Krooninen sairaus

tiivistelmä

Erotusmoduulit proteiini-2 (UCP2) tiedetään tukahduttaa mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto ja työskentelee lääkeresistenttiä syöpäsolujen lieventämiseksi oksidatiivista stressiä. Käyttämällä lääkkeen herkkä HL-60-solujen ja lääkeaineille MX2 alalinja mallijärjestelminä, osoitamme, että genipin, joka on UCP2 estäjä, herkistää lääkeresistentti solujen sytotoksisten aineiden. Lisääntynyt MX2 solukuolemaa havaittiin samanakaiseen hoidon genipin ja eri annoksilla menadionia, doksorubisiinin ja epirubisiinin. DCFH-DA fluorimetriaa paljasti, että kasvu MX2 solukuolemaan liittyi tehostetut solun ROS tasoilla. Lääkkeen aiheuttama kasvu ROS oli yhteydessä genipin inhibitiota mitokondrioiden protonin vuotaa. Valtion 4 ja lepää solujen hengitystaajuuksilla olivat korkeammat MX2 soluissa verrattuna HL-60-solujen, ja lisääntynyt hengitys oli helposti tukahdutti genipin on MX2 soluissa. UCP2 osuus merkittävä 37%: n lepää solujen hapenkulutus osoittaa, että MX2 solut ovat toiminnallisesti riippuvaisia ​​tämän proteiinin. Suurempia määriä UCP2-proteiinin havaittiin MX2

verrattuna of the HL-60-mitokondrioita. Havaitut vaikutukset genipin puuttuivat HL-60-solujen osoittaen selektiivisyyttä tämän luonnontuote lääkeresistenttiä soluissa. Spesifisyys genipin varten UCP2 vahvistettiin käyttäen CHO-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti UCP2 jossa genipin indusoi ~22% lasku tilassa 4 hengitystä. Nämä vaikutukset olivat poissa tyhjän vektorin ilmentävien CHO-solujen ei UCP2. Täten kemiallinen estyminen UCP2 kanssa genipin herkistää monilääkeresistenteistä syöpäsolujen sytotoksisille aineille.

Citation: Mailloux RJ, Adjeitey CN-K, Harper ME (2010) Genipin inhiboivan vaikutuksen Erotusmoduulit Protein-2 herkistää lääkeresistenttiä syöpäsolut sytotoksisille aineille. PLoS ONE 5 (10): e13289. doi: 10,1371 /journal.pone.0013289

Editor: Maria Moran, sairaala 12 Octubre Madrid, Espanja

vastaanotettu: toukokuu 27, 2010; Hyväksytty: 14 syyskuu 2010; Julkaistu: 13 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Mailloux et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia Kanadan Institutes of Health Research: Institute of Nutrition, Metabolism and Diabetes Mary-Ellen Harper, ja tohtori Ryan Mailloux on vastaanottajaa Postdoctoral Fellowship alkaen Sydän ja Stroke säätiö Kanadan Program Grant, myöntämiä Molecular Function ja Imaging ryhmä Ottawan yliopistosta Heart Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

luonnostaan ​​tai hankittu lääkeresistenssin kemoterapia-aineiden merkitsee suurta estettä päin onnistunut hävittämiseksi syöpien [1]. Kyky syöpäsolujen kiertää lääkkeen myrkyllisyys johtuu induktio kehittää vieroitus mekanismeja. Itse asiassa jatkuvan altistumisen syöpäsolujen kemoterapeuttisia aineita voidaan saada pro-selviytymisen vastauksia, tunnettu siitä, että parannettu kyky tehdä kemoterapeuttisia vaarattomia [2], [3]. Vaikka syöpäsolut vedota lukuisia strategioita mitätöidä myrkkyjä, tiukka valvonta ROS tasoilla on merkittävä sopeutumisreaktio [4]. Varmistetaan, että ROS tasot jäävät myrkyttömiä alue on jatkuva haaste syöpäsoluja Todellakin, syöpäsolut jatkuvasti alttiina korkeille ROS tuottaman heikentynyt aerobista aineenvaihduntaa, kemoterapeuttiset, ravinteiden puutteesta, ja isäntä immuunivasteet [5], [ ,,,0],6], [7]. Jos ei puututa nämä singlet elektroni harjoittajat voivat vahingoittaa keskeisiä solujen makromolekyyleistä johtaa solun kuolemaan [8], [9]. Siksi sarja anti-oksidatiivisen puolustus strategioita vedonnut syöpäsolut pitää ROS tasoilla siedettävissä rajoissa.

induktio UCP2 on yksi monista mukautumismekanismeja vedonneet lääkeresistenttiä solujen ylläpitämiseksi ROS homeostaasin [10], [11]. UCP2 kuuluu mitokondrioiden anionin harjoittaja superperheen ja pitää korkea homologia alkuperäisen mitokondrion irtoamisen proteiini, joka on erittäin selektiivisesti ilmaistaan ​​ruskean rasvan, UCP1 [12]. Eri tutkimukset ovat osoittaneet, että UCP2 voi estää oksidatiivista stressiä lisäämällä virtausta protonien matriisiin siten tehdä elektronin virrata hengitysteiden kompleksit tehokkaampi [13], [14], [15]. Tämä toiminto UCP2 voi olla erityisen tärkeää syöpäsolujen koska niiden mitokondriot ovat metabolisesti epänormaaleja [16].

