Krooninen sairaus

tiivistelmä

syklinen AMP (cAMP) estää proliferaatiota useita syöpäsoluja. Olemme aiemmin raportoitu antiproliferatiivinen vaikutus PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (8-PIP-cAMP ja 8-HA-cAMP) kahdella ihmisen syöpäsolujen linjat eri alkuperää. 8-Cl-cAMP, toinen cAMP analoginen, joilla tiedetään olevan antiproliferatiivisia ominaisuuksia, on tutkittu mahdollisena syöpälääkkeen. Tässä vertasimme antiproliferatiivista vaikutusta 8-Cl-cAMP, ja PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja kolmella ihmisen syöpäsolulinjoissa (ARO, NPA ja WRO). 8-Cl-cAMP, ja PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja oli samalla voimakas antiproliferatiivinen vaikutus BRAF-positiivisia ARO ja NPA-soluja, mutta ei BRAF-negatiivinen WRO soluja, joissa vain 8-Cl-cAMP johdonmukaisesti esti solukasvun . Vaikka hoito PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja liittyi kasvun pysähtymisen, 8-CI-cAMP aiheuttamaa apoptoosia. Tutkimiseksi edelleen toimia 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, analysoitiin niiden vaikutukset signalointireiteissä osallisena solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Mielenkiintoista, PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, mutta ei 8-CI-cAMP, inhiboitu ERK fosforylaatio, kun taas 8-CI-cAMP yksin aiheuttama progressiivinen fosforylaation p38 mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK), aktivoimalla AMPK by sen metaboliitin 8-CI-adenosiini. Tärkeää on, että pro-apoptoottinen vaikutus 8-Cl-cAMP voitaisiin estää suureksi osaksi farmakologinen inhibitio p38-MAPK. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että 8-Cl-cAMP, ja PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja, vaikka vertailukelpoisia antiproliferatiivinen teho, toimivat erilaisten mekanismien kautta. PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja aiheuttaa kasvun pysähtymistä soluissa kuljettavat BRAF onkogeeni, kun taas 8-Cl-cAMP apoptoosin, ilmeisesti aktivoimalla p38 MAPK-reitin.

Citation: Lucchi S, Calebiro D, de Filippis T, Grassi ES, Borghi MO, persani L (2011) 8-kloori-syklinen AMP ja proteiinikinaasi A I-Selective Syklisen AMP analogit syöpäsolun kasvun estoon erilaisten mekanismien kautta. PLoS ONE 6 (6): e20785. doi: 10,1371 /journal.pone.0020785

Toimittaja: Andrew D. Badley, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 tammikuu 2011; Hyväksytty: 09 toukokuu 2011; Julkaistu: 10 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Lucchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ oli osittain tukevat tutkimusta varat Istituto Auxologico Italiano. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syklinen AMP (cAMP) on ikivanha ja arjen kemiallinen messenger, on löydetty sekä prokaryooteissa ja eukaryooteissa. Selkärankaisilla se on tärkeä solunsisäinen välittäjäaine välittäjäaineiden ja hormonien ja säätelee olennaista solujen toimintoja, kuten supistuminen, eritys ja replikointi. Vaikka cAMP on antiproliferatiivinen vaikutus useimmissa solutyypeissä, se tarjoaa päinvastainen, eli pro-mitoosi, kannustin neuronien ja useita soluja hormonaalisten alkuperästä [1], [2]. Ei ole yllättävää sitten, geenit koodaavat keskeisiä elementtejä cAMP-reitin toimivat onkogeenien tai oncosuppressors, useimmat kauniisti vuonna endokriinisoluissa [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Lisäksi säätelyyn ylöspäin tyypin I isoformien cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin A (PKA) on dokumentoitu useissa maligniteettien [11].

Koska cAMP on antiproliferatiivinen vaikutus tuumorisoluihin, solun läpäisevä cAMP-analogeja on pidetty terapiaan ihmisen syövän [11]. 8-CI-cAMP, parhaiten tutkittu näiden yhdisteiden, on antiproliferatiivisia sekä

in vitro

ja

in vivo

ja on arvioitu vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa [11], [ ,,,0],12], [13]. Silti, vaikka hyvin dokumentoituja vaikutuksia 8-Cl-cAMP, ei ole yhteistä sopimusta sen vaikutusmekanismiin. Vuonna uraauurtava tutkimusten mukaan ryhmä Yoon Cho-Chung se oli itse asiassa osoittaneet, että 8-CI-cAMP muuttaa suhde PKA sääntelyn (R) alayksiköistä (tyyppi I vs. tyyppi II) vähentämällä taso tyyppi IR alayksiköiden [11], [14]. Vaikka tämä ilmiö katsottiin vastaavan antiproliferatiivinen vaikutus 8-CI-cAMP, tuloksia uudempien tutkimusten mukaan vaikutukset 8-CI-cAMP sen sijaan välittyvät sen aineenvaihduntatuotteen 8-CI-adenosiini ja ovat riippumattomia PKA aktivointi ja /tai korjauksilla suhde tyypin I ja tyypin II R alayksiköstä [15], [16], [17], [18].

