Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli MikroRNA pienen keuhkosyöpä (SCLC) ei juuri tunneta. miR-34a tunnetaan p53 säädellään-tuumorisuppressorin microRNA monissa syöpätyypeissä. Kuitenkin sen terapeuttista vaikutusta ei ole koskaan tutkittu SCLC, syövän tyyppi usein toimintahäiriö p53. Tutkimme ilmaus paneelin 7 MikroRNA (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, ja anna-7a) 31 SCLC kasvaimissa, 14 SCLC solulinjat, ja 26 NSCLC solu linjat. Havaitsimme huomattavasti pienempi miR-21, miR-29b, ja miR-34a ilmentyminen SCLC solulinjoissa kuin NSCLC solulinjoissa. Ilmaisu on 7 MikroRNA oli liity SCLC potilaiden kliinisiä piirteitä ja ei ollut prognostisten aikavälillä kokonaiselossaoloaika tai aika ilman taudin etenemistä eikä ennustavan hoitovasteen. Yliekspressio tai alisäätely miR-34a ei vaikuttanut SCLC solujen elinkykyä. Ilmaisu Näiden 7 MikroRNA myös ei ennustanut

in vitro

herkkyys sisplatiinin tai etoposidin SCLC solulinjoissa. Yliekspressio tai alisäätely miR-34a eivät vaikuttaneet herkkyys sisplatiinin tai etoposidin SCLC solulinjoissa. Toisin downregulation MIR-34a kohdegeenien cMET ja Axl yliekspressiolla miR-34a NSCLC solulinjoissa, luontainen ilmaus cMET ja Axl oli alhainen SCLC solulinjoissa ja ei vaikuttanut yli-ilmentymisen miR-34a. Tuloksemme viittaavat siihen, että ilmaus 7 valitun MikroRNA eivät prognostisia vuonna SCLC potilailla, ja miR-34a ei liity pahanlaatuiseen käyttäytymiseen SCLC-solujen ja tuskin on terapeuttinen kohde.

Citation: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham T, Wang Y, et ai. (2011) MicroRNA Expression ja kliininen tulos pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 6 (6): e21300. doi: 10,1371 /journal.pone.0021300

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 08 helmikuu 2011; Hyväksytty: 25 toukokuu 2011; Julkaistu: 22 kesäkuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tutkimuksen rahoittivat National Institutes of Health, National Cancer Institute sisäiset ohjelmaa. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) osuus on noin 10-20% keuhkosyöpää ja on tunnettu sen aggressiivisuus ja huono eloonjääntiprosentin [1], [2]. Huolimatta kohtalainen edistytty viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, eloonjäämisaste SCLC potilaista on edelleen hyvin huono [2], [3]. Osittain koska riittämätön molekyyli biomarkkereiden ohjata hoitoon SCLC, kliiniset tulokset molekyylitason kohdennettuja hoitomuotojen kuten imatinibi gefitinibi, Bcl-2-estäjät, ja mTOR inhibiittorit hoidossa SCLC potilaat ovat pettymys [4].

MicroRNA ilmaisu korreloi biologisia ominaisuuksia syövän, kuten solujen erilaistumista, aggressiivisuus, invaasio, angiogeneesi, ja metastaattinen käytös [5], [6], [7]. Esimerkiksi miR-34 perheenjäsenten, miR-34a, miR-34b, ja miR-34c, ovat suoria transkription tavoitteita p53 ja niiden ilmaisun indusoi solukierron pysähtymisen syöpäsolulinjoissa [8]. miR-29b toimii tuumorisuppressorina microRNA kautta palauttaminen normaalin DNA: n metylaatio [9]. Kliinisesti microRNA profilointi on osoitettu diagnosoinnin apuna syövän sekä ennuste ennusteen ja hoitovasteen [6], [10]. Roolit MikroRNA syövän biologian ja ennuste ennustaminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on tutkittu laajasti. Lisääntynyt miR-34a liittyi vähemmän pahenemisvaiheita pienessä retrospektiivinen tutkimus resektoitiin NSCLC potilaiden [11]. Yli-ilmentymisen let-7a, mahdollisesti tukahduttaminen RAS onkogeeni [12], osoitettiin liittyvän kasvanut selviytymisen pienisoluista keuhkosyöpää [13], ja se oli myös yksi suojaava ennustetekijöiden uusiutumisen ehkäisemiseksi kirurgisesti resektoitiin NSCLC [14] . Yli-ilmentyminen ”oncomirs” miR-21 ja miR-155 osoitettiin liittyvän pieneni selviytymisen pienisoluista keuhkosyöpää [13], [15]. On vain vähän tietoa roolista mikroRNA ilmaisun SCLC, ja toiminta useita hyvin dokumentoituja syöpään liittyvien MikroRNA muissa syöpätyyppeihin ole koskaan käsitelty SCLC. Esimerkiksi vaikka SCLC on ominaista usein p53 toimintahäiriö [16], rooli miR-34a, p53 säännelty kasvain vaimennin microRNA [8], [17], ei ole koskaan tutkittu SCLC.

