Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme hiljattain selvitetty uusi toiminto CD82 E-kadheriinin välittämä homocellular tarttumista; koska tämä toiminto, se voi estää syöpäsolun irtaantuu ensisijainen syöpään pesä ja raja etäpesäke. Kuitenkin vaikutus CD82 on selektiiniligandin-välitteisen heterocellular adheesio ei ole vielä selvitetty. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet vaikutuksista etäpesäkkeiden vaimentimen CD82 /KAI1 annetun heterocellular syöpäsolujen tarttumista endoteeliin verisuonten jotta edelleen valaista funktio tetraspanins. Yli-ilmentymistä CD82 syöpäsoluissa johti inhibitio kokeellisesti aiheutetun keuhkometastaasien hiirissä ja esti merkitsevästi adheesion näiden solujen ihmisen napalaskimon epiteelisoluja (HUVEC)

in vitro

. Esikäsittely soluja toiminto häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineiden SLE

a /x estivät merkittävästi tarttumista CD82-negatiivisten solujen HUVECeja. Lisäksi, solut yli-ilmentävät CD82 esillä vähentynyt ilmentyminen SLE

a /x verrattuna CD82-negatiivisia villityypin soluissa. Merkittävät alas-säätely ST3 β-galaktosidi α-2, 3-sialyylitransferaasi 4 (ST3GAL4) havaittiin cDNA microarray, reaaliaikainen PCR, ja Western blotting-analyysit. Knockdovvn

ST3GAL4

on CD82-negatiivinen villityypin soluissa inhiboi ilmentyminen SLE

x ja vähentää solun tarttumista HUVEC. Olemme päätellä, että CD82 vähenee SLE

a /x ilme kautta alas-säätely

ST3GAL4

ilmaisun ja siten vähentää syöpäsolujen tarttumista verisuoniin, mikä johtaa estoon etäpesäkkeiden.

Citation: Yoshihama N, Yamaguchi K, Chigita S, Mine M, Abe M, Ishii K, et al. (2015) romaani toiminta CD82 /KAI1 sisään Sialyl Lewis Antigeeni-välitteisen syöpäsolujen tarttumista: Evidence for Anti-Etäpesäke Effect Down-asetus Sialyl Lewis antigeenejä. PLoS ONE 10 (4): e0124743. doi: 10,1371 /journal.pone.0124743

Academic Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 24 joulukuu 2014; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2015; Julkaistu: 29 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Yoshihama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (Kaken nro 23390465) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology of Japan (jotta T. Sugiura). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on monivaiheinen ilmiö ominaista kasvainsolujen vaeltamista niiden ensisijainen sivuston hyökkäystä isännän verestä tai imusuonten kylvö kaukaisten elinten, ja myöhemmän kehityksen etäispesäkekasval-. Ekstravasaatio pahanlaatuisia soluja liittyy vuorovaikutus P- ja E-selektiinin, jotka ovat solun adheesiomolekyylien löytyy endoteelisolujen pinnalla, jotka reunustavat verisuonten yhdessä vastaavan hiilihydraatin ligandeja esiintyy pinnalla pahanlaatuisten solujen [1]. Useat molekyylilajikkeiden hiilihydraatti ligandien selektiineiksi ilmentyvät syöpäsolujen, mukaan lukien sialyyli Lewis X (SLE

x) ja sialyyli Lewis A (SLE

a). Lukuisat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus SLE

x ja SLE

a kasvainsolun musiineilla on suoraan korreloi etäpesäkkeitä, syövän etenemiseen, ja huono ennuste [2,3], ja tiedetään, että ilmaus SLE

x /a on merkittävästi parannettu kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin, molekyylimekanismi asetuksen perustana SLE

x /a syöpäsoluissa ei ole hyvin ymmärretty.

