Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä (~22 nukleotidi) ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät lukemattomia biologisia prosesseja ja usein väärin säädellystä syövässä. Syöpään liittyvän MikroRNA on havaittu seerumissa ja plasmassa ja olla lupaava vähän invasiivisia syövän biomarkkereita, mahdollisesti arvioimiseksi tautitiedoista metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta, jota on vaikea koepala. Tässä käytimme miRNA profilointi tunnistamiseen syöpään liittyvään miRNA jotka ilmentyvät eri seerumista metastasoituneen kastraatio resistenttejä eturauhassyöpä (mCRPC) verrattuna terveisiin kontrolleihin. 365 miRNA profiloitu tunnistimme viisi seerumin miRNA (miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-210 ja miR-375), joka oli koholla tapauksissa kontrolleihin verrattuna yli kaksi itsenäistä ikäryhmät. Yksi näistä, miR-210, on tunnettu transkription kohteena hypoksia-reagoiva HIF-1α signalointireitin. Altistuminen Viljeltyjen eturauhasen syöpäsolujen hypoksia johti induktion miR-210 ja sen vapautumista solunulkoiseen ympäristöön. Lisäksi olemme havainneet, että seerumin miR-210 tasot vaihtelivat suuresti keskuudessa mCRPC potilaiden terapiaa, ja korreloi hoitovastetta arvioimana muutos PSA. Tuloksemme viittaavat siihen, että (i) syöpään liittyvän hypoksia on usein aiemmin aliarvostettu ominaisuus mCRPC, ja (ii) seerumin miR-210 voidaan kehittää edelleen ennakoivan biomarkkereiden potilailla, joilla on tähän selvä sairaus biologia.

Citation: Cheng HH, Mitchell PS, Kroh EM, Dowell AE Chery L, Siddiqui J, et al. (2013) Circulating microRNA Profilointi Tarkoittaa osajoukon metastasoituneen eturauhassyövän Potilaat, joilla Evidence of Cancer-Associated Hypoksia. PLoS ONE 8 (7): e69239. doi: 10,1371 /journal.pone.0069239

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2013. Hyväksytty: 6. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 30 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamat Canary Foundation (MT), Damon Runyon-Rachleff Innovation Award (MT), DOD Eturauhassyöpä New tutkija Award (MT), National Institutes of Health (NIH) CA093900 (ja KJP), NIH CA143055 (ja KJP) , NIH PO1 CA085859 (ja RLV), NIH SPORE P50 CA69568 (jotta KJP ja AMC), NIH SPORE P50 CA97186 (PSN, MT, ja RLV), NIH TR01 5R01DK085714 (MT), NIH T32CA009515-28 (ja HHC) , Eturauhassyöpä Foundation Luovuus-palkinto (MT), ja Richard M. Lucas Foundation (ja RLV). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Muneesh Tewari on nimetty keksijä on vireillä patenttihakemus otsikolla ”Use of Extracellular RNA mitata Disease, ”# 12/993828. H.H.C., P.S.M., E.M.K., A.E.D., L. C., J. S., P.S.N., B.S.K., R.L.V., A.M.C., K.J.P., ja C.M. julistaa ole kilpailevia intressejä. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

luonnollinen historia metastasoituneen kastraatio resistenttejä eturauhassyöpä (mCRPC) vaihtelee laajalti, mikä viittaa heterogeeninen tauti biologia tässä potilasryhmässä. Kuitenkin vähän tiedetään biologinen heterogeenisuus mCRPC ja lähestymistapoja kliinistä kerrostuminen potilaita ovat rajalliset, suurimmaksi osaksi siitä metastaattisen kudos ei ole rutiininomaisesti käytettävissä tutkimus. Vähän invasiivisia (esim veripohjaisten) lähestymistapoja, jotka voivat auttaa kerrostuvat potilaita perusteella erillisten tuumoribiologiassa voi olla arvokasta tietoa valintaa hoidon, mikä on erityisen tärkeää äskettäin käyttöön useita uusia tehokkaita hoitoja mCRPC.

