immunisoidusta hiiri ja fuusiokumppanin, X63-Ag8-653, fuusioitiin käyttäen polyetyleeniglykoli-välitteisen solun fuusio, jota seurasi valinta hybridooma menetelmällä Kinebuchi et al. [28]. Solut, jotka oli reagoinut immobilisoidun FGFR1 viljeltiin seerumittomassa GIT väliaineessa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japani) tuottaa mAb: iden, kunnes 80% soluista oli kuollut. Sitten solut poistettiin tästä alustasta sentrifugoimalla (1000 rpm, 15 min), ja ammoniumsulfaattia lisättiin 50% kylläisyys, ja jätettiin yön yli 4 ° C: ssa. Saatu sakka otettiin talteen sentrifugoimalla (1000 rpm, 30 min) ja liuotettiin kaksi kertaisesti laimennettua sitomispuskuriin (Protein AMAPS II kit), minkä jälkeen IgG-adsorboitiin proteiini-A-kolonniin (GE Healthcare Life Science). Sen jälkeen eluoidaan mAb: t pylväästä, eluaatti dialysoitiin PBS: ää vastaan ​​yön yli puhdistaa vasta-aineita, jotka saatiin useiden mAb tunnustetaan FGFR1. Yksi näistä mAbien nimettiin A2C9-1 ja vahvistettiin tunnistaa FGFR1 Western-blottauksella ja FACS käyttäen näytteitä FGFR1 ilmaistu NIH3T3-soluissa.

Affinity mittaus

affiniteetti anti-FGFR1 mAb: t for FGFR1 määritettiin perustuen pintaplasmoniresonanssilla (SPR) käyttäen Biacore 3000 laitteella (Biacore AB, Uppsala, Ruotsi). N solunulkoinen domeeni FGFR1 kovalenttisesti kytketty CM-5-sensorisirun alhaisella tiheydellä (215 vaste yksikköä FGFR1). Sitova kinetiikka oli sitten arvioitu käyttämällä kaksi sarjalaimennoksia vasta-aineen konsentraatioissa 500-0,08 nM ajopuskurissa (PBS, pH 7,4, 0,005% (v /v), polysorbaatti 20 – suodatetaan ja josta kaasut oli poistettu) 25 ° C: ssa ja virtaus- nopeudella 25 ml /min. Regenerointimenettely koostui kolmesta injektiota 10 ml 2,5 M guanidiinihydrokloridia, jonka jälkeen anturi siru huuhdeltiin 5 minuutin ajan ajopuskurissa. Tilastot ja tietojenkäsittely tehtiin käyttämällä BIA ohjelmistokokeilusta 4.0.1 ja GraphPad Prism 4,02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Kaikki SPR kokeet suoritettiin Biaffin GmbH Co. KG (Kassel, Saksa).

vaikutusta arvioitaessa anti-FGFR1 mAb maksan syöpäsolun elinkelpoisuuden

vaikutuksen tutkimiseksi annon IFN-α (OIF®) yhdistettynä anti-FGFR1 mAb (A2C9-1 tai A2D11-1) ja HCC-soluissa, arvioimme eloonjäämisaste HepG2-solujen läsnä ollessa ja puuttuessa IFN-α ja /tai anti-FGFR1 mAb. HepG2-solut ympättiin kaivoihin 24-kuoppalevylle tiheyteen 1 x 10

4 solua /kuoppa, minkä jälkeen anti-FGFR1 mAb, IFN-α tai anti-FGFR1 mAb + IFN-α lisättiin, ja viljelyä jatkettiin 0-6 päivää. Sitten solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä, ja eloonjäämisaste arvioitiin käyttäen MTT-määrityksissä. Vasta-aine-viljelyalusta lisättiin negatiivisena kontrollina, ja solut, joihin mikään lisättiin käytettiin ylimääräinen kontrolli.