osoittivat äskettäin, käyttämällä reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) -pohjaisen plateform, että ilmentymisen profiilit paneelin seitsemän syöpään liittyvien MikroRNA (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, asennuspalveli- 155, ja anna-7a) eivät ole ennustavia eivätkä ennustetekijöiden NSCLC saavilla potilailla platinapohjaiseen adjuvanttihoitoa [18]. Kuitenkin resektoidun haimasyövän käyttäen samaa paneelia MikroRNA, osoitimme, että alhainen ilmentyminen miR-21 oli yhteydessä lisääntyneeseen eloonjäämiseen adjuvanttihoitona kahdessa itsenäisessä ikäluokat haiman adenokarsinooma potilaille [19], mikä viittaa siihen, että ilmaus MikroRNA ja niiden prognoosi- ja ennakoiva vaikutukset ovat todennäköisesti kasvain erityinen. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme roolia MikroRNA ennustamiseen sekä ennusteen ja hoidon lopputulos SCLC käyttämällä potilaan näytteitä ja SCLC solulinjoissa. Olemme edelleen tutkittu, miten ilmaus miR-34a vaikuttaa pahanlaatuinen käyttäytymiseen SCLC-solujen.

Tulokset

microRNA ilmentyminen SCLC kasvaimia ja keuhkosyövän solulinjat

Taulukossa 1 esitetään yhteenveto tärkein potilaiden ominaispiirteet, ja taulukko S1 kuvaa microRNA ilmaisun suhteessa kliinisiin muuttujiin. Suuntaus havaittiin hyväksi korkeamman let-7a ilmaisun naisilla ja nuoremmilla potilailla (p = 0,07 ja 0,13 vastaavasti, Wilcoxonin Rank-Sum testi). Mitään merkittäviä korrelaatioita välillä ei havaittu ilmentyminen MikroRNA ja kliinisiä tekijöitä. Vertasimme ilmaus 7 MikroRNA välillä SCLC solulinjojen ja NSCLC solulinjat. Alempi ilmentyminen miR-21, miR-29b, ja miR-34a löydettiin SCLC solulinjoissa kuin NSCLC solulinjoissa (p 0,001 kaikissa kolmessa MikroRNA, kuva S1), joka on sopimukseen aiemman raportin [20] . Olemme edelleen suorittaa

in situ

-hybridisaatio miR-34b on SCLC tuumorinäytesylinterin ja havaittu sytoplasmista ekspressiota miR-34b ja ydinvoiman ilmaus nucleolar RNA U6 odotetusti (kuva S2).

microRNA ilmaisua ei korreloi selviytymisen SCLC potilaiden

keskimääräinen eloonjäämisaika ja ilman taudin etenemistä tämän tutkimuksen kohortin olivat 49,1 ja 35,7 viikkoa vastaavasti. Kuten odotettua, pidempi kokonaiselossaoloaika havaittiin SCLC potilailla, joilla oli rajalliset sairaus ja potilaat, joille saatiin täydellinen vaste hoidon jälkeen (taulukko 1 ja taulukko S2). Niistä 7 MikroRNA tutkittu, ei ollut eloonjääminen eroa potilaiden välillä, joilla on korkea ja matala microRNA ilmaisun, määritellään mediaanin ilmentymisen kunkin mikroRNA kasvaimen yksilöt (taulukko 2). Tämä päti sekä rajallinen ja laaja tautia sairastavilla potilailla (taulukko S3).