ROS ovat luontainen sivutuote aerobinen hengityksen jälkeen mitokondrioiden hengitys- kompleksit I ja III voivat nauttia ja singlet elektroni vähentäminen kaksiatomiseksi hapen [17]. Noin 0,2-2% O

2 metaboloituu mitokondrioita muunnetaan ROS [18]. Kuitenkin ROS sukupolvi voidaan huomattavasti parantaa ehtoja, jotka yli-tarjonta vähentää vastineet hengitysteiden komplekseja lisäten mitokondrion kalvon potentiaali (

Δψ

m). Itse asiassa se on raportoitu useita tutkimuksia, joissa ROS muodostumista Hengitysketjun on voimakkaasti riippuvainen

Δψ

m [19], [20]. Siten pienikin Depolarisaatio että

Δψ

m voi parantaa elektroni virtausta kompleksit ja vähentää mitokondrioiden ROS tuotanto. UCP2 voivat täyttää irtoamisen rooli syöpäsolujen; muut raportit kuvaavat ilmaus muiden irtoamisen proteiineja, kuten UCP3 ja UCP5 vuonna adenokarsinooma ja paksusuolen syöpäsoluissa [21], [22]. Itse asiassa eri

in vivo

ja

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että UCP2 on

bona fide

uncoupler oksidatiivisen fosforylaation ja rajoittaa oksidatiivisen vahinkoa kudoksiin, kun taas tappio UCP2 toiminto lisää mitokondrioiden ROS tuotanto [13], [23], [24], [25], [26]. Lisäksi irrotus aktiivisuus UCP2 on ajateltu antaa negatiivista palautetta silmukka akuuttien valvontaa ROS muodostumisen mitokondrioiden [27]. Siten UCP2 voi olla olennainen merkitys sopeutumisreaktio syöpäsolujen kemoterapeuttisia.

Inhiboivaa lääkeresistenssideterminantit mekanismit edustaa yhtä menetelmää herkistävät syöpäsolujen kemoterapeuttiset [21], [22]. UCP2 yli-ilmentyminen on kuvattu erityyppisten syöpien mukaan lukien leukemia-solut, ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, kilpirauhasen kasvaimet, ja hepatoomat [28], [29], [30], [31]. Aivan viime aikoina, UCP2 knock-down on myös osoitettu lisäävän myrkyllisiä vaikutuksia kemoterapeuttisen sisplatiinin [32]. Enemmän kiehtovan, UCP2 yli-ilmentyminen on ehdotettu osaksi mukautuva mekanismi tarvitaan eloonjäämisen syöpäsolujen haitallisia ympäristöissä [11]. Esimerkiksi yli-ilmentyminen UCP2 in HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa vähentää pro-apoptoottisen vaikutusten kemoterapeuttisten aineiden, etoposidi ja doksorubisiini [33]. Tämä havaittiin myös lääkeresistenttiä L1210 /DDP leukemia soluja, jotka käyttävät UCP2 sammuttamiseksi kemoterapian aiheuttaman ROS kautta protonin vuodon mekanismi [10]. Siten UCP2 voi edustaa ainutlaatuista tavoite herkistymistä lääkkeille vastustuskykyisten solujen kemoterapeuttisia. Tavoitteena Nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli testata hypoteesia, että genipin, ote

Gardenia jasminoides

, jonka on osoitettu estävän UCP2 ja parantaa insuliinin eritystä, voi estää UCP2 on lääkeaineille MX2 syöpäsolujen lisätä oksidatiivista stressi ja herkkyys sytostaattien. Genipin on osoitettu olevan erittäin selektiivinen UCP2. Todellakin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että genipin nimenomaan vaikeuttaa UCP2 välittämää protoni vuotaa haiman β-soluihin, munuaisten mitokondrioita ja aivokudoksessa [34], [35]. Huomionarvoista on myös se, että genipin on perinteinen kiinalainen lääke hoidettaessa tyypin 2 diabetes [35].