Tetraspanins tai TM4SF proteiinit, käsittävät suuren ryhmän transmembraanisia proteiineja esiintyy solun pinnalla, joka voi muodostavat komplekseja kalvolla reseptoreihin, kuten integriinit. Jotkut tetraspanin-perheen proteiinien on raportoitu on erityisen tärkeä rooli tuumorisolujen etäpesäkkeitä [4,5]. CD82 /KAI1, jäsen tetraspanin superperheen, oli ensimmäinen tunnistettu T-solu apumolekyylikoostumusten [6] ja sen jälkeen tunnistettu geneettinen näyttö syövän etäpesäkkeiden synnyssä [7]. Vuonna pahanlaatuinen kiinteitä kasvaimia, ilmaus CD82 /KAI1 vahvasti korreloi paremman ennusteen syöpäpotilaille, kun taas sen alassäätöä on yleisesti todettu kliinisesti pitkälle edenneitä syöpiä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CD82 /KAI1 on suppressori ja metastaasit erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. [8,9]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, on usein havaittu, että ekspressio CD82 korreloi käänteisesti invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin rinta-, virtsarakko-, paksusuoli-, kohdunkaula, maha-suolikanavan, iho-, keuhko-, eturauhas-, haima-, maksa-, ja kilpirauhasen [10-13]. CD82 säätelee solujen aggregaation, solun liikkuvuus, syöpäsolujen leviämiseen ja apoptoosin [14]. Olemme raportoineet, että CD82 stabiloi E-kadheriinin-β-kateniinin komplekseja estämällä β-kateniinin tyrosiinifosforylaation. Tämä toiminto vahvistaa homocellular syöpäsolujen tarttumista ja estää syöpäsolujen karkaaminen ensisijainen pesiä [15]. Toisaalta, kun kasvainsoluja hyökätä veren tai imusuonten, heterofiilisten intersellulaarinen välinen tartunta kasvainsolujen ja endoteelisolujen alusten on tarpeen, koska ensimmäinen vaihe etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin. Sialyyli Lewis-antigeenien syöpäsolut mukana tartunta selektiinin endoteelisolujen alusten [16]. Kuitenkin vaikutus CD82 on selektiinin ligandi- välitteistä soluadheesiota ei ole vielä selvitetty.

tässä tutkittiin vaikutuksia metastaasin vaimentimen CD82 /KAI1 on prosessi heterocellular tarttumisen kasvainsolujen endoteeliin verisuonia, jotta edelleen valaista funktio tetraspanins. Ensin osoitettiin, että sialyyli Lewis antigeeni synteesiä säätelee CD82 /KAI1 välittämän järjestelmä, ja sitten tutkittiin vaikutuksia tämän mekanismin syöpäsolumetastaasi in hiiren etäpesäke malli.

Materiaalit ja menetelmät

vasta-aineet ja reagenssit

hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (G-2) ja kanin polyklonaalisia vasta-aineita (C-16) vastaan ​​KAI1 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Seuraava toiminto häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineita käytettiin: anti SLE

x (hiiren monoklonaalisia) ja anti-SLE

a kappale (hiiren monoklonaalisia) vasta-aineita, jotka on saatu Santa Cruz Biotechnology ja MILLIPORE (Temecula, CA, USA), vastaavasti, samoin kuin hiiren monoklonaalinen vasta-aine β1-integriinin, joka saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA).

Soluviljely

ihmisen solulinja H1299 (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja) ja sen transfektanttisolun linjat, H1299 /zeo ja H1299 /CD82, perustettiin vuonna laboratoriossamme avulla transfektion kontrollina vektorin tai CD82-cDNA, vastaavasti, ja solun lajittelu-pohjainen kloonivalinnan tekniikkaa, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Sigma), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) ja 2 mM L-glutamiinia.

kahta solulinjaa käytettiin tässä tutkimuksessa, H1299 /zeo ja H1299 /CD82, on kuvattu aikaisemmin [10]. H1299 /Zeo on valetransfektoidut solulinja, joka ilmentää heikkoa CD82 ilmaisu, kun taas H1299 /CD82-solut yli-express CD82 seuraavat cDNA transfektion. Immunoblottauksella analyysi osoitti, että taso CD82-proteiinin H1299 /CD82-solujen oli 20 kertaa suurempi kuin villityypin tai H1299 /zeo soluja, kun taas virtaussytometria osoitti, että solun pinnan taso CD82 in H1299 /CD82-solujen oli noin 9- kertainen verrattuna villin tyypin tai H1299 /Zeo soluja.