Kiertävä MikroRNA (miRNA) ovat syntymässä luokka veripohjaisten biomarkkerit, joilla on mahdollisuuksia antaa tietoa selvästi tuumoribiologiassa yksittäisillä potilailla [1]. miRNA ovat pieniä (~22 nukleotidi), ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota translationaalisen tukahduttaminen tai hajoaminen kohdennettujen selostukset [2]. Erityiset miRNA on havaittu säätelemään erilaisia ​​kriittisiin prosesseihin kasvaimen fysiologiaan, mukaan lukien angiogeneesi [3], epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon [4], etäpesäke [5] ja kasvaimen vaste hypoksia [6]. miRNA on osoitettu olevan tehokkaita kudospohjaisia ​​syöpä biomarkkereita-in syöpien diagnosoimiseksi tuntematon kudosalkuperän ja ennustamisessa kliinisiin tuloksiin [7] – [9]. Me ja muut ovat osoittaneet, että verenkierrossa, soluvapaa kasvainperäinen miRNA ovat erittäin stabiileja, ja havaittavissa seerumissa syöpäpotilaiden [1]. Aiemmissa työtä, käytimme ehdokas miRNA lähestymistapa tunnistaa merkittävät korkeus miR-141 seerumissa metastasoituneen kastraatio kestävät eturauhassyöpä (mCRPC) [1].

Jotta enemmän kattavasti tunnistamaan eturauhassyöpää -associated verenkierrossa miRNA, nykyisessä tutkimuksessa profiloitu seerumin miRNA potilailta, joilla on mCRPC. Määrittelimme viisi seerumi miRNA jotka olivat merkittävästi koholla tapauksissa terveisiin kontrolleihin verrattuna, mukaan lukien hypoksia liittyvä miR-210. Sen määrittämiseksi, onko syöpäsolujen voi vapauttaa miR-210 vastauksena hypoksia, olemme alttiina eturauhassyöpäsolulinjoissa ja hypoksisissa olosuhteissa ja havaittiin, että miR-210 indusoitiin ja vapautuu solun ympäristöön. Sen analyysi kliinisistä näytteistä ja tuloksia, löysimme todisteita siitä, että alaryhmä mCRPC potilaista on kasvanut miR-210 tasoilla ja että tämä korreloi hoitovaste, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt hapenpuute on ominaista mCRPC joka voi määritellä potilasryhmässä, jossa erillisten taudin biologiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP (ATCC® CRL-1740 ™) ja Vcap [10] ihmisen eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin RPMI 1640 ja DMEM, vastaavasti, kukin täydennettynä 10% FBS: ää (tai seerumittomissa olosuhteissa, kuten edellä), 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Hypoksinen olosuhteet (1% O

2) perustettiin vuonna Thermo Scientific 3595 Incubator (ThermoFisher), jossa solut säilytetään happiolosuhteissa (20% O

2) rinnakkain.

RNA Eristys viljellyt solut ja elatusaine

väliaine poistettiin soluista viljeltiin 24, 48 tai 72 tuntia normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Solut pestiin 5 ml: aan PBS ja hajotettiin jäällä suoraan kulttuuri malja 600 ul Lysis /Binding puskurin

mir

Vana miRNA eristyspakkausta (Ambion). Lysaatit kerättiin käsin steriilillä soluraaputtimella ja siirrettiin RNaasi- /DNaasiton 2 ml mikrosentrifugiputkeen. RNA uutettiin solulysaateista noudattamalla valmistajan suosittelemaa protokollaa koko RNA: n eristämistä. Solujäänteet poistettiin 500 ui: n alikvootti elatusainetta (10 ml kokonaistilavuus) suodattamalla 0,2 um NanoSep suodatusyksikön (Millipore) 14000 x

g

, 5 min, huoneenlämpötilassa. 400 ui suodatettua näytettä yhdistettiin 400 ul: 2X denaturointiliuos (Ambion) ja vorteksoitiin.

C. elegans

spiked-oligonukleotideihin, otettiin käyttöön (seoksena 25 fmol kumpaakin oligonukleotidia 5 ul: n kokonaistilavuudessa kohti nesteen näyte) jälkeen denaturointi- ja käytetään normalisointia vaihtelun RNA: n eristys eri puolilla näytettä, kuten aikaisemmin on kuvattu [1]. RNA uutettiin elatusaineesta lysaateista käyttämällä

mir

Vana PARIS Kit (Ambion) seuraten valmistajan suosittelemaa protokollaa koko RNA: n eristämistä.

Ethics lausunto

Kaikki kliiniset näytteet olivat saatu henkilöillä, jotka kunhan kirjallinen lupa. Tutkimukset suoritettiin ilmoituksen mukaisesti Helsingin ohjeiden ja etiikasta hyväksyntää Institutional Review Boards yliopistossa Washington, Fred Hutchinson Cancer Research Center ja University of Michigan.

Veren käsittely ja eristäminen Serum Clinical näytteitä

Kaikki kliiniset näytteet saadaan University of Washington ja Michiganin yliopistossa kerätty ja käsitelty aikaisemmin kuvatulla [1], [11].

