Krooninen sairaus

tiivistelmä

Oikea-aikainen luonnehdinta syöpä evoluution tarvitaan ennustaa hoidon tehokkuuden ja havaita resistenssin aikaisin. Korkea pitoisuus analyysi yhden verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) mahdollistaa peräkkäinen luonnehdinta genotyyppisten, morfometrisen ja proteiinin ilmentyminen muutoksia reaaliajassa aikana syövän hoitoon. Tämä käsite tutkittiin potilaan kanssa kastraatiotason kestävä eturauhassyövän etenemässä sekä kemoterapiaa ja täsmähoitoihin. Tässä tapauksessa tutkimuksessa, me yhdistää yli neljä ajankohtina 41 genominlaajuisten kopioluvun vaihtelu (CNV) profiilit plus nikamaluhistumien parametrit ja androgeenireseptorin (AR) proteiinin tasot. Merkillistä, vähän muutosta havaittiin vastauksena tavanomaisen kemoterapian, osoittaa se, että ainutlaatuinen klooni (A), jolla erittäin jäsensi CNV profiileja ja AR + fenotyyppi havaittiin verenkierrossa ennen ja jälkeen hoidon. Kuitenkin kliininen vaste ja myöhempi edistyminen jälkeen täsmähoitoihin liittyi jyrkkä ehtyminen kloonin A seurasi peräkkäinen syntyminen kaksi erillistä CTC osapopulaatiosta jotka erosivat sekä AR genotyypin ja ilme fenotyypin. Vaikka AR- solujen tasainen tai pseudo-diploidi CNV profiileja (klooni B) tunnistettiin aikaan vasteen, uusi kasvain sukujuuret AR + solujen (klooni C) CNV muuttunut profiilien havaittiin aikana uusiutumisen. Osoitimme, että klooni C, vaikka liittyvät fylogeneettisesti kloonata, hallussaan ainutlaatuisia somaattisen CNV muutoksia, kuten

MYC

vahvistus, tapahtuma liittyy hormoni paeta. Mielenkiintoista, osoitimme, että molemmat kloonit hankittu

AR

geenimonistuman hyödyntämällä eri evoluution polkuja. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat aikataulua kasvaimen kehitys hoitovaste ja luoda puitteet monen mittakaavan analyysi nesteen koepaloja määrällisesti ja seurata taudin kehittyminen yksittäisillä potilailla.

Citation: Dago AE, Stepansky , Carlsson A, Luttgen M, Kendall J, Baslan T, et ai. (2014) Rapid Fenotyyppiset ja Perimän muutos vastaus Therapeutic Paine Eturauhassyöpä päätellä High Content Analysis of Single verenkierrossa olevia kasvainsoluja. PLoS ONE 9 (8): e101777. doi: 10,1371 /journal.pone.0101777

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 joulukuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 01 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Dago et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Award Number U54CA143906 National Cancer Institute. A. E. Dago on vastaanottaja PA-12-149- Research täydennykset edistää Diversity in Health-Related Research myönsi National Cancer Institute (NCI). A. Carlsson rahoitetaan Ruotsin tiedeneuvoston Dnr 2012-235. JH, JK, TB ja MW tuettiin erityisen apurahan Dr. Marilyn Simons syövän tutkimusta CSHL, joka on Breast Cancer Research Foundationin apurahan, ja tutkimuksen tuki Skyline Genomics. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Dr. Asya Stepansky Skyline Genomics ollut merkittävä rooli kehitettäessä protokolla eristämiseksi DNA HD-CTC soluissa ja suorittivat Illumina kirjaston valmistelut. Skyline Genomics taloudellisesti tukenut Illumina sekvenoinnilla Cold Spring Harbor Genome laitos osoituksena niiden valmiuksia tulevan palveluntarjoajan. Yhtiö ei ole roolia suunnittelussa kokeissa tai tietojen tulkintaa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja on ristiriitoja paljastaa. HD-CTC määritys tekniikka kuvataan tässä on lisensoitu Epic Sciences. ML, AK, KB ja PK on omistusosuuksia Epic Sciences. AS on työntekijä Skyline Genomics, ja oli merkittävä rooli kehitettäessä protokolla eristämiseksi DNA HD-CTC soluissa ja suorittivat Illumina kirjaston valmistelut. AS ei ollut mitään roolia suunnittelussa kokeissa tai tietojen tulkintaa. JH on perustaja ja osakas horisonttiin genomiikka. AED, AC, JK, TB, MW ja MEG ja ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

