Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

määritetty hiljattain, että dentiinin sialophosphoprotein (DSPP), jäsen sisaruksen (Small integriiniä sitova ligandi N-glykoproteiinien) perhe phosphoglycoproteins, on erittäin ylössäädelty ihmisen suun okasolusyöpää (OSCCs), jossa ilmentymisen lisääntyminen liittyy kasvaimen aggressiivisuus. Tutkia vaikutukset

DSPP

-silencing on kasvaimia profiilit suusyövän solulinja, OSC2 lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) häiriöt käytettiin vaientaa

DSPP

in OSC2 soluissa.

Menetelmät /Principal havainnot

Useita alueita DSPP transkriptio oli suunnattu shRNA häiriöön HDSP-shRNA lentiviraalinen hiukkaset suunniteltu hiljentää DSPP geeniekspressiota. Ohjaus shRNA plasmidi koodaa sekoitetun sekvenssin kykene hajottamaan tahansa tunnetun solun mRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Sen jälkeen puromysiiniselektion vakaiden riviä

DSSP

-silenced OSC2 solujen fenotyyppinen tunnusmerkkejä suun syövän synnyn analysoitiin Western blot ja RT-PCR-analyysit, MTT (solu-elinkelpoisuus), pesäkkeiden muodostuminen, modifioitu Boyden-jaosto (maahanmuutto ja invaasio), ja virtaussytometria (solusyklin ja apoptoosin) analyysit.

DSPP

-silenced OSC2 solut osoittivat muuttunut solujen morfologia, vähentää kannattavuus laski pesäkkeiden muodostuminen kyky laski muuttoliike ja invaasio, G0 /G1 solusyklin pidätyksen, ja lisääntynyt kasvainsolujen herkkyyttä sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Lisäksi MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, Ki-67, p53, ja EGFR olivat alassäädetty. Oli olemassa suora korrelaatio on

DSPP

-silencing ja MMP tukahduttaminen, osoitettuna neliösumman regressio: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, ja MMP-9: {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013)}.

Johtopäätökset /merkitys

DSPP

-silencing in OSC2 solussa laski keskeisiä tunnusmerkkejä suun kasvaimen kehittymisen ja tarjoaa ensimmäisen toiminnallisen näyttöä mahdollisesta avainasemassa for DSPP suun syöpäbiologian. Alas-MMP-2, MMP-3, MMP-9, p53 ja VEGF

DSPP

-silenced OSC2 solujen tarjoaa merkittävän toiminnallisen /molekyyli puitteet selvittämisessä mekanismeja DSPP toiminnan suusyövän biology .

Citation: Joshi R, Tawfik A, Edeh N, McCloud V, Looney S, Lewis J, et al. (2010) Dentin Sialophosphoprotein (DSPP) Gene-hiljentäminen Estää Key Kasvaimia synnyttävä toiminta Human Oral Cancer Cell Line, OSC2. PLoS ONE 5 (11): e13974. doi: 10,1371 /journal.pone.0013974

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2010 Hyväksytty: 12 lokakuu 2010; Julkaistu: 12 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Joshi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus (NIDCR) /National Institutes of Health (NIH) Grant # K23DE017791-01A1 (KUEO); Medical College of Georgia Research Institute (MCGRI), Inc. Grant # STP00105W005 (KUEO); ja Wendy Will Case Cancer Foundation (KUEO). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Dentin sialophosphoprotein (DSPP) on jäsen sisarusta (Small integriiniä sitova ligandi N-kytketty glykoproteiini) perheen soluväliaineen glycophosphoproteins [1]. Muut perheenjäsenet ovat luun sialoproteiinia (BSP), dentiinin matriisi proteiini 1 (DMP1), dentiinin sialophosphoprotein (DSPP), osteo- (OPN), ja matriisi solunulkoinen phosphoglycoprotein (MEPE) [1]. Expression sisaruksista ajateltiin alunperin rajoittuvan luuston ja hampaiden missä ne toimivat helpottamiseksi dentiinin ja luuta mineralisaatio [1] – [3]. Viimeaikaiset raportit kuitenkin osoittavat, että sisarukset ovat läsnä myös ei-mineralizing metabolisesti aktiivisia ductal epiteelisolujen sylkirauhaset, nephrons, ja eccrine hikirauhaset missä niiden toiminta voi liittyä korjaukseen Perisellulaarinen ja soluväliaineen (ECM) proteiineja vaurioitua vapaiden radikaalien avulla luotua intensiivistä aineenvaihdunta [4] – [6].