Eläimet ja etäpesäkkeiden määritys

Kahdeksan viikkoa vanhat naaraspuoliset kateenkorvattomia nude-hiirten (BalbC cAJcl-nu) hankittiin Kyudo (Fukuoka , Japani). Hiiret majoitettiin laminaarivirtausmittaria kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja ruokitaan autoklavoitiin vettä ja ruokavalion laitoksissa hyväksymässä Kyushu University. Jokainen kaappi sisälsi 1-4 hiirillä kokeellisiin ryhmittelyä. Eläin koemenettelyn oli hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitea Kyushu University (Luvan numero: A23-13-1).

kokeelliset keuhkometastaasitestissä tutkimukset, 1,0 x 10

6 solua tai ajoneuvon (PBS) vain injektoitiin häntälaskimon kautta. Hiiret jaettiin satunnaisesti seuraaviin 4 ryhmään: (A) ei käsittelyä (Ohjaus: ruiskutettiin vain PBS: ää), (B) H1299, (C) H1299 /Zeo, ja (D) H1299 /CD82. Kukin ryhmä sisälsi vähintään 3 hiirtä (yhteensä 20 hiirtä käytettiin). Kahdeksan viikon kuluttua injektion jälkeen hiiret tapettiin antamalla pentobarbiturate (100-120 mg /kg) minimoida kärsimyksen ja keuhkot otettiin talteen. Lung metastaasipesäkkeiden laskettiin jos ne voidaan nähdä paljain silmin edellä kuvatulla [15].

immunoblottianalyysi

Solulysaatit Immunoblottausta laadittu soluhajotuspuskurin (1% Triton X -100, 2 mM natriumortovanadaattia, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 10 ug /ml leupeptiiniä, 10 ug /ml aprotiniinia, 1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCI, pH 7,2). Solulysaatit SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ja inkuboidaan tietyn ensisijaisen vasta-aineita. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen piparjuuren peroksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita ja parannettu kemiluminesenssin reagenssia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Bändit skannattiin tietokoneavusteisen densitometria (ChemiDoc XRS-J; Bio-Rad) ja analysoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad) kuten aiemmin on kuvattu [14, 15].

fluoresoiva merkintöjä elävien solujen ja soluadheesioanalyysin

live H1299 solut leimattiin käyttäen Vybrant DiO eikä solu-etikettiratkaisut (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

määrällisesti kasvainsolu tarttuvuus ihmisen napalaskimon epiteelisoluja (HUVEC), standardi staattista sähköä määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. HUVEC-soluja (1,5 x 10

4-solut) asetettiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille, jotka oli esipäällystetty 0,1% gelatiinia (Sigma), ja viljeltiin vähän glukoosia DMEM, jossa 20% FBS: ää ja 0,1 ug /ml perus-FGF 2 -3päivä perustaa konfluentteja HUVEC yksisolukerrosten. Fluoresoivasti leimattua H1299-soluja (4,0 x 10

4 solua /kuoppa) lisättiin endoteelin yksikerroksisen ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan.

vaikutusten tutkimiseksi funktion häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineiden syöpäsolujen tarttumista HUVEC yksikerroksista, H1299-soluja esikäsiteltiin 5 ug /ml funktion häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineita 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten sovellettu HUVEC yksikerroksista.

kuopat pestiin 3 kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja soluja kiinnitettiin metanolilla 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Kiinnittyneet solut kvantitoitiin valomikroskoopilla käyttämällä korkean tehon kenttä (x 200). Kunkin kolmena kappaleena kokeissa solujen määrä 5 satunnaisesti valitun kentät on määritelty ja laskee laskettiin keskiarvo.

transfektio lyhyen hiusneula-RNA (sh RNA) B

Viljellyt H1299 /CD82 ja H1299 /Zeo-solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. H1299 /CD82-sh. ohjaus ja H1299 /CD82-sh.CD82 solulinjoja transfektoimalla H1299 /CD82-solujen kanssa pLKO.1-puro-ohjaus Vector (Sigma) ja pLKO.1-puro-/sh.CD82: NM_002231 (Sigma), vastaavasti [ ,,,0],18]. H1299 /Zeo-sh.control ja H1299 /Zeo-sh.ST3GAL4 solulinjoja Lipofectamine-välitteinen transfektio H1299 /Zeo solujen pLKO.1-puro-ohjaus Vector ja pLKO.1-puro-sh.ST3GAL4: NM_06081105 (Sigma), vastaavasti. Pesäkkeet, joilla resistenssin puromysiiniä (Sigma) yksittäisten transfektiokokeissa yhdistettiin. Ilmentymisen taso CD82 ja ST3GAL4 in shRNA transfektoiduissa H1299-solujen seurattiin RT-PCR: llä ja immunoblottauksella. Nämä solut ylläpidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 2 ng /ml puromysiiniä.