Tulokset ja keskustelu

Genipin herkistää lääkeresistenttiä leukemiasolujen ROS myrkyllisyys

syntyminen lääkkeille vastustuskykyiset syöpä fenotyypit on mukana hankinta tehokkaan valvonnan ROS homeostaasiin. UCP2 on tärkeä säätelijä ROS tuotannon lääkeresistenttiä syöpäsoluja [10], [11]. Tämä mitokondrion sisäkalvon proteiini ilmentyy korkeilla tasoilla lääkkeille vastustuskykyisiä soluja ja sen on osoitettu olevan keskeisessä asemassa kuriin oksidatiivista stressiä [10], [36]. Niinpä pyrittiin määrittämään, jos kemialliset esto UCP2 voisivat tehdä lääkeresistenttiä soluja herkempiä sytotoksisille aineille. Lääkeaineille MX2 soluilla lisääntynyt resistenssi superoksidi tuottavat menakinoni, menadionin (kuvio 1A). Menadionin tuottaa ROS Nopeasti pyöräily välillä kinoni ja semikinonin tila ja sitä käytetään usein jäljitellä oksidatiivisen stressin [37]. Todellakin, HL-60 elinkelpoisuus väheni merkittävästi käsittelemällä 10pM menadioni. Lisäksi altistuminen HL-60-solujen 100 uM menadionia johti 90%: n lasku solujen elinkelpoisuuden. Kuitenkin MX2 solut säilytetään solujen elinkelpoisuutta pitoisuudet menadionin jopa 100 uM (kuvio 1A). Immunoblot-analyysit paljastivat, että mitokondrioita MX2 solut sisälsivät suurempia määriä UCP2 proteiinia (kuvio 1 B). Päinvastoin kuin muissa tutkimuksissa, huomasimme, että anti-N19-vasta antanut hyvin selkeän kemiluminesenssisignaali [38]. Elektroforeettisen liikkuvuuden UCP2 varmistettiin käyttämällä perna lysaattia. Anti-C20-vasta-aine ei ole signaalia jopa perna lysaatin (tuloksia ei ole esitetty). Immuunianalyyseilla havaittiin vain lievää muiden anti-oksidatiivisen puolustus entsyymien MX2 soluissa (kuvio 1 B). Näin ollen vaikka lääkeresistenttiä MX2 solujen lisätä useita anti-oksidatiivisen puolustus entsyymien lisäämiseksi ROS käsittelyyn, UCP2 näyttää suurimman ilmentymisen lisääntyminen verrattuna lääkkeen herkkä HL-60 vastine. Spesifisyys genipin varten UCP2 vahvistettiin käyttäen CHO-soluja transfektoitiin stabiilisti joko UCP2 tai tyhjän vektorin ohjaus. Immunoblottaus vahvisti, että UCP2 ilmentyy vain CHO-UCP2-soluja (kuvio 1C). Yksikaistasignaalin kussakin kaistalle Immunoblottien myös linjattu ~32 KDa osoittaa spesifisyyttä vasta-aineen UCP2 proteiinia.

In situ

bioenergetic määritystä CHO-soluissa stabiilisti transfektoitu UCP2 tai tyhjää vektoria käytettiin testaamaan spesifisyyden genipin. Mittaus pohjapinta OCR ennen genipin hoitoa paljasti, että CHO-UCP2 soluilla on huomattavasti suurempi hapenkulutus, joka oli ~18% enemmän koholla kuin CHO-EV-solut (852,523 ± 45,838 OCR /mg proteiinia CHO-UCP3 vs 721,352 ± 15,050 OCR /mg proteiinia CHO-EV, p 0,05, n = 3). Kuitenkin genipin hoito (20 ja 50 uM) johtaa 12 ja 22%: n lasku OCR CHO-UCP2 soluissa verrattuna CHO-EV-soluissa (kuvio 1 C). Näin ollen nämä tiedot osoittavat selvästi erityisiä estovaikutuksen genipin on UCP2. On syytä huomata, että genipin hoito ei ollut vaikutusta OCR CHO-EV-solujen havainnollistaa spesifisyys genipin varten UCP2.

) elinkelpoisuus HL-60 (täynnä timantti) ja MX2 (täytetään neliö) altistuksen jälkeen menadioni. Soluja altistettiin 24 tunnin ajan eri pitoisuuksilla menadionin (0-100 umol /l), minkä jälkeen arviointi elävien solujen lukumäärä. Elinkelpoisuus ilmaistuna prosenttia säätöarvon. Kruskall-Wallis kanssa post-hoc Mann-Whitneyn testi, n = 3, p 0,05. * Tarkoittaa tilastollisesti merkitsevä HL-60-solujen verrattuna valvoa ja # merkitsee tilastollista merkitystä MX2 verrattuna kontrolliin. B) immunoblottianalyysi antioksidanttia puolustus entsyymejä ja UCP2. Mitokondrioita MX2 (M) ja HL-60 (H), solut eristettiin ja analysoitiin UCP2, MnSOD, ja GPx4. Sytosoliin käytettiin G6PDH määrityksiin. NADP-ICDH toimi lastaus ohjaus sytosoliin ja mitokondrioiden jakeet. Perna lysaattia (100 ug) käytettiin UCP2 lastaus ohjaus. Molekyylipaino UCP2 varmistettiin käyttämällä molekyylimassamarkkerit. C)

