Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syövän vastainen toiminta Berberiini (BBR) on raportoitu laajasti erilaisissa syöpäsolun linjat. Kuitenkin minimaalinen inhiboiva pitoisuudet BBR vaihtelivat suuresti eri solulinjojen ja hyvin vähän tutkimuksia on omistettu selventää tätä näkökohtaa. Tässä tutkimuksessa käytimme kolme syöpäsolulinjoilla, HepG2, HeLa- ja SY5Y, verrata kuljetuksen ja jakelun BBR. HPLC Tulokset osoittivat, että BBR kykeni läpäisemään kaikki solulinjat taas kumulatiiviset pitoisuudet olivat merkittävästi erilaiset. HepG2-soluissa kertynyt korkeampi BBR pidempi kuin kaksi muuta solulinjat. Molecular telakointi tutkimukset paljastivat BBR sitoutumiskohta P-glykoproteiinin 1 (P-gp). Lisäksi olemme selvitetty, että BBR säännelty P-gp: n sekä mRNA ja proteiini tasoilla. BBR aiheuttama transkription ja translaation P-gp HeLa ja SY5Y soluja, kun taas BBR esti P-gp ilmentymistä HepG2-soluissa. Lisäksi tutkimus osoitti, että BBR säätelee P-gp ilmentymisen riippuen erilaisia ​​mekanismeja (tai vaikuttavat erilaiset tekijät) erilaisissa solulinjoissa. Yhteenvetona, tutkimuksemme on paljastanut useita mekanistinen näkökohtia BBR asetus P-gp eri syöpäsolulinjoissa ja voivat tuoda joitakin hyödyllisiä oivalluksia käyttöä BBR anti-syövän lääkekehityksessä.

Citation: Pang YN, Liang YW, Feng TS, Zhao S, Wu H, Chai YS, et al. (2014) Kuljetus Berberiini osaksi HepG2, HeLa- ja SY5Y Cells: A Korrelaatio sen syövän vaikutusta. PLoS ONE 9 (11): e112937. doi: 10,1371 /journal.pone.0112937

Editor: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, University of Kreeta, Kreikka

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2014; Hyväksytty 17. lokakuuta 2014; Julkaistu: 17 marraskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (81374006 ja 81073092) ja National S T Major Special Project New Drug R 40 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 60 ° C 10 sekuntia, 72 ° C 20 s; 72 ° C: ssa 10 minuuttia ja jäähdytettiin 4 ° C: ssa. Data käsiteltiin käyttäen LC-480 II ohjelma (Roche, USA).

Western blot

proteiini näytteet valmistettiin ja niitä käytettiin Western-blottauksella, kuten on kuvattu aiemmin [22]. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia. Proteiininäytteet erotettiin 8% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (TBS-puskuri, joka sisälsi 0,05% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-ainetta laimennettuna 3% maitoa TBST 4 ° C: ssa yön yli. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat hiiren monoklonaalinen anti-P-gp (1:500, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), GFP (1:3000, Abmart, Shanghai, Kiina) ja β-aktiini (1:2000, Boster Biotekniikka Wuhan, Kiina). Toiseksi käytetty vasta-aine oli vuohen anti-hiiri-HRP-vasta-ainetta (1:1000, ZSGB-BIO, Kiina), minkä jälkeen kemiluminesenssin, kuten on kuvattu [21].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SD ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). F Testi suoritettiin käyttäen Excel-ohjelmisto Office 2007 (Microsoft, US). Kun F-testin, opiskelijan

t

-testi kahden ryhmän välillä suoritettiin. Yksisuuntainen ANOVA

t

-testi käytettiin analysoimaan eroja sarjaa dataa Graph Pad Prism 5.0 ohjelmisto (Graph Pad, San Diego, USA).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