RNA: n eristäminen kliinisestä seeruminäytteistä

Kokonais-RNA eristettiin 400 ui seerumia kerättiin University of Washington käyttäen Mirvana PARIS kit (Ambion), kuten aiemmin on kuvattu [1]. Yhtä suuret tilavuudet kutakin näytettä tyypin koottiin ja mCRPC ja terveen luovuttajan seerumin altaat (n = 25 kullekin allas) ja TLDA profilointia. Kokonais-RNA eristettiin seeruminäytteet kerätään University of Michigan käyttäen miRNeasy RNA: n eristys (Qiagen) seuraavasti: 400 ui seerumia jaettiin neljään, 100 ul: n eriä. Kukin näyte denaturoitiin käyttäen 10X tilavuuteen (1 ml) Qiazol, joka vorteksoitiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia.

C. elegans

spiked-oligonukleotideihin, otettiin käyttöön (seoksena 25 fmol kumpaakin oligonukleotidia 5 ul: n kokonaistilavuudessa kohti nesteen näyte) jälkeen denaturointi, joita käytettiin normalisoimiseksi vaihtelun RNA: n eristys eri puolilla näytettä, kuten aikaisemmin on kuvattu [1] . RNA uutettiin käyttäen 0,2 x tilavuus kloroformia (220 ui), ja kokonais-RNA eristettiin valmistajan protokollaa. Tietyn näytteen RNA eristettiin kustakin 100 ul: n erä yhdistettiin ja konsentroitiin 100 ul: n tilavuudessa yli Microcon YM-3 suodatin yksikköä (Millipore) 14000 x

g

, 1,5 tuntia, 4 ° C: ssa, jotka olivat ladattu invertoidaan esipunnittuun 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkiin ja eluoitiin nopeudella 1000 x

g

, 3 min, 4 ° C: ssa. Putket plus eluaatti punnittu analyyttinen mittakaavassa ja saatettiin 100 ul eluoimispuskurilla. RNA säilytettiin -80 ° C: ssa.

kokoelma ja käsittely Kliinisen kudosleikkeiden

Laser-capture mikro-leikkely (LCM) jäädytettyä-kudosleikkeiden.

Osiot flash-jäädytettiin eturauhasen ja imusolmuke saatu eturauhasen ja nopea ruumiinavaus vastaavasti arvioitiin jonka patologi määritellä alueille kasvain epiteelisolujen. Laser kaapata mikrodissektion 5 um: n leikkeitä jäädytetyn kudoksen tehtiin Leica ™ CM3050S kryostaatilla -20 ° C: ssa (Leica, Wetzlar, Saksa), asetettiin PEN Membrane Frame Kalvot (MDS Inc., Ontario, Canada) sitten värjätään ja kiinteä mukaan HistoGene ™ LCM Frozen § -värjäyspakkausta protokolla (MDS Inc.). Kunkin näytteen noin 2000 solua laser jää 200x suurennuksella (Veritas, Arcturus MDS Inc., Ontario, Canada). Otettu näyte asetettiin 300 ul: ssa lyysipuskuria päässä RNAqueous® RNA: n eristäminen Kit (Ambion, Austin, Texas), inkuboitiin 30 minuuttia 42 ° C: ssa ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA eristäminen suoritettiin. miRNA eristettiin sitten käyttämällä RNAqueous® RNA: n eristäminen Kit (Ambion).

RNA eristäminen LCM kudosnäytteistä.

Kokonais-RNA eristettiin LCM kudosnäytteistä käyttämällä RNAqueous-Micro RNA: n eristys kit (Ambion) seuraavasti: Pakastettu lysaatit sulatettiin jäällä, vorteksoitiin ja sentrifugoitiin 16100 x g, 30 s, huoneenlämpötilassa.

C. elegans

piikki-oligonukleotideihin, otettiin käyttöön (seoksena 25 fmol kumpaakin oligonukleotidia 5 ul: n kokonaistilavuudessa kohti nesteen näyte) ja käytettiin normalisointiin vaihtelun RNA: n eristys eri puolilla näytettä, kuten aikaisemmin on kuvattu [1], minkä jälkeen lisättiin 3 ui LCM lisäaine. RNA saostettiin lysaatista seos 1,25 tilavuutta 100% molekyyli-luokan EtOH, ja sen jälkeen sitoutuneen Micro Suodatinpatruuna kokoonpano (esikostutetun 30 ui Lysis Solution 5 min) sentrifugoimalla 10000 x g, 1 min. Suodatin pestiin (180 ui Wash Solution 1, 10000 ×

g

, 1 min, 2 x 180 ui Wash Solution 2/3, 16100 ×

g

, 30 sekuntia; ilmaa vain, 16100 ×

g

, 30 s). RNA eluoitiin kolonnista kahdesti 10 ui 95 ° C: ssa eluutiopuskuria jaetaan ennalta punnittu putket. Eluaatit punnittiin analyyttisellä mittakaavassa ja saatettiin 20 ul eluoimispuskurilla. RNA säilytettiin -80 ° C: ssa.