DNA-siru

Kokonais-RNA uutettiin H1299 /zeo ja H1299 /CD82-soluihin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA-siru hybridisaatio ja skannaus suoritettiin Affymetrix (Santa Clara, CA, USA), käyttämällä Affymetrix geenilastuun HG-U133A plus2.0. GCRMA in Bioconductor (https://www.bioconductor.org) käytettiin koetin analyysi ja normalisoimiseen microarray data.

Tilastollinen analyysi (Studentin

t

-testi) ja taitettava muutokset suodatin ( 3,0) (H1299 /CD82 vs. H1299 /Zeo) suoritettiin peräkkäin valitsemaan merkittäviä geenejä. Käyttämällä geeni määritelmä ominaisuus, kaikki transferaa- jotka säätelevät sialyyli Lewis antigeenejä tunnistettiin ja on lueteltu taulukoissa 1 ja 2.

Reaaliaikainen käänteistranskriptaasi (RT) polymeraasin toi- (PCR ) B

Kokonais-RNA uutettiin H1299-soluja käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi. MRNA-tasojen määrä kolmena rinnakkaisena käyttäen reaaliaikaista PCR-järjestelmän kanssa Brilliant SYBR Green qPCR Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Spesifisten alukkeiden ja glykosyylitransferaasin olivat seuraavat: (

ST3GAL1

: 5′-GCATAACGCCCATATAGAT-3 ’ja 5′-AAGGCTCTGACTGCTCTGT-3’;

ST3GAL2

: 5′-CTGGATGCTGGGACCTAC-3 ’ja 5’-GCTACTTGGAAGGCTGAGG-3 ’;

ST3GAL3

: 5′-TCCTGGACGCACAATATC-3′ ja 5′-GGTCTGAAGACTCCTGTGTA-3 ’;

ST3GAL4

: 5′-AGTAGAAAACAACCCAGACAC-3′ ja 5 ’ -AGAGGTTGAGAATCCGAA-3 ’; ja

ST3GAL5

: 5′-TGCCTCAGTTCACCCTCA-3′ ja 5′-TGGTGGTGTTTGTGTGCTG-3 ’.

PCR-syklien olosuhteet olivat 10 min 95 ° C: ssa 1 syklin, jota seuraa 45 sykliä kukin 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 60 s. Amplikonit ovat vahvistaneet, että signaalit ovat ainutlaatuisia dissosiaatiokäyrä analyysejä. Ilmentymistasot kunkin näytteen, joka on saatu rinnakkain määritykset, normalisoitiin kuin koodaavan geenin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

) ja analysoitiin käyttämällä LightCycler2.0 System ohjelmistopaketti (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA).

tulokset

ektooppinen ilmentymä CD82 estää keuhkometastaasitestissä hiirillä

ensimmäisessä kokeessa varmistimme etäpesäkkeitä estävä vaikutus CD82, joka on aiemmin raportoitu käyttäen eläimen etäpesäke malli [17]. Kokeellisen keuhkometastaasitestissä tutkimuksissa me ruiskutetaan H1299-solujen häntälaskimoon 8-viikkoisen naaras-kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Kahdeksan viikon kuluttua injektion tahansa metastaasipesäkkeiden havaittiin ja laskettiin visuaalisesti. CD82 oli voimakas estävä vaikutus koko ja lukumäärä keuhkojen etäpesäkkeiden pesäkkeitä (kuvio 1). Erityisesti hiiret transfektoitu H1299 /Zeo solut osoittivat 100% keuhkojen etäpesäkkeiden (7/7), kun taas CD82 transfektanteilla, H1299 /CD82, osoittivat merkittävän eston metastaasin, joiden etäpesäke oli ainoastaan ​​28,5% (2/7). Ottaen huomioon, että keuhkojen etäpesäkkeiden määrä heijastaa suoraan laajuutta soluadheesion keuhkojen verisuonten, tämä tulos viittaa siihen, että CD82: lla on tärkeä rooli soluadheesion verisuonia.

häntälaskimoiden nude-hiiriin injektoitiin 1,0 × 10

6 H1299 /Zeo tai H1299 /CD82-soluihin. Kahdeksan viikkoa injektion jälkeen, hiiret tapettiin ja keuhkot otetaan talteen. Metastaasipesäkkeiden laskettiin silmämääräisesti. Injektio H1299 /Zeo solut johti 100% keuhkojen etäpesäkkeiden (7/7), kun taas H1299 /CD82-solut osoittivat merkitsevästi alhaisempi etäpesäkkeiden (28,5%, 2/7).