androgeenireseptorin-androgeenireseptorin (AR) signalointireitin on olennaista kehittymistä ja etenemistä eturauhasen syöpä ja se on keskeinen tavoite monien terapeuttisten aineiden [1]. Metastaattisessa eturauhassyöpä (PCA), androgeenien puute hoitoa (ADT), muodostaa kultakanta hoidon aiheuttavan kasvaimen taantumiseen tukahduttamalla AR aktivointia. Huolimatta ensimmäinen vastaus ADT, potilaat kehittävät usein resistenssin ja edetä kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC), parantumaton sairaus huonon ennusteen. Nämä potilaat hoidetaan usein salvage hormoni-hoitojen, mukaan lukien aineet, kuten ei-steroidiset anti-androgeenien ja androgeenin synteesin estäjät [1]. Hallinnoida näitä hoitoja, ennustamisessa hoitovasteen ja tunnistaa varhaiset viitteet hoidon kestävyys ovat suuria haasteita. Tasot prostataspesifisen antigeenin (PSA), androgeenien säätelemä proteiini mitattiin seerumissa, käytetään valvomaan terapeuttinen vaste CRPC potilailla, mutta sen ennustavan kykyä tässä potilasryhmässä on rajoitettu [2]. Lisäksi vaikka monet tutkimukset ovat tunnistettu molekyyli tapahtumia, jotka voivat myötävaikuttaa terapeuttiseen vastustuskykyä androgeenista kohdentamisaineita, on vaikea soveltaa näitä havaintoja johtuen vähäinen tarjonta peräkkäin hankittujen kudosten ja odotettu heterogeenisuus useita metastaattisen talletukset läsnä missä tahansa yksittäisen potilaan [3], [4]. Sinänsä menetelmät, joka antaisi ei-invasiivisia peräkkäisiä seurannan kautta kliininen hoitokuuri olisi valtava arvo kliinikoille.

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) on mahdollista saada aikaan ei-invasiivisia keinoin arvioidessaan progressiivinen syöpiä reaaliajassa hoidon aikana, ja edelleen, jotta suora hoito seuraamalla fenotyyppiset fysiologisia ja geneettisiä muutoksia, jotka tapahtuvat hoitovastetta. Useimmilla CRPC potilailla, primaarikasvaimen on poistettu, ja CTC odotetaan koostuvat solujen irtoa etäpesäkkeitä, joka tarjoaa ”nesteen koepala”. Tällä hetkellä ainoa tapa hyväksytty CTC luettelointi (CellSearch, Veridex) perustuu immuunijärjestelmän rikastamiseen lähestymistapa, esivalitsee ilmentävien solujen epiteelikasvaimet adheesiomolekyyliin (EpCAM), epiteelin solunpintamarkkeria [5]. Vaikka numeerinen määrällisesti CTC käyttää CellSearch on tuottanut joitakin varoituksia syntymässä olevista tietyissä syövissä [6] – [8], tätä menetelmää on rajoituksia, kuten alhainen herkkyys (solut, joilla on alhainen tai poissa EpCAM ilmaisua ei kerätä) ja käy säännöllisesti /saastuminen genomisesti normaalin leukosyyttien näytteen valmistus, joka vaikeuttaa entisestään molekulaarinen ja tietojen tulkinta. Äskettäin genomista muutokset perustuvat array CGH ja rajoitettu sekvensointi on raportoitu CTC eristettiin CellSearch järjestelmän [9]. Yksityiskohtainen analyysi pariksi kasvaimia ja etäpesäkkeitä (n = 2) ja CTC (n = 8) ehdotti, että useimmat mutaatiot havaitaan CTC olivat läsnä matalan tason primaarikasvaimen [9]. Kuitenkin, koska yksi ajankohta aikana kliinisen taudin kulun tutkittiin tässä tutkimuksessa ei käsitellä sitä, kuinka kasvain voi vastata ja kehittyä terapeuttinen painetta.

Tässä osoitamme voiman kaksi hiljattain kehitetty teknologioita tarjota kattavampi muotokuva molekyylitason muutoksiin, yksisoluvaiheessa taso, joka CRPC potilaan alla hoitopaine sekä ADT ja kemoterapia asetukset. High Definition-CTC (HD-CTC) menetelmää käytettiin pituussuuntaisen tunnistamista ja luettelointi CTC [10] ja aasit ekspressiota varten AR [11]. Määritys työllistää puolueeton protokolla tutkia ja erottaa CTC keskuudessa ympäröivään leukosyyttien perustuu niiden sytokeratiini positiivinen (CK +) fenotyyppi käyttämällä korkean resoluution immunofluoresenssimenetelmällä kuvantaminen. Lisäksi HD-CTC-tekniikkaa säilyttää solujen morfologia siten, että mahdollistaa morfometrisen ja epäsuoran kvantifioinnin AR ja CK-proteiinin ekspressiotasoja kaikista CTC tunnistetut verinäytteessä. Edelleen karakterisoimiseksi kunkin CTC protokolla kehitettiin talteen yksittäisten solujen olosuhteissa, jotka sopivat myöhempää genomisen analyysin muunnosta yhden ytimen sekvensointi, jonka ovat kuvanneet Navin,

et al.

