Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Honokiol, pienen molekyylipainon luonnontuote, on aiemmin raportoitu aktivoida apoptoosia ja estää mahalaukun kasvaimen kehittymisen. Onko honokiol estää angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen edelleen tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Testasimme vaikutukset honokiol on angiogeeninen aktiivisuus ja vatsakalvon levittäminen käyttämällä

in vivo, ex vivo

ja

in vitro

-analyysijärjestelmissä. Signalointi vasteet ihmisen mahasyövän soluja, ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolut (HUVEC), ja eristetyt kasvaimia havaittiin ja analysoitiin. Vuonna ksenografti mahakasvaimen hiirimallissa, honokiol estivät merkittävästi vatsakalvon levittämistä havaita PET /TT tekniikkaa. Honokiol myös tehokkaasti vaimennettu angiogeneesiä havaitaan poikasen rakkokalvon kokeessa, hiiren Matrigel plug määritys, rotan aortan rengas endoteelisolujen itämistä määrityksessä, ja endoteelisolujen putken muodostumista määrityksessä. Lisäksi honokiol tehokkaasti parantaa signaali anturin ja aktivaattori transkription (STAT-3) defosforyloinnilla ja estivät STAT-3 sitoutuu DNA: han ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa ja HUVEC, joka korreloi säätely ylöspäin aktiivisuuden ja proteiinin ilmentymistä Src homologia 2 (SH2) sisältävä tyrosiinifosfataasin-1 (SHP-1). Calpain-II-estäjä ja siRNA transfektio merkittävästi päinvastaiseksi honokiol aiheuttama SHP-1 aktiivisuutta. Vähentynyt STAT-3 fosforylaation ja lisääntynyt SHP-1 ilmentymisen myös esitetty yksittäisiä vatsakalvon etäpesäkkeitä. Honokiol kykeni myös inhiboimaan VEGF sukupolven, jota voitaisiin kumota SHP-1 siRNA transfektiota.

Johtopäätökset /merkitys

Honokiol lisää ekspressiota ja aktiivisuutta SPH-1, joka edelleen deaktivoi STAT3 kautta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol on uusi ja angiogeneesin estäjä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsoluja, mikä tukee soveltamisen mahdollisuuksia honokiol mahalaukun syövän hoidossa.

Citation: Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et ai. (2012) Calpain /SHP-1 Vuorovaikutus by Honokiol vaimennus Peritoneaalisille levittäminen mahasyövän

nu /nu

Hiiret. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711

Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Saksa

vastaanotettu: 17 tammikuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 24 elokuu 2012

Copyright: © Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusapurahoja Taichung Veterans General Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) ja National Science neuvoston Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa potilaista (-60%) ja mahasyövän diagnosoidaan myöhään tauti. Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy maailmanlaajuiseen syöpään kuolleisuus kehittyneissä maissa ja jolla etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi [1]. Leikkaus ja yhdistelmä solunsalpaajahoitojen mahasyövän on osoitettu antavan vain vaatimaton selviytymisen etuja kehittyneissä tapauksissa, ja lähes 50% potilaista kuolee jälkeen toistumisen [2], [3]. Merkittävä muoto toistuminen on vatsakalvon levittämiseen. Syövän kasvua ja vatsakalvon etäpesäke ovat angiogeneesistä riippuvaisia, prosessi, joka liittyy useita angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), epidermaalinen kasvutekijä (EGF), fibroblastien kasvutekijä, prostaglandiini E2: n, interleukiini-8, kemokiini (CXC-motiivin) ligandin 1, ja matriksimetalloproteinaasi perheen [4] – [6]. Useat molekyyli signaaleja, kuten signaalin anturin ja aktivaattori transkription-3 (STAT-3), tumatekijä-EB, Akt, mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien, syklo-oksigenaasi-2, lipoksigenaasin, indusoituva typpi–pioksidisyntaasia, tuumorinekroositekijä ja muut , on myös osoitettu olevan osallisena kasvaimen etenemiseen ja angiogeneesissä [7] – [9]. Kuitenkin solu- ja molekyylitason mekanismeja kehittämiseen, eteneminen, ja etäpesäke mahasyöpä vielä epäselviä.