MicroRNA profilointi käyttäen TaqMan Low-Density Array miRNA qRT-PCR ja biologisten merkkiaineiden Candidate Selection

RNA yhdistettyjen seerumista mCRPC potilaiden tai terveiden verrokkien (koostuu yhtäläiset RNA tilavuus kustakin 25 näytettä per pool) käänteiskopiointiin kahtena reaktiot 2 ui yhdistettiin RNA käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit ja TaqMan miRNA Multiplex RT Analyysit (Human Pool Set). Koottu yhdistetty näyte lähestymistapa valittiin kustannustehokas löytö miRNA biomarkkereita. miRNA-ekspressio profiloitu kunkin RT reaktio jäljitellä käyttämällä TaqMan Low Density Array (TLDA, v1.0) kuten aiemmin on kuvattu [1]. Multiplex käänteistranskriptiotuotteiden TLDA qRT-PCR suoritettiin Applied Biosystems 7900HT lämpösyklerissä käyttämällä valmistajan suosittelemaa sykliolosuhteita. Tiedot analysoitiin SDS Suhteellinen kvantifiointitietokoneohjelmaa versio 2.2.2 (Applied Biosystems), jossa on automaattisesti määritetty vähimmäiskynnys, joka oli yli perustason kaikkien jotka osoittavat mitattavissa vahvistusta yli taustan. Arvot, jotka olivat alle minimirajan annettiin mielivaltaisesti syklin kynnys (CT) arvo 40.

P

-arvot määrättiin Studentin t-testi arvioidaan jäljitellä profilointitiedot kustakin altaan määrittää merkittäviä eroja miRNA ilmaisun välillä mCRPC allas ja terveillä verrokeilla allas RNA-näytteet. Fold-muutos (FC) arvot johdettiin laskemalla 2

∧ (AveCT

mCRPC uima-AveCT

terveisiin pool). MicroRNA ehdokas biomarkkerit valittiin kriteeri FC 5 ja

P

0,05.

mittaus miRNA ja mRNA-tasojen Individual TaqMan Quantitative Reverse-transkriptio PCR (qRT-PCR)

miRNA-johdettu seeruminäytteistä käänteiskopiointiin käyttäen TaqMan miRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems) ja kvantifioidaan TaqMan miRNA qRT-PCR: llä käyttämällä miRNA-spesifinen aluke /koetin asetetaan (Applied Biosystems), kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],1]. Täydellinen kuvaus TaqMan määrityksiä Tässä tutkimuksessa käytetty annetaan taulukossa S4.

miRNA johdettu seeruminäytteistä saatu University of Michigan kvantitoitiin TaqMan miRNA qRT-PCR: llä käyttämällä synteettistä miRNA Standardikäyrien absoluuttisia identtisesti kuin on kuvattu University of Washington näytteen setti [1], paitsi että ennen monistusvaihe suljettiin kaikkien miRNA kvantifiointiin muut kuin miR-210 (tämä perustui empiiriseen näyttöä siitä, että pre-vahvistus ei lisää absoluuttista kopio määrä miRNA havaittavissa muiden TaqMan miRNA määrityksissä käytetään tässä, tuloksia ei ole esitetty).

