Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sädehoitoa (RT) on edelleen yksi suosituimmista hoitovaihtoehtoja paikallinen eturauhassyöpä (Korkki). Tarkoituksena oli tutkia

in vitro

vaikutus LBH589 yksin ja yhdessä RT kasvuun ja selviytymistä CaP solulinjojen ja mahdollisia mekanismeja säteilylle herkäksi tämän yhdistelmähoitoa. Vaikutus LBH589 yksin tai yhdessä sädehoidon kanssa kahdella CaP solulinjoissa (PC-3 ja LNCaP) ja normaali eturauhasen epiteelin solulinja (RWPE-1) tutkittiin MTT: n ja klonogeenisten määrityksissä, solusyklin analyysi, Western blotting apoptoosin -aiheiset ja solujen check Point proteiineja, ja DNA kaksinkertainen lohkon murtuma (DSB) korjaus markkereita. Immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin edelleen vahvistamaan DSB ilmaisun käsitellyissä CaP soluissa. Tuloksemme osoittavat, että LBH589 esti lisääntymistä sekä korkki ja normaalit eturauhasen epiteelisolujen aikaa ja-annosriippuvaisesti; matala-annos LBH589 (IC

20) yhdistettiin RT parantunut tehokkuus soluntappokyky korkki soluissa; verrattuna pelkkään sädehoitoon, yhdistelmä hoito LBH589 ja RT aiheuttama enemmän apoptoosin ja johti kasvaa tasaisesti sub-G1 väestö ja poistaminen RT aiheuttaman G2 /M pidätys, lisääntynyt ja pysyviä DSB, vähemmän aktivointi ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) /homologinen rekombinaatio (HR) korjaus reittejä ja paneelia solusyklin liittyviä proteiineja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LBH589 on mahdollinen lisäävän aineen radioherkkyyttä ihmisen CaP soluja. LBH589 käyttää joko yksinään tai yhdessä RT on houkutteleva strategia hoitoon ihmisen korkki.

Citation: Xiao W, Graham PH, Hao J, Chang L, Ni J Power CA, et al. (2013) Yhdistelmähoito kanssa histonideasetylaasi estäjä LBH589 ja säteily on tehokas hoito-ohjelma eturauhassyövän solut. PLoS ONE 8 (8): e74253. doi: 10,1371 /journal.pone.0074253

Editor: Hari Koul, University of Colorado, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 lokakuu 2012; Hyväksytty: 02 elokuu 2013; Julkaistu: 26 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Xiao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tukee Urakehitys Fellowship National Health Medical Research Council (YL), Australia; St George Hospital Cancer Research Trust Fund (PHG), Sydney, Australia; ja China Scholarship neuvosto (WWX), Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nykyinen hoitovaihtoehtoja lokalisoitu hatun sädehoitoa (RT), kirurgian ja hormonaalisen hoidon. Vaikka aggressiivinen säteily ei parantaa biokemiallisia ohjaus, suurempi peräsuolen ja virtsan toksisuuksia tapahtui myös [1]. Paikallinen vika jälkeen RT pysyy 20% -35% vuonna keski- ja suuren riskin CaP potilailla [2], mikä lisää etäpesäkkeiden ja alempi selviytymistä. Siten tutkimus uuden yhdistelmän lähestymistapa, jossa selektiivinen radio-herkistävä RT lisäämiseksi CaP radioherkkyyttä tarvitaan kipeästi.

histonideasetylaasi estäjät (HDACi) ovat syntymässä ryhmä aineita, jotka on suunnattu histonideasetylaasi (HDAC) ja lupaavia säteilyherkistimet parhaillaan tutkittavana. Säteilylle herkäksi by HDACi, kuten valproiinihappo [3] on osoitettu prekliinisissä tutkimuksissa. HDACi indusoi tai säätelijä solujen käyttäytymistä, kuten apoptoosin, solukierron ja DNA: n korjaukseen prosesseja. Sen uskotaan aiheuttaa sen vaikutuksia lähinnä muuttamalla histoni ja chromatin rakenteet, siten moduloida geeni transkriptio [4]. Lisäksi nämä acetylases ja deasetylaasit voi myös moduloida solun toimintoja riippumattomia geenin ilmentymisen vaikuttamalla ei-histoni-proteiinien, kuten p21: [5], p53 [6], Ku70 [6]. Toimimalla useisiin histoni ja ei-histoni-proteiinien, HDACi pystyy välittämään apoptoosin, solusyklin ja DNA korjaukseen prosessien hyvin järjestettyjä tavalla.