[12] ja Baslan,

et ai.

[13]. Yhdistetty mahdollistamat keinot jäljittää ajan molekyylitason muutokset CTC väestön korreloimalla nikamaluhistumien ja proteiinin ilmentyminen tietoja genomin laaja CNV muutoksia kullekin 41 yksittäisen CTC eristetty neljä kliinisesti merkittäviä ajankohtina. Pystyimme yhdistämään syntymistä erillisten CTC osapopulaatioiden varustettuja erityisiä molekyyli muutoksia kliinisen taudin kulun varsinkin aikana kohdennettujen ADT, joka oli kliinisesti edustaa lyhyen ajanjakson vasteen seurasi vastustuskyky ja kliinisen paeta.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaan kliininen historia ja verinäytteet Kerätyt aikana hoito

tutkimus hyväksyi Institutional Review board (IRB) ja University of Southern California Kattava Cancer Center. Potilas säädetty kirjallinen lupa.

Potilaalla PCA metastaattinen joka lannenikamaa diagnoosin, jonka ensisijainen koepala edustaa ensimmäisen näytteen tässä tutkimuksessa. Alustava käsittely koostui androgeenideprivaatio terapian (leuprolidiasetaatti). Kun 5 kuukautta, oli kliininen eteneminen CRPC ja potilas oli kirjoilla kliinisessä tutkimuksessa doketakselin yhdistettynä bevasitsumabin ja everolimuusi (clinicaltrials.gov tunniste: NCT00574769). Ennen kemoterapiaa aloitettiin, perustason verta piirtää otettiin (Draw 1) mukaisesti näytekokoelmatodistuksen protokollaa. Kliiniset etenemistä todettiin kuluttua 4 kuukauden protokollan määrittelemän kemoterapiaa. Seuraavien 3 kuukautta, lisäannos doketakselin sekä ulkoinen-palkki sädehoidon ja samarium (

153Sm) Lexidronam (luun kohdistamisen radiofarmaseuttiset) oli rajoitettu lievittävä hyötyä. 12 kuukauden kuluttua diagnoosin, hoidon abirateronin asetaatti, korkeasti selektiivisiä androgeenireseptorin inhibiittorin aloitettiin. Verta otettiin ennen aloittamista abirateronin (Draw 2), 3 viikon jatkuvan hoidon samaan aikaan kliinisen vasteen edustaa vähentää kipuja ja PSA (Draw 3), ja 9 viikon samaan aikaan kliinisen etenemisen edustaa lisäämällä kipu ja PSA-arvot (Draw 4). Sen jälkeen abirateronin, hoito muutettiin kabatsitakseli ilman kliinisen vasteen seuraa nopea kliinisen tilan heikentyminen. Potilas kuoli laajalti metastaattisen eturauhassyövän 4 kuukauden Draw 4 (17 kuukautta diagnoosin).

Veren Näytteenotto ja käsittely CTC Detection

Potilaan ääreisveren kerättiin erään IRB hyväksytty protokolla. Näytteet lähetettiin laboratoriossamme ja käsitellä 24 tunnin ajan jälkeen piirtää. Näytteen valmistus on kuvattu aikaisemmin [10]. Lyhyesti, se koostuu punasolujen hajoamiseen seuraa pinnoitus tumallisten solujen yhtenä kerroksena on mittatilaustyönä solun tarttumista objektilasille seuraa varastointiin biorepository. Kukin näyte on tuotettu vähintään 14 itsenäistä diat CTC tunnistamiseen ja luonnehdintaan.