Gene-ilmentyminen kvantifioitiin TaqMan qRT-PCR seuraavasti: RNA-käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan Gene-expression Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) pienessä mittakaavassa RT reaktio [käsittäen 0,5 pl 10 X Reverse-Transcription Buffer, 0,5 ui 10X Random Primers, 0,2 ui 100 mM dNTP dTTP, 0,25 ui Multiscribe käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä ja 3,55 ui RNA-; muita komponentteja kuin tulo-RNA: ta valmistettiin suurempi tilavuus master mix], käyttäen Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) 50 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 30 sykliä 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 60 sekunnin ajan. Syntynyt cDNA yhdistettiin 3,75 ul esivahvistusta määritysreagenssit [käsittäen 2,5 ui TaqMan Esivahvistustaso Master Mix ja 1,25 ui TaqMan Gene-Expression Assay (GUSB tai KRT18) laimennettuna 1:100 TE; muita komponentteja kuin tulo cDNA valmistettiin suurempi tilavuus master mix tuottaa 5,0 ul: n kokonaistilavuudessa PCR-reaktiossa], käyttäen Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 14 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 4 minuutin ajan. GUSB tai KRT18 pre-monistusreaktion tuotteet yhdistettiin 2,75 ui PCR määritysreagenssit [käsittäen 2,5 ui TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, nro AmpErase UNG ja 0,25 ui 20X TaqMan Gene-Expression Assay) tuottaa 5,0 ui kokonaistilavuudessa PCR reaktio GUSB tai KRT18, vastaavasti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems 7900HT lämpösyklilaitteessa 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Tiedot analysoitiin SDS Suhteellinen kvantifiointitietokoneohjelmaa versio 2.2.2 (Applied Biosystems), jossa automaattinen CT puitteet määrittämällä lähtötilanteen ja kynnyksen TT-määritystä (katso taulukko S3 tulosten lähetti-RNA mittaukset).

Tulokset ja keskustelu

jotta tehokkaasti löytää seerumin miRNA jotka ovat differentiaalisesti runsas välillä syöpätapausta kontrolleja, käytimme reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) seulomiseksi ero runsaasti 365 miRNA seerumin RNA poolattavissa mCRPC potilaista (

n =

25) versus ikä-verrokeilla (

n =

25; kaikki tarkastukset oli normaali PSA ja normaali digitaalinen peräsuolesta tentti havaintoja). Sen jälkeen normalisointia tietoja käyttämällä piikki-valvonta miRNA ja vertailu yhdistettyjen seerumin RNA mCRPC tapauksissa että valvonnan (Fig. 1

ja

upotus

) tunnistimme yhdeksän miRNA osoittaminen suurempi kuin 5-kertainen muutos runsaus (oikaisemattomat

P

0,05, Studentin t-testi). Me seuraavaksi erikseen mitattuna nämä yhdeksän miRNA seerumista RNA yksittäisten mCRPC tapausten ja kontrollien avulla miRNA-spesifisiä Taqman qRT-PCR-määrityksissä. Seerumin viisi miRNA vahvistettiin olevan merkittävästi koholla mCRPC tapauksissa verrattuna kontrolleihin (miR-141:

P

0,0001, miR-200a:

P =

0,007, miR-200c :

P =

0,017, miR-375:

P =

0,009, ja miR-210:

P =

0.022, Wilcoxonin rank analyysi). Keskimääräinen taitettava ero tapausten ja kontrollien välillä vaihtelivat 4,6 (miR-375) 27,9 (miR-141) (Fig. 1

B

,

ylempi

ja taulukko S1). Lisäksi vastaanotin toimineiden (ROC) tontteja osoittavat kapasiteettia näiden miRNA erottamaan näiden kahden ryhmän välillä (miR-141 Area Under the Curve (AUC) = 0,899; miR-200a AUC = 0,699; miR-375 AUC = 0,773 ; miR-200c AUC = 0,721 ja miR-210 AUC = 0,678) (Kuva. 1

B

,

pienempi

). Mikä tärkeintä, olemme varmistaneet, että ohjaus miRNA ei ilmennetty eri kahden populaatioiden (Fig. S1).

(

A)

mittaus verenkierrossa miRNA seerumeista yhdistettiin potilailta, joilla on edennyt eturauhassyöpä kuin verrattuna terveiltä luovuttajilta (käsittäen Discovery Set) by TLDA profilointia. Blue- ja ruskea-täytetyt ympyrät edustavat seerumin miRNA nousu tai lasku (jossa mukauttamaton p-arvo 0,05), vastaavasti, mCRPC potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna.

Upotus:

Yhdeksän miRNA osoittanut 5-kertainen muutos (oikaisemattomat

P

0,05, Studentin t-testi). FC, fold-muutos. (

B) B Vahvistus mCRPC liittyvän seerumin miRNA yksittäisissä näytteissä Discovery Set yliopistosta Washington näytteitä.

Ylä

: miRNA biomarkkereiden ehdokasta mitattiin yksittäisissä näytteissä TaqMan miRNA qRT-PCR (

P

osoittama Wilcoxonin rank test), jossa miRNA runsaus on annettu suhteen miRNA kappaletta /ul seerumia. Punaiset palkit, keskiarvo +/- SEM miRNA kopiota /il seerumia kullekin ryhmälle.

Ala

: Receiver operating (ROC) käyrät juoni herkkyys vs. (1 – spesifisyys) arvioida kykyä kunkin miRNA biomarkkerina erottaa tapauksia valvontaa.