sisäänotto soluihin BBR

solunsisäinen jakauma BBR on tärkeää ymmärtää rooli BBR kuin syöpälääke. Meillä työskentelee kolme edustaja solulinjoissa: HepG2, HeLa ja SY5Y analysoida BBR jakeluun [23] – [26]. Myrkytön annos BBR (0,5 ug /ml) käytettiin koko tutkimuksen tulosten perusteella on sytotoksisuuskokeeseen ja kuolleisuutta käyrät (kuviot. 1A-F). Konfokaalimikroskoopilla kuvattu BBR jakelu elävissä soluissa (kuvio. 2A), paljastaa, että BBR voi tulla HepG2, HeLa ja SY5Y solujen sisällä 1 tunnin kuluttua lääkehoidon (kuviot. 2B, C). Valtaosa BBR oli sytoplasmassa ja mitään ilmeistä ydinvoiman merkintä oli havaittu. Aiemmat raportit ovat osoittaneet BBR syöttää tuman ja kilpailla TBP (TATA Box Binding proteiini) ja TATA Box PC12-solujen [14]. Olemme kuitenkin laiminlyönyt tumaan jakautuminen BBR näissä kolmessa syöpäsolulinjoissa.

(A-F) sytotoksisuus ja kuolleisuutta BBR käyttäen MTT-määritystä. (A, B) HepG2, (C, D) HeLa. (E, F) SY5Y. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,005, tilastollista merkitystä BBR käsiteltyjen ryhmien suhteessa kontrolliin ryhmille. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kuudesta itsenäisestä kokeesta (n = 6).

(A-I) Kuvia solunsisäisen sijainnin BBR soluissa ennen ja jälkeen 0,5 ug /ml BBR anto 1 h. (A-C) HepG2-soluissa; (D-F) HeLa-soluissa; (G-I) SY5Y-soluissa. Fluoresenssi BBR näkyy vihreällä, ero häiriöitä kontrasti (DIC) luvut edustavat laajuus solujen ja asteikko bar on 10 pm.

Sitten käytimme HPLC ja LC /MS kvantitatiivisesti analysoimaan solunsisäinen pitoisuus BBR HepG2, HeLa ja SY5Y solujen jälkeen solun sisälle pääsyä. Tulokset osoittivat, että BBR voidaan tehokkaasti erottaa ja havaita käyttämällä HPLC mukaisesti ilmoitettu olosuhteissa (kuviot. 3A-C). Standardi käyrät BBR osoittaneet vahvaa signaali-kohina-suhde ja hyvä lineaarinen suhde (R

2 = 0,999) välillä piikin pinta-ala ja pitoisuus BBR (Fig. 3d). Oli eroja oton BBR joukossa kolme solulinjat. HPLC-määritys osoitti, että HepG2-soluissa, BBR suurin pitoisuus (C

max) oli noin 2188,8 pmol /mg noin 12 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 3E). C

max BBR HeLa ja SY5Y olivat 357,8 pmol /mg ja 65,5 pmol /mg, vastaavasti (kuviot. 3F, G). Kolmen tunnin kuluttua pitoisuudet BBR HeLa ja SY5Y solut tulivat alas. On osoitettu, että BBR oli kertynyt korkeammalle tasolle HepG2-soluissa kuin toiset.

(A-C) HPLC-kromatogrammit. (A) Standard BBR; (B) Tyhjä näyte BBR käsitellyistä soluista; (C) näytteet solujen BBR hallinto 12 tuntia. (D) Standard käyrät BBR pitoisuus jakeessa AU intensiteetti käyttäen HPLC-määritystä. (E-G) kineettinen käyttäytyminen BBR soluissa in juoni hallinnon kanssa aika 24 tuntia. (E) HepG2; (F) HeLa; (G) SY5Y-soluissa. (H, I) LC /MS kromatogrammit BBR HepG2-soluissa annon jälkeen 24 tuntia. (H) massaspektri BBR; (I) kromatogrammissa BBR. Standard BBR näytettiin vihreää; näyte osoitettiin violetti väri. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kuudesta itsenäisestä kokeesta (n = 6).

Lisäksi ymmärtää, onko suurempi BBR pitoisuus HepG2-soluissa johtui rooli HepG2 aktiivisesti metabolizing BBR pystytimme LC /MS analysoida metaboliitti tuotteita BBR soluissa. Kuten raportoitu, on olemassa aineenvaihduntatuote tuotteita BBR suun kautta tai injektion ottoa rotilla [27]. Emme kuitenkaan ole havainnut mitään niistä HepG2-soluissa (kuviot. 3H, I), mikä viittaa siihen, BBR säilyi ehjänä HepG2-soluissa [28].