Aiemmat raportit ovat tunnistaneet säätely ylöspäin joidenkin jäsenten sisarukset erilaisissa syövissä, mukaan lukien rinta-, keuhko-, ja eturauhasen syöpiä [7] . OPN kuitenkin on sisarus, joista on yksiselitteinen todiste sen rooli monissa vaiheita syövän kehittymisen ja etenemisen [6] – [8]. Kertyvät tiedot alkavat syyttämään muita perheenjäseniä, etenkin BSP ja DSPP, jossa rooleja eri vaiheiden syövän etenemisen kuten solun kasvussa, tarttuvuus, muuttoliike, ja /tai etäpesäkkeiden [6] – [8]. Olemme äskettäin raportoitu säätely ylöspäin BSP, DSPP, ja OPN, ihmisen suun okasolusyöpää (OSCCs) [9] ja joissakin ihmisen suun epiteelisolujen dysplasia (OEDs) [10]. Nämä raportit osoittavat, että DSPP on hyvin säädelty huonosti eriytetty ja histologisesti aggressiivinen OSCC [9]. Merkittävää on, OEDs ilmentävät DSPP tai ilman BSP näytteille 4-kertainen taipumus siirtymisen OSCC verrattuna OEDs ilmentävät BSP yksin, mikä viittaa siihen, että DSPP ilmaisua lisäsi riskiä paikallisen ensisijainen OSCC kun BSP ilmaisu laski tällaista riskiä [10]. Kuitenkin tällä hetkellä ole tietoa toiminnalliset ja mekanistinen roolia DSPP suun syövän kehittymistä ja etenemistä.

Tässä tutkimuksessa pyritään luomaan toiminnallisen korrelaatioita DSPP ilmaisun ja biologinen käyttäytyminen OSCC, lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) häiriöt käytettiin tuottamaan vaiennettu

DSPP

in OSCC solulinjassa OSC2.

DSPP

-silenced OSC2 jälkeen solut arvioitiin sen määrittämiseksi, missä määrin hiljentäminen vaimentaa tai kumoaa avain pahanlaatuinen ilmiasun OSC2 solujen käyttäen erilaisia ​​standardin

in vitro

tekniikoita.

tulokset

DSPP on yliaktiivista suusyövän solulinjoissa, OSC2 ja SCC25 ja dysplastisia suullinen epiteelisolulinja, DOK

OSC2 ja SCC25 ovat ihmisen OSSC johdetut solulinjat alueellisista kohdunkaulan imusolmuke etäpesäke on primaaristen ihmisen kielen okasolusyöpä, ja ensisijainen kieli okasolusyöpä, vastaavasti [11] – [13]. DOK on ihmisen suullinen epiteelin dysplastic solulinja on peräisin selkä kielen [14]. Arvioida endogeenisen ilmentymisen tasot DSPP proteiinia ja mRNA: n OSC2, SCC25, ja DOK solujen western blot ja semikvantitatiivinen-käänteistranskriptaasia (RT) -PCR-analyysit suoritettiin kokosolulysaateista ja kokonais-RNA uutteet, vastaavasti, kuten on kuvattu Materiaaliin ja menetelmät. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit koostuivat kokosolulysaateista ja kokonais-RNA otteita MCF-7 cell (peräisin nisärauhassyöpä) ja HOK soluja (peräisin ensimmäisen kulttuuri ihmisen suun keratinosyyttien), tässä järjestyksessä. DSPP merkittävästi yliaktiivista OSC2, SCC25 ja DOK verrattuna HOK solut translaation (kuvio 1A) ja transkription (kuvio 1 B) tasojen. Nämä

in vitro

havainnot ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia meidän viime tutkimuksiin, jotka osoittavat ylös-säätely DSPP sisään OSCC potilailta, ja sen täydellinen puuttuminen normaalissa suun limakalvon epiteelin [9].