In situ

analyysin spesifisyys genipin varten UCP2. Vahvistamista seuraavan pohjapinta hapenkulutus hinnat, vaikutus genipin OCR CHO-UCP2 (valkoiset pylväät) soluihin arvioitiin. Solut altistettiin (0-50 uM) genipin 15 minuuttia ja sitten OCR testattiin. Data ilmaistiin% CHO-EV OCR.

UPO TUS

: immunoblot-analyysi UCP2 CHO-UCP2 ja CHO-EV-soluissa. SDH toimi latauskontrollina. Kruskall-Wallis kanssa post-hoc Mann-Whitneyn testi, n = 3, p 0,05. * Merkitsee tilastollista merkitystä verrattuna kontrolliin. D) Arvio genipin myrkyllisyyden ja vasteen lääkkeen herkkien HL-60 ja lääkkeille vastustuskykyisiä MX2 solujen samanaikainen hoito menadionia ja genipin. Solut altistettiin genipin (0-500 umol /l) läsnä ollessa tai poissa ollessa 20 uM menadionin 24 tuntia. Altistusjakson, solujen elinkelpoisuus määritettiin. ♦ ja ▪ edustavat altistumista joko genipin tai genipin + menadioni. Elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina kontrolliin. Kruskall-Wallis kanssa post-hoc Mann-Whitneyn testi, n = 3, p 0,05. * Vastaa tilastollista merkittävyyttä, kun solut altistetaan sekä menadionia ja genipin verrattiin kontrolliin. # Vastaa tilastollista merkitystä, kun genipin altistuneet solut kontrolliin verrattuna soluihin. E) Käsittely genipin ja menadionia lisää MX2 solukuolemaa. MX2 solut altistettiin 20 umol /l menadionia ja genipin (0-500 umol /l) 24 tuntia. Määrä solukuolemaa määritettiin käyttäen PI-määrityksellä. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, p 0,05. * Edustaa merkitys verrattuna 0 uM.

On selvää, yllä tietojen MX2 solut ilmentävät suuria määriä UCP2 ja genipin nimenomaan estää UCP2. Seuraavaksi arvioimme jos genipin voisi herkistää MX2 solujen menadioni myrkyllisyys. Sekä sen käyttöä hoidettaessa tyypin 2 diabetes, genipin on käytetty hoitamaan gliooma, hepatoomat, ja on anti-inflammatorisia ominaisuuksia [35], [39], [40], [41]. Kuitenkin niukasti tietoja on genipin myrkyllisyyttä. Tuloksemme osoittavat, että genipin suurempina pitoisuuksina 50 uM johti solun elinkyvyn menetykseen sekä HL-60 ja MX2 viljelmät (kuvio 1 D). Tämä johtuu todennäköisimmin sen proteiiniin silloittavaa kykyjä. Genipin silloitus johtaa tuotannon sinistä pigmenttiä. Kuitenkin, ei sinistä pigmenttiä ei havaittu pitoisuuksina genipin 100 uM (tuloksia ei ole esitetty). Pitoisuudet alle 50 uM ei ollut merkittävää vaikutusta kannattavuuteen joko MX2 tai HL-60-solujen. Vielä tärkeämpää on, altistuminen MX2 solujen yhdistelmä 20 uM menadionin ja genipin (pitoisuus niin alhainen kuin 10 uM) johti jyrkkään laskuun solujen elinkelpoisuuden (kuvio 1 D). Lisääntyi vuonna MX2 elinkelpoisuutta altistuessaan 100 uM genipin yhdistettynä menadionia mutta siellä oli vielä merkittävä lasku elinkelpoisuutta verrattuna kontrolliin. Herkistävän vaikutuksen genipin jotta menadionin vahvistettiin käyttäen PI määritystä. Altistuminen MX2 soluja 24 h 20 uM menadioni, kun läsnä on 10 tai 20 uM genipin johti 2-kertaiseen ja 8-kertainen nousu solujen kuoleman, vastaavasti (kuvio 1 E). Sen sijaan pitoisuudet menadionin ≥50 uM vaadittiin aiheuttamaan MX2 kuolema kun genipin oli poissa (kuva S1). Lisäksi kasvu solukuolema oli moninkertainen kun genipin oli mukana. Propidiumjodidia ottoa voi esiintyä sekä nekroottisen ja apoptoottisia soluja. Siten mittasimme useita apoptoosin markkereita. Ei aktiivista kaspaasi-3 havaittiin ja sytokromi C: ssa oli poissa sytosoliin sopusoinnussa induktion nekroosi (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka nämä kaksi apoptoosia biomarkkerit ei havaittu, joka on syvällisempää analyysiä mekanismi solukuoleman tarvitaan. Myös vaikutuksia arvioi eri määriä genipin on ei-syöpä C2C12 myoblas- solulinjassa. C2C12 Myoblastien näkyvät kasvu solukuolemaan, kun niitä käsitellään ≥50 uM genipin (kuva S1). Nämä havainnot viittaavat siihen, että genipin ei indusoi merkittävän vähennyksen solujen elinkelpoisuuden pitoisuuksina alle 50 uM ja vaikutukset genipin on MX2 solut johtuvat sen vuorovaikutusta UCP2. Huolimatta Näiden havaintojen lisää