P-gp on merkittävä effluksitransportteri of BBR

vahvistaa roolia P-gp in ulosvirtausta BBR HepG2, HeLa ja SY5Y solujen selektiivisen P-gp-salpaaja, Zosuquidar (LY335979, Selleckchem, USA) käytettiin [29], [30]. Kuten on esitetty kuviossa. 4, Zosuquidar tehokkaasti lisääntynyt pitoisuus BBR HepG2, HeLa ja SY5Y soluja, mikä viittaa siihen, että P-gp on merkittävä BBR effluksitransportteri näissä soluissa. Nämä tulokset olivat hyvin yhtäpitäviä aiempien tutkimusten kanssa, [28], [31].

Soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml BBR ja 0,3 umol Zosuquidar, estäjä P-gp toimintaa, 12 tuntia. Solunsisäisen pitoisuudet BBR määritettiin HPLC-analyysillä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3). *

v.s.

Ohjaus,

P

0,05. **

vs of the ohjaus,

P

0,005,

t

-testissä.

Molecular telakointi BBR P-gp

analysoitava tarkemmin vuorovaikutusta P-gp ja BBR tietokoneella perustuen molekyylien telakointi. Kiderakenteen ihmisen P-gp on tunnistettu tietokannasta NCBI. Siksi käytetään samaa rakennetta kuin reseptorin suorittamaan molekyylitason telakoinnin BBR. Tulokset viittasivat siihen, että BBR kykeni sitoutumaan lääkeaineen sitovan taskun P-gp (kuviot. 5A, B). Sitoutumiskohdan BBR sijaitsi ”alempi” osa sitovan taskun (kuviot. 5C, D). Liuku energia on -9,1 kcal /mol, mikä viittaa korkean sitoutumisaffiniteetin BBR P-gp.

(A) Side ja (B) ylhäältä päin BBR sitova tasku P-gp. (C, D) yleinen telakointi näkemykset BBR sitovaan taskuun P-gp. Blue mesh: proteiinin elektroni isodensity kartan ympärillä sitoutumiskohtaan. Proteiini ovat edustettuina sarjakuva (läpinäkyvyys = 20%), pieniä molekyylejä ja tärkeitä aminohappoja (kuten merkitty) ovat edustettuina linjat (valkoinen ja vihreä, hiili. Punainen, happi. Sininen, typpi). Keltainen katkoviiva, vetysidoksen.

BBR vaikuttaa P-gp: n ilmentyminen

Valaistaan ​​onko BBR säätelee P-gp: n ilmentyminen, tutkimme mRNA ja proteiini ekspressiotasot P-gp: HepG2, HeLa ja SY5Y solujen jälkeen BBR hoidon. Tulokset osoittivat, että mRNA: n P-gp lisättiin HeLa ja SY5Y-soluissa, kun taas vähentynyt HepG2-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, kun BBR hoidon (Fig. 6A). Lisäksi Western blot-analyysi validoitu nämä tulokset, jotka osoittavat, että BBR lisääntynyt P-gp: n ilmentymistä HeLa- ja SY5Y-soluissa, mutta laski ilmentymisen HepG2-soluissa (kuviot. 6B, C).

(A) mRNA: n ilmentymiä endogeenisen P-gp käyttäen reaaliaikaista PCR. (B) Western blotting-määritys osoitti muutoksia P-gp-proteiinin BBR hoitoon. (C) suhde muutokset P-gp verrattuna β-aktiini. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. 3 erilliselle kokeelle (n = 3). Pitoisuus BBR oli 0,5 ug /ml. *

v.s.

Ohjaus,

P

0,05; **

v.s.

Ohjaus,

P

0,005,

t

-testi. Sillä paneelit (A) ja (C), Vasen, HepG2; Middle, HeLa; Oikea, SY5Y.