Immunofluoresenssivärjäys ja CTC Enumeration

Tässä tutkimuksessa käytimme protokolla perustuu julkaistun HD-CTC määrityksessä yhdistettynä arviointi of androgeenireseptorin (AR) asema sytokeratiini (CK) positiivinen CTC väestöstä [11]. Lyhyesti, solut leimattiin käyttäen hiiren monoklonaalista sytokeratiini 19 (1:100, Dako) ja panCK (1:100; Sigma) primaaristen vasta-aineiden tunnistamiseksi sytokeratiini (CK) positiivisia soluja. AR positiivinen HD-CTC tunnistettiin käyttäen kanin anti-AR monoklonaalinen vasta-aine (1:250, Cell Signaling Technology). Sekä CK ja AR antigeenejä visualisoitiin käyttäen AlexaFluor sekundäärisiä vasta-aineita; CK ensisijainen vasta-aineet tunnustettu Alexa Fluor 555 IgG1 sekundaarista vasta-ainetta (1:500, Invitrogen) ja kaniinin AR vasta-aine tunnustettu Alexa Fluor 488 IgG (H + L) sekundaarista vasta-ainetta (1:1000, Invitrogen). Alexa Fluor 647 konjugoitu anti-CD45 (1:125; ABD Serotec) primaarisena vasta-aineena käytettiin tunnistamaan leukosyyttien kuin syrjäytyminen merkki. Sen vahvistamiseksi, että solut ovat kidealkioita ja jotta analyysi ydinvoiman morfologia kaikki solut värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI).

Levyt kuvaamisen ja oletettua CTC kirjattiin tietokoneohjattua suuren läpimenon fluoresenssimikroskooppiin 10-kertainen suurennus. CTC tunnistettiin hematologian teknikko käyttämällä aiemmin julkaistu kriteerit, joiden DAPI + ydin plus sytokeratiinia positiivisuus ja CD45 kielteisyys [10]. Androgeenireseptorin proteiinin ilmentymiseen ja lokalisointi arvioitiin käyttäen kahta kriteeriä (1) läsnäolo (AR

+) tai poissa (AR

-) AR värjäystä, ja (2) Ar solunosasijaintia (ydin- AR vs. sytoplasmista värjäytymistä tai molempia ). Kynnys AR positiivisuus määriteltiin signaali yli 6 standardipoikkeamaa yli keskimääräisen signaalin voimakkuuden (SDOM) havaittu ympäristössä leukosyyttien (tausta). Solunosasijaintia mitattiin käyttämällä suhteellinen Pikselitiheys AR värjäystä yli tumaan ja sytoplasmaan.

HD-CTC Toistettavuus määrityksen

HD-CTC määritys teknisesti validoitu solulinjan tippakokeilla päästä R

2 = 0,9997 on lineaarisuus testausta aiemmin raportoitu. Nämä kokeet suoritettiin käyttäen SK-BR-3-solulinjojen ja 0-3 x 10

2 solua ml normaalia luovuttajan valvonnan verta. Variaatiokerroin on 16% ja prosessorien välisen korrelaation on R

2 = 0,979. Näytteen valmistus prosessi kiinni vakiotoimintamenettelyt potilasnäytteillä kautta baari koodattu järjestelmä kaikkia tarvikkeita ja välineitä. Kaikki off-the-shelf instrumentointi kalibroitiin mukaan teknisten validointi protokollien aikana todetut käyttöönoton [14].

Extraction yksittäisten solujen

vakiomenettelynä, joilla pyritään minimoimaan DNA: n fragmentoituminen soluja poimittiin kuluessa 5 päivää alkuperäisen värjäyksen menettelyn. Kokeellinen protokolla HD-CTC neste vaihe kaapata jaettiin kolmen erillisen peräkkäiset vaiheet: (1) CTC siirtäminen, (2) solujen louhintaan ja (3) eristäminen ja manipulointia yhden CTC alavirran molekyyli- analyysejä.

HD-CTC siirrettiin (vaihe 1) käyttäen muunnosmatriisi alkuperäisestä tiedonkeruu HD-CTC tunnistaminen. Kalibroinnin jälkeen ja siirtäminen, jokainen ehdokas solu uudelleen kuvattiin 40 × resoluutio yksityiskohtaista morfometristä analyysia. Solun louhinta (vaihe 2) Eppendorf Transfer Man NK2 mikromanipulaattorin käytettiin kaapata solun kiinnostava sisällä 25 ° rosoinen mikropipetin (Piezo Drill Tip ES, Eppendorf) soveltamalla nesteen imu. Kun solulle on kiinni sisällä mikropipetin (vaihe 3), solun huuhdeltiin PBS: llä ja talletetaan sisällä 0,2 ml PCR-putkeen, joka sisälsi 2 ui lyysipuskuria (200 mM KOH, 50 mM DTT). Sitten näyte ja pakastettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes se jatkokäsiteltiin. Kaikki välineet ja tarvikkeet oli puhdistettava käyttäen DNAase ratkaisu ja UV-valolle altistuksen 30 minuuttia ennen koetta.