p53-proteiinin ilmentymistä ei liity miR-34a /b /c ilmentymisen SCLC kasvaimissa

Koska asennuspalveli- 34a, miR-34b, ja miR-34c ovat suoria transkription tavoitteita p53 [8] ja bcl-2 on kohteena miR-34a [21], tutkimme, p53 ilmaus vaikuttaa ilmaus miR-34a /b /c ja onko bcl-2: n ilmentymisen liittyy miR-34a. Käyttämällä näytteet samasta tutkimuskohortissa, Dingemans

et al

osoittivat, että proteiini p53 ei liity selviytymisen SCLC potilaiden ja on liity proteiinin ilmentymistä Bcl-2 sekä [22]. Havaitsimme, että proteiini p53: n in SCLC kasvaimissa oli liity ilmentymisen miR-34a, miR-34b, ja miR-34c (kuvio S3A, B, ja C). Lisäksi ilmaus miR-34a oli liity ilmaus Bcl-2 in SCLC kasvaimissa (kuvio S3D).

miR-34a ilmaisua ei liity elinkelpoisuutta SCLC

in vitro

tutkia roolia mikroRNA ilmaisun pahanlaatuinen käyttäytymistä SCLC, keskityimme miR-34a koska miR-34a ilmoitettiin olevan prognostinen selviytymisen merkki [11] ja on yksi harvoista ehdokkaista microRNA korvaaminen hoito NSCLC [23], [24]. Me yliekspressoidaan tai alassäädetty miR-34a SCLC soluissa. Käyttäen Cy3-leimattua miR esiaste tai -estäjä arvioida transfektion tehoa, olemme huomanneet, että 24 tuntia transfektion jälkeen, transfektion tehokkuus miR-esiaste tai inhibiittori NCI-H82 SCLC-soluja oli lähes 100% (kuvio S4). Korkea transfektion tehokkuus havaittiin myös NCI-H146, NCI-N592, GLC4, A549, ja NCI-H1299-soluja (tietoja ei esitetty). Havaitsimme suurempi kypsä miR-34a ilmentyminen transfektoiduissa soluissa miR-34a esiasteen ja alemman kypsä miR-34a ilmentyminen transfektoiduissa soluissa miR-34a-inhibiittori verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus esiasteen ja estäjän (kuvio 1A). Kun taas yli-ilmentymisen miR-34a indusoi G1 pidätetty useissa syöpäsolulinjoissa [8], G1 pidätys ei havaittu NCI-H82 SCLC solu transfektoidaan miR-34a esiaste (kuvio 1 B). Downregulation miR-34a NCI-H146-soluissa, jotka ilmensivät korkeampaa miR-34a verrattuna mediaani ilmentymistason 14 SCLC solulinjoja (taulukko S4) ja NCI-N592 soluja, jotka ilmaisivat alhaisempi miR -34a, ei vaikuttanut elinkelpoisuutta SCLC-soluja (kuvio 1C ja D). Toisin kuin yleisesti hyväksytty tuumorisuppressori vaikutus miR-34a, yliekspressio miR-34a NCI-82-solut eivät vaimentaa solun kasvua (kuvio 1 E), kun taas vaimennus solujen kasvun havaittiin NCI-H1299 NSCLC-soluja (kuvio S5 ), kuten osoitti aiemmassa raportissa [23]. Toisin Wiggins

et al.

Osoittaneet, että toistuvat transfektio ja pitkäaikainen inkubointi miR-34a vähenee NCI-H226 NSCLC syöpäsolun elinkelpoisuus [23], emme onnistuneet tarkkailla vaikutusta toistuva transfektion miR-34a pienentämiseen solujen elinkykyä NCI-N592 soluissa (kuvio 1 F).