in vivo

analysoi myrkyllisyydestä genipin ja sen soveltuvuus syövän kliinisessä ympäristössä tarvitaan. Näin ollen, genipin herkistää lääkeresistentti solut, jotka ilmentävät UCP2 ROS tuottavat aineet.

Genipin herkistää MX2 solujen Antrasykliinit myrkyllisyys

Menadioni on osoitettu olevan syövän vastaisen vaikutuksen ja on käytetty mitomysiini C II vaiheen tutkimuksissa hoitoon kehittynyt keuhkosyöpä [42]. Kuitenkin, menadionin ei tällä hetkellä työskentelee syövän kemoterapeuttista. Niinpä määritimme jos genipin voisi herkistää MX2 solujen yleisesti käytetty kemoterapeuttisia, erityisesti kinoni-pohjainen anthracyclins, doksorubisiini ja epirubisiini. MX2-solut ovat hyvin tiedetään olevan resistenttejä tälle kemoterapeuttisten ai- neiden luokka [43]. Kuten kuviossa 2A on esitetty, MX2 solut olivat resistenttejä lisätä epirubisiinin pitoisuuksia (0,5 pM), päinvastoin kuin lääkkeen herkkä vastine. Kuitenkin, terävä välein solukuolemaan havaittiin genipin käsiteltyjen MX2 solut altistetaan kasvavia määriä epirubisiinia (kuvio 2A). Kummallista, genipin ja epirubisiini (0,05-0,1 uM) co-hoito lisäsi solukuolemaa HL-60-soluissa, mutta tämä vaste oli mitätöity suuremmilla annoksilla epirubisiini (0,5 uM, MX2 soluilla 4-kertainen lisäys taas HL-60-solujen näytetään 2-kertainen lisäys). MX2-solut olivat myös resistenttejä doksorubisiinille hoitoon (kuvio 2B). Kiehtovan, HL-60-solujen näytetään vain suuntaus lisääntynyt solukuolema, mutta tilastollista merkitsevyyttä ei saavutettu (0,05-0,5 uM doksorubisiini, vain 20-40%: n nousu; p 0,05). Tärkeimmät havainto Kuviossa 2B on kasvanut merkittävästi MX2 solukuoleman käsittelemällä genipin ja doksorubisiinin (0,05-,5 uM; ~50-110%; p 0,05). Herkistävä vaikutus genipin ei havaittu HL-60-solut, joita käsiteltiin doksorubisiini, joka on sopusoinnussa estovaikutuksen genipin on UCP2. Käyttö epirubisiinin ja doksorubisiinin pitoisuus on yli 1 uM yhdessä genipin johti jyrkkä nousua solukuolemaa HL-60 ja MX2-soluja (tietoja ei esitetty). Näin ollen, genipin riisuu kemoterapeuttisen resistenssin lääkkeille vastustuskykyiset solut yli-ilmentävät UCP2.

HL-60 ja MX2-soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin ja sitten altistettiin joko epirubisiinia (0-0,5 uM) tai doksorubisiinin (0-0,5 uM) poissa tai läsnä ollessa 20 uM genipin. Määrä solukuoleman määritettiin PI määrityksessä. Tulokset ilmaistiin prosentteina kontrolliin. A) ♦ epirubisiini vain, ▪ epirubisiini + genipin. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, * p 0,05. * Vastaa tilastollista merkittävyyttä, kun epirubisiinia ja genipin käsiteltiin soluja verrattuna kontrolliin. # Vastaa tilastollista merkitystä, kun epirubisiini käsiteltyjä soluja verrattiin kontrollisoluihin. B) ♦ doksorubisiini vain, ▪ doksorubisiini + genipin. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, p 0,05. * Vastaa tilastollista merkittävyyttä, kun epirubisiini ja genipin käsiteltiin soluja kontrollisoluihin verrattuna.