Yhden Cell Next Generation Sequencing ja bioinformatiikka- Analysis

solu, joka sisältää Ampullit siirrettiin kuivajäätä sekvensointia laboratorioon. Lyhyesti, hajotettiin solujen seos sulatettiin ja alistettiin WGA ja sekvensointi kirjaston rakentaminen, kuten aiemmin on raportoitu [13]. WGA suoritettiin manuaalisesti 96-kuoppalevyformaatissa käyttäen WGA4 Genomeplex Single Cell kaikkiaan Genome Amplification Kit (Sigma-Aldrich), jota seurasi puhdistus käyttämällä QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen). Pitoisuus eluoitua DNA mitattiin käyttämällä Nanodrop 8000 (Thermo Scientific). Jokaista hyvin, vahvistusta pidettiin onnistuneena, jos saatu DNA-pitoisuus oli ≥70 ng /ul (eluointi 50 ui), jota seurasi edelleen Quality Control (QC) vahvistaa sopivan näytteen kokojakauma käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (High herkkyys DNA Assay ja Kit, Agilent Technologies).

lisäksi yksityiskohtainen analysoinnissa käytettyjen menetelmien sekvenointitulosten julkaistiin äskettäin ryhmämme [13]. Lyhyesti, tietojenkäsittelyjärjestelmillä käsittää kolme vaihetta: ensin, vittämällä järjestyksessä lukee perustuu viivakoodien toiseksi, kartoitus lukee ihmisen genomiin (hg19, Genome Reference Consortium GRCh37, UCSC Genome Browser tietokanta) [15], ja poistamalla PCR kaksoiskappaleet; ja kolmanneksi, normalisoi ja guaniini-sytosiini (GC) sisältö ja arvioimalla kopioluvun avulla CBS segmentointialgoritmi. Kopiomäärä profiileja tässä katsauksessa perustuvat 20000 vaihteleva pituus genomin siiloissa, keskimäärin pituus ~150 kilo-emäsparia kumpikin, ja laskettiin suhde verrattuna normaaliin (hg 19). Tiedot ilmoitetaan tässä mediaani oli lasken 1780000 ainutlaatuisen kartoituksen lukee, joiden välillä 244190 (minimi sulku 200000) ja 5.330.000.

Cluster Analysis

hierarkkinen klusterointi suoritettiin R [16] käyttämällä heatmap.2 toiminto gplots pakkauksessa. Wardin menetelmällä euklidinen etäisyys metristä käytettiin klusterointi. Heatmap värjäytyy mukaisesti cutoffs edellä kuvatun ja klustereiden suoritettiin käyttäen mediaani keskitetty tietojen.

Frequency Analysis Määritä Perimän muutostyöt

Käyttämällä mediaani keskitetty CNV profiilit, sulku suhteet vs. mediaani 0,8 ja 1,25 käytettiin määrittämään poistot ja monistuksia, vastaavasti. Näitä cutoffs käytettiin sekä värittää heatmap ja tehdä taajuus analyysi.

Tilastot ja Solumorfologia Analysis

Solu muoto (

solu pyöreys

) analysoitiin jäljitys solun solulimassa rata yhdistelmäkuvaan kunkin CTC. Merkitystä solu kuva tuotiin R, ja kolme pistettä sovitettiin muotoon käyttäen pienimmän neliösumman algoritmia kuvanneet Halir ja Flusser [17]. Algoritmi tuottaa solun pääakseli, joka on suurin säde asennettu kolme pistettä (katso olevat tiedot). Solu pyöreys (

c

) on arvioitu osa

de facto

solun alueella (

) ja ala ympyrän säde (

r

) asettaa solun pääakselia.

p-arvo käytetään vertailun pyöreys välillä CTC Draw 3 ja 4 laskettiin käyttäen Wilcoxonin summaa-rank-testiä.