edellisessä työssä havaitsimme, että pari paikkasidonnainen cAMP-analogeja (8-PIP-cAMP, ja 8-HA-cAMP), joka, kun sitä käytetään yhdistelmänä, aktivoivat selektiivisesti PKA I, oli voimakas antiproliferatiivinen vaikutus kahdella BRAF-karsinooman solulinjoissa (ARO ja NPA), mutta ei BRAF-negatiivinen WRO soluihin [19]. Tässä tutkimuksessa verrattiin 8-CI-cAMP ja nämä PKA I-selektiivisiä cAMP analogien samoilla sinoomasolulinjoja (ARO, NPA ja WRO), katsomalla parametreja kuten solujen kasvua, apoptoosin ja muutokset keskeisten signalointi kaskadeja, jotka saattavat olla osallisina niiden antiproliferatiivisia vaikutuksia.

tulokset

Effect of 8-CI-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP analogien soluproliferaatioon

ensin verrattiin antiproliferatiivinen vaikutus 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja. Tätä tarkoitusta varten olemme käsiteltiin ARO (paksusuolen syöpä), NPA (melanooma) ja WRO (follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma) solut eri konsentraatioilla 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja eri aikoja (24-96 h) ja arvioitiin solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Tulokset osoittivat, että molemmat hoidot olivat yhtä voimakkaita estämään kasvua ARO ja NPA-soluja, kun taas vain 8-Cl-cAMP oli yhdenmukainen antiproliferatiivinen vaikutus WRO soluihin (kuvio 1). Vaikutus hoitojen saavutti maksimin jälkeen 72-96 tunnin inkuboinnin (tuloksia ei ole esitetty), ja se oli annoksesta riippuvaa, ja IC50-arvojen 55,3 pM ARO ja 84,8 uM NPA solujen PKA I-selektiivisen cAMP-analogien välillä 2.3 ja 13.6 uM 8-CI-cAMP kaikissa kolmessa solulinjoissa. Yhdenmukainen aiempaan toteamukseen antiproliferatiivinen vaikutus 8-CI-cAMP on PKA-riippumaton ja ainakin osittain välittyvät sen aineenvaihduntatuotteen 8-CI-adenosiini [15], [16], [17], [18], vaikutus 8-Cl-cAMP inhiboi merkittävästi käsittelemällä fosfodiesteraasi-inhibiittori IBMX, joka estää konversio 8-Cl-cAMP: n 8-Cl-adenosiini. Päinvastoin, IBMX ei muuttanut antiproliferatiivinen vaikutus PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (kuva S1). Lisäksi antiproliferatiivinen vaikutus 8-Cl-cAMP ei näytä välittyvän PKC, kuten käsittelemällä PKC-inhibiittorin ei muuta vastetta 8-Cl-cAMP: tä (kuvio S2).

ARO, NPA ja WRO soluja viljeltiin 72 tuntia, kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet joko tyypin cAMP analogisen (t) ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. PKA I, PKA I-selektiivisiä analogeja käytetään ekvimolaariset.

Effect of 8-CI-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP analogien solusyklin etenemisen ja apoptoosin

Myöhemmin , arvioimme onko antiproliferatiivinen vaikutus 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja liittyi kasvun pysähtymisen ja /tai apoptoosin. Tämä ongelma on ratkaistu yhdistämällä lähestymistapoja.

Ensinnäkin olemme analysoineet vaikutuksia 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP analogien solusyklin ja apoptoosin virtaussytometrialla analyysi tuman DNA sisältöä . Tätä tarkoitusta varten ARO, NPA ja WRO soluja käsiteltiin joko tyypin cAMP analogisen (t) eri aikoja ja analysoida sen jälkeen DNA propidiumjodidilla. 8-Cl-cAMP-hoitoon liittyi vähentämistä solujen G0 /G1 ja kertyminen solujen S-vaiheessa. Lisäksi, se liittyy merkittävä kasvu osa apoptoottisten solujen, toisin sanoen ne, joilla on osa-G0 /G1 DNA-pitoisuus. Sitä vastoin, altistuminen PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja ei aiheuta merkittävää apoptoosin lisääntymistä. Ainoa tuntuva vaikutus PKA I-selektiivisiä cAMP analogien oli hienoista nousua solujen määrä G0 /G1 (tilastollisesti merkitsevä ARO solut) ja taipumusta vähentämisestä solujen S ja G2 /M vaiheessa, sekä yhteensopiva kertyminen G0 /G1 (taulukko 1).