(A) Western blot (WB) ja densitometristen analyysit osoittavat merkittävää voimistumista DSPP vuonna OSC2, SCC25, ja DOK soluja verrattuna HOK negatiivisiin kontrolleihin. On pohjapinta ( 10%) tasosta DSPP ilmentymisen ensisijainen HOK soluissa. MCF7 solulinjan tiedetään ilmentävän DSPP käytettiin positiivisena kontrollina. Normalisointi oli kanssa β-aktiini. (B) semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoittaa DSPP-mRNA: n ekspression OSC2, SCC25, ja DOK solujen yhdenmukainen WB tulokset (A), jossa ei havaita DSPP-mRNA-tasot HOK solussa. Normalisointi oli kanssa GAPDH. Solut, joita käytetään tutkimuksessa: OSC2, ihmisen OSCC solulinja on peräisin alueellisten kohdunkaulan imusolmuke etäpesäke on primaaristen ihmisen kielen okasolusyöpä; SCC25, ensisijainen kieli okasolusyöpä; DOK, ihmisen suun epiteelin dysplastic solulinja on peräisin selkä- kieli; ja MCF7 (kirjainlyhenne Michigan Cancer Foundation – 7), ihmisen rintasyövän solulinjaa, joka on eristetty 69-vuotiaan valkoihoinen nainen.

Transient DSP-shRNA transfektiotulokset muuttuneessa morfologia OSC2 solujen

Todettuaan perustason ekspressiotasojen DSPP kahdessa OSCC solulinjoissa etenimme tutkimaan, kuinka vakaa

DSPP

-silencing kautta lentiviraalinen välittämän pieni hiusneula-RNA (shRNA) häiriö vaikuttaa kasvaimia profiilit OSC2 soluja. Valitsimme OSC2 solut heidän SCC25 vastine, koska todistettavasti korkeampi ilmentymistaso DSPP on OSC2 soluissa sekä proteiini- ja mRNA-tasot (kuvio 1), ja myös siksi, OSC2 soluilla erittäin vahva invasiivisia fenotyypin osoituksena kokeellisissa nude hiiren malleissa [11 ] – [13]. Jotta voitaisiin arvioida välittömiä vaikutuksia DSP-shRNA transfektion on OSC2 solumorfologiaan, transfektoidut solut yhdessä valvontaa valokuvattiin 24- ja 48-tunnin transfektion (ohimenevä vaihe) ennen aloittamista puromysiiniselektion stabiilisti transfektoitujen solujen. Kuten kuvioissa 2C ja 2F (havainnollistava alueet valokuvattu), DSP-shRNA transfektoitujen OSC2 soluista osoitti selvästi suurempi määrä solujen huomattava menetys solu-solu yhteyttä ja entistä munanmuotoinen ja epäsäännöllinen ääriviivat verrattuna ei-transfektoitujen OSC2 soluissa (kuvio 2A) tai salattu sekvenssiohjaukset (kuviot 2B, 2E). Fluoresenssimikroskopia väliaikaisesti transfektoitujen coGFP-shRNA kloonit osoittivat vahvaa vihreän fluoresenssin osoitus suuri osa transfektiotehokkuutta (kuvio 2D). Jatkoimme vakaan DSP-shRNA-vaiennetaan OSC2 soluihin puromysiiniselektion jotta selvittää, missä määrin mahdolliset muutokset muissa keskeisiä fenotyypin tunnusmerkkejä OSCC.