Miten BBR säätelee P-gp ilme ei tunneta. Määrittämään vaikutuksen BBR P-gp transkription aloitusta, P-gp 1 kb promoottori fuusioitu GFP rakennettiin (Fig. 7A) ja transfektoitiin kolme solulinjoihin [19]. Näitä soluja käsiteltiin kanssa tai ilman BBR ja sen jälkeen virtaussytometrialla valinta ja RT-PCR-analyysi (kuviot. 7B-D). RT-PCR Tulokset paljastivat, että BBR ei ole sääntelyä rooli promoottorin aktiivisuuden P-gp. Lisäksi proteiini ilmentymisen taso GFP ei vaikuttanut BBR mukaan Western blotting tulokset kuvioissa. 7E-H. Koska GFP fuusioitiin P-gp promoottori plasmassa ja se ei ole läsnä nisäkässoluissa, GFP-proteiinin ilmentymisen tiedot osoittivat, ettei BBR voinut toimia P-gp promoottorin tran-.

(A ) Kaavamainen kartta P-gp 1 kb promoottori fuusioitu GFP (P-gp promoottori-GFP) rakentamiseksi. Musta, P-gp-promoottori. Green, lukukehys EGFP. (B-D) mRNA ilmaisuja P-gp 1 kb: n promoottori fuusioituna GFP: n läsnä tai poissa ollessa BBR reaaliaikaisella PCR. (B), HepG2; (C), HeLa; (D), SY5Y. (E) Western blotting testi osoitti muutokset P-gp 1 kb promoottori fuusioitu GFP proteiini BBR hoitoon. (F-H) suhde muuttuu GFP versus β-aktiini. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. 3 erilliselle kokeelle (n = 3). ”

ns”

tarkoittaa tilastollisesti merkitseviä.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ymmärtää vuorovaikutusta BBR, voimakas anti-syöpä yhdiste, ja P-gp, laajasti levitetty lääkkeen effluksitransportteri. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että pitoisuudessa 0,5 ug /ml BBR pystyi suojaamaan viljellyissä hermosolujen vaurioilta jälkeen hapen ja glukoosin puutteen [22], ja me todentaa se ei aiheuttanut vahinkoa HepG2, HeLa tai SY5Y soluja perustuu MTT-määritys . Meidän Tässä työssä, havaitsimme sisäänkäynnin BBR konfokaalimikrosko- ja kirjataan dynaaminen kertyminen BBR käyttäen HPLC ja LC /MS: llä. Tulokset osoittivat merkittäviä eroja kolmen solulinjoissa HepG2 kertynyt enemmän BBR pidempi kuin kaksi muuta solulinjat. LC /MS määritystä, löysimme ei ollut metaboliitteja BBR HepG2-soluissa jälkeen BBR annon, joka osoittaa korkea pitoisuus BBR HepG2-soluissa on vain BBR itse. Siksi, päättelimme, että HepG2 voisi kertyä enemmän BBR ja pitää sen pidempään soluissa.

Kuten kirjallisuudessa raportoitu [15], P-gp on pääasiassa vastuussa ulosvirtausta BBR. Siksi käytimme erityinen estäjä P-gp, joka tehokkaasti esti ulosvirtausta BBR ja lisääntynyt BBR pitoisuus HepG2-soluissa. Erityinen sitova tasku P-gp BBR paljastui molekyyli- telakointi ennusteen. Osittain tästä sivustosta, jonka kautta BBR voivat vaikuttaa kykyyn P-gp välittämisessä BBR ulosvirtausta, vaikka yksityiskohtainen mekanismi korreloidaan Nämä ilmiöt (sitoutuminen BBR ja ulosvirtaus tehokkuutta P-gp) on vielä tuntematon.

soveltamalla molekyylibiologian ja biokemian menetelmillä, mittasimme mRNA ja proteiini P-gp-soluissa sen jälkeen, kun BBR hoidon. Tulokset osoittivat, että BBR indusoi mRNA: ta ja proteiinia ilmaisuja P-gp HeLa ja SY5Y-soluissa, ja näin ollen edistää ulosvirtausta BBR ja vähentää pitoisuus solunsisäisen BBR. Nämä tulokset saattavat selittää havainnon, että pitoisuutta solun BBR huipussaan ja laski nopeasti näissä soluissa. Kuitenkin P-gp ilmaisu laski kasvavilla pitoisuuksilla BBR HepG2-soluissa, joka oli hyvässä sopusoinnussa se, että pitoisuutta solun BBR jatkuvasti kasaantuneet HepG2-soluissa.