Seuraavaksi analysoimme vapautumista histoni-sitoutuneen DNA-fragmentit sytosoliin, merkkiaineena apoptoottisten DNA: n fragmentoituminen. ARO, NPA ja WRO solut altistettiin submaksimaalisella pitoisuudet PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja tai 8-Cl-cAMP, ja määrä nukleosomien sytoplasmassa arvioitiin tietyn ELISA. 8-Cl-cAMP: n hoito aiheutti merkittävän kasvun DNA: n fragmentoituminen kaikissa kolmessa solulinjoja, jotka oli havaittavissa lähtien, 48 h inkuboinnin jälkeen. Päinvastoin, ei induktio DNA: n fragmentoituminen havaittiin soluissa, joita käsiteltiin PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (kuvio 2A ja tietoja ei näytetty).

: vaikutus DNA: n fragmentoituminen. Solut altistettiin 8-Cl-cAMP: tä (100 uM) tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (100 uM kutakin), 48 tuntia ja vapautumista histoni-sitoutuneen DNA-fragmentit sytosoliin arvioitiin tietyn ELISA. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen. B: vaikutus kaspaasi 3/7. Solut altistettiin 8-Cl-cAMP: tä (100 uM) tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (100 uM kutakin), 72 h, ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus määritettiin, jonka luminoiva määritys. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen. * P 0,001 vs. kontrolli-soluja. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​vaihtelun verrokkiin soluviljelmässä ilman lääkkeitä.

Lopuksi, kuten apoptoosiin liittyy kaspaasi aktivointi [20], tutkimme vaikutus sekä hoitojen kaspaasi 3 /7, joka mitattiin käyttämällä luminoiva määritys. Merkittävä kasvu kaspaasi 3/7 aktiivisuutta havaittiin ARO, NPA ja WRO solut altistettiin 8-Cl-cAMP: alkaen 24 h hoidon, mutta ei samassa käsitellyissä soluissa PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (kuvio 2B ).

yhdessä nämä tiedot osoittivat, että 8-CI-cAMP, mutta ei PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja indusoi apoptoosin ARO, NPA ja WRO soluja.

Apoptotic reittejä aktivoidaan 8- Cl-cAMP

tutkimiseksi reitin mukana indusoiman apoptoosin 8-cl-cAMP, arvioimme kaspaasi 8 (ulkoinen tie) ja kaspaasi 9 (sisäisen reaktiotien) käyttäen tiettyä luminoivien määrityksissä. Varhainen ja ohimeneviä (10 min-1 h) kaspaasi 8, mutta ei kaspaasi 9, havaittiin (kuva 3), mikä viittaa siihen, että 8-Cl-cAMP voi indusoida ulkoinen tie. Nämä kaksi kaspaasit eivät osoittaneet mitään aktivointi myöhempinä ajankohtina (24-48 h) (tuloksia ei ole esitetty).

ARO, NPA ja WRO solut altistettiin 8-Cl-cAMP: tä (200 uM) eri aikoja ja toiminnan kaspaasin 8 ja 9 mitattiin käyttämällä erityisiä luminescent määrityksiä. Tiedot ovat kolmesta kuuteen toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. * P 0,05 vs. pohjapinta. ** P 0,01 vs. pohjapinta. *** P 0,001 vs. pohjapinta. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​vaihtelu lähtötasoon verrattuna.

Effect of 8-CI-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP analogien tasoista PKA alayksiköiden

Koska se on ollut kertoi, että 8-CI-cAMP aiheuttaa alas-säätely RIα ja ylös-säätely RIIβ alayksiköiden [14], [21], me verrattiin 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP analogien annetun ilmaus PKA R alayksiköt. Tätä tarkoitusta varten ARO, NPA ja WRO soluja stimuloitiin 8-CI-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja eri aikoja ja tasojen RIα, RIIα ja RIIβ arvioitiin Western blot analyysi hyödyntäen isoentsyymiselektiivisiä erityisiä vasta-aineita. Hoito ARO, NPA ja WRO solut joko 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja liittyi ilmentämisen vähentymiseen tasojen RIα alayksikön, kun taas tasojen jäljellä alayksiköiden ei ollut vaikutusta (kuvio 4 ).