(A) OSC2 soluja ennen lentiviraalinen transduktoitu- transfektio DSP-ShRNA näytteille morfologia elinkelpoisten epiteelikasvainsolut viljelmässä. (B, E) Salattu (kontrolli) sekvenssin transfektoitiin OSC2 solujen 24- ja 48 h, joilla eläviä epiteelisoluja ja morfologia on verrattavissa (A). (C, F; havainnollistava alueet) DSP-shRNA transfektio OSC2 soluja, joilla merkittävästi lisääntynyt määrä solujen menetys solu-solu yhteyttä, monipuolisemman ja epäsäännöllinen ääriviivat, näkyvästi ydinvoiman kupliminen, ja solujen hajoamisen yhdenmukaiset veltto ja kuolevien solujen 24- ja 48-h, vastaavasti. (D) copGFP transfektoidut OSC2 solujen vahvistaa erittäin korkea transfektiotehokkuus (vihreä fluoresenssi).

Generation vakaan

DSPP

-silenced OSC2 solulinja

Stable linjat DSP-vaiennettu ja salattu sekvenssiohjaukset valittiin avulla puromysiiniresistenssin antibioottien kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tehokkuus DSP-shRNA lentiviraalinen rakentaa stabiilisti hiljentäminen DSPP in OSC2 soluissa varmistettiin western blot ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysit. Kuten kuviossa 3 on esitetty, Western blot ja densitometrinen analyysit kuuden eri DSP-shRNA transfektoidut OSC2 vakaa linjat osoittivat DSPP hiljentäminen välillä -5% [Line (L) 4] ~95% L2 verrattuna vakaa shRNA-salattu sekvenssi (SHC ) ohjaus (kuvio 3A). Nämä tulokset varmistettiin vielä immunofluoresenssilla konfokaalimikroskopiaa osoittaa vähensi merkitsevästi DSPP signaali (vihreä fluoresenssi) L2 vakaa linjojen verrattuna ohjaus (kuvio 3C).

Stable riviä valikoima lentiviruksen transdusoimattomien shRNA valmistus toteutettiin puromycine valinta. (A) WB ja vastaavia densitometristen analyysit tason DSPP-hiljentäminen valinnan jälkeen kuudesta vakaa riviä osoittavat taso hiljentäminen vaihtelee -5% (linja [L] 4) ~95% (L2) verrattuna salattu sekvenssi (SHC) ohjaus. (B) qRT-PCR-analyysi osoittaa vähensi merkitsevästi DSPP-mRNA DSPP-vaiennetaan L1 ( 90%) ja L2 ( 95%) solujen (näytteille eniten knockdown WB) verrattuna SHC valvontaa. (C) Immunfluorescence konfokaalimikroskopia varmentaa DSPP-hiljentäminen kuin vähensi merkittävästi DSPP signaali (vihreä fluoresenssi) L2.

Samalla olemme todennettu tehokkuutta DSP-shRNA in heikentävien DSPP mRNA lentivirally infektoiduissa soluissa by qRT-PCR käyttäen L1 ja L2 näytteille eniten knockdown on kuusi riviä (katso kuva 3A) on western blot. Tulokset osoittavat vähensi DSPP mRNA tasoilla L1 ( 99%) ja L2 ( 95%) verrattuna shRNA SHC ohjauslinja (kuvio 3B). C

T-arvoja qRT-PCR-analyysi suhteellisten DSPP mRNA tasot SHC ohjaus ja

DSPP

-silenced L1 ja L2 normalisoituivat kanssa taloudenhoito geeni GAPDH. Tämä shRNA välittämä vaikutus oli spesifinen, koska GAPDH tasot eivät eronneet merkittävästi joukossa DSP-shRNA transfektoiduissa soluissa ja valvontaa.

DSPP

-silencing vähentää p53, Ki-67 ja PCNA, ja estää soluproliferaatiota ja pesäkkeitä muodostumista OSC2 soluissa

vaikutukset

DSPP

-silencing tasoista proliferatiivisen merkki, Ki-67, PCNA, ja solusyklin säädin p53 analysoitiin western blot kaikkien kuuden

DSPP

-silenced OSC2 vakaa linjat. Verrattuna SHC ohjausjohto, tasot Ki-67, PCNA, ja p53 pienenivät merkittävästi, mikä osoittaa, että DSPP voi parantaa proliferaatiota suun syöpäsoluissa kautta mekanismit, joihin liittyy p53, Ki-67, ja PCNA (kuvio 4A).