LBH589 on hydroksaamihappojohdannaiseksi ja uusi yleiseurooppalainen HDACi [7]. Qian et ai. raportoitu, että LBH589 yksinään vähensi angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua PC-3-ksenografti eläinmalli [8]. Faasin I tutkimus on tehty käsittelemällä kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) käyttävillä potilailla suun LBH589 kanssa tai ilman doketakselin, jotka osoittavat lupaavia tuloksia tulevaisuuden kliiniseen käyttöön [9]. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että LBH589 voivat olla käyttökelpoisia yhdessä RT hoitamiseksi paikallisen CaP.

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että LBH589 voisi tappaa CaP solujen kanssa ja käsittely CaP solujen LBH589 ennen RT lisäisi herkkyyttä CaP solujen RT.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja vasta

LBH589 (panobinostat) hankittiin Selleck Chemicals (Selleck Chemicals South Loop West, Houston, TX, USA). Muut käytetyt kemikaalit hankittiin Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), ellei toisin mainita. Ensisijainen ja toissijainen vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1.

Vasta

Lähde

Tyyppi

Laimennus

Inkubaatioaika

Lämpötila

Application

Kanin anti-humaani- kaspaasi-3 (Pro) EpitomicsMAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen kaspaasi-3 (Active) EpitomicsMAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen histoni H3 (asetyyli K9) AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen histoni H4 (asetyyli K8) AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-ihminen p21AbcamPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen p-p53AbcamPAb1: 1000o /n4

° CWBMouse anti-ihminen p53AbcamMAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen fosfo- CDK1 (Tyr15) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen CDK1 (cdc2) AbcamPAb1: 10000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen p-Chk-1AbcamPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen Chk-1AbcamPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen p-Chk-2AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-ihmisen Chk-2AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-ihmis-fosfo-Rb (Ser795) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihmis-fosfo-Rb (Ser807 /811) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4

° CWBMouse anti-ihminen RbAbcamMAb1: 1000o /n4

° CWBMouse anti-ihmisen γH2AXAbcamMAb 1: 500 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° CIF WBRabbit anti- ihmisen Ku70EpitomicsPAb1: 1000o /n4

° CWBRabbit anti-ihminen Ku80EpitomicsPAb1: 1000o /n4

° CWBMouse anti-ihminen BRCA1AbcamMAb1: 200 (IF) 1: 200 (WB) o /n4

° CWB, IFRabbit anti -ihmisen BRCA2AbcamPAb1: 200 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° CWB, IFMouse anti-ihminen RAD51AbcamPAb1: 100 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° CWB, IFMouse anti -ihmisen GAPDHMilliporeMAb1: 500o /n4

° CWBMouse anti-ihmis-lgG1-negatiivinen controlDakoIgG11: 1000o /n4

° CIFGoat anti-kani-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat anti-hiiri-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat anti-hiiri Alexa Fluor® 488 Dye ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Vasta-aineet käytetään western blotting ja immunofluoresenssivärjäyksen.