Janus-aktivoitu kinaasi (Jak) /STAT signalointireitin tärkeä rooli säätelyssä solujen kasvua, angiogeneesin, erilaistuminen, muuttoliike, ja etäpesäkkeiden [10]. Konstitutiivisen aktivaation STAT polkuja, erityisesti STAT-3, on liittynyt monenlaisia ​​ihmisen syöpäsairauksia. Jatkuva STAT-3 fosforylaation on havaittu useissa erilaisissa ihmisen syövissä, kuten kiinteitä kasvaimia mahan, paksusuolen, maksan, eturauhas-, rinta-, keuhko-, ja pään ja kaulan sekä veren pahanlaatuisia kasvaimia [8], [10]. Aiempi tutkimus on osoittanut, että fosforylaatio STAT-3: n ja VEGF-proteiinin ilmentyminen on lisääntynyt ihmisen mahasyövän kudos, joka puolestaan ​​nostaa angiogeeninen fenotyyppi ja edistää mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen [11]. Toisaalta tietyt fosfataasit tiedetään olevan tuumorisuppressoreilla, ja se voi olla tärkeä rooli inhibitio tai valvontaa syövän kasvua [12] – [15]. Proteiini tyrosiinifosfataasien (PTP), mukaan lukien SH2 domain sisältäviä tyrosiinifosfataasin (SHP) -1 ja SHP-2, pystyvät säätelemään negatiivisesti STAT signalointi tyrosiini defosforyloitumista useiden komponenttien liittyvän signaalireitteihin [13] – [15] . Jatkuva aktivointi STAT-3 kasvaimissa voidaan helpottaa ainakin osittain lakkaa toimimasta näiden fosfataasien. Calpain II on osoitettu rooli Endoplasmakalvosto (ER) stressiin säännelty tumorigeneesin, joka osallistuu mekanismi honokiol-estivät mahalaukun tumorigeneesin [16]. Lisäksi edellinen tutkimus on osoittanut myös, että SHP-1 on endogeeninen substraatti calpain seuraavista A23187-aiheuttamaa verihiutaleiden aktivaation [17]. Siksi kalpaiinin /SHP-1-säännelty STAT-3: n ja VEGF reitti voi olla mukana angiogeneesiin, kasvua, ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsoluja.

Honokiol, pienen molekyylipainon luonnontuote, on merkittävä aktiivinen biphenolic yhdiste

Magnolia officinalis

, jonka tiedetään parantaa mikrobi-infektion, tulehduksen ja ruoansulatuskanavan häiriöt perinteisissä Aasian lääkkeiden järjestelmiä [18]. Edellisessä tutkimus osoitti, että honokiol estää mahalaukun tuumorigeneesiä aktivoimalla 15-lipoksigenaasin-1 ja sen seurauksena inhibitio peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin-A: n ja COX-2-riippuvainen signaalien [19]. Honokiol on osoitettu aiheuttavan ER stressiä ja käynnistää calpain-II-välitteinen glukoosin säätelemä proteiini-94 lohkominen ja apoptoosin ihmisen mahasyövän soluihin [16]. On osoitettu, että VEGF: n ilmentyminen voisi olla vasteellinen ravinteiden puutetta olosuhteissa, jotka aiheuttavat ER stressiä [20], [21]. Lisäksi ER-stressi aktivaattori tunikamysiini on todettu selvästi estää hiussuonten kehityksen, mikä viittaa siihen, että tämä ER stressin indusoija voi olla potentiaalinen rooli rinta- kasvaimen hoidossa [21]. Vaikutukset honokiol on ER stressin korreloivat angiogeneesiä ja mahakasvaimen etäpesäke ovat vielä epäselviä. Täällä arveltu, että honokiol estää angiogeneesiä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen kautta calpain /SHP-1-säänneltyjen STAT-3: n ja VEGF-reitin. Tulokset osoittivat, että honokiol selvästi esti angiogeneesiä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen kautta calpain /SHP-1 vuorovaikutuksen aktivoimien STAT-3 defosforyloinnilla ja VEGF alassäätöä polku.

Tulokset

Honokiol estetty Peritoneaalisille etäpesäke mahasyövän

in vivo

Syöpä on usein ominaista suosia [

18F] fluori-2-deoksi-D-glukoosia (FDG), ja [

18F] -FDG /PET voi toimia korvikkeena mittana terapeuttista tehoa. Toiminnallinen mahdollisuus pieneläinten kuvantamisen avulla kliinisen PET /TT-laite, jossa FDG arvioitiin. Neljä ryhmää hiiriä varten vatsakalvon etäpesäke kokeissa tutkittiin. Selvitys /kuva etäpesäkkeiden tilannetta esitetään kuviossa 1. Hyödynsimme [