(A) WB ki-67, PCNA, ja p53 seuraavat

DSPP

-silencing in OSC2 soluilla merkittävää downregulation kutakin näistä proteiineista. (B) lisääntyminen tila

DSPP

-silenced OSC2 soluja verrattuna vanhempien OSC2 ja SHC ohjaus toteutetaan kautta MTT-analyysi osoittaa vähentynyt solujen lisääntymistä 53%: L2 (osoitetaan eniten aste hiljentäminen) verrattuna 5% L4 (vähiten hiljentämisen), ja -30% ja L6 (kohtalainen hiljentäminen) ja SHC ohjaus (p 0,05; n = 3). (C) L2 solut muodostivat pienempiä ja huomattavasti vähemmän ( 25%) pesäkkeitä pehmeässä agarissa verrattuna vanhempien OSC2 ja SHC ohjaus soluja (* p 0,05).

Jotta laajuuden määrittämiseksi johon

DSPP

hiljentäminen vaikuttaa leviämisen OSC2 soluja, suoritimme MTT määritykset kolme kuudesta

DSPP

-silenced stabiileja linjoja, jotka sisälsivät L2 osoittaa korkeaa

DSPP

-silencing, L4 osoittaa vähiten hiljentämisen, ja L6 osoittaa, kohtalainen hiljentäminen. Verrattuna SHC ohjaus ja vanhempien OSC2 solulinjat, vaimentaminen

DSPP

liittyi keskimäärin 53%: n lasku solujen lisääntymisen päivänä 6 L2 (kuvio 4B; P 0,05; n = 3). Suhteen kyky muodostaa pesäkkeitä, L2 solut muodostivat pesäkkeitä pehmeässä agarissa, jotka olivat huomattavasti pienempiä ja vähemmän kuin tuonti SHC valvontaa ja vanhempien OSC2 soluista (kuvio 4C). Pesäkkeiden lukumäärä muodostuu L2-soluissa oli merkittävästi vähentynyt ( 25% vanhemman OSC2 solujen ja noin 20% SHC-ohjattu), kuten on esitetty kuviossa 4C pylväsdiagrammi. Nämä tulokset viittaavat siihen merkittävä tehtävä jo DSPP suun syöpäsolujen kasvua ja leviämistä. L2-solut osoittavat merkittävin määrin

DSPP

-silencing kaikista kuusi riviä käytettiin varten tutkimuksia vaikutuksista hiljentäminen muuttoliikettä ja invaasio, ja solusyklin toimintaa.

DSPP

-silencing vähenee OSC2 maahanmuutto- ja invaasion

Kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa, teimme hyökkäyksen ja muuttoliike määritykset käyttämällä muunnettua Boyden jaosto kokeiluja, jotta voidaan määrittää, missä määrin

DSPP

hiljentäminen vaikuttaa muuttoliike ja invaasion OSC2 soluja. Kuten kuvassa 5, vaimentaminen

DSPP

(L2) laski invaasiota (kuvio 5A) ja muuttoliike (kuvio 5B) ja OSC2 solun 25% kussakin tapauksessa, verrattuna SHC ohjaus ja vanhempien OSC2 solut (p L2 =

DSPP

-silenced OSC2 solujen rivi 2; OSC2 = vanhempien (ilman Knockdown) OSC2 solut, M1 = eläviä soluja; M2 = paljon soluja.

Lisäksi, taso EGFR väheni merkittävästi L2-soluissa verrattuna SHC valvontaa, mikä viittaa siihen, että EGFR inhibitio tarvitaan sisplatiinin indusoiman apoptoosin OSC2 soluissa (kuvio 7C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DSPP hiljentämisen OSC2 soluissa, kun taas johtaa G

0 /G

1 pidätys (katso kuvio 6A) ja näin ollen vähentänyt lisääntymisaktiivisuus, ei lisää apoptoosia; kuitenkin DSPP tukahduttaminen voi merkittävästi parantaa herkkyyttä OSC2 solujen sisplatiinin indusoiman apoptoosin kautta mekanismi johon downregulation EGFR.