Huomautuksia: MAb: monoklonaalinen vasta-aine; o /n: yön yli; Pab: polyklonaalinen vasta-aine; WB: western blotting; IF: immunofluoresenssi; HRP: piparjuuri peroxidas CSV Lataa CSV

Soluviljely

androgen-ei reagoi PC-3 ja androgeenien reagoiva LNCaP CaP solulinjat, ja normaalin ihmisen eturauhasen RWPE-1 solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). PC-3 ja LNCaP-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% (tilavuus /tilavuus) kuumennettiin-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä, kun RWPE-1-soluja viljeltiin K-SFM-elatusaineessa, johon oli 0,2 ng /ml rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää (rEGF) ja 25 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta ilman FBS: ää. Kaikkia solulinjoja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

MTT-määritys

Solulisääntyminen arvioitiin korkki ja normaalissa eturauhasessa solulinjojen jälkeen LBH589 hoidon käyttäen MTT-määritystä jälkeen julkaistun menetelmän [10]. Lyhyesti, 2000-soluja siirrostettiin 96-kuoppalevyille jelyväliaineessa 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LBH589 (0 ~ 20 umol /l) tai sama tilavuus DMSO valvonta tuoretta väliainetta toisen 24, 48 ja 72 tuntia, vastaavasti. Absorbanssi (OD) luettiin 560 nm: ssä BIO-TEC mikro-levynlukijaa (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset ovat edustettuina OD suhde käsitellyn ja kontrollisolut. IC

20 (20% inhiboiva pitoisuus) LBH589 24 tunnin laskettiin ja valittiin seuraavat kokeet.

Colony muodostavat määrityksessä

PC-3, LNCaP ja RWPE-1-soluissa käytettiin pesäkkeitä muodostavien määrityksiä kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [10]. Lyhyesti, 1,5 ~ 2 x 10

6 PC-3, LNCaP ja RWPE-1-soluja käsiteltiin 6 cm: n malja LBH589 vastaavissa IC

20 pitoisuus tai sama tilavuus DMSO: ta (kontrolli) 24 tunnin ajan ja sitten 200 ~ 2 x 10

5-soluja siirrostettiin 6 cm ruokia. 8 tunnin kuluttua elpyminen, LBH589 käsiteltyjen ja DMSO-käsiteltyjen ohjaus solut altistettiin yksittäinen annos säteilytyksen (0-8 Gy) huoneenlämpötilassa käyttäen lineaarista kiihdytin (Elekta, Tukholma, Ruotsi), annosnopeudella 2,7 Gy /min 6 MV fotonien (Cancer Care Centre, St George sairaala, Sydney, Australia). Sen jälkeen RT, kaikki solut pestiin välittömästi lääkkeetön väliaineessa. Sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin jälkeen solut värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeet, määritellään ryhmiä 50 solua, pisteytettiin manuaalisesti tuella Olympus INT-2 käänteismikroskooppi (Tokio, Japani). Tiedot RT yksinään tai yhdistelmänä käsitelty (LBH589 ja RT) solut normalisoitu vastaan ​​YK-säteilytettyjä soluja (pisteytetään 100% pesäkkeenmuodostuskyvyn).

virtaussytometrianalyysin solusyklin jakeluun

0,5 ~ 2 x 10

6 PC-3 ja LNCaP CaP solua maljattiin 10 cm: n maljalla 24 tunnin ajan, käsiteltiin sitten LBH589 vastaavissa IC

20 pitoisuudet tai DMSO (kontrolli) vielä 24 tuntia, ennen kuin altistetaan 2 Gy RT. Tiettyinä ajankohtina (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 ja 72 h kuluttua 2 Gy), trypsinoitiin pysyvä ja kelluvat solut yhdistettiin ja kiinnitettiin kylmällä 70% (v /v) etanolia 4 ° C: ssa. Histogrammit DNA sisältöä analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (V.7.6.1, Tree Star, Inc., Oregon, USA) määrittämiseksi solukierron jakelu (seur G1, G1, S ja G2 /M).