tulokset ja keskustelu

hoitovasteen valvoma Longitudinal CTC Molecular Analysis

jotta voidaan arvioida potilaan hoitovasteen korkea pitoisuus yksisoluisia analyysi mukaan lukien: (1) AR proteiinin ekspression fenotyyppi , (2) AR solunosasijaintia ja (3) CNV genomista profilointi tehtiin vuonna CTC yksilöity verinäytteistä neljällä eri väliajoin edustaa päätöksentekoajankohdat standardin huolta CRPC lukien: (Draw 1) välittömästi ennen aloittamista doketakselin kemoterapian, (Draw 2) välittömästi ennen abirateronin asetaattia (korkeasti selektiivisiä androgeenireseptorin synteesi estäjä), (Draw 3) kolmen viikon kuluttua, ja (Draw 4) yhdeksän viikon jatkuvan abirateronin hoitoa. Erityiset tiedot kaikista profiloitu solut on esitetty tietoja. Lisäksi, samanlainen sekvensointi perustuvaa menetelmää käytettiin saamiseksi CNV profiilin yhden metastaattisen sivuston potilaasta käyttäen luubiopsian otettu diagnoosin aikana (5 kuukautta ennen kiinnittää 1) ennen minkään syövän terapiaan. Kuten kuviossa 1A, ja aikana 7 kuukauden ajaksi kiinnittää 1 ja 2, potilas osoitti ensimmäisen vastauksen doketakselia kemoterapiaan seuraa vastus. Samalla potilaan neste biopsia osoitti tasaisessa suhteessa AR

+ ja AR

– osapopulaatioiden kun kokonaismäärä CTC väheni (kuvio 1A, 1D, kuviossa S1 ja taulukko S1).

( A) yhteenlaskettu HD-CTC laskee, mukaan lukien määrä fenotyypiltään erillisiä AR

+ ja AR

– soluja, määritettiin kullekin veren Tasapeli kerättyjen hoitotoimenpiteitä. CTC määriteltiin AR positiivinen, jos AR-signaali voimakkuus oli suurempi kuin kuusi standardipoikkeamaa yli keskiarvon (SDOM) ympäröivän leukosyyttien (tausta). Palkki-kuvaaja näyttää muutoksen jakautuminen AR

+ ja AR

– CTC osapopulaatioiden pitkin hoitokuurin merkitty punaisella ja sinisellä vastaavasti, ja numerot on esitetty kunkin pylvään yläpuolella. (B) PSA-pitoisuus mitattiin kunkin hoidon aikapisteessä. (C) Boxplot solun pyöreys kunkin CTC tunnistettu useissa eri kohtelu ajankohtina. (D) edustaja 40 × immunofluoresenssimenetelmällä kuvia AR

+ ja AR

– HD-CTC alapopulaatioiden yksilöity kussakin käsittelyssä ajan-. Immunofluoresenssikoe kanavat ovat värillisiä seuraavasti: ydin: blue; sytokeratiinia: punainen; AR: valkoinen; ja CD45: vihreä. AR fenotyypin on osoitettu vasemmassa alakulmassa kunkin kuvan. Kaikki kuvaajat muodostettiin käyttäen ggplot2 ja RGL paketteja R.

genominen CNV profiilit CK

+ solujen kiinnittää 1 ja 2 olivat kaksi (kuviot 2 ja S2). Kolme näistä soluista olivat negatiivisia AR ilmaisun (CK

+ AR

-), kun taas enemmistö (16/19) osoitti korkeita AR proteiinin (CK

+ AR

+). Yksi AR

– ja yksi AR

+ solu oli lähes normaali CNV profiilit verrattavissa saatu yhden CK

-CD45

+ valkosoluja (kuva 2). Kaikki muut CK

+ AR

+ solut osoittivat monimutkainen kuvio genomi uudelleenjärjestelyjä, jotka olivat samanlaisia ​​kuin genomisen profiilin saatu takautuvasti potilaan luumetastaasipotilailla (hormoni naiivi kudosnäyte) hankittu diagnoosi (Kuva 2 ja Kuva 3A) . CK + AR + solujen ja luumetastaasipotilailla näyte jaettu useita voittoja ja tappioita kromosomi käsivarret plus ominaisuus polttoväli vahvistus on 3p13 keskitettynä fosfataasin säätelyalayksikön PPP4R2 ja joka sisältää vähintään kaksi geenit syövässä, FoxP1 [18], [19] ja MITF [20] (kuvio 2). Tasolle resoluutio käytettävissä, kukin jaettu tapahtumista oli identtiset genomista breakpoints ja hierarkkinen klusterointi analyysi AR

+ solujen piirtää 1 ja 2 ryhmittyneet yhdessä luumetastaasipotilailla (Cluster A kuviossa 3A). Tästä näyttöä, päättelemme, että nämä solut ovat

bona fide

CTC peräisin potilaan metastaattista linjaa. Huolimatta selkeä linjaa suhde, AR

+ verisolujen poikkesi etäpesäke on AR lokuksessa, joka osoittaa monikopiovektoria monistamiseen eri segmentit Xq12 sisältävä AR-geenin itsensä. AR vahvistus on yleistä CRPC, ja on yhdistetty etenemiseen kastraation herkkä eturauhasen syövän CRPC [21]. On huomionarvoista, että jokainen AR monistukset (kuvio 3C) ovat ainutlaatuisia, jotka johtuvat useista eri raja-arvot kummallakin puolella AR-geenin, mikä osoittaa, että AR-monistus syntynyt useita itsenäisiä kertoja (konvergentti evoluutio) todennäköisesti seurauksena valikoivan paineen asettamat androgen vajaushoidon.