Stable

DSPP

-silencing in OSC2 soluissa vaimentaa MMP-2, MMP -3, ja MMP-9 ilmaisuja

Aiemmat raportit ovat tunnistaneet tiettyjä vuorovaikutukset joidenkin jäsenten sisarus perheen proteiinien kanssa näytematriisi (MMP). Erityisesti BSP kumppanit proMMP-2, OPN kanssa proMMP-3, ja DMP-1 proMMP9 aktivoimiseksi vastaavien proteaasien [4], [17]. Kuitenkin MMP kumppani (t) DSPP ja MEPE mahdollisesti ei ole tunnistettu. Kuitenkin, pyrimme määrittämään ilmentymisen aseman näissä kolmessa tunnettujen rinnakkaiskohde-kumppaneita MMP: t kaikissa kuudessa syntyy

DSPP

-silenced OSC2 linjat.

Kuten Western blot ja densitometrinen analyysit, tasot sekä pro- ja aktivoitua MMP-2, MMP-3, ja MMP-9 pitoisuus väheni kaikissa vaan yksi kuudesta

DSPP

-silenced OSC2 linjat verrattuna SHC säätimet (kuviot 8A, 8B). Yhtä merkittävää on suora korrelaatio on

DSPP

-silencing ja MMP tukahduttaminen, osoitettuna neliösumman regressioanalyysillä kautta alkuperä: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}, MMP-3 {(y = 0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, ja MMP-9: {(y = 1.248x, p = 0,005 , y 0,809, p = 0,013); Kuva 8C)}. Kuitenkin taso MMP tukahduttaminen ei eronnut merkitsevästi pro- ja pilkotaan muotoja. Samoin lasku VEGF tasot vakaa

DSPP

-silenced linjat vaihtelivat 5% (L4) ja 86% (L2) kanssa taso tukahduttaminen suoraan verrannollinen asteeseen

DSPP

-silencing (kuvio 8D), mikä viittaa siihen, annoksesta riippuva suhde DSPP ilmaisun ja angiogeeninen aktiivisuus OSCCs. Yhdessä nämä tulokset viittaavat säätelyroolia varten DSPP vuonna säätely ja aktivointi sisarus-kumppaneina MMP sekä angiogeneesiä suusyöpää.

(A) WB ja (B), jotka vastaavat densitometristä analyysit osoittavat merkittävää alaspäin sääntely pro- ja aktivoitua MMP-2, MMP-3, ja MMP-9 kaikissa paitsi yhdessä (L4) kuudesta

DSPP

-silenced vakaa linjat. (C) Vähiten neliö regressio analyysit osoittavat merkittävästi vähentää tasot pro-ja aktivoitua MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}; MMP-3 {(y = 0.0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, ja MMP-9: {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013) }, ja suora korrelaatio asteen

DSPP

-silencing ja MMP tukahduttaminen; kuitenkin, taso MMP tukahduttaminen ei eronnut merkitsevästi pro- ja pilkotaan muotoja. (D) densitometrinen analyysi WB VEGF tasot osoittivat alassäätöä vaihtelevat 5% (L4) ja 86% (L2) kanssa tason alassäätöä suoraan verrannollinen asteeseen

DSPP

– hiljentäminen.