Kohdunulkoisia ilmentyminen CD82 inhiboi kasvainsolun kiinnittyminen HUVEC kautta sialyyli Lewis-antigeenien

syöpäsolujen tarttumista verisuonten liittyy vuorovaikutus P- ja E-selektiinin epiteelisolujen verisuonten vastaavaan SLE

x ja SLE

hiilihydraatti ligandien syöpäsolujen pinnalla [12]. Analysoimme vaikutus CD82 solun tarttumisen verisuonten käyttäen aiemmin kuvattua soluadheesion määritystä HUVEC [11]. Se on aiemmin vahvistettu, että HUVEC ilmaista sekä P- ja E-selektiinin [11]. Havaitsimme, että noin 65% ladattu H1299 /Zeo solujen tarttunut HUVEC yksikerroksista. Toisaalta, H1299 /CD82-solut osoittivat merkitsevästi vähemmän soluadheesiota, ja vain 6,6% noudattaminen HUVEC yksikerroksista (kuvio 2A ja 2B). Esikäsittely-funktiolla häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineiden SLE

x, SLE

a, tai β1 integriinien estyy H1299 /Zeo tarttuvuus HUVEC 9,4%, 8,4%, ja 30,2%, tässä järjestyksessä (kuvio 2C). Sen sijaan toiminta häiriöitä aiheuttamattomia vasta-aineiden SLE

x /a ei todettu merkitsevää estoa H1299 /CD82 soluadheesiota HUVEC. Nämä tulokset viittasivat vahvasti siihen, estävä rooli CD82 in sialyyli Lewis-välitteistä soluadheesiota.

fluoresoivasti leimattu H1299 /zeo tai H1299 /CD82-soluja (4,0 x 10

4 solua /kuoppa) levitettiin HUVEC yksikerrosviljelmään ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa. Noudatetaan solut kvantifioitiin 30 minuutin jälkeen. Noudatetaan H1299 /Zeo (A) ja H1299 /CD82 (B-solut) ja vaikutus funktion häiriöitä aiheuttamattomia vasta soluadheesiota HUVEC yksikerroksista analysoitiin (C). H1299-soluja esikäsiteltiin 5 ug /ml mainituilla vasta-aineilla ja sitten levittää HUVEC yksikerroksista. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja määrä kiinnittynyt solujen keskiarvo. Palkit osoittavat keskihajonnan.

ektooppinen ilmentymä CD82 vähentää sialyyli Lewis synteesi

ilmentyminen sialyyli Lewis antigeenejä H1299-soluissa analysoitiin immunoblottauksella (kuvio 3). SLE

A havaitaan vyöhykettä, jotka vastasivat noin 97, 125 ja 200 kDa, ja sen ekspressiotaso oli 5-8 kertaa suurempi H1299 /Zeo soluissa kuin H1299 /CD82-solut (kuvio 3A). Vastaavasti, ilmaus SLE

x-proteiinien havaittiin noin 90, 125, ja 200 kDa, ja se oli 5-8 kertaa suurempi H1299 /zeo soluissa kuin H1299 /CD82-soluja (kuvio 3B). Nämä löydökset olivat tulosten mukaisesti HUVEC adheesiomäärityksellä.

Koko solulysaateista (200 ug) H1299-soluja (H1299 /zeo, zeo; H1299 /CD82, CD82, H1299 /CD82-sh.control , sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82, sh.CD82) erotettiin 7,5% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottauksella anti-SLE

A (a) tai anti-SLE

x (B ) vasta-aineita. Sama blotit stripattiin ja uudelleen koestettiin β-aktiini latauskontrollina. Kokeet toistettiin kolmena kappaleena, ja edustavimmat tiedot esitetään.

Lisäksi olemme transfektoidut H1299 /CD82-solujen CD82 shRNA vahvistaa, onko tämä säätely alaspäin sialyyli Lewis antigeenejä on suora vaikutus ektooppisen ilmentymisen CD82.

CD82

shRNA estivät täysin CD82 ilmaisu (kuvio 3C) ja samalla tuotanto SLE

A ja SLE

x toipunut ekspressiotasot havaitaan H1299 /Zeo soluja.