(C) B validointi mCRPC liittyvän seerumin miRNA itsenäisessä Validation Set.

Ylä

: Seerumin pitoisuus (kopiota /ui) miR-141, miR-375, miR-200c, miR-200a ja miR-210 mitattiin TaqMan miRNA qRT-PCR. Dot-juoni liittyy

P

arvot määrittämä Wilcoxonin-rank-testi. Dot tontteja ja ROC käyrät muodostettiin kuvattu Fig. 1.

Ala

:

punainen

, tulokset validointi näytejoukko saatu Michiganin yliopistossa.

Musta

, tulokset perusnäytteeseen asettaa saatu University of Washington toistettu kuviosta. 1

B

, alempi

. AUC, alue käyrän alla; mCRPC, eturauhassyöpä potilaiden seerumit; FC, fold-muutos; CTL, kontrolliseerumit (mistä samanikäisiin uros yksilöiden normaalin PSA ja negatiivinen digitaalinen peräsuolesta tentti).

Validoida nämä havainnot riippumattomalla näytesarjan kerätty eri laitos, mittasimme miR-141 , miR-200a, miR-200c, miR-375 ja miR-210 seerumista vielä 21 mCRPC potilasta ja 20 ikä-haun terveillä verrokeilla kerätty Michiganin yliopistossa. Kaikki viisi miRNA kohosivat seerumista mCRPC tapauksissa suhteessa kontrolleihin tässä itsenäinen validointi asetettu. MiR-141, miR-375 ja miR-210 oli merkitsevä

P

-arvo kynnyksen 0,01 toisessa kohortissa (

P =

0,001,

P =

0,021,

P =

0.022, vastaavasti) ja miR-200a ja miR-200C taipumus kohti merkitys (

P =

0,073,

P =

0,055, tässä järjestyksessä) (Fig. 1

C

,

ylempi

). ROC käyrät olivat yleensä yhtäpitäviä välillä näytteen settejä kahden toimielimen (Fig. 1

C

,

pienempi

). Analyysi seerumin miRNA markkereita eri yhdistelminä osoitettu, että lisäämällä ylimääräisiä miRNA seerumin miR-141 (jolla oli paras suorituskyky yksin) ei paranna kykyä erottaa tapausten ja kontrollien välillä (tuloksia ei ole esitetty). Tämän mukaisesti havainnon, huomasimme, että joukossa syöpätapausta, joissa ilmentyminen miR-141, miR-200a, miR-200c, ja miR-375 oli suurempi kuin kaikkien terveiden verrokkien, nämä miRNA myös korreloi merkitsevästi keskenään ja seerumin PSA (taulukko S2). Sen sijaan miR-210 ei osoittanut merkittävää korrelaatiota tahansa näistä neljästä miRNA (taulukko S3) kanssa eikä seerumin PSA, mikä viittaa siihen, että se tarjoaa erillistä tietoa taudista biologiasta.

Voit selvittää viiden seerumin miRNA markkereita ja mCRPC ilmaistaan ​​eturauhassyöpäkudoksen, ja se voisi näin ollen olla uskottavasti syöpäsolujen johdettu, mittasimme niiden ilmentyminen epiteelisoluissa, jotka olivat laser talteenotto mikro-leikeltiin ensisijainen eturauhassyöpäkudoksille (

n =

8) ja imusolmukemetastaaseja (

n =

8). Olemme havainneet miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-375 ja miR-210 kaikissa kudostyypeissä arvioidaan (taulukko S3), mikä viittaa siihen, että nämä viisi miRNA, kun havaitaan verenkierrossa, voi olla peräisin eturauhassyövän, vaikka lisäksi muista lähteistä ei voida sulkea pois.

Kolme seerumin eturauhasen syöpään liittyvän miRNA tunnistettu (miR-141, miR-200a ja miR-200C) ovat epiteelin-erityisiä, erittäin liittyviä järjestyksessä ja ovat tunnettuja rooleja säilyttäen epiteelin tilassa tukahduttaminen epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon [4]. Oletamme, että kohonneet veressä miR-141, miR-200a ja miR-200C heijastavat epiteelin alkuperä eturauhassyöpäsolujen.