Kuten kuviossa. 6 ja kuvio. 7, mRNA ja proteiini ilmauksia P-gp HeLa ja SY5Y solut sääteli jälkeen BBR annon, kun taas mRNA ilmaus P-gp promoottorissa transfektoiduissa soluissa ei sääteli. Voit tarkistaa tuloksen, suoritimme täydentävä kokeen käyttäen GFP-proteiinin ilmentymisen. Tulokset osoittivat GFP-proteiinia ilmaisut eivät olleet sääteli jälkeen BBR annon, tukemalla mRNA ekspressiotietojen P-gp: in promoottori transfektoiduissa HepG2, HeLa ja SY5Y soluja. Koska ei ole GFP-proteiinia nisäkässoluissa, GFP-proteiinia ekspressiotietojen tukevat vahvasti, että BBR ei ole ottanut kantaa promoottori P-gp.

BBR ilmoitettiin kohonneen hyötyosuutta useita yhdisteitä estämällä P- gp Caco-2 suoliston soluista [16]. Se edistää myös ilmentymisen P-gp monilääkeresistenssin syöpäsolujen mukaan lukien suun kautta (KB, OC2), mahalaukun (SC-M1, NUGC-3) ja paksusuolen (COLO 205, CT 26) syöpäsoluja [32], [33 ], mikä viittaa monimutkaisuus suhteiden BBR ja P-gp eri soluissa.

Koska BBR voinut tulla ytimet, ei ole todennäköistä, että BBR on mitään toimia DNA /geenisekvenssit, johtava mitään vaikutusta BBR P-gp promoottori transkription. Yhdistä eri P-gp ekspressiokuvioiden aiheuttama BBR, me ennustaa, että vaikutus BBR P-gp ilmentymisen pitäisi tapahtua jälkeen geenin transkription, esimerkiksi mRNA ja proteiini vakautta tai proteiini posttranskriptionaalisella muutos. Työllisyyden P-gp-salpaaja merkittävästi inhiboi P-gp: n funktiona kuljettamisesta BBR kolmen solulinjoissa, mikä osoittaa, että ei ole olemassa eroja funktio P-gp-proteiinia soluissa. Tämä viittaa siihen, että voi olla erilaisia ​​solun tekijöitä, P-gp-proteiinin ilmentymistä soluissa ja vuorovaikutusta kuvaavia keskuudessa BBR, P-gp: n ja eri signaalitransduktioreaktioteiden voi olla hyvinkin erilainen eri syöpäsolulinjoissa, mikä johtaa eri Kasvaimen vastetta solujen BBR. Tämä vaatii lisätutkimuksia.

Johtopäätökset

Yhteenvetona, tämä on ensimmäinen raportti siitä, miten BBR säänneltyjen P-gp: n toimintaa keskuudessa HepG2, HeLa- ja SY5Y syöpäsolun linjat. P-gp yhdistyy BBR jotta se voisi täyttää BBR, ja samanaikaisesti BBR häiritsee P-gp ilmaus säätelemään omaa ulosvirtausta sytoplasmaan. BBR aiheuttama ilmaus P-gp HeLa ja SY5Y soluja, mutta esti ilmaus P-gp HepG2-soluissa, todennäköisesti johtuu erillisiä malleja P-gp-proteiinia käännös. Ei ollut suoraa sääntelyä P-gp promoottori transkription, mikä osoittaa eroja asetukseen tai /ja mekanismeja, joita esiintyy HepG2-soluissa ja HeLa ja SY5Y soluja. Erot joukossa kolme solulinjojen osoitettu tässä tutkimuksessa saattaa auttaa meitä ymmärtämään syöpäsolut kyvyille omaksumisen ja kuljettaa syöpälääkkeet, myös avustaisivat tietoa mahdollisista lääkeresistenssimekanismien.

Kiitokset

Kiitämme kaikkia kollegoja laboratoriossamme. Kiitämme tohtori Yu Tian, ​​Drug Discovery Facility Tsinghuan yliopiston, että apua LC /MS havaitseminen.