Kohdunulkoinen ilmentymä CD82 vähentää mRNA-tasoja Glykosylaasitransferaasitoiminnan liittyvistä geeneistä sialyyli Lewis synteesi

jotta voidaan tutkia mekanismeja alas-säätely sialyyli Lewis antigeenejä mukaan CD82, teimme maailmanlaajuinen DNA-siru analyysi mahdollisista sääntelyviranomaisten sialyyli Lewis antigeenejä (kaikki transferaasien). Kuten on esitetty taulukossa 1, CD82 merkittävästi alassäädetty (0,05-kertainen muutos) ilmentymisen

ST3GAL4

(alleviivattu taulukossa 1). Sen sijaan, geenien ilmentymistä, jotka koodaavat muiden ryhmien glykosyylitransferaasien ja sokerin kuljettaja ryhmien ei merkittävästi muuttunut.

vieressä tutkittiin vaikutukset CD82 mRNA: han ja proteiini tasoilla ST3GALs käyttäen reaaliaikaista PCR: ää (kuvio 4) ja immunoblottauksella (kuvio 5), vastaavasti. Ektooppinen ilmentyminen CD82 ei ollut vaikutusta ilmentymistä ST3GALs, paitsi merkittävä lasku

ST3GAL4

mRNA ja proteiini tasoilla.

Kokonais-RNA eristettiin H1299-solut ja analysoitiin todellisia -Time RT-PCR: llä. mRNA-tasot Glykosylaasitransferaasitoiminnan koodaavien geenien

(ST3GALs) B korjattiin suhteessa tasot

GAPDH

mRNA, jossa H1299 /zeo asetettu 1. Data on esitetty keskiarvona ± SEM.

kokosolulysaateista (300 ug) H1299 soluja (H1299 /Zeo, Zeo; H1299 /CD82, CD82, H1299 /CD82-sh.control, sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82 , sh.CD82) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottauksella anti-ST3Gal ensisijainen vasta-aineita. Samat blotit riisuttu ja uudelleen probed varten β-aktiini ja CD82. Kokeet toistettiin kolmena kappaleena, ja edustavimmat tiedot esitetään.

Myös arvioi vähentäminen

ST3GAL4

in H1299 /CD82-solut oli CD82-tietyn tapahtuman käyttämällä CD82 knockdown. Sen jälkeen knockdovvn CD82, proteiinin taso ST3GAL4 täysin palautunut tasolle havaittu H1299 /Zeo soluja.

ST3GAL4

shRNA vähentää sLex- tuotanto

tutkia alaspäin sääntely ST3GAL4 vähentää tuotantoa sLex, me pudotti

ST3GAL4

vakaa transfektoimalla

ST3GAL4

shRNA. Ilmaisu on

ST3GAL4

oli nimenomaan vähentää shRNA sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 6A ja 6B). Proteiini taso SLE

x väheni merkittävästi H1299 /Zeo shST3GAL4 soluja (0,3-kertainen H1299 /Zeo sh.cont). Sen sijaan proteiinia taso SLE

ei todettu merkitsevää eroa H1299 /Zeo-sh.cont solua ja H1299 /Zeo-sh.ST3GAL4 soluissa. Havainto, että ST3GAL4 nimenomaan vähentää SLE

x proteiinin tuotantoa ehdotti, että SLE

x tuotantoa alas-säädellä CD82 ilmaisun kautta

ST3GAL4

alassäätöä (kuvio 7A ja 7B).

. Kokonais-RNA eristettiin H1299-solut ja analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. mRNA-tasot on

ST3GALs

korjattiin suhteessa tasot β-aktiini-mRNA: n, kanssa ja H1299 /Zeo asetettu 1. Data on esitetty keskiarvona ± SEM. B. Koko solulysaateista (300 ug) H1299-soluja (H1299 /zeo, zeo; H1299 /CD82, CD82, H1299 /Zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) olivat erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottauksella anti-ST3GAL4 ensisijainen vasta-aineita. Samat blotit riisuttu ja uudelleen probed varten β-aktiini. Kokeet toistettiin kolmena kappaleena, ja edustavimmat tiedot esitetään.