(A) miR-34a ilmentymisen NCI-N592 solujen ja NCI-H82 transfektoitujen solujen miR-34a esiaste tai estäjä. Delta-delta-Ct-arvo on kalibroitu delta Ct-arvo miR34a transfektoiduissa soluissa ohjaus miR esiaste tai inhibiittori, vastaavasti. (B) Cell cycle jakelu NCI-H82 solu transfektoidaan ohjaus miR esiaste, miR-34a esiaste, hallita miR estäjä, ja miR-34a estäjä. (C ja D), Cell kasvun määrityksessä NCI-H146 (C) ja NCI-N592 (D), jotka on transfektoitu miR-34-estäjä tai ohjata miR estäjä. (E) solukasvumäärityksessä NCI-H82 transfektoitujen solujen miR-34a esiaste tai ohjata miR esiaste. (F) Solujen elävyys NCI-N592 solujen jälkeen toistuva transfektion ohjaus miR esiaste tai miR-34a esiaste. Solut laskettiin ja transfektoitiin uudelleen kolmen päivän välein. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan. p-arvot laskettiin solujen elinkelpoisuuden 5 päivää transfektion jälkeen, lukuun ottamatta mikroRNA esiaste NCI-N592 solu, joka laskettiin solujen määrä laskettiin 9 päivää sen jälkeen, kun ensimmäisen transfektion.

microRNA ilmaisu ei vaikuta lääkkeen herkkyyttä SCLC-solujen

testattiin ensin korrelaatio microRNA ilmaisun ja herkkyys 14 SCLC solulinjat sisplatiinin ja etoposidin. Ei ole yllättävää, herkkyyttä SCLC-solujen etoposidiksi korreloi herkkyys sisplatiinin (korrelaatiokerroin = 0,74, p = 0,004). Havaitsimme, että ilmentyminen 7 MikroRNA ei ollut yhteydessä kemosensitiivisyys SCLC-solujen joko agentti (taulukko 3).

Seuraava arvioida onko yliekspressio tai alisäätely miR-34a SCLC soluissa vaikuttaisi kemoterapian herkkyys, koska miR-34a ilmentyminen ilmoitettiin liittyvän kemoterapian resistenssin eturauhassyöpäsolulinja [25]. NCI-H82-soluissa, jotka kantavat hiljainen TP53 mutaatio (taulukko S4) transfektoitiin kontrolli miR esiaste, miR-34a esiaste, hallita miR estäjä ja miR-34a estäjä, ja sen jälkeen sisplatiinia tai etoposidin. IC

50 arvoihin sisplatiinihoitoon olivat 0,9 ± 0,02 uM, 1,19 ± 0,3 uM, 0,83 ± 0,15 uM, ja 0,79 ± 0,13 uM, vastaavasti (p = 0,1 yksisuuntaisella ANOVA) (kuvio 2A ja B). IC

50 arvoihin etoposidi hoito oli 0,28 ± 0,05 uM, 0,31 ± 0,04 uM, 0,54 ± 0,40 uM, ja 0,58 ± 0,07 uM, vastaavasti (p = 0,24) (kuvio 2C ja D). Sillä GLC4 soluja, jotka kantavat K132E mutaatio TP53-geenin (taulukko S4), IC

50 arvoihin sisplatiinihoitoon olivat 3,03 ± 0,87 uM, 2,56 ± 0,85 uM, 1,87 ± 0,30 uM, ja 1,92 ± 0,61 uM (p = 0,14) (kuvio S6A); IC

50 arvoihin etoposidi hoito oli 0,19 ± 0,03 uM, 0,28 ± 0,01 uM, 0,20 ± 0,03 uM, ja 0,19 ± 0,06 uM, vastaavasti (p = 0,08) (kuvio S6b). Yhteenvetona, ohimenevä yli-ilmentyminen tai alisäätely miR-34a SCLC-solut eivät vaikuta herkkyys sisplatiinin tai etoposidin, riippumatta TP53 tilan.

transfektoitiin ilmoitetuilla oligonukleotideja. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan määrityksissä kolmena kappaleena.