ARO, NPA ja WRO soluja käsiteltiin 8-Cl-cAMP: tä (100 uM) tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (100 uM kutakin) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Tasot RIα, RIIα ja RIIβ mitattiin Western blot-analyysi. Esitetyt tulokset edustavat Western-blotteja (A) sekä tulokset densitometrisen analyysin neljästä itsenäisestä kokeesta (B). * P 0,01 vs. pohjapinta. ** P 0,001 vs. pohjapinta. Nämä tiedot ilmaistaan ​​vaihtelu lähtötasoon verrattuna.

Effect of 8-CI-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja on ERK 1/2 ja Akt

pyrki ymmärtää paremmin vaikutusmekanismi 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, me sitten tutkittiin, mikä vaikutus molempien hoito kahteen keskeiseen signalointikaskadien, jotka osallistuvat solujen kasvua, eli ekstrasellulaarinen signaali säädelty kinaasi 1/2 (ERK) mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) reitti ja fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitillä.

ERK1 /2 ovat hyvin tunnettu MAPK, jotka aktivoituvat vasteena kasvuärsykkeille ja tärkeitä rooleja neoplastisen transformaation [22]. Lisäksi cAMP: n on todettu estävän ERK 1/2 aktivoitumista useiden solutyyppien, jossa se on antiproliferatiivinen vaikutus [1], [2]. Tämä näyttää olevan kyse myös ARO ja NPA soluja, missä, kuten olemme aiemmin osoittaneet, antiproliferatiivinen vaikutus PKA I-selektiivisiä cAMP analogien liittyy eston ERK 1/2 fosforylaation Thr202 /Tyr204 [19] . Tämän perusteella, voimme arvioida vaikutusta 8-Cl-cAMP: n käsittely ERK fosforylaation Thr202 /Tyr204 Western blot-analyysi, jossa fosfo-spesifistä vasta-ainetta. Analyysi ERK aktivoinnin varhaisessa ajankohtina paljasti ohimenevä nousu sekä hoitojen (kuva S3). Ristiriidassa, mitä me aikaisemmin havaittu vastauksena PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, krooninen altistuminen 8-CI-cAMP ei liittynyt myöhään ja jatkuva estyminen ERK-fosforylaation (kuvio 5).

ARO , NPA ja WRO soluja käsiteltiin 8-Cl-cAMP: tä (100 uM) tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (100 uM kutakin) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Tasot ERK 1/2 fosforyloitiin Thr202 /Tyr204 ja yhteensä ERK mitattiin Western blot-analyysi. Esitetyt tulokset edustavat Western blotit sekä densitometrinen analyysi kolmesta neljään itsenäisestä kokeesta. P-ERK /yhteensä-ERK suhteet ilmaistaan ​​suhteellinen vaihtelu versus-tasojen kunkin yksittäisen kokeen. * P 0,05 vs. pohjapinta. ** P 0,01 vs. pohjapinta.

Toinen proteiini, joka on osallisena solujen lisääntymisen on seriini /treoniini-kinaasi Akt, joka on aktivoitu PI3K tuotteita ja fosforylaation Ser473 ja Thr308 [23] . Siksi arvioitiin vaikutusta 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja on Akt fosforylaation Ser473 ja Thr308, kertoo sen aktivoinnin. Yhdenmukaisesti me aiemmin raportoitu [19], käsittelemällä 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisiä analogeja ei aiheuttanut merkityksellisiä muutoksia Akt-fosforylaation varhaisessa aikapisteissä (kuvio S3), ja enintään 72 tuntia (tietoja ei ole esitetty).

Effect of 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogien on p38 MAPK

8-Cl-cAMP: n on osoitettu indusoivan p38 MAPK: n fosforylaatiota HL60 ja HeLa-solut [24], [25]. Siksi arvioimme vaikutus 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja on p38 MAPK fosforylaatioon. Huomasimme, että hoito ARO, NPA ja WRO solujen 8-CI-cAMP liittyi asteittain lisääntynyt p38 MAPK fosforylaatio, joka alkaa 24 tunnin inkuboinnin (kuva 6). Päinvastoin, hoito PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja ei muuttanut fosforyloitumisaste p38 MAPK (kuvio 6), lukuun ottamatta pieniä ja ohimenevää, jotka eivät tilastollisesti merkitsevä. Lisäksi hoito 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisiä analogeja ei aiheuttanut muutoksia p38 MAPK fosforylaation varhaisessa ajankohtina (kuva S3).