In vivo

kasvaimen vastainen vaikutus

DSPP

-silencing on OSC2 soluissa

anti-kasvain vaikutus DSPP- hiljentäminen in OSC2 soluissa testattiin kahdessa Balb /c nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti DSPP-vaiennetaan OSC2 soluja (L2 riviä) läpi vasemmalta laidalta, kun salattu askelohjaus (SHC riviä) istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen. Kuten esitetty Täydennyskuvio S1, suuntaus kohti hidastunut kasvaimen kehitystä ja kasvua johtaen kaiken pienempi kasvaimen havaittiin L2 kasvain verrattuna SHC kontrollituumoreilla yli 6 viikon [Taulukot S1A ja S1G (parvikuvio]. Histologisen arviointi hematoxylene ja eosiinilla (H & E) kohdat osoitti hyvin eriytetty ja aggressiivinen okasolusyöpä liittyy SHC (kontrolli) johdettu kasvaimia (kuvio S1B) verrattuna vähemmän eriytetty L2 johdettu kasvaimia (kuvio S1C). lisäksi L2 johdettu kasvaimia oli taipumus muodostua pieniä kutistuu saarilla, näkyvämpiä tuumorinekroosi kuin SHC johdettu kasvaimia (kuvio S1C). Merkittävästi, immuostain varten DSPP todennettu DSPP väheneminen L2 johdetaan kasvaimissa (kuvio S1E) verrattuna korkea DSPP tasolla SHC johdettu kasvaimissa (kuvio S1D). Kuvio S1F on edustava esi-immuuni IgG negatiivinen kontrolli. Nämä tulokset viittaavat, että alennettua tuumorigeenisen tunnusmerkkejä OSCC seuraavista

DSPP

-silencing havaittiin

in vitro

kokeita edellä kuvatut toistettavissa

in vivo

.

keskustelu

Tämä tutkimus, jonka tarkoituksena on saada oivalluksia toiminnallista roolia DSPP biologiassa suusyövän, suunniteltiin looginen jatko aikaisemmassa raportteja, joiden mukaan DSPP on hyvin yliaktiivista aggressiivinen ihmisen OSCCs [6] ja niissä OEDs merkittävästi suuri alttius siirtymisen invasiivisia OSCC [10]. Parhaan tietomme mukaan meidän nykyinen raportti on ensimmäinen osoittaa säätelyä DSPP kahdessa suusyövän solulinjoissa verrattuna parhaimmillaan perustason perusterveydenhuollossa normaalissa suun keratinosyyttejä (NOK). Merkittävämpää, tämä on ensimmäinen raportti tutkimuksesta, joka tutki vaikutukset

DSPP

-silencing on kasvaimia profiilit suullisen tasyöpäsolulinja.

DSPP

, suurin jäsen sisarus geeniperheen, koodaa ~1300 aminohapon proteiini translaation lohkaistaan ​​kahteen pääproteiineja, dentiinin sialoproteiinia (DSP) ja dentiinin fosfoproteiini (DPP, jota kutsutaan myös phosphorin) [2], [18] – [ ,,,0],20]. Ilmaisu DSP ja DPP oli alun perin ajatellut rajoittua dentiinin (ja odontoblasts), jossa niillä on merkittävä rooli mineralisaatio, DPP ollessa runsaampaa kahden proteiinin [2], [19], [21]. Kuitenkin myöhemmät tutkimukset osoittivat, että alhaisempi DSPP ilmentymisen on läsnä luun [1] – [3]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet merkittäviä ekspressiotasot DSPP (ja muiden jäsenten sisaruksen perhe) metabolisesti aktiivisia tiehyen epiteelisolujen [4] – [6], ja sen säätelyyn ylöspäin osajoukko rinta-, suun kautta, keuhko- ja eturauhassyövät [6] – [9]. Koska DSPP sisältää erittäin konservoituneita MQXDPP motiivi, joka on esitetty DMP1 olla mukana proteolyyttinen prosessointi, on oletettu, että sama tolloid liittyvien proteaasien (erityisesti BMP1) katkaisevat DSPP osaksi DSP ja DPP [19], [20]. Proteolyyttinen prosessointi DSPP MMP-2, MMP-20, ja kallikreiini liittyvät peptidaasi 4 on raportoitu [19].