Expression of miR-34a kohdegeenien vaihtelevat eri syöpäsolulinjoissa

arvioitiin ilmentymisen valitun miR-34a kohde-geenien SCLC ja NSCLC solulinjoissa. Geenit valittu täyttyivät [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], ja AXL [27]. Havaitsimme käänteinen korrelaatio miR-34a ja c-MET mutta ei Bcl-2: n ilmentymisen 5 SCLC solulinjoissa (kuvio S7A ja B). Huolimatta suhteellisen alhainen miR-34a ilmentyminen SCLC solulinjoissa (kuvio S1), emme tarkkailla keskimääräistä suurempi c-MET ilmentyminen SCLC solulinjoissa kuin NSCLC solulinjoissa (kuvio S7A). Havaitsimme kuitenkin vähentynyt proteiinin ilmentymistä cMET A549 ja NCI-H1299 NSCLC solulinjat transfektoidaan miR-34a esiaste (kuvio 3A). Koska cMET ilmentyminen NCI-H82 oli havaittavissa, ektooppinen ilmentyminen miR-34a tai ohjaus esiasteita ei ollut vaikutusta cMET ilmaisun, odotetusti. Pieneneminen bcl-2-proteiinin ekspressio havaittiin NCI-N592 transfektoitujen solujen miR-34a esiaste (kuvio 3A). Koska vain MAP2K1 mutta ei MAP2K2 geeni on tavoite miR-34a, emme havaita alentunut proteiinin ilmentymisen MEK1 /2-soluissa, jotka on transfektoitu miR-34a esiaste; Tämä johtuu oletettavasti irtisanotuille roolit MAP2K1 ja 2. transfektio miR-34a esiaste vaimentua mRNA ilmentymisen AXL geenin A549- ja NCI-H1299 NSCLC-solujen yli 70% (muutos delta Ct yli 1,7), kun taas mRNA: n ilmentymisen AXL geenin NCI-H82 ja NCI-N592 SCLC-soluja oli liian alhainen, jotta voidaan havaita reaaliaikainen PCR-määritys (kuvio 3B). Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että ektooppinen ekspressio miR-34a voi alas-säädellä miR-34a kohde-geenejä soluissa, jotka ilmentävät tavoitteet.

(A) proteiini ilmentymistä miR-34a tavoitteet syöpäsolulinjoissa transfektoiduissa kanssa ohjaus esiaste (C) tai miR-34a esiaste (M). (B) mRNA ilmentymistä AXL geenin syöpäsolut transfektoitu ohjaus esiaste tai miR-34a esiaste. RNA kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Ekspression geenin NCI-H82 ja NCI-N592 solut olivat havaittavissa (UD).

Keskustelu

Tässä osoitti ekspressiota 7 tunnettuja syöpään liittyvien MikroRNA in SCLC kasvaimia ja solulinjoissa sekä NSCLC solulinjoissa. Havaitsimme, että ilmaus näiden MikroRNA oli liity kliinisiä ominaisuuksia ja tuloksista SCLC potilaista. Expression näistä MikroRNA oli liity herkkyyttä SCLC solujen sisplatiinin tai etoposidin. Lisäksi yli-ilmentyminen tai alisäätely miR-34a ei vaikuttanut SCLC solujen elinkelpoisuuden tai herkkyyttä sisplatiinin ja etoposidin. Olemme lisäksi havaittu, että ilmentyminen miR-34a kohdegeenien voivat vaihdella kesken SCLC ja NSCLC solulinjoissa.

Vaikka MikroRNA on laajalti tutkittu useissa syövän tyyppejä, on olemassa vain muutamia julkaisuja käsitellään rooli microRNA vuonna pahanlaatuinen käyttäytymistä SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko

et al.

Verrattuna microRNA ilmaisun välillä SCLC-solulinjat ja kasvaimen vapaa keuhkokudosanalyysin potilailla, joilla on krooninen keuhkoahtaumatauti [28]. Du

et al.

Vertasivat microRNA ekspressiokuviota välillä 9 SCLC ja 7 NSCLC solulinjat, ja yksi mesoteliooma solulinjaa [20], ja Guo

et al.

Verrattiin SCLC solulinja, NCI-H69, jossa sen doksorubisiiniresistenttejä sub-line [30]. Ranade

et al.

Ilmoitetaan vain tutkimuksen avulla SCLC Tuumorinäytteet [29]; 16 MikroRNA tutkittiin hengissä analyysi 25 potilasta, ja miR-92a-2 * todettiin mahdollisena huono ennustetekijöiden merkki.