18F] -FDG-PET /TT havaita vatsakalvon etäpesäkkeitä hiirillä ympätty ihmisen mahalaukun syöpäsolujen (MKN45 tai SCM-1) kanssa tai ilman honokiol hoitoon. Kuten kuviossa 2 on esitetty, suurin intensiteetti projektio tuotetaan tyypillinen edustaja hiirillä. Vatsakalvon etäpesäke leimasi kontrollihiirissä (vasen paneeli), ja se oli tehokkaasti muuttamaan jonka honokiol hoito (oikea paneeli). Nämä kuvat osoittavat selvästi, että noninvasive [

18F] -FDG sisäänottokyvyt vatsakalvon etäpesäkkeitä valvonta hiiret olivat huomattavasti korkeammat kuin vuonna honokiol hoidetuissa hiirissä. Kvantifiointia intensiteetti on esitetty kuviossa 3A. Vatsaonteloon honokiol (5 mg /kg, kaksi kertaa /viikko) vähensi merkittävästi arvioitu radioaktiivisuusyksiköllä ja erityisiä sisäänoton arvot (SUV) määritetään FDG-PET /CT hiirillä, jotka inokuloitiin mahalaukun syövän solut (Fig. 3). Lisäksi monet etäpesäkenystyröiden löytyivät vatsaonteloon (suoliliepeessä) valvonnan hiirillä, jotka inokuloitiin MKN45 ja SCM-1 (Fig. 2) soluja. Sen sijaan, vatsakalvon kasvaimen kyhmyjä todettiin yksittäisesti käsitellyissä hiirissä honokiol. Kvantifiointi noduulia per kenttä on esitetty kuviossa 3B.

(A) Neljä ryhmää hiiriä tutkittiin ja lueteltu. (B) Etäpesäkekuormitus olosuhteet syövän soluinokulaation PET /CT valvonta- ja edelleen sitten honokiol hoitoon. Ihmisen mahalaukun syövän soluja (4~5 x 10

6 solua) MKN45 (a) ja SCM-1 (b) inokuloitiin hiirille 7. päivänä

[

18F ] -FDG-PET toimi korvike mittana terapeuttista tehoa. Kasvaimia nude-hiiriä vahvistettiin 7 päivää sen jälkeen, kun vatsaonteloon siirrostuksen mahalaukun syövän solujen (MKN45, A; SCM-1, B). Sitten hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti honokiol (5 mg /kg /kahdesti viikossa). Kaksikymmentä-kahdeksan päivän kuluttua honokiol hoidon, FDG-PET /CT-kuvia hiiriä otettiin, ja sitten hiiret tapettiin varten makroskooppinen tutkimus jakelun levittää etäpesäkkeitä. Edustaja FDG-PET /CT-kuvia eläinten inokuloitiin MKN45 (A-a) tai SCM-1 (B-a) mahalaukun syövän solujen kanssa tai ilman honokiol (HK) käsittely on esitetty. HK (5 mg /kg) annettiin vatsaontelon sisäisenä pistoksena. Enimmäisintensiteetti projektio tyypillinen edustaja nude-hiirten (vasen, kasvain ohjaus, oikea, HK hoito) näytetään. Lisäksi monet etäpesäkenystyröiden havaittiin suolilieve ohjaus hiirillä, jotka inokuloitiin MKN45 (A-b) tai SCM-1 (B-b) soluissa. Sen sijaan, vatsakalvon etäpesäkkeiden havaittiin satunnaisesti honokiol-käsitellyillä hiirillä.

Hiiret inokuloitiin ihmisen mahalaukun syövän soluja (MKN45 ja SCM-1). [

18F] -FDG-PET /TT kuvantaminen tehtiin ja analysoitiin. (A) kvantitatiivinen arvioitu radioaktiivisuuden (Bq /ml, a) ja erityinen oton arvoihin (SUV, b) laskettiin. SUV käytetään indeksin onko hotspot on merkittävä. (B) Photomacrographs metastaattisen vatsakalvon kyhmyt näkyvät. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 6-8). * P 0,05 verrattuna kontrolli.

Honokiol Inhibioitu Angiogeneesi

in vivo

,

ex vivo

, ja

in vitro

Endoteelisolut ovat kriittisiä angiogeenisen prosessin, joka on tarpeen kasvaimen kasvu ja etäpesäke. Me seuraavaksi tutkittiin angiogeenisen vaikutuksen honokiol käyttäen kananpojan rakkokalvon määritys (

CAM

määritys), Matrigel tulppa määritys, aortan rengas itämistä määrityksessä, ja endoteelisolujen putken muodostumiseen. Kuten on esitetty kuviossa 4A, honokiol esti tehokkaasti neo-verisuonten muodostumista

CAM

määritykseen ilman mitään näkyvää vaikutusta ennestään verisuonia. Kvantitatiivinen analyysi paljasti, että honokiol aiheutti 2,5-kertaisen määrän väheneminen vasta muodostuneiden verisuonten verrattuna, että väliaineen ohjaus.