Läsnäolo kohonnut kiertävän miR-141 ja miR-375 mCRPC potilailla on myös havaittu viime mCRPC kiertävän miRNA biomarkkereiden tutkimuksia [12] – [16]. Mielenkiintoista, kohonnut miR-210 ei raportoitu näissä muissa tutkimuksissa, huolimatta siitä, että huomasimme tämän itsenäisessä näyte asetetaan kahdesta eri toimielimissä. Tämä voi johtua eri vertailu ryhmät käyttivät (esim paikallinen eturauhassyöpä sijaan terveillä verrokeilla kuin vertailuryhmässä ja mCRPC), käyttö plasman sijasta seerumi, erot tietojen analyyttinen lähestymistapa käyttää tunnistamaan ilmentyvät eri miRNA sekä mahdolliset erot kliinisissä ominaisuudet mCRPC potilaista eri tutkimuksessa.

kohonneet miR-210 seerumissa potilailla, joilla on mCRPC oli erityisen kiinnostava, koska tämä miRNA on hyvin tiedetään transkriptionaalisesti aktivoida hypoksia indusoitavissa 1 alfa (HIF-1α) [17], [18] ja saattaa osaltaan sopeutumista hypoksia kasvaimissa [19], [20]. Tämä nostaa esiin sen mahdollisuuden, että miR-210 on tuottanut ja vapautuu hypoksinen eturauhasen solujen syöpä (ja /tai kasvaimen mikroympäristössä), mahdollinen selitys kohonneet miR-210 havaitsimme seerumissa osajoukon potilaille, joilla on mCRPC.

voit testata, onko hypoksia voivat stimuloida tuotantoa ja vapautumista miR-210 eturauhassyöpäsoluissa, me tunnettu miR-210 runsaus LNCaP ja VCAP eturauhassyövän solulinjoissa (sekä suodatettua väliaine) alla normoxic (20% O

2) ja hypoksinen (1% O

2) olosuhteet yli 72 tunnin ajan myötä (Kuva. 2). miR-210 kohoamiseen hypoksia verrattuna normoksia joiden alkuperäinen induktio LNCaP-soluissa mitä seuraa lisääntynyt taso medium (Fig. 2). Vuonna VCAP soluissa, emme noudattaa samoja kasvu miR-210 kopiota /ng RNA ja tasot laskivat 72 tuntia. Me spekuloida, että tämä voisi johtua solukuoleman tai vaihtoehtoisesti että sääntely miR-210 vastauksena hypoksia VCAP solut voivat olla ensisijaisesti esiintyvä tasolla julkaisu. Emme kuitenkaan havaita portaittain, ajasta riippuva nousu tason solunulkoisen miR-210 elatusaine on Vcap soluja (Fig. 2). Yhdessä tulokset osoittavat, että kohonneet miR-210 seerumissa voisi heijastaa kasvaimen hypoksia.

Vasen sarake,

miR-210 kopiota /ng RNA: ta LNCaP ja VCAP ihmisen eturauhassyövän solulinjoja viljeltiin normoxic (20% O

2) (valkoiset pylväät) tai hypoksinen (1% O

2) (siniset palkit) edellytykset 24, 48 tai 72 tuntia.

Oikea palsta,

miR-210 kopiota /ul suodatettu väliaine vastaa solun näytteitä. *,

P

arvo 0,05; **,

P

arvo 0,01; ***,

P

arvo 0,001 (Studentin t-testi).

kasvain hypoksia on hyvin tunnettu prosessi, joka edistää syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden monissa ihmisen syövissä [21]. Arviointi kasvaimen hypoksia mCRPC on rajoitettu mennessä johtuen harvoin näytteenotto etäpesäkkeiden rutiini potilaiden hoitoa. Vuonna immunohistokemiallista tutkimuksessa HIF-1α lauseke, joka sisällytetty pieni joukko eturauhassyöpäetäpesäkkeet, HIF-1α ilmentyminen havaittiin vaihtelevan suuresti etäpesäkeleesioita [22]. Tässä osoitamme, että osajoukko Metastasoivassa eturauhassyöpä on lisääntynyt seerumin miR-210, jotka osoittavat aiemmin aliarvostettu hypoksian mCRPC. Vaikka ei-kasvainkudoksessa lähteitä miR-210 ei voida sulkea pois, että systeeminen hypoxemia ei ole tyypillinen piirre mCRPC on yhdenmukainen malli, jossa kasvain kudoshypoksiaa on peräisin ylimäärä seerumin miR-210. Erityisesti kohonnut kiertävän miR-210 on havaittu myös potilailla, joilla haiman adenokarsinooma [23], sairaus, jossa kasvain hypoksia on hyvin tunnustettu ja johtuu korkea interstitiaalinen paineen ansiosta isännän desmoplastic vastaus.