Vaikka ilmaus 7 MikroRNA tutkimuksessamme arvioitiin monissa syövän tyypit

in vitro

,

in vivo

, ja kasvaimen yksilöt, niitä ei ole arvioitu ennen suhteessa potilaiden eloonjäämisen SCLC. Vaikka tutkimus on takautuva ja potilas kohortti on pieni, tämä on ylivoimaisesti suurin SCLC potilaan kohortin ja kokoelma SCLC solulinjojen tutkimiseksi microRNA ilmaus tässä kasvaimen tyyppi. Mukaisesti edellisessä raportti, posthoc analyysi suuren mahdollisille satunnaistetussa NSCLC [18], ilmentyminen 7 MikroRNA ollut ennustetekijöiden eivätkä ne korreloivat hoitoon tulos SCLC potilailla. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että MikroRNA muu kuin 7 MikroRNA esitetään tässä voivat olla tärkeitä SCLC, ja siksi lisätutkimuksia voi olla aiheellista SCLC arvioida ennusteen arvioinnissa on MikroRNA ei tutkittu tässä tutkimuksessa.

asennuspalveli- 34a on laajalti tutkittu tuumorisuppressoriproteiinia microRNA joka välittää apoptoosia, solusyklin pysähtymisen, lisäkasvun estäminen, vanhenemista, ja estämällä hyökkäyksen ja muuttoliikkeen eri syöpätyyppejä (tarkistettavaksi Hermeking

et al

. [31]). Kasvain vaimennin vaikutus miR-34a syöpäsolujen voi kuitenkin olla kasvain Tyyppikohtainen; kun taas miR-34a down-regulation kasvua IMR-90 fibroblastien [8] sekä useita NSCLC solulinjat [23], Li

et al.

osoitti, että yli-ilmentyminen miR-34a ei ole vaikutusta solujen lisääntymistä, solusyklin jakeluun, eikä apoptoosia maksasyövän solulinjassa [32], ja Pang

et al.

osoitti, että yli-ilmentyminen miR-34a ei ole vaikutusta proliferaatioon kohdunkaulan syövän solulinjojen Hela ja SiHa sekä choriocarcinoma solulinja JAR [33]. miR-34a on suora transkription kohteena p53 [8], ja mutaatiot TP53-geenin on todettu yli 75% SCLC yksilöiden [16]. Suuntaus suosii pienempi ilmentyminen miR-34a SCLC solulinjoissa verrattuna kasvaimettomina keuhkokudoksesta on havaittu aiemmin [28]. Suostumuksella löydämme että kohdunulkoinen miR-34a ilmaisua ei alas-säädellä solun kasvua tai aiheuttaa G1 pidätys, miR-34a ilmaisua ei korreloinut tautinsa (taulukko S1) ja etenemiseen (taulukko 2) on SCLC potilaista. Kiehtovan, kaikki SCLC solulinjat testattiin tässä tutkimuksessa ilmaistaan ​​alhainen cMET ja Axl, kaksi miR-34a kohdegeenien. On todennäköistä, että kasvua vaimentava vaikutus miR-34a voi olla kudos- ja tautikohtaista, sanelee mahdollisesti taso luontainen miR-34a kohde-geenin ilmentymistä, jossa solut, joilla on alhainen miR-34a kohde-geenin ilmentymistä, kuten SCLC-solujen, voi tehdä miR-34a toiminnallisesti voimaton.

Yhteenvetona ilmaus 7 syöpään liittyvien MikroRNA eivät korreloi kliinisten tulosten SCLC potilaista. miR-34a ilmentyvän myös eivät liity pahanlaatuiseen käyttäytymiseen SCLC syöpäsoluja ja se todennäköisesti olla ehdokkaana terapeuttinen kohde tähän tautiin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja etiikka selvitys

Kolmekymmentäyksi formaliinilla kiinteä, parafinoidut (FFPE) kasvain näytteet potilaalla, jotka faasin III tutkimuksessa Pohjois-Hollanti Oncology ryhmä [22] saatiin VU University Medical Center, Amsterdam, Alankomaat hyväksymisen jälkeen Institutional Review Board [22]. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikille osallistujille.