ARO, NPA ja WRO soluja käsiteltiin 8- Cl-cAMP: tä (100 uM) tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (100 uM kutakin) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Tasot fosforyloitua ja koko p38 MAPK mitattiin Western blot -analyysillä. Esitetyt tulokset edustavat Western blotit sekä densitometrinen analyysi kolmesta itsenäisestä kokeesta. P-p38 /yhteensä-p38 suhteen normalisoidaan perustasoille. * P 0,05 vs. pohjapinta. ** P 0,01 vs. pohjapinta. *** P 0,001 vs. pohjapinta.

Lopuksi arvioitiin, onko pro-apoptoottinen vaikutus 8-Cl-cAMP oli riippuvainen p38 MAPK aktivointia. Tätä varten me käsiteltiin 48-72 tuntia kaikki kolme solulinjaa 8-Cl-cAMP: n läsnä ollessa tai ilman selektiivisiä p38 MAPK-estäjät (SB 202190 tai SB203580) ja analysoitiin solusyklin jakautumisen virtaussytometrialla, kuten on kuvattu edellä. Mielenkiintoista on, estämällä p38 MAPK suurelta osin estää pro-apoptoottinen vaikutus 8-Cl-cAMP: tä (kuvio 7).

Soluja stimuloitiin 8-Cl-cAMP: tä (100 uM) joko läsnä ollessa tai Koska p38 MAPK estäjien (10pM SB203580 tai SB202190) 72 tuntia ja apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla analyysi jälkeen propidiumjodidivärjäys. Tiedot on saatu vähintään kolmen erillisen kokeen. Tiedot ilmaistaan ​​vaihtelun verrokkiin soluviljelmässä. * P 0,05 ja ** P 0,001 vs. soluissa, joita käsiteltiin 8-Cl-cAMP: n yksinään.

Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että pro-apoptoottinen vaikutus 8-Cl-cAMP Aro, NPA ja WRO solut välittävät p38 MAPK.

osallistuminen AMPK aktivoinnissa p38 MAPK 8-CI-cAMP

Tuoreessa tutkimuksessa [25] on ilmoittanut, että antiproliferatiivisia vaikutuksia 8-Cl-cAMP voidaan välittyy aktivoitumisen AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) sen jälkeen, kun metabolization 8-Cl-adenosiini. Todentamaan tämän hypoteesin arvioimme vaikutuksia molempien aktivaattorin, AICAR ja estäjä, yhdiste C, on AMPK. Hoito AICAR jäljitteli vaikutukset 8-Cl-cAMP on p38 MAPK fosforylaatioon ja kaspaasi 3/7 toimintaa. Lisäksi, yhdiste C pystyi suurelta osin estää sekä fosforylaation p38 MAPK ja aktivaation indusoiman apoptoosin 8-Cl-cAMP: tä (kuvio 8).

ARO, NPA ja WRO soluja stimuloitiin 8- Cl-cAMP: tä (100 uM) tai AMPK aktivaattori (AICAR, 1 mM) 72 tuntia joko läsnä tai poissa ollessa esikäsittelyn kanssa AMPK estäjä (yhdiste C, 2,5 uM). V: tasot fosforyloidun ja koko p38 MAPK mitattiin Western blot -analyysillä. Siinä on esitetty tuloksia edustavan Western blot kokeissa sekä densitometrinen analyysi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Aineisto on normalisoitu kontrollien tasoihin. B: kaspaasi 3/7 aktiivisuus määritettiin, jonka luminoiva määritys. On esitetty tulokset vähintään kolmen erillisen kokeen. Tiedot on normalisoitu ohjaamaan soluviljelmässä. Legend: A: ohjaus, B: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: Yhdiste C, E: 8-CI-cAMP + Yhdiste C, F: AICAR + Yhdiste C. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 vs. kontrolli. # P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 vs. 8-CI-cAMP. § P 0,05, §§ P 0,01, §§§ P 0,001 vs. AICAR.