Genipin hoidon häiritsee aerobisen hengityksen lääkeresistenttejä soluja

Vaikka glykolyyttisen fenotyypin syöpäsolujen entsymaattinen koneet tarvitaan aerobisen hengityksen usein säilyy [44]. Huolto toiminnallisten mitokondrioiden on ratkaisevaa syöpäsolun,

esim.

, Krebsin sykli entsyymit tarjoavat anabolisia esiasteiden nopeasti jakautuvia soluja [6]. Ryhmämme on osoittanut aiemmin, että mitokondrioiden lääkeresistenttiä leukemia solut eivät ole kytkeytyneet ja että tämä liittyy pienentynyt solun ROS tasoilla [10]. Niinpä arveltu, että herkistävän vaikutuksen genipin johtui sen kyky estää UCP2 välittämää irrottaminen on

Δψ

m. Kuten on esitetty kuviossa 3A, pohjapinta hapen kulutus oli suurempi MX2 verrattuna HL-60-solujen (~54% suurempi, p 0,05). Tämä osoittaa, että mitokondriot MX2 solut ovat metabolisesti aktiivisia kuin HL-60-mitokondrioita. Treatment of HL-60 ja MX2 solujen oligomysiini laski hengityksessä -60% ja ~38%: lla (kuvio 3A). Tämä osoittaa, että ~62%: n lepää solun O

2 kulutus MX2 soluissa johtuu irrotetaan hengitystä (

esim.

Kuin ATP tuottavat toiminnot). Sharp poikkeamat mitokondrioiden aineenvaihdunta liittyy usein hankinta aggressiivisen syövän fenotyyppien [6]. Todellakin, kohdennettuja häiriöitä mitokondrioiden aineenvaihdunta on kuvattu mahdollinen syöpähoidon [2]. Esikäsittely genipin merkittävästi vähentynyt pohjapinta hengityksen MX2 soluissa (kuvio 3A). Näitä vaikutuksia ei havaittu HL-60-solujen. Genipin aiheutti ~37% lasku hengitystiheys paljastaen että UCP2 on määrällisesti tärkeää ylläpitää irrottamisen mitokondrion fenotyyppi jopa vakio inkubointiolosuhteissa. Vertailun vuoksi CHO-UCP2 solujen kokenut ~22% lasku OCR-hoidon jälkeen 50 uM genipin (kuvio 1C). Ristiriita CHO ja MX2-soluissa on todennäköisesti johtuu eroista annoksen ja aika altistumisen kahden erillisen solua riviä. Tämä havainto osoittaa yleisesti, että UCP2 on merkittävä tekijä MX2 solujen bioenergetiikan. Lisäksi lisäyksen jälkeen genipin että oligomysiini käsiteltyjen MX2 soluissa hengitystiheys oli identtinen kuin HL-60-soluja (kuvio 3A). Tämä osoittaa, että UCP2 oli täysin vastuussa lisääntyneestä hengityksen MX2 soluja. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että genipin estää spesifisesti UCP2-välitteisen irrotuksen [34], [45]. Esimerkiksi Zhang

et al

havainnollistaa, että protoni vuoto ei vaikuta genipin vuonna UCP2

– /- solut ja kudos, joka ei ilmennä UCP2 [35]. Havaitsimme samankaltaisia ​​suuntauksia CHO-solut altistettiin genipin (kuvio 1 C). Näin ollen, genipin täysin estää lisääntynyt solujen hengityksen MX2-soluissa, kun se ei ole vaikutusta HL-60-kantasolujen.

A) Hapen kulutus mittaukset solut altistetaan 20 uM genipin 24 h altistuksen. Hapenkulutus mittaukset suoritettiin sen jälkeen, kun 30 min inkuboinnin reaktioväliaineessa puuttuessa (valkoiset pylväät) tai läsnä ollessa (harmaat pylväät) ja oligomysiini. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 6, ** p 0,01. Käsitellyt MX2 tai HL-60-soluja vain verrattiin niitä vastaavat ohjaus keskiarvoja. B) Hapen kulutus mittaukset altistuneiden solujen genipin (20 uM) ja /tai menadionia (20 uM) 24 tunnin ajan. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 4, * p 0,05