(A) rakkokalvon kokeessa (

CAM

määritys) oli suoritetaan. Neovaskulaarisissa muodostuminen ansaan tyypin I kollageenin geelejä tai ilman honokiol (HK, 20 uM) hoitoon tutkittiin. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin ympärillä ladattu levy kuvattiin. (B) Matrigel (0,6 ml), istutettiin ihon alle nude-hiiriin tai ilman honokiol (10 ug /ml) tai VEGF: ää (100 ng /ml). Injektoitu Matrigel nopeasti muodostunut yksi kiinteä geeli tulppa. Jälkeen 21 päivää, hiiret tapettiin ja matrigeeliä tulpat leikattiin. Edustavia Matrigel tulpat (a) ja IHC CD31 värjäys osastoja matrigeelin tulpat (b) on esitetty. Kvantitatiivinen alusten (c) ja endoteelisolujen (d) in Matrigel tulppa kohdissa (pulssia /kenttä) laskettiin. Numerot ovat kussakin tapauksessa keskiarvo viidestä eri dioja ja viisi aluetta kohti slide. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 8-10). * P 0,05 verrattuna kontrolli.

Matrigel tulppa määrityksessä, matrigeeliä, joka sisälsi VEGF (100 ng /ml geeliä) kanssa tai ilman honokiol (10 ug /ml) implantoidaan ihon alle nude-hiiriin . 21 päivän kuluttua implantaatiosta muodostunut matrigeelin tulpat leikattiin ja valokuvattiin. Tulpat VEGF yksin olivat selvästi juovikas, verisuonten ja punainen. Tulpat sisältävät VEGF: n ja honokiol olivat kalpea, mikä osoittaa lainkaan tai vähemmän verisuonten muodostumista (Fig. 4B-a). Tutkimme myös suonitiheys ja alus morfologian pistokkeen kohdissa H E-värjäys ja immunohistokemiallista värjäystä vasta-aineella CD31, joka on endoteelisolumarkkeri. Vaskularisaatio on honokiol + VEGF ryhmän väheni merkitsevästi verrattuna VEGF yksin ryhmä (Fig. 4B-b). Kvantifiointi vaskularisaation laskemalla alusten ja esitetty endoteelisolujen paljasti, että verisuonten tiheys honokiol-käsitellyssä ryhmässä oli merkittävästi vähentynyt (kuviot. 4B-c ja 4B-d).

Seuraavaksi endoteelisolut indusoitiin versoa eristetyistä rotan aortan renkaita läsnä ollessa Matrigel ja ECGM (endoteelisolujen kasvualusta), joka sisälsi angiogeenisten sytokiinien, kuten VEGF, ja emäksinen fibroblastikasvutekijä. Laaja endoteelisolujen seuraus rotan aortan rengas eksplanttien havaittiin kontrolliryhmässä (Kuva. 5A). Honokiol hoito johti merkittävään (~five-kertainen) väheneminen endoteelin seuraus ja versoja aorttarenkaat (kuviot. 5A ja 5C). Lisäksi morfologiset erilaistumisen endoteelisolujen putken muodostumiseen tutkittiin käyttäen kaksiulotteista matrigeeliä menetelmällä. Kuten kuviossa 5B on esitetty, kylvö HUVEC in matrigeeliä johti verisuonten putkimaisen rakenteen muodostuminen. Honokiol tehokkaasti inhiboi endoteelisolujen putken muodostumiseen vähentämällä putkimainen rakenne pituus ja leveys (kuviot. 5B ja 5D).

(A) Honokiol inhiboi endoteelisolujen versoja aortan rengas määrityksessä. Aortat kerättiin 6 viikon ikäisiä Sprague-Dawley-rottia ja leikataan 1 mm viipaleiksi, jotka asetettiin sitten 12-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät matrigeeliä. Renkaat valokuvattiin ja analysoitiin. Endoteelisolujen versoja oli runsas kontrolliryhmässä aortan renkaat (vasemmanpuoleiset paneelit), mutta ei soi käsitelty honokiol (HK, keskimmäinen paneeli, 40 uM, oikea paneeli, 60 uM). (B) Honokiol tukahdutti endoteelisolujen-putken muodostumiseen. HUVEC-solut ympättiin matrigeeliä päällystetty 96-kuoppalevyille. Soluja käsiteltiin honokiol (40 ja 60 uM) 12-18 tuntia. Putki muodostuminen kuvat otettiin kiinni ylösalaisin valomikroskooppia, ja putki kokoonpanojen pisteytettiin. (C) aste pienten suonten versoja aorttarenkaat pisteytettiin välillä 0 (vähiten positiivinen) 4 (useimmat positiivinen). (D) kvantifiointi HUVEC-putken muodostumiseen näkyy. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 8-10). * P 0,05 verrattuna kontrolli.