Solulinjat

Paneeli 14 SCLC ja 26 NSCLC solulinjat tutkittiin ja luetellaan Materials S1. Kaikki syövän solulinjoja ylläpidettiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), lukuun ottamatta NCI-H792, joka pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. TP53 geenimutaatio solulinjoissa määritettiin etsimällä p53 kotisivuilta (https://p53.free.fr/), IARC TP53 Database (https://www-p53.iarc.fr/), ja COSMIC tietokannan (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).

RNA

Kokonais-RNA uutettiin FFPE näytteitä RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation kit (Ambion, Austin, TX) ja kokonais-RNA solulinjoissa uutettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeiden.

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

Expression kypsä miRNA, mukaan lukien miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, ja anna-7a, arvioitiin qRT-PCR-analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu [18] . RNU6B snRNA käytettiin endogeenista ohjaus. Kukin microRNA-määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Expression of MikroRNA ilmoitettiin delta Ct arvo (Ct arvo RNU6B – Ct-arvo kohde microRNA). Me on määritelty ryhmien tuumorien tai solujen, joilla on korkea tai matala ilmentymisen perusteella mediaani ilmentymisen arvo kunkin mikroRNA.

Expression of Axl-geenin suoritettiin käyttäen Taqman-geenin ilmentymisen määritystä (Applied Biosystems), ja ilmoitettiin delta ct-arvo. GAPDH-geenin käytettiin endogeenista ohjaus.

transfektio mikroRNA esiaste tai inhibiittorit

miR-34a esiaste ja inhibiittoripastojen sekä Cy3-leimattua ohjaus miR esiaste ja estäjä ostettiin Ambion. Transfektio miR-esiaste tai inhibiittori suoritettiin käyttäen SIPORT ™

NeoFX

™ Transfection Agent (Ambion) ja noudattamalla valmistajan suosituksen lopulliseen oligonukleotidin konsentraatio on 30 nM.

Cell kasvun analyysi

vaikutuksen määrittämiseksi transfektion solun kasvuun, 5,000-10,000 transfektoitujen solujen ilmoitettu microRNA esiaste tai inhibiittori maljattiin 96-kuoppaisille levyille. Solukasvu määritettiin CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corp. Madison, WI) 24 tunnin välein 5 peräkkäisen päivän ajan. Tulokset esitettiin optinen tiheys (OD-arvo) absorbanssi 490 nm: ssä.

toistuvat transfectin ja N592 solun

100000 NCI-N592 SCLC-soluja maljattiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin miR -34a esiaste tai valvontaa esiaste. Solut kerättiin, laskettiin ja transfektoitiin uudelleen vastaavien miRNA 72 tunnin välein.

kasvun inhibitiomääritykset

Sisplatiini ja etoposidin saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). 10000-solut ympättiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille levyille, jotka oli transfektoitu osoitetun prekursorin tai inhibiittori MikroRNA, viljeltiin 24 tuntia, ennen kuin lisättiin eri pitoisuuksia sisplatiinin ja etoposidin, ja inkuboitiin vielä 72 tuntia. Sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinin ja etoposidin määritettiin CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Prosenttiosuus solujen elinkyky määritettiin jakamalla absorbanssiarvot käsiteltyjen solujen kuin käsittelemättömien solujen, ja pitoisuus sisplatiinin tai etoposidin johtaa 50%: kasvun esto (IC

50), määritettiin.

immunohistokemia tutkimus

immunohistokemia tutkimus p53 ja bcl-2 in SCLC kasvaimia tehtiin ja raportoitu aiemmin [22].

Western blot

NCI-N592 ja A549-soluja transfektoitu miR-34a esiaste tai ohjaus esiasteen inkuboitiin 48 tuntia. Solut kerättiin, lysaatit valmistettiin, ja Western blot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Vasta-aineet saatiin Sigma-Aldrich (aktiini), Santa Cruz Biotechnology Inc. (c-MET), Cell Signaling Technology (MEK1 /2), ja Dako (bcl-2). Intensiteetit c-MET ja Bcl-2 arvioitiin käyttäen GeneTools ohjelmistoa (SynGene), normalisoitu intensiteetti aktiini, ja kalibroitu ilmentymistason A549 ja NCI-H146 solu, vastaavasti.