UCP2 tiedetään olevan negatiivinen säätelijä mitokondrioiden ROS tuotanto, kiinteistön johtuvan sen lievä irtoamisen aktiivisuutta. Kahdessa tyylikäs tutkimuksissa Echtay

et al

saatu vakuuttavia todisteita siitä, että UCP2 välittämä protoni johtokyky on maksimaalisesti aktivoituu oksidatiivisen stressin mitokondrioissa [27], [46]. Tämän tyyppinen ”indusoituva” protoni vuoto on kuvattu tärkeä suojakeino ehkäisyssä nousu mitokondrion ROS päästöjä. Niinpä testasimme jos ROS hoito voisi lisätä protoni vuotaa MX2 soluissa. Menadioni käsittely ei muuta hapen kulutusta MX2 soluissa (kuvio 3B). Nämä tiedot osoittavat, että ROS ei aiheuttanut lisäkorotukset protoni vuotaa riippuvainen hengitystä. Kuitenkin HL-60-solujen, menadionin hoitoon merkittävästi vähentynyt hapen kulutus, ehkä johtuen heikentynyt kyky näiden solujen ohjata solujen ROS tasoilla (kuvio 3B). Mitokondrioiden aineenvaihdunta (

esim.

, Sitruunahappokierron entsyymejä ja elektroninsiirtoketju proteiinit) on merkittävä tavoite ROS myrkyllisyyttä. Täten lasku hapenkulutus havaittu HL-60-solujen altistuvat menadionia osoittaa, että nämä solut on alhaisempi kyky ylläpitää siedettävän tason solujen ROS: n läsnä ollessa sytotoksisia aineita. Yllä olevat tiedot osoita, että UCP2 estää ROS aiheuttamaa arvonalennuksia mitokondrioiden aineenvaihduntaan. Toisin sanoen, alhainen runsaasti UCP2 että HL-60-solut voivat merkitä sitä, että ne eivät pysty myrkyllisyyden ROS. Vuonna MX2 soluissa, tuloksemme tukevat päätelmää, että UCP2 on jo maksimaalisesti aktivoitu. Itse asiassa kaksi erillistä kokeissa (kuvio 3A ja 3B) genipin vähentynyt hapen kulutus ~37% soluissa, normaaleissa inkubaation olosuhteissa. Lisäksi nonphosphorylating hengityksen osuus ~62% O

2 kulutusta MX2 soluissa ja genipin estivät yli puolet tästä hengitystä, mikä normalisoituminen kuin fosforyloivan hengitystä (

eli

, HL -60 arvot). Siksi UCP2 muodostaa suuren osa nonphosphorylating hengityksen MX2 soluissa. Näin ollen, ainutlaatuinen metabolinen profiili lääkeaineille syöpäsolujen näyttää sisältävän parannetun UCP2-välitteisen mitokondrioiden irrottamista välttää sytotoksisia vaikutuksia huume- ja mitokondrioiden tarttuvien ROS.

hoito genipin parantaa lääkkeen aiheuttama ROS tuotanto

edellä esitetyt tiedot osoittavat, että esto UCP2 mukaan genipin tuloksia induktion lääkkeen aiheuttamista solukuoleman monilääkeresistenttejä MX2 soluja. Koska UCP2 esto herkistää solut ROS tuottavat aineet, me sitten testata, jos genipin hoito tehostetun lääkkeen aiheuttama ROS muodostumista. HL-60-solut, joita käsiteltiin menadionia yksin tuotetaan paljon enemmän ROS kuin lääkeresistenttiä vastine (kuvio 4A). Tämä havainto on sopusoinnussa parannettu ROS käsittelykapasiteetti lääkeaineresistenttien soluissa. Kuitenkin co-hoito MX2 solujen genipin ja menadionia lisääntynyt ROS tasoilla. Todellakin altistuminen genipin käsiteltyjen MX2 solujen eri määriä menadionin lisännyt ROS tasoilla (kuvio 4B). 50 uM menadionia, oli jyrkkä nousu ROS tasoilla genipin altistuneet MX2 soluissa. Vain kohtalainen nousu ROS tuotanto havaittiin HL-60-solujen käsitelty menadionia ja genipin (kuva 4B). Hoidon genipin yksin MX2 solut eivät lisätä ROS tasoja (kuvio 4B). Siten genipin tekee MX2 soluja herkempiä hoidon ROS tuottavat aineet häiritsemällä protoni vuotaa.

ROS tasot arvioitiin ehjät HL-60 ja MX2-soluissa käyttäen DCFH-DA. A) ROS tasoilla soluissa altistetaan ainoastaan ​​menadioni (0-50 uM) 24 tuntia. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, * p 0,05. B) ROS tasoilla soluissa alttiina 0 tai 20 uM genipin ja menadionia (0-50 uM) 24 tuntia. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01.

Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin doksorubisiinin kanssa. Doksorubisiini on klassisesti viitataan topoisomeraasi II: n inhibiittori [47]. Kuitenkin muita mekanismeja myrkyllisyys, kuten ROS, on ehdotettu [48]. Doksorubisiinin kanssa yksinään aiheutti annoksesta riippuvaa kasvua ROS tasoilla HL-60-solujen (kuvio 5A). Sitä vastoin ei ole nousua ROS havaittu MX2 soluissa jopa 1 uM. Kuitenkin, kun genipin oli mukana doksorubisiinin, kasvaa ROS tasot havaittiin MX2 soluissa (kuvio 5B). Todellakin, altistuminen genipin ladattu solujen pitoisuuksiin doksorubisiinin niinkin alhainen kuin 0,1 uM johtivat jyrkkään kasvuun ROS tasoilla. Vaikka doksorubisiini käytetään laajalti syöpälääke, sen toimintamekanismia ei täysin tunneta. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että doksorubisiini voi lisätä ROS tasoilla MX2 soluissa samanakaiseen hoidon genipin. On aivan mahdollista, että doksorubisiini toksisuus kohdistuu mitokondrioissa. Anthracyclins ovat kinoni molekyylejä, kuten menadioni, jotka kykenevät katalysoimaan singletti elektronin vähentäminen kaksiatomiseksi hapen superoksidi. Superoksidi, riittävän korkeina pitoisuuksina, häiritsee moitteettoman toiminnan mitokondrioita. Kuitenkin tässä tutkimuksessa tuotannon ROS Doksorubisiini- ja menadionia in MX2 soluissa vaaditaan genipin hoitoa. On täysin mahdollista, että lääke-resistenttien solujen selviytymään estäviä vaikutuksia doksorubisiinin ja kinonit ylläpitämällä mitokondrioiden käytettäessä irrotetaan tilassa rajoittamalla ROS muodostumista.

ROS tasot arvioitiin ehjät HL-60 ja MX2-soluihin käyttäen DCFH -DA. A) ROS tasoilla HL-60-solujen ja MX2 solut altistettiin doksorubisiini (0-1 uM) 24 tuntia. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01. B) ROS tasoilla HL-60-solujen ja MX2-solut altistettiin 20 uM genipin ja doksorubisiinia (0-1 uM) 24 tuntia. 1-suuntainen ANOVA post-hoc Tukeyn testi, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01.

tulokset osoittavat, että luonnollinen tuote genipin voi tehdä lääkkeille vastustuskykyisten syövän solut herkempiä ROS tuottavat aineet. Kliininen käyttö genipin mahdollisena lääkkeen herkistävä aine vaatii lisätutkimuksia. Itse asiassa lääkeaineen herkistävä vaikutus genipin tutkittiin tässä yleisesti tutkittu riviä syöpäsoluja. Siksi on selventää mahdollisesta roolista genipin syövän hoidossa, kattava

in vivo

analyysejä vaaditaan nyt (

esim.

, Eläinkokeissa). Tämä tutkimus kuitenkin tarjoaa joitakin tärkeitä alustavia oivalluksia mahdollista käyttöä genipin syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa, herkistävä vaikutus genipin johtui sen vuorovaikutus UCP2, proteiini ilmentyy runsaana MX2 solun mitokondrioissa. Spesifisyys genipin varten UCP2 varmistettiin CHO-solut, jotka ilmentävät stabiilisti UCP2. HL-60-solut olivat vastetta genipin kohtelu, joka todennäköisimmin johtuu pieniä määriä UCP2 ilmaistu näissä soluissa. Erityinen estävä vaikutus genipin varmistettiin käyttämällä CHO-soluja joko ilmentävät tai eivät ilmennä UCP2. Siten meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​tietyn vaikutuksen genipin on UCP2. UCP2 on ilmaistu useissa normaaleissa somaattisten solujen (splenosyytit, haiman β-soluissa, kateenkorvan soluja ja useita muita immuunijärjestelmän-tyypin solujen) [26]. Määrä ilmaistu lääkeresistenttiä syöpäsolujen huomattavasti suurempi kuin proteiinin tasot ei-syöpäsoluja ja huumeisiin herkkien syöpäsolujen. Alhainen UCP2 proteiinitasot ylläpitää tiukkaa translaation ohjaus ja nopea hajoaminen [49]. Kummallista, glutamiini on ollut mukana induktio UCP2 mRNA käännös [50] ja lääkkeille vastustuskykyisiä syöpäsolut ovat parantaneet glutamiinia ottoa ja aineenvaihduntaa, prosessi välittämä Myc [51]. Näin ollen, on mahdollista, että glutamiini riippuvuus on osallisena parantaa UCP2-proteiinin ilmentymistä drug-resistentit solut. Olisi mielenkiintoista selvittää, UCP2 voidaan indusoida Myc. Tässä tutkimuksessa käytettävä mekanismi UCP2 välittämää väheneminen ROS johtuu sen irrottamista aktiivisuutta.