Honokiol lakkautetaan STAT-3: n signaloinnin in Human Mahalaukun Syöpäsolut, HUVEC, ja Kasvaimet

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet vahvan korrelaation aktivoitu STAT -3 ja angiogeeninen fenotyyppi [11]. Olemme edelleen selvitetty vaikutusta honokiol on fosforylaatiota STAT-3 ihmisen mahasyövän soluja (MKN45 ja AGS) ja HUVEC. Kuten kuviossa 6 on esitetty, honokiol vähensi tyrosiini (Tyr705) fosforylaatio STAT-3 on aika-riippuvaisella tavalla noin kaksi kertainen pieneneminen 1-2 h AGS-soluissa (kuvio. 6A) ja 3 10- kertainen pieneneminen 0,5-24 h MKN45 soluissa (kuvio. 6B). Yllättäen honokiol indusoi STAT-3 defosforylointia Tyr705, mutta ei Ser727, tähteet näissä ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Kuitenkin honokiol samanaikaisesti estämällä sekä Tyr705 ja Ser727 fosforylaation STAT-3 HUVEC (Fig. 6C). Kvantitatiivinen analyysi proteiinin bändejä Western blot käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto on esitetty kuviossa 7. tulokset analyysin kanssa -konfokaalimikroskoopilla osoitti myös, että honokiol poisti tyrosiini (Tyr705) fosforylaatio STAT-3 AGS soluissa ja HUVEC (kuvio . 8A).

AGS (A) ja MKN45 (B) lepovirta ihmisen mahasyövän solujen ja HUVEC-soluja (C) käsiteltiin kanssa ja ilman honokiol (HK, 5-40 uM) varten osoitetut ajat. Kokosolulysaateille valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella havaitsemiseksi fosforyloidun STAT-3 (Pstat-3, Tyr705). Blottings uudelleenseulottiin anti-STAT-3-vasta-aineita varten normalisointi. Tulokset edustavat vähintään viiden itsenäisen kokeen.

AGS (A) ja MKN45 (B) lepovirta ihmisen mahasyövän solujen ja HUVEC-soluja (C) käsiteltiin kanssa ja ilman honokiol (HK, 5- 40 uM) varten osoitetut ajat. Kokosolulysaateille valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella havaitsemiseksi fosforyloidun STAT-3 (Pstat-3, Tyr705). Blottings uudelleenseulottiin anti-STAT-3-vasta-aineita varten normalisointi. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolli.

(A) p-STAT-3 (Tyr705) ilmaisuja mahasyövän soluissa (AGS) ja HUVEC käsitelty honokiol (HK, 10 ja 20 uM ) 1 h, havaittiin konfokaalisella mikroskoopilla. (B) Kasvaimet nude-hiiriä vahvistettiin 7 päivää sen jälkeen, kun vatsaonteloon siirrostuksen MKN45 soluja. Sitten hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti honokiol (5 mg /kg /kahdesti viikossa) ja 28 päivää. P-STAT-3 (Tyr705) ilmaisuja etäpesäkkeitä eristetty hiiristä kanssa tai ilman HK hoitoa näkyvät. P-STAT-3 (Tyr705) proteiini ilmaisuja, värjätty tummanruskea, havaittiin immunohistokemiallisesti. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolli.

tutki vielä STAT-3 fosforylaation in vatsakalvon etäpesäkkeitä eristetty nude-hiirissä inokuloitu MKN45 solujen kanssa tai ilman honokiol (5 mg /kg) hoitoon. Immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että p-STAT-3 yli-ilmentymisen ja kerääntymistä kasvaimen alueella, myös ytimet ja solulimassa, merkittävästi kumota honokiol hoito (Fig. 8B). Vuonna Western blotting-analyysi, honokiol merkittävästi vähentynyt kertyminen p-STAT3 tuumoreissa verrattuna ajoneuvon ohjaus (Kuva. 9A). Ilmaisu konstitutiivisen STAT3 ei vaikuttanut. Lisäksi DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT-3 vahvistettiin edelleen käyttäen EMSA. Kuten on esitetty kuviossa 9B, honokiol inhiboivat merkittävästi lisääntynyt DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT-3 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Honokiol esti myös VEGF-nousi STAT-3 DNA: n sitoutuminen aktiivisuus HUVEC (Fig. 9B).