(A) kokosolulysaateista (300 ug) H1299 soluja (H1299 /Zeo, Zeo; H1299 /CD82, CD82; H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottauksella anti-SLE

a tai anti-SLE

x vasta-aineita. Sama blotit stripattiin ja uudelleen koestettiin β-aktiini latauskontrollina. Kokeet toistettiin 3 kertaa, ja edustavimmat tiedot esitetään. (B) densitometrinen analyysi suoritettiin (A), jonka jälkeen normalisoinnin densitometrinen arvo β-aktiini ja merkitty ”Suhteellinen ilmentyminen arvo (β-kateniinin /β-aktiini)”. Suhteellinen ilmentyminen arvot 3 yksittäisistä kokeista laskettiin keskiarvo. Palkit osoittavat keskihajonnan.

ST3GAL4

shRNA estää solun tarttumista HUVEC

Lopuksi tutkittiin, mikä vaikutus shRNA välittämää down-regulation

ST3GAL4

on soluadheesiota HUVEC. Soluadheesiota HUVEC osoitti noin 50%: n inhibition villityypin H1299 /zeo soluissa, sen jälkeen

ST3GAL4

pudotus. Kuitenkin esto taso H1299 /Zeo shST3GAL4 solut eivät pääse kuin H1299 /CD82 (90%: n inhibition H1299 /Zeo; Kuva 8).

fluoresoivasti leimattu H1299 /Zeo, H1299 /CD82, H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, ja H1299 /Zeo-sh.control-soluja (4,0 x 10

4 solua /kuoppa) levitettiin HUVEC yksikerrosviljelmään ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa. Noudatetaan solut kvantifioitiin 30 minuutin jälkeen. H1299 solut kiinni HUVEC yksikerroksista analysoitiin. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja määrä kiinnittynyt solujen keskiarvo. Palkit osoittavat keskihajonnan.

Keskustelu

CD82 /KAI1 on raportoitu olevan anti-metastaattisen ominaisuuksia ja on aikaisemmin vahvistettu olevan vaimennin etäpesäkkeiden. Olemme aiemmin osoittaneet, uusi toiminto CD82 E-kadheriinin-välitteisen homofiilisiä välistä adheesiota [15]. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia CD82 on heterofiilisten soluadheesiota on veren tai imusuonten, joka on ensimmäinen askel etäpesäkkeiden kaukaisiin elimiin; ja esitteli uuden säätelevän roolin CD82 in sialyyli Lewis-riippuvaisen soluadheesiota. Meidän

in vivo

etäpesäkkeiden määrityksessä, CD82 oli voimakas estävä vaikutus koko ja lukumäärä keuhkojen etäpesäkkeiden pesäkkeitä (kuvio 1) sen jälkeen, kun suora ruiskutus syöpäsolujen hiireen häntälaskimoon. Siten, tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, estävä rooli CD82, että syöpäsolujen tarttumista verisuonten endoteelisoluihin.

Sialyl Lewis-antigeenit ovat mukana ensimmäisen vaiheen syöpäsolujen adheesion verisuonten [16]. Lukuisat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus SLE

x ja SLE

a kasvainsolun musiineilla korreloi suoraan etäpesäkkeitä, syövän etenemiseen, ja huono ennuste [2,3]. Kun ensimmäinen adheesion kautta sialyyli Lewis-antigeenit, on muodostettu, integriini-välitteisen adheesion arvoihin, [19]. Olemme osoittaneet, että lisäämällä anti-integriini-vasta-aine vain osittain inhiboi syöpäsolujen tarttumista HUVEC, mikä viittaa siihen, että ensimmäinen sialyyli Lewis-antigeeni-välittämä adheesio on välttämätön syövän solun tarttumista verisuonten (kuvio 2). Kohdunulkoinen ilmentyminen CD82 alassäädetty synteesiä SLE

a /x (kuvio 3), joka tukee tulokset HUVEC adheesiomäärityksellä.

biosynteesipolun SLE

A ja SLE

x määräytyy erilaisia ​​entsyymejä, jotka katalysoivat siirtoa siaalihapon ja fukoosia oligosakkaridin sivuketjut glykokonjugaattien. Lyhyesti,

N

-acetyllactosamine (GlcNac) β1 oligosakkaridin syntetisoidaan GlcNAc transferaasien. Perustuen GlcNac β1 oligosakkaridi alustoille, β1, 3-galaktosyylitransferaaseja (β3Gal-Ts) syntetisoimiseksi α1 → 3 disakkaridit (tyypin 1 ketjuja) ja β1, 4-galaktosyylitransferaaseja (β4Gal-Ts) koota α1 → 4 disakkaridit (tyypin 2 ketjuja). Sialyylitransferaasi (ST), joka kuuluu