Terapeuttinen koe ihmisen maksan syöpäsoluja-ksenosiirrettyjä mouse

HepG2 solut ( 5 x 10

6 solua /hiiri) olivat ksenosiirrettyjä subkutaanisesti selkään CB17-SCID /SCID-hiirten. Kun määrät kasvainten oli 100 mm

3, hiiret jaettiin 7 hoitoryhmään: 1) hiiret PBS-ryhmässä sai laskimonsisäisen injektion PBS: ää (250 ui) ja normaali hiiri-IgG (100 ug). 2) IFN-α ryhmä sai intraperitoneaalisesti injektoimalla IFN-α (OIF®: 2000 U) ja normaali hiiri-IgG (100 ug). 3) Vasta-ryhmä sai intravenöösien PBS ja anti-FGFR1 mAb (100 ug, A2C9-1). 4) IFN-α + vasta-aine ryhmä sai intraperitoneaalisesti injektoimalla IFN-α (2000 U) ja laskimoon injektiot anti-FGFR1 mAb (100 ug). 5) IFN-α + vasta-aine + PBMC-ryhmä sai intraperitoneaalisesti injektoimalla IFN-α (2000 U), suonensisäisiä injektioita anti-FGFR1 mAb (100 ug) ja laskimoon PBMC (1 x 10

7-soluissa). 6) IFN-α + PBMC-ryhmä sai intraperitoneaalisesti injektoimalla IFN-α (2000 U) ja laskimoon PBMC (1 x 10

7-soluissa). 7) PBMC ryhmä sai suonensisäisesti PBMCdden (1 x 10

7 solua). Hoidot annettiin 5 kertaa yhteensä, alkaen päivänä 0 ja sen jälkeen 1 viikko myöhemmin (w1), 2 viikkoa myöhemmin (w2), 5 viikkoa myöhemmin (W5) ja 6 viikkoa myöhemmin (W6). Vain w6, vasta-annosta nostettiin 200 ug /hiiri. Kukin ryhmä sisälsi 4 eläimet, ja koko kasvain mitattiin (pääakseli) x (pienempi akseli) x 2 viikoittain kuluttua lääkityksen aloittamisesta. Kasvaimet kerättiin 1 viikko sen jälkeen, kun lopullista käsittelyä.

Immunophotodetection tuumoria kantavissa hiirissä

HepG2 ihmisen HCC-solut (1 x 10

6 solua) ksenosiirrettyjä osaksi selkään SCID-hiirten . Kolme viikkoa myöhemmin, kun ympättiin kasvain saavutti noin 10 mm halkaisijaltaan, IFN-α (OIF; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) annoksella 20000 U /hiiri tai PBS: ää (kontrolli) intraperitoneaalisesti. 24 tunnin kuluttua, 50 ug Alexa Fluor 680-konjugoidulla anti-FGFR1 mAb suonensisäisesti häntälaskimoon. Sitten hiiret kuvattiin anestesiassa käyttäen IVIS LUMINA kuvantamisjärjestelmä (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA).

tukeminen Information

Kuva S1.

induktio

FGFR1

transkriptien IFN-α ja IFN-β. HepG2-solut (1 x 10

6 solua) ihon alle ksenosiirrettyjä osaksi selkään SCID hiirillä. Kun inokuloitu kasvain oli saavuttanut 10 mm halkaisijaltaan, IFN-α tai IFN-β intraperitoneaalisesti tai suonensisäisesti annoksella 2000 U /hiiri. Kasvaimen kudokset kerättiin sitten 0, 1, 3, 8, 24 ja 48 tuntia antamisen jälkeen. A Time-aikana FGFR1 ja OAS1 (valvonta) mRNA: n ilmentymisen antamisen jälkeen IFN-α. FGFR1 mRNA (sininen viiva) lisättiin 3 h (151%), 8 h (202%) ja 24 h (119%) annon jälkeen. OAS1 mRNA (punainen viiva) lisättiin 3 h (162%), 8 h (133%) ja 24 h (150%) annon jälkeen. On esitetty kahdella rinnakkaisnäytettä reaaliaikaisen RT-PCR: llä. B, aika-kulku FGFR1 ja OAS1 mRNA: n ilmentymisen antamisen jälkeen IFN-β. FGFR1 mRNA (sininen viiva) lisättiin 8 h (348%) ja 24 h (337%) annon jälkeen, kun taas OAS1 mRNA (punainen viiva) lisättiin 3 h (262%) ja 8 h (511%) annon jälkeen. Tasot mRNA: n ekspression normalisoitiin, että GAPDH-mRNA: n.