(A) Western blotting havaitsemiseksi p-STAT-3 (Tyr705) proteiinien etäpesäkkeitä eristetty hiiristä tai ilman honokiol (HK) on esitetty hoidon. (B) EMSA suoritettiin havaitsemiseksi STAT-3 DNA: n sitoutuminen toimintaan AGS, SCM-1 (vasen paneeli), ja HUVEC (oikea paneeli) kanssa tai ilman honokiol hoitoa. Soluja käsiteltiin honokiol eri ajanjaksojen kuten. VEGF (20 ng /ml), parannettu STAT-3 DNA: n sitoutuminen aktiivisuus HUVEC, ja tämä parannus purettiin honokiol (10 uM). Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolli.

Honokiol aiheuttama SHP-1-säännelty STAT-3 defosforylaatio mahasyövän, endoteelisolut, ja Kasvaimet

SHP-1 on ei-transmembraaninen PTP [12]. Me seuraavaksi tutkittava, onko honokiol voi säädellä ilmentymistä ja toimintaa SHP-1. Kuten kuviossa 10A on esitetty, honokiol parantaa proteiinin ilmentymistä SHP-1, mutta ei SHP-2, ja HUVEC ja AGS solujen ajan riippuvalla tavalla. Farmakologiset PTP estäjä ja SHP-1 siRNA transfektiota tehokkaasti poisti honokiol aiheuttama STAT-3 defosforyloinnilla in HUVEC ja AGS soluja (Kuva. 10B-a). Samanlaisia ​​tuloksia SCM-1-soluja ja SV-40 kuolemattomiksi hiiren mikroverisuonten endoteelisoluja (SVECs) käsiteltiin honokiol on esitetty kuviossa 10B-b. Me seuraavaksi tutkittava, onko endogeeninen SHP-1 moduloidaan honokiol. Honokiol kykeni muistelemalla SHP-1 aktiivisuutta mahasyövän soluissa, HUVEC ja SVECs on ajasta riippuva tavalla (kuva. 11A). Honokiol myös lisännyt SHP-1-proteiinin ilmentyminen vatsakalvon etäpesäkkeitä eristetty MKN45-ympätty hiirten paljasti immunohistokemiallisella analyysillä (Kuva. 11B). Tutkimme lisäksi vuorovaikutusta SHP-1 ja STAT-3 käyttäen menetelmiä samanaikainen immunosaostus ja Western blotting. Kuten on esitetty kuviossa 11C, SHP-1 spesifisesti liittyy STAT-3 AGS soluissa ja HUVEC: n läsnä ollessa honokiol verrattuna IgG-ohjaus.

Soluja käsiteltiin honokiol (10 ja 20 uM) ja eri aika kursseja kuten. (A) SHP-1 ja SHP-2-proteiinin tasot, havaittiin Western blot -analyysillä soluissa kanssa tai ilman honokiol hoitoa. (B) fosforylaatiolla STAT-3 mahasyövän soluissa (AGS ja SCM-1) ja endoteelisoluja (HUVEC: t ja SVECs) kanssa tai ilman honokiol (10 uM HUVEC, SVECs, ja SCM-1, 20 uM AGS) hoitoa 24 h: n läsnä tai poissa ollessa fosfataasinestäjällä (PTP-inhibiittori II, 20 uM) tai SHP-1 siRNA transfektion havaittiin. A, tiedot esitetään keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolli. B, esitetyt tulokset edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

Soluja käsiteltiin honokiol (HK) eri ajanjaksojen kuten. (A) Soluja käsiteltiin honokiol (HUVEC: t, 20 uM, SVECs, 20 uM, AGS, 20 uM, SCM-1, 40 uM), on ilmoitettu ajat, ja sitten SHP-1-aktiivisuudet mitattiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 7). * P 0,05 verrattuna kontrolli. (B) immunohistokemiaallisesti SHP-1 ilmentymisen etäpesäkkeitä eristetty hiiristä kanssa tai ilman HK hoitoa näkyy. Leikkeet värjättiin anti-SHP-1-vasta-aine. (C) vuorovaikutus STAT-3 ja SHP-1 havaittiin AGS soluissa tai HUVECeja. Immunosaostettiin proteiinit kerättiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-anti-STAT-3 tai anti-SHP-1-vasta-aineita. A ja B, tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 5). * P 0,05 verrattuna kontrolli. C, tulokset esitetään edustavat vähintään neljän itsenäisen kokeen.