Cell cycle analyysi virtaussytometrillä

48 tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin kylmällä 70%: sta etanolia PBS: ssa vähintään 24 tunnin ajan, ja leimattiin propidiumjodidilla ennen laskemista soluja. Värjäyksen jälkeen solut laskettiin FACScalibur käyttämällä CellQuest Pro -ohjelmistoa (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). Solusyklin fraktiot analysoitiin käyttämällä Modfit 3.0 ohjelmistoa.

In situ

hybridisaatio MikroRNA

In situ

hybridisaatio miR-34b on suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Nucleolar RNA U6 käytettiin positiivisena kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 17,0 (SPSS, Chicago, IL). Eloonjääminen laskettiin käyttäen Kaplan-Meier-menetelmää. Vertailu selviytymisen eri ryhmien määritettiin log-rank-testi. Erot microRNA ilmaisun ryhmien välillä analysoitiin Wilcoxonin Rank-Sum testi. Korrelaatio huumeiden herkkyyden ja microRNA ilmentyminen analysoitiin Spearmanin. Vertailu lääkeaineen herkkyys transfektoitujen solujen eri oligonukleotidien suoritettiin yksisuuntaisella varianssien (yksisuuntainen ANOVA). Kaikki p-arvot olivat kaksipuolinen ja p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentäminen MikroRNA vuonna SCLC versus NSCLC solulinjoissa. Epäsymmetrisesti Ct-arvo -15 osoittaa, että ilmentymisen mikroRNA solussa on liian alhainen, jotta voidaan havaita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s001

(TIF)

Kuva S2.

in situ

hybridisaation MikroRNA on SCLC kasvain. Nucleolar RNA U6 ja miR-34b todettiin käyttäen biotinyyli tyramide-pohjainen järjestelmä, jossa Vector NovaRed substraattina (ruskea). Yksilöiden ryntäily negatiivinen kontrolli ja miR-34b oli co-Mayerin hematoksyliinillä (sininen).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s002

(TIF) B Kuva S3.

korrelaatio p53 ja (A) miR-34a, (B) miR-34b, ja (C) miR-34c, ja (D) korrelaatiota ilmentymisen miR-34a ja bcl-2. P53- ja Bcl-2 esitettiin prosentteina värjättyjen solujen immunohistokemiallisesti. Korrelaatiokerroin (r) ja p-arvo määritettiin Spearman menetelmällä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s003

(TIF) B Kuva S4.

NCI-H82 solu transfektoitiin (A) Cy3-leimattua microRNA estäjä ja (B) Cy3-leimattua microRNA esiaste.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s004

(TIF) B Kuva S5.

solukasvumäärityksessä NCI-H1299 NSCLC transfektoitujen solujen miR-34a tai valvontaa esiaste. Virhepylväät viittaavat standardipoikkeamat.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s005

(TIF) B Kuva S6.

kasvun inhibitiotesti on GLC4 käsiteltyjen solujen (A) sisplatiini ja (B) etoposidia. Solut transfektoitiin ilmoitetuilla oligonukleotideja. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan määrityksissä kolmena kappaleena.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s006

(TIF) B Kuva S7.

Proteiinin ilmentyminen c-MET ja Bcl-2 in 5 SCLC ja 3 NSCLC solulinjoissa. (B) välinen korrelaatio miR-34a ja c-MET ilmentymisen sekä Bcl-2 in 5 SCLC solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s007

(TIF) B Taulukko S1.

MikroRNA ja kliinisen covariables.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s008

(DOC) B Taulukko S2.

vaikutus kliinisten covariables on ilman taudin etenemistä (PFS).

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s009

(DOC) B Taulukko S3.

vaikutus mikroRNA ilmaisun ilman taudin etenemistä (PFS, viikkoa) vuonna SCLC potilailla ositettu rajoitettu sairaus tai laajoja sairaus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s010

(DOC) B Taulukko S4.

TP53 tila ja miR-34a ilmentyminen SCLC solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s011

(DOC)

Materiaalit S1.

Cancer solulinjat.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s012

(DOC) B