ST3Gal

perhe sisältää 6 alaperheiksi entsyymejä. Näistä ST3Gal3 sialylates tyypin 1 ketjuja tuottaa SLE

a, kun taas ST3Gal4 ja -6 vaaditaan sialylate tyypin 2 ketjut SLE

x tuotantoa.

peräkkäinen lisääminen α1, 4-sidottu fukoosin tyypin 1 ketjuja ja α1, 3-sitoutunutta fukoosia tyypin 2 ketjujen fukosyylitransferaasi- (FUTs) viimeistelee biosynteesiä SLE

A ja SLE

x, vastaavasti. Ilmaisu SLE

A ja SLE

x liittyy syövän synnyn ja syövän etenemiseen. Ilmaus

ST

ja

FUT

geenit, jotka koodaa tarvittavia entsyymejä biosynteesiä näitä antigeenejä korreloi myös näiden pahanlaatuisten merkkiä. Lisääntynyt mRNA tasot

ST

ja

FUT

löytyy useita erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia.

ST3GAL3

ilmentymistä potilailla, joilla on rintasyöpä oli vahvasti yhteydessä huonoon ennusteeseen ja vähentää yleistä eloonjäämistä [20]. Samoin lisääntyneen ekspression

ST3GAL4

ja

FUT4

ilmoitettiin peräsuolen karsinoomat [21]. Vastaavasti alas-säätely

ST3GAL4

on havaittu peräsuolen syövän kudoksissa ja ihmisen munuaissyövän [22,23]. Mahasyövän, ilmentymisen tasot

ST3GAL3

ja

FUT4

mRNA merkittävästi parannettu syöpäkudosten [24]. Lisäksi ilmaus

FUT4

ja

FUT7

mRNA liittyvät huonoon ennusteeseen keuhkosyöpäpotilaiden [25], ja lisääntynyt aktiivisuus α1,3 /4-FUTs havaittiin munasarjojen kohdunkaulan verrattuna terveeseen kudokseen [26] Chandrasekaran et al., 1992 EV Chandrasekaran, R.K. Jain ja K. L. Matta, Munasarjasyöpä alfa 1,3-L-fukosyylitransferaasin. Erilaistumista selvästi katalyyttinen lajien ainutlaatuisen substraatin, 3′-sulfo-N-asetyylilaktosamiinin yhdessä muiden synteettisten akseptorien,

J Biol Chem

267 (1992), s. 23806-23814. Katso Record Scopus Viittaukset vuonna Scopus (26). Nämä raportit viittaavat siihen, että roolit

ST

ja

FUT

eroavat eri syöpätyyppejä

in vivo

.

Meidän mallissa CD82 merkittävästi alas- säännelty (0,05-kertainen muutos) ilmentymistä

ST3GAL4

. Sitä vastoin ilmaus muiden ryhmien glykosyylitransferaasien ja sokerin kuljettaja ryhmien ei merkittävästi muuttunut. Knockdovvn

CD82

mRNA shRNA in H1299 /CD82-solut johti elpyminen

ST3GAL4

ilmaisun ja synteesiä SLE

a /x, mikä viittaa siihen, että CD82 on erityisiä vaikutuksia

ST3GAL4

ilme.

Kuten edellä mainittiin,

ST3GAL4

yleensä syntetisoi vain SLE

x ja meidän

ST3GAL4

knockdown tutkimus osoitti tulokset osoittavat tiettyä alas -regulation SLE

x H1299 /Zeo shST3GAL4 soluja. Sen sijaan, ektooppinen ilmentyminen CD82 vähensi synteesiä SLE

A ja SLE

x, samanaikaisesti. Tämän tyyppinen ristiriita on raportoitu aiemmin. Entsyymiaktiivisuus ST3GAL4 rekombinanttiproteiinin oli tehokas sekä tyypin 1 että tyypin 2 disakkarideja

in vitro

, kun taas

in vivo

, se oli ainoa tehokas tyypin 2 alustoille [27] Sasaki et ai ., 1993 K. Sasaki, E. Watanabe, K. Kawashima, S. Sekine, T. Dohi ja M. Oshima

et ai

., Expression kloonaus uuden Gal beta (1-3 /1- 4) GlcNAc alfa-2,3-sialyylitransferaasi-, käyttämällä lektiini resistenssin valintaa,

J Biol Chem

268 (1993), s. 22782-22787. Katso Record Scopus