Keskustelu

cAMP-analogeja inhiboimaan useita syöpäsoluja. Parhaiten tutkittu näistä yhdiste on 8-CI-cAMP, joka on osoittanut antiproliferatiivinen vaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

ja on arvioitu vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa [11 ], [12], [13]. Tuoreessa tutkimuksessa, olemme kuvanneet antiproliferatiivista vaikutusta parin cAMP analogien selektiivinen PKA I ihmisen sinoomasolulinjoja [19]. Tavoitteena Tämän työn tavoitteena oli vertailla vaikutus näiden cAMP analogien kuin hyvin tutkittu 8-CI-cAMP ja edelleen tutkia niiden mekanismi (t),. Tulokset viittaavat siihen, että 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, vaikka vastaavia teho, eroavat solutyypissä selektiivisyys ja mekanismi (t),. PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja aiheuttaa kasvun pysähtymistä, mutta ei apoptoosin, ja kuten olemme aikaisemmin osoittaneet, niiden vaikutukset näyttävät välittyvän, jonka PKA-riippuvaisen inhibition ERK aktivointi. Sen sijaan 8-CI-cAMP vaikutukset todennäköisimmin kohdistaman sen aineenvaihduntatuotteen 8-CI-adenosiini, ovat riippumattomia PKA aktivoinnin, ja ilmeisesti välittävät AMPK aktivaatio ja myöhempi p38 MAPK riippuvan apoptoosin induktion.

Tuloksemme osoittavat, että 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja on vastaavasti voimakas antiproliferatiivinen vaikutus, mikä viittaa siihen, että molemmat voivat säilyttää potentiaalinen syövän hoidossa. PKA I-selektiivisiä cAMP analogit näyttävät vaativan läsnäoloa konstitutiivisen ERK aktivaation, ehdottivat niiden ollessa erittäin aktiivisia ainoastaan ​​BRAF

V600E-mutatoitunut ARO ja NPA soluja, jossa ne estävät ERK fosforylaatiota. Sen sijaan 8-CI-cAMP estää voimakkaasti solujen kasvua myös BRAF-negatiivinen WRO soluihin, mikä viittaa siihen, että se voi olla tehokas laajempaa syöpäsoluja.

Useat havainnot viittaavat siihen, että 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP analogit toimivat kautta erilaisia ​​mekanismeja. Ensinnäkin, vaikutus 8-CI-cAMP näyttää välittyy pääasiassa yhteisymmärryksessä aiempien huomautusten [15], [16], [17], [18], sen aineenvaihduntatuotteen 8-CI-adenosiini, joka toimii kautta AMPK, eikä stimuloimalla PKA, ehdottivat vaikutuksesta IBMX ja valikoivan AMPK aktivaation /esto; Päinvastoin, IBMX ei muuta antiproliferatiivinen vastaus PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja. Toiseksi, 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja tuottamaan erilaisia ​​muunnelmia solusyklin. Erityisesti, 8-Cl-cAMP, mutta ei PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja, apoptoosin. Kolmanneksi PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, mutta ei 8-CI-cAMP, vähentää ERK fosforylaatio ARO ja NPA soluja. Neljänneksi 8cl-cAMP, mutta ei PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja, lisätä p38 MAPK fosforylaatiota.

vaikutusmekanismi 8-CI-cAMP on erittäin keskusteltu. Cho-Chung ja kollegat ovat tehneet paljon työtä tämän aiheen, jonka tulokset osoittavat, että 8-CI-cAMP indusoi kasvun ehkäisyä lisäämällä RI RII suhde [14], [21]. Toisaalta, uudempi tutkimukset viittaavat siihen, että tämä asetus ei ole merkittävä syy kasvuinhibitiosta [17]. Tässä raportissa huomaamme, että 8-CI-cAMP vähentää ilmentymistä RIα ARO, NPA ja WRO soluja. Kuitenkin, huomaamme, että IBMX, joka estää konversio 8-Cl-cAMP: n 8-Cl-adenosiini, joka on metaboliitti voi aktivoida PKA, vähentää merkittävästi antiproliferatiivista vaikutusta 8-Cl-cAMP.

tuoreessa tutkimuksessa [25] on osoittanut, että 8-Cl-adenosiini kykenee stimuloimaan AMPK, joten tutkimme osallistumisen tämän reitin 8-Cl-cAMP: n indusoiman apoptoosin. Meidän tuloksemme osoittavat, että apoptoosin induktio 8-Cl-cAMP on liitetty kaspaasi 3/7, ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin AICAR, aktivaattoria AMPK. Lisäksi yhdiste C, joka on AMPK estäjä, estää kaspaasi 3/7 induktion sekä AICAR ja 8-Cl-cAMP vastaavasti. Lopulta, ehdotamme, että pro-apoptoottinen vaikutus 8-CI-cAMP välittyy AMPK.