Honokiol Altered ER Morfologia, indusoi Calpain-II-säänneltyjen SHP-1 aiheuttama STAT-3 defosforylaatio, ja Laskua VEGF Generation

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ER-stressi on tärkeä rooli angiogeneesissä [20], [21]. Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus honokiol on ER mikrorakenteen transmissioelektronimikroskopialla. Kuten on esitetty kuviossa 12A, ER laajentumista ja pirstoutumista oli esillä honokiol saaneilla SCM-1 mahalaukun syövän solujen ja HUVEC.

(A) Soluja käsiteltiin honokiol (HUVEC: t, 10 uM, SCM-1, 40 uM) 18 tuntia. Solut kerättiin ja visualisoidaan elektronimikroskoopilla, kuten kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät”. Nuolet osoittavat laajentuneet ER. Alkuperäinen suurennus: 9800x. (B) Soluja käsiteltiin tai ei honokiol (HUVEC: t, 20 uM, AGS, 20 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa rekombinantti-proteiinin kalpaiini II (re-kalpaiini) tai kalpaiini II siRNA transfektion, ja sitten solut analysoitiin SHP -1 toimintaa. (C) transfektoitiin villityypin STAT-3 (wt) ja mutantti-STAT-3 (mut) plasmidit tai SHP-1 siRNA, ja sitten VEGF sukupolven määritettiin. (D) vuorovaikutus kalpaiini ja SHP-1 havaittiin AGS soluissa. Immunosaostettiin proteiinit kerättiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-anti-calpain-II tai anti-SHP-1-vasta-aineita. A ja D, tulokset ovat edustavat vähintään 4 itsenäisestä kokeesta. B ja C, tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n≥4). * P 0,05 verrattuna kontrolli. # P 0,05 verrattuna honokiol yksin.

Lisäksi halusimme selvittää calpain-II aktivoitumista tarvitaan SHP-1 aktiivisuutta honokiol käsiteltyjä soluja. Farmakologiset kalpaiinia estäjä ja calpain-II siRNA transfektio vähentää tehokkaasti honokiol tehostetun SHP-1 aktiivisuutta AGS soluissa ja HUVEC (Fig. 12B). Solut, jotka käsitelty yhdistelmä-DNA-kalpaiini-II, positiivisena kontrollina, osoitti 4-5-kertainen SHP-1-aktiivisuuteen (Fig. 12B). VEGF: n tiedetään sisältävän STAT-3-promoottori sitoutumiskohdan. Me seuraavaksi tutkittava, onko honokiol voi säädellä VEGF ilme. Honokiol vähensi VEGF sukupolven AGS soluissa ja HUVEC, ja tämä vaikutus purettiin SHP-1 siRNA transfektiota (Fig. 12C). Lisäksi transfektio mutantti-STAT-3-plasmidi soluihin esti myös VEGF-sukupolvi. Yhdistelmä honokiol kanssa mutantti-STAT-3 plasmiditransfektiolla soluissa synergistisesti vähensi VEGF tuotantoa verrattuna jompikumpi hoito yksinään (Fig. 12C). Edelleen vahvistaa vuorovaikutusta calpain-II ja SHP-1, samanaikainen immunosaostus ja Western blotting suoritettiin mahalaukun syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa 12D, kalpaiinin-II jotka liittyvät erityisesti SHP-1 AGS-soluissa, kun läsnä on honokiol (20 uM) verrattuna IgG-kontrolli. Samoin honokiol aiheuttama calpain /SHP-1 vuorovaikutus havaittiin myös HUVEC-soluja (tietoja ei esitetty).

Keskustelu

Honokiol on tärkeä osa

Magnolia officinalis

, joka on siirtymäkauden lääke Aasiassa [18]. Honokiol hallussaan anti-oksidatiivisen ja tulehdusta estäviä

in vitro

ja

in vivo

[22] – [25]. Honokiol on osoitettu olevan voimakkaita anti-proliferatiivista aktiivisuutta endoteelisolujen

in vitro

ja kasvaimen vaikutuksia vastaan ​​angiosarcoma nude-hiirissä [26]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että honokiol on voimakas angiogeneesin estäjä ja vatsakalvon etäpesäkkeiden mahasyövän. Tutkimuksemme on keskittynyt vaikutuksia ja mahdollisia mekanismeja honokiol peritoneaalidialyysia etäpesäke ja angiogeneesiä käytetään PET /CT,