Monoklonaalinen vasta-aine, LF-Mb21, käytetty tässä tutkimuksessa tunnistaa sekä täyspitkän (DSPP) ja DPP osan mutta ei DSP. 97 kDa: n proteiini bändi kuviossa 1A on osoitus pilkkömistuote, DPP, mutta pienempi molekyylipaino bändejä, jotka olisivat DSP eivät olleet läsnä. Lisäksi molekyylipaino bändi approksimoi täyspitkä DSPP oli poissa. Sen jälkeen hiljentäminen konstruktilla muotoilu suunnattu täyspitkä

DSPP

, vain hyvin pieni tasoilla 97KD bändi nähtiin useimmissa vakaa linjojen, mikä osoittaa vaiennettaisi

DPP

ja täyspitkä

DSPP

. Vaikka on mahdollista, että meidän Knockdown strategia saattaa myös ovat vähentäneet DSP tasolla, emme voi määrittää, perustuvat tämänhetkisiin tietoihin, onko eri vaikutuksia Knockdown on kasvaimia profiilia OSC2 solujen kuvattu johtuivat alentuneesta DPP, DSP, tai molemmat (tai jopa ehjä DSPP). On kuitenkin hyvin vaikuttava tässä vaiheessa, että vähiten, DPP tai sen muokattuja muotoja voi olla rooli kasvaimia sääntelytoimintaa suun syöpäsoluja. Lisätutkimukset, kuten strategioiden (esimerkiksi lisäämällä joitakin furiinin estäjiä, katso Ref. [20]), joka aiheuttaa solujen erittämään ainoastaan ​​täyspitkää DSPP joita voitaisiin käyttää tavallisena tarvitaan myöhempiä tutkimuksia käsitellään erityisiä mekanistinen merkitys DPP, DSP tai täyspitkä DSPP biologiassa suusyöpä.

arvostelu erityisten geenien tuotteita profiloitua tässä tutkimuksessa, seuraava

DSPP

vaiennettu, osoittavat, että mikään niistä on tähän asti liittynyt mahdollinen rooli DSPP suun syöpä. Koska eritetty proteiini DSPP edustaa ihanteellisen tavoitteesta shRNA-välitteisen hiljentämisen, ja analysoimalla toiminnalliset vaikutukset

DSPP

-silencing in OSC2, osoitamme, että

DSPP

-silencing alas-säätelee avain proteiinit osallistuvat kasvainsoluproliferaation, angiogeneesin, ja paikallinen invaasio. Erityisesti meidän tiedot osoittavat, että hiljentäminen

DSPP

suun syöpäsolujen liittyy merkittäviä alas-säätely sisarus-kumppaneina MMP, VEGF, p53, ja solujen lisääntymistä markkereita Ki-67 ja PCNA. Up-asetusten MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, ja p53 kanssa tasot korreloivat tulokseen sekä varoituksia parametreja kuten edenneen taudin vaiheessa, invaasio, ja etäpesäkkeiden on aiemmin liittynyt suusyövän [22] – [ ,,,0],24]. Siten tuloksemme osoittaa merkittävää säätely alaspäin MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, ja p53 seuraava vakaa

DSPP

-silencing in OSC2 soluissa viittaa siihen, että DSPP voi toimia ylävirtaan näiden proteiinien tuotteita. Lisäksi säätely alaspäin p53 osoittaa, että DSPP voivat suoraan tai ainakin etäältä, säädellä näkökohtia solusyklin aktiivisuutta.

Viimeaikaiset raportit viittaavat myös siihen, että MMP-välitteinen remontin soluväliaineen (ECM) on todellakin, yksi useista alkutapahtumien jolloin OSCC solujen hyökätä ympäröivän strooman [25]. On oletettu, että varhainen MMP kasvain tai ympäröivän stroomasoluissa helpottaa remodeling ECM, mikä vapauttaa kasvutekijöitä varmistaa elinkelpoinen nidus ensisijaisen kasvaimen kasvua [26], [27]. Puolestaan ​​kasvaimen kasvua johtaa angiogeenisten kytkin, jonka aikana tasapainon proangiogeeninen tekijöitä, kuten VEGF voitetaan ilmaus angiogeenisten estäjien [28]. VEGF-välitteistä angiogeneesiä on tunnusomaista OSCC etenemisen [25], [29], ja MMP-2 ja MMP-9 on molemmat liitetty induktio angiogeenisen kytkimen eri malleja [26], [27].