Lisäksi osoitamme, että pro-apoptoottinen vaikutus 8-CI-cAMP mukana on asteittainen lisäys p38 MAPK fosforylaation. P38 MAPK on keskeinen säätelijä solujen eloonjäämistä [26], [27], ja se on liitetty pro-apoptoottinen vaikutus 8-Cl-cAMP: HL60 ja HeLa-soluissa [24], [25]. Tutkia, p38 MAPK aktivointi on riippuvainen by AMPK käytimme aktivointi /esto strategian samanlainen kuin yksi hyväksytty kaspaasi 3/7. Koska AMPK saarto estää suureksi osaksi ja AMPK aktivointi jäljitteli vaikutukset 8-Cl-cAMP on p38 MAPK, meidän tiedot viittaavat vahvasti siihen, että 8-CI-cAMP muuntamisen jälkeen sen metaboliitin 8-CI-adenosiini aktivoi p38 MAPK kautta stimulaation of AMPK.

yrittäessään selventää johtavalla reitillä kaspaasi 3/7 aktivointia, mittasimme aktiivisuutta alkupään caspases 8 ja 9, jotka ovat mukana ulkoisten ja sisäisten apoptoottisten reittien, vastaavasti. Kun taas ei kaspaasi 9 havaittiin, varhainen ja vain ohimenevä (5 min-1 h) kaspaasi 8 havaittiin. Nämä tiedot saattavat osoittavat osallistumista ulkoinen tie pro-apoptoottisen vaikutukset 8-Cl-cAMP. Kun kuitenkin otetaan huomioon havaittu pitkä viive kaspaasi 8 ja 3/7, ja tilapäinen luonne kaspaasin 8 aktivaation, on mahdollista, että muut mekanismit, todennäköisesti riippumaton ylävirran kaspaasien, saattaa olla mukana kaspaasi 3 /7. Mielenkiintoista on, että vaikka ne mekanismit, jotka p38-MAPK voi aktivoida kaspaasit eivät ole täysin selvitetty, mahdollisesti suoraan kaspaasi 3, jonka p38 MAPK on myös raportoitu [28].

Lopuksi todettakoon, että tulokset osoittavat, että sekä 8-CI-cAMP ja PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja on vastaavasti voimakas antiproliferatiivinen vaikutus syöpäsolujen radoilla eri alkuperää. Näin ollen ne molemmat säilyttää potentiaali syöpälääkkeiden. 8-CI-cAMP näyttää olevan tehokas laajempaa solutyyppejä ja indusoi apoptoosia. Toisaalta, mekanismi (t), 8-Cl-cAMP ja PKA I-selektiiviset cAMP analogit ovat erilaisia, mikä viittaa siihen, että ne voivat olla erilaiset farmakologiset ja toksikologiset profiilit, sekä ainutlaatuinen kasvaimia torjuvaa ominaisuuksia. Tulevaisuuden

in vivo

kokeita tarvitaan verrata niiden tehoa ja siedettävyyttä prekliinisissä syövän malleissa.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

soluviljelmäreagenssit Invitrogen (San Giuliano Milanese, Italia). 8-klooriadenosiini-3 ’, 5′-syklinen monofosfaatti (8-Cl-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3′, 5’-syklinen monofosfaatti (8-PIP-cAMP) ja 8-hexylaminoadenosine-3 ’, 5’cyclic monofosfaatti (8-HA-cAMP) ostettiin biolog Life Science Institute (Bremen, Saksa). BCA-kit ja nitroselluloosakalvoille ostettiin Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ ja β-aktiini vasta-aineet hankittiin BD Biosciences Pharmingen (Milano, Italia). Fosfo-ERK, fosfo-Akt, fosfo-p38 MAPK, ERK, Akt: n ja p38 MAPK-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). HRP konjugoidut hiiren ja kaniinin sekundaariset vasta-aineet hankittiin Chemicon International (Temecula, CA). ECL-plus kit hankittiin Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Saksa). The Cell Death Detection ELISA Plus pakki ostettiin Roche Applied Science (Mannheim, Saksa). CellTiter-Blue solujen elinkykyä ja kaspaasi-Glo 3/7, 8 tai 9 määritykset hankittiin Promega Corporation (Madison, WI, USA). 4- (4-fluorifenyyli) -2- (4-metyylisulfinyylifenyyli) -5- (4-pyridyyli) 1 H-imidatsoli (SB203580) hankittiin Biosource (Nivelles, Belgia). 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinia (IBMX), 4- (4-fluorifenyyli) -2- (4-hydroksifenyyli) -5- (4-pyridyyli) -1 H-imidatsoli (SB202190), bisindolyl-maleimidi I (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-piperidin-1-yylietoksi) fenyyli] -3-pyridin-4-ylpyrazolo [1,5-a] pyriimdine (yhdiste C) ja kaikki muut reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich (Milano , Italia).