CAM

määrityksessä Matrigel plug määritys, aortan rengas endoteelisolujen itämistä määrityksessä, endoteelisolujen putken muodostumiseen määrityksessä, ja

in vitro

Solukokeita. Tulokset osoittivat, että honokiol voivat tukahduttaa angiogeneesiä ja vatsakalvon levittämistä kautta calpain-II-aktivoitu SHP-1 aktivaatio signalointiryöpyn. Aktivointi fosfataasin SHP-1 honokiol edelleen johti alas-säätely STAT-3 aktivointi ja VEGF tuotantoa, mikä johtaa angiogeneesin inhibitiota ja vatsakalvon etäpesäke. Kuitenkin, angiogeneesin inhibitiota ja estämällä metastaattista potentiaalia syöpäsolujen honokiol voi olla erillinen osa, joista toinen on vaikutusta honokiol angiogeneesiin suoraan ja toinen vaikutus honokiol syöpäsoluihin.

Viime useita vuotta, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivointi STAT perheen, erityisesti STAT-3, liittyy soluproliferaatioon, angiogeneesin ja metastaasin [10], [11], [27] – [30]. Aktivoitunut STAT-3: n ekspressio on löydetty eri kasvain- soluja ja näytteitä ihmisen syöpäkudoksissa. Vapautettiin STAT-3 aktivointi on ehdotettu olevan tärkeä rooli yli-ilmentymisen VEGF ja lisääntynyt angiogeenisten fenotyyppejä mahasyövän, jotka voivat vaikuttaa mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen [11]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että honokiol voidaan tehokkaasti estää fosforylaation STAT-3: HUVEC-soluja (sekä Tyr705 ja Serine727 sivustot), ihmisen mahasyövän soluja (Tyr705 päällä), ja vatsakalvon etäpesäkkeitä (Tyr705 site). Koska onkogeeninen aktivaatio tyrosiinikinaasien on yhteinen piirre syöpiä keskityimme roolista Tyr705 fosforylaation STAT-3.

SHP-1 hallussaan potentiaalinen tuumorisuppressoriproteiinia funktio ja on negatiivinen säätelijä JAK /STAT signalointireitti [15]. On myös osoitettu, että SHP-1 fosfataasi voi sitoutua fosforyloidun Y1173 verkkotunnuksen, joka johtaa EGFR defosforylaatio [31]. Y429, että sytoplasminen domeeni erytropoietiinireseptoriin on ehdotettu olevan sitoutumiskohdan proteiinityrosiinifosfataasi SH-PTP1, joka voi olla tärkeä rooli päättämisestä proliferatiivisen signaalit [32]. SHP-1 on myös osoitettu olevan antagonisti kasvutekijän signalointi epiteeli- ja hematopoieettisten solujen [15]. SHP-1 oli erityisen korostettiin mahdollisena fysiologinen antagonisti VEGFR signaloinnin [33]. Endoteelisoluissa, SHP-1 liitetään fyysisesti VEGFR2 ja tarvitaan myös sekä TNFa-välitteisen ja kudos-estäjä metalloproteinaasien (TIMP) -välitteisen angiogeneesin estäminen [31]. Siten SHP-1 aktivaatio voi olla merkittäviä vaikutuksia sääntelyn lisääntymistä ja angiogeneesiä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että honokiol erityisesti tehostettu ilmentyminen SHP-1, mutta ei SHP-2, mahalaukun syövän, endoteelisolujen, ja vatsakalvon etäpesäkkeitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol voivat estää endoteelisolujen angiogeneesiä ja syöpäsolumetastaasi, joka voi olla esimerkiksi SHP-1 aiheuttama STAT-3 alassäätöä polku.

Aikaisemmat tutkimukset ovat ehdottaneet tärkeä rooli ER stressin molekyylimekanismi angiogeneesiä ja syöpäsolujen kasvua [16], [20], [21]. Koyama ja kollegat ovat myös ehdottaneet, että ER stressin aiheuttama kalsiumin häiriöt voivat olla mukana induktioon amyloidi β keskittymisen ja angiogeenisen tekijän ilmentymistä verkkokalvon pigmenttiepiteelin [34]. Tuore tutkimus on osoittanut, että ER stressin säännelty IRE-1α signalointi hallussaan olennainen toiminto istukan kehitys ja alkion elinkelpoisuuden korostaen suhde ER stressiä, ja angiogeneesi istukan raskauden aikana [35]. Kim ja kollegat ovat osoittaneet, että sekä SHP-1 ja SHP-2 ovat endogeenisia substraatteja kalpaiinia, joka on mukana yhteydessä

suoliameba

indusoimaan isännän solukuolemaa [36]. Erityisesti kalpaiinien aktivoituvat, kun solunsisäisen kalsiumin ([Ca

2+] i) pitoisuus on koholla;