hyvin dokumentoitu ilmiö liittyy kasvaimen hypoksia on yhdessä vastustuskykyä sädehoidon, kemoterapian ja muita hoitoja [21]. Sen määrittämiseksi, onko havaittu seerumin miR-210 tasot olivat yhteydessä hoidon vastus, me takautuvasti arvioi potilaat vastaamasta tai resistenttejä jatkuvaa hoitoa laskemalla% PSA muutos /päivä käyttäen saatavilla kliinistä PSA-arvot mitattiin viimeksi ennen ja aikaan seerumin miR-210 piirtää. Therapies vaihteli potilaiden tässä retrospektiivinen väestö, mutta tyypillisesti mukana androgeenien puute hoitoa käyttämällä GnRH-agonistia yhdessä kemoterapeuttisen aineen (esim doketakseli mitoksantronia). Huomasimme, että seerumin miR-210 tasot olivat merkitsevästi korreloivat% PSA muutos /päivä hoidon aikana (Fig. 3

, Pearson r = 0,46,

P =

0,029). Aiheutuvien mahdollisten melun potilailla, jotka ovat vähemmän tietoa alhaisten tasojen syöpään liittyvän seerumin miRNA, analysoimme myös potilasalaryhmässä joilla on korkea mCRPC liittyvän seerumin miRNA (eli ”miRNA-korkea osajoukko”, määritellään potilaat joiden seerumin miR-141, miR-200a, miR-200c ja /tai miR-375-tasot olivat suuremmat kuin korkein arvo havaittu missään 25 tervettä verrokkia). Tässä ryhmässä korrelaatio seerumin miR-210 ja% PSA muutos /päivä oli vieläkin voimakkaampi (Fig. 3

, Pearson r = 0,61,

P

= 0,029). Lisäksi seerumin miR-210 oli silmiinpistävän pienempi potilailla, joiden sairaus oli reagoi hoitoon (PSA vakaat tai laskussa), verrattuna niihin, joiden sairaus oli resistentti hoitoon (PSA lisääntyi ≥25%) (Fig. 3

B,

P

=

0,001). Mikä tärkeintä, emme noudata tätä yhdessä neljän muun seerumin miRNA tunnistettu tutkimuksessamme (Fig. 3

C

). Meidän tiedot osoittavat, malli, jossa kasvoi hypoksiavaste signalointi on läsnä osajoukko mCRPC potilailla, mikä johtaa seerumin miR-210 ja hoidon kesto.

Ylä:

miR-210 kopiota /il seerumia versus% PSA muutos /päivä. % PSA muutos /päivä edustaa mitta hoitovastetta ja laskettiin käytettävissä kliinisiä PSA-arvot mitattiin viimeksi ennen, ja aikaan seerumin miR-210 piirtää. Mean välinen aika kahden veren tasapeliä oli 30 päivää. Suljetut ympyrät edustavat potilasryhmässä määritelty ”miRNA-korkea”, joka perustuu korkeampia runsaasti mCRPC liittyvän seerumin miRNA verrattuna kaikkiin verrokkiyksilöitä (kuten on kuvattu Tulokset ja keskustelu). Avoimet ympyrät edustavat potilaalla on mCRPC jotka eivät täytä määritelmää ”miRNA-korkea”. Yhtenäinen viiva edustaa suuntaus rivin miRNA-korkea potilaiden alaryhmässä, katkoviiva suuntaus linja kaikilla potilailla.

Middle:

miR-210 kopiota /ul seerumia potilailla joko PSA Response (R) tai Ei PSA Response (NR). PSA Response määritellään laskemassa tai vakaa PSA (muutoksista alle 25%: n nousu), ja ei PSA Response määritellään PSA kasvua 25% tai enemmän, samanlainen Eturauhassyöpä työryhmän kriteerit.

Ala:

Kopiot /il seerumia miR-141, miR-200a, miR-200c ja miR-375 potilailla, R ja NR.

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti verenkierrossa miR-210 yhdessä mCRPC. Tuloksemme esiin mahdollisuuden, että seerumin miR-210 tasoja voidaan käyttää tunnistamaan biologisesti erillisiä, osajoukko mCRPC potilailla, joilla on kasvaimeen liittyvien hypoksia, jolle kehittää vaihtoehtoisia terapeuttisia lähestymistapoja voidaan harkita. Esimerkiksi plasman miR-210 tasojen on raportoitu olevan koholla haimasyövän potilaille ja indikaattorina hypoksian [23], [24], samoin kuin korreloi vastauksena trastutsumabi syöpäpotilaista [25]. Lisäksi mTOR estäjiä tutkitaan eturauhassyövän, ja pre-kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että mTOR esto voi johtaa AKT aktivointi ja HIF-1α transkription aktivaation [26].