Kopioi numero vaihtelu profiileja potilaan luuhun etäpesäke; kontrollina yksi WBC; ja yhden CTC kustakin neljästä hoidon aikapisteissä on esitetty. Vastaava fluoresoiva kuva kennon käytetään tuottamaan CNV profiili on esitetty oikealla. Asiaankuuluvat genomista muutoksia ja niiden kromosomin lokalisoinneissa esiintyy kunkin erityisen piirtää on merkitty vaaleansinisellä baareja.

(A) Kolme eri klonaalisen suvusta, edustettuina Cluster A, B ja C, tunnistettiin perustuen vertailu 41 yhden solun CNV profiileja valvomattoman hierarkkinen klusterointi. Veren piirtää, josta jokainen solu eristettiin on merkitty Draw 1: keltainen; Draw 2: oranssi; Draw 3: violetti; ja Draw 4: musta. Vertailukohtana, luun etäpesäke FFPE kudos sisällytettiin puun värillinen vihreä. Alla puu, lämpökarttana ilmaisee liitetyt (punainen) ja deleetiot (sininen) koko genomin kunkin yksittäisen solun. (B) Frequency genomista monistukset ja poistot kolmessa klustereita tunnistettu. Alueet ainutlaatuisesti vahvistetaan (punainen) tai poistetaan (sininen) klusterin A ja C on korostettu. (C) yksityiskohta käyrä AR vahvistus tapahtuma värillinen kohden piirtää kunkin klusterin näkyy.

Draw 3, kolmen viikon abirateronin asetaatti hoitoa, potilaan näkyy selkeä kliininen vaste kuin määritelty lasku PSA ja kipu (kuvio 1 B). Tämä vastaus samaan aikaan äkillinen muutos CTC fenotyyppien ja genotyyppien. Vaikka absoluuttinen määrä CTC Draw 3 oli verrattavissa Draw 2, oli lähes täydellinen ehtyminen AR

+ CTC väestöstä (kuvio 1A). CK

+ solujen tunnistettu Draw 3 ilmaisi vähän tai ei lainkaan AR proteiinia ja myös erosivat morfologisesti näyttäessään huomattavasti enemmän pitkänomainen kuin AR

+ solujen kiinnittää 1 ja 2 (kuva S1 ja taulukko S1). Tämä elimellisen muutoksen heijastuu pieneneminen mediaani solussa pyöreys (kuva S3) 0,87 (sd = 0,14) in Draw 1 ja 2 0,62 (sd = 0,15) Draw 3, p 10

-11 Wilcoxonin -sum testi (kuvio 1 C).

selvää vaikutusta hoidon näkyi myös genomisessa analyysiin Draw 3 missä muuttuneita fenotyyppisistä korreloi selvästi genomisen profiileja. Suurin osa (10/12) fenotyyppisesti AR

– soluja Draw 3 ei monistettiin AR ja näytteillä normaalisti tai lähes normaali (pseudodiploid) profiilit (kuva S2) asettamalla ne Cluster B kuvioissa 3A. Toinen kahdesta AR

– soluja tästä ajankohta oli CNV allekirjoitus tyypillistä Cluster lukien monistaminen AR, kun taas toinen liittyy kolmannen klusterin (Cluster C kuviossa 3A), hallitsee soluja myöhemmin aikapisteessä ( Draw 4). Missensemutaatioita vaikuttaa AR proteiinin vakauteen ja /tai nonsense mutaatioita AR geeni voisi selittää AR fenotyyppi-genotyypin erot kahdessa viimeisessä solua. Me tulkita, että ensimmäisen vastauksen abirateronin asetaatti merkittävästi tyhjentynyt androgeeniriippuvaisen AR

+ väestö, ja että toinen AR

– väestö hallitsi pseudodiploid soluja oli läsnä liikkeessä. Perustuen solujen kokonaismäärään, oleskelevat vakiona välillä piirtää 2 ja 3, päättelemme, että Draw 3 väestö on seurausta syöpä, mutta lähteestä ulkopuolella tärkeimmät kasvaimen sukuperää (kuvio 3A).