Soluviljely

ARO, NPA ja WRO solut ystävällisesti I. Bongarzone (Milano, Italia). Tuore DNA-profilointi-analyysi on paljastanut, että ARO solut vastaavat HT-29 koolonisyöpäsolulinja ja NPA solut vastaavat M14 /MDA-MB-435S melanoomasolulinjalla [29]. WRO solut ovat peräisin follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma [30]. Kaikki soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 1% penisilliiniä ja 1% streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

valikoiva aktivointi PKA I

aktivoivat selektiivisesti PKA I, käytimme yleisesti käytetty strategia samanaikaisesti käyttämällä kahta erillistä cAMP-analogeja, eli 8-piperidinoadenosine-3 ’, 5’-syklinen monofosfaatti (8-PIP-cAMP) ja 8-hexylaminoadenosine-3 ”5’cyclic monofosfaatti (8-HA-cAMP), joista jokaisella on suuri selektiivisyys sitoutumisesta joko päällä A (8-PIP-cAMP) tai B (8-HA-cAMP) tyypin I PKA R-alayksiköiden [19].

Proliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio arvioitiin käyttämällä 3- (4,5-dimetylthiazole-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), kuten aiemmin on kuvattu [19 ]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille, ja 24 h sen jälkeen, kun pinnoitus käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja (8-PIP-cAMP + 8-HA-cAMP). Eston PKC, soluja inkuboitiin 30 min GF109203x ennen kuin lisättiin 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisen cAMP-analogeja. MTT: tä (0,5 mg /ml) lisättiin soluihin kolme tuntia ennen mittausta, ja formatsaanikiteet, muodostuu pelkistyminen mitokondrioissa MTT, liuotettiin DMSO /etanolia 01:01. Suhteellinen kasvu laskettiin absorbanssista 550 nm: ssä käyttäen seuraavan yhtälön avulla: suhteellinen kasvu (%) = (OD

550 nm käsitellyn kuoppiin /OD

550 nm Verrokkikuoppien) x 100.

Detection apoptoottisten DNA: n fragmentoituminen

DNA pirstoutuminen arvioitiin hyödyntäen Cell Death Detection ELISA Plus kit. Tämä määritys tarjoaa kvantitatiivinen määritys histoni liittyvän DNA-fragmenttien (mono- ja oligo-nukleosomien) on sytoplasmaattinen osa solulysaateista. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille ja 24 tuntia myöhemmin käsiteltiin 8-Cl-cAMP tai PKA I-selektiivisiä cAMP-analogeja: ssa 48 tuntia. Sitten näytteet käsiteltiin ja analysoitiin kolmena kappaleena, mukaan valmistajan ohjeiden.

määritys kaspaasi toiminnan

kaspaasi-aktiivisuus mitattiin käyttämällä luminoivaa kaspaasi-Glo 3/7, 8 tai 9 määrityksissä seuraten valmistajan ohjeita. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus normalisoitu solujen määrä, jotka sisältyvät kuhunkin hyvin, määritetään käyttämällä fluorometrisen CellTiter-Blue solunelinkykyisyysmääritys. Aktivointitasoa kaspaasien 8 ja 9 on ilmaistu suhteessa ei-käsiteltyjen näytteiden. Luminescent ja loisteputki mittaukset suoritettiin käyttäen hyväksi Fluoroskan Ascent FL monilevylukija (Thermo Labsystems, Helsinki, Suomi).

analyysi solukierron virtaussytometrialla

Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin sitten jääkylmällä 70% etanolilla. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä ja värjättiin PBS: llä, joka sisälsi 40 ug /ml propidiumjodidia ja 100 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Näytteet analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Buccinasco, Italia).

Western blot-analyysi

havaitsemiseksi PKA säätelyalayksiköt, solut hajotettiin muutettu RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ( 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% Na deoksikolaattia, 2 mM EDTA, 2 mM Na

2VO

4, 2 mM Na

4P

2O

7, 2 mM NaF). Havaitsemiseksi ERK, Akt, ja p38 MAPK fosforylaatio, solut hajotettiin SDS-näytepuskuria (62,5 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyseroli, 50 mM DTT: tä, 0,01% bromifenolisininen), heti kuumennetaan 5 min 95 ° C: ssa ja käsiteltiin ultraäänellä. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.