Draw 4. kerättiin pisteen kliinisen etenemisen, kun PSA-pitoisuudet kasvoivat 9 viikon kuluttua siitä abirateronin (kuvio 1 B). Tässä vaiheessa, CTC count oli laskenut 47% edellisen aikapisteessä, mutta oli jälleen tapahtunut huomattava fenotyyppisen muutos, koska suurin osa CTC olivat jälleen AR

+ kanssa solun Pyöreysarvo 0,81 tyypillistä solujen ensimmäisestä kaksi tasapeliä (kuvio 1C ja kuvio S1). Tämä havainto, mielikuvan kyseessä hoidon vasteen ja CTC fenotyypin pikemminkin kuin koko CTC count, on yhdenmukainen Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa, jossa ilmaus kaksi merkkiaineita AR signalointireitille päällä CTC seurattiin vastauksena androgeenin terapiasta [ ,,,0],22].

Muutokset hoitovaste oli jälleen nähtävissä genomitasolla, kuten (6/10) solut muodostivat enemmistön uuden, ilmeisesti klonaalinen, subpopulaatio (Cluster C kuvioissa 3A ja S2). CNV allekirjoitukset Cluster C ovat selvästi alkuperäisessä sukujuuret, menee takaisin luumetastaasipotilailla näytteet ennen systeemistä hoitoa, mutta on nyt ominaista toiminnallisesti merkittäviä tapahtumia kuten kapea amplikonin sisältävän MYC, ja häviäminen FOXP1 /MITF amplikoni yhdessä muiden erojen huomattava kuvioissa 2, 3A ja 3B. MYC vahvistus on yksi yleisimmistä muutoksia havaittiin etäpesäkkeitä, ja on ehdotettu olevan ohitus mekanismi AR riippumaton vastuksen [23]. Mielenkiintoista tutkia tarkemmin Genomisen AR vahvistus (hahmoteltu kuvio 3C) osoittaa, että toisin kuin heterogeeninen vahvistus rajoja havaittu aikaisemmissa soluissa (cluster A), solut klusterin C näytteille yhden profiilin muoto, jossa on lähes yhtenäinen raja-arvot ja merkittävästi korkeampi AR vahvistusta. Yhdessä genomisen tekijät viittaavat siihen, että Cluster C solut edustavat uutta linjaa, ilmeisesti kestävät abirateronin asetaattia, ja tuotetaan ehkä yhdestä kestävä solu.

Lisäksi morfometrisiin analyysi AR solunosasijaintia osoitti AR oli yleensä tumassa solujen kiinnittää 1 ja 2, mutta todettiin huomattavasti vähemmän lokalisoitu tumaan vuonna CTC eristetty Draw 4 kerättiin etenemiseen (p = 0.00017 Wilcoxonin-sum test) (kuva 4). Tämä havainto on erityisen mielenkiintoinen, kun otetaan huomioon viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että ligandi riippumaton AR silmukointivarianteista saattaa välittää abirateronin resistenssin ihmisen CRPC ksenograftimallia [24], ja että nämä katkaistu ja konstitutiivisesti aktiivisia muotoja AR havaitaan tumassa sekä sytoplasmassa eturauhassyövässä solulinjoissa [25].

(A) vertailu AR solunosasijaintia että CTC tunnistettu veressä ennen ja yhdeksän viikon abirateronin hoidon. Korrelaatio AR ja DAPI signaalit solussa on osoitus AR on colocalized DAPI,

so.

Lokalisoitu solun tumassa. Korkea korrelaatio oli yleisesti nähty abirateronin hoitoa, mutta siirtyminen vähemmän tumaväriä havaittiin yhdeksän viikon hoidon (p = 0.00017, Wilcoxonin sum-rank-testi). (B) ja (D) korkeus kartat rakennettu pikseli intensiteetit CK (punainen), AR (vihreä) ja DAPI (sininen) edustavaa CTC havainnollistamaan solunosasijaintia AR. Solu (B) eristettiin ennen abirateronin aloittamista ja näyttää AR värjäämällä rajoittuu tumaan, kun taas sytoplasminen AR värjäytymistä havaittiin CTC tunnistettu aikaan terapeuttisen uusiutumisen (D). (C) ja (E) Pinta-AR versus DAPI-signaalin intensiteetit kunkin pikselin sisälle soluun 40 x kuvia CTC (B) ja (D), tässä järjestyksessä. Jokainen tontti piste värittää vastaava CK-signaalin voimakkuuden. Nuclear lokalisointi havaittiin positiivinen korrelaatio kaksi intensiteettiä (C), ja ydinvoiman syrjäytymisen negatiivinen korrelaatio (E). phenotype-genotype.

doi:10.1371/journal.pone.0101777.s004

(DOCX)

Acknowledgments

We