Immunofluoresoivat värjäys γH2AX ja HR korjaukseen liittyvän reitin proteiinit

PC-3 ja LNCaP CaP soluja käsiteltiin samaa protokollaa kuin on kuvattu solukierron analyysiin (katso edellä). Saatuaan 2 Gy RT, LBH589-käsiteltyjen ja dimetyylisulfoksidin käsiteltyjä soluja altistettiin immunofluoresenssivärjäyksen tietyissä aikapisteissä (pre-RT, 24, ja 72 h sen jälkeen, kun 2 Gy). Solu valmistelu immunofluoresenssivärjäyksen oli aikaisemmin kuvatulla muutoksin [11,12]. Värjätyt solut tutkittiin käyttäen FV300 /FV500 Olympus laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) ja kuvien otettiin kiinni. Kutakin käsittelyä varten kunnossa, γH2AX, BRCA1, BRCA2 ja RAD51 pesäkkeet määritettiin vähintään 50 solua. Laskeminen γH2AX, BRCA1, BRCA2, ja RAD51 ydinvoiman pesäkkeet näissä soluissa suoritettiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa (WWX ja JLH).

Western blotting

PC-3 ja LNCaP CaP soluja käsiteltiin samaa protokollaa kuin on kuvattu solusyklin analyysi (katso edellä). LBH589-käsiteltyjen ja kontrolli solut altistettiin 2 Gy RT. Sekä kelluvat ja tarttuvat solut kerättiin tiettyyn aikaan pistettä (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 ja 72 h kuluttua 2 Gy) ja western-blottauksella, kuten on kuvattu aiemmin [13]. Membraanit inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden ja piparjuuri peroxidise (HRP) -leimattu sekundäärisiä vasta-aineita tietyille olosuhteissa (taulukko 1). ImageQuant LAS4000 järjestelmä (GE Terveydenhuolto, USA) käytettiin kuvan tallennuksen.

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa (n = 3). Tulokset esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Säteilytetty kokeissa, hengissäsäilymisosuudet laskettiin seurasi: SF = [keskiarvo pinnoitus tehokkuuden säteilyn (± LBH589) käsitellyissä soluissa jaettuna tarkoittaa maljaamalla valvonnan tehokkuutta (± LBH589)]% Survival fraktioiden yhdistelmä-käsiteltyjen solujen korjattiin sytotoksisuuden of LBH589. RT selviytyminen käyrät sovitettiin mukaan lineaarisen-neliöllinen malliin käyttäen GraphPad Prism 4.0 ohjelmisto (GraphPad, San Diego CA):

Survival = e

– (aD + βD

2)

seuraavat parametrit laskettiin: α arvo, β arvo, α /β-arvo, ID90, ID

50, ja ID10 (RT annos tuottaa eloonjääntifraktio 10%, 50%, ja 90%, tässä järjestyksessä) ; ja SF2 (eloonjääntifraktion 2 Gy). Sädeherkistävä vaikutus LBH589 edusti annos lisälaite tekijä (DEF) laskettuna ID

50 RT käsitellyissä soluissa jaettuna ID

50 yhdistelmä käsiteltyjä soluja [14]. Kaksisuuntainen ANOVA käytettiin tutkittaessa vaikutuksen RT annoksen ja LBH589 tuloksista parametrit (esim hengissäsäilymisosuus, solusyklin jakelu, γH2AX pesäkkeitä numero). Kahden otoksen t-testiä käytettiin vertaamaan keskimääräinen prosenttiosuus seur G1, G1, S ja G2 /M-vaiheessa olevien solujen, ja keskimääräinen γH2AX, BRCA1, BRCA2, RAD51 pesäkkeitä väliltä erityisiä kahden hoitojakson olosuhteissa. Mahdolliset merkittäviä eroja (

p

0,05) arvioitiin käyttämällä SPSS v 16.0 ohjelmisto (SPSS, Chicago, IL, USA).

Tulokset

Vaikutus LBH589 yksin soluproliferaatioon käyttämällä CaP-solujen ja normaalien eturauhasen epiteelisolujen

ajasta ja annoksesta riippuvaa soluproliferaatiota inhibition vaikutus havaittiin sekä CaP soluissa (PC-3 ja LNCaP) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1) (kuvio 1A). IC

20-arvo 24 h PC-3, LNCaP ja RWPE-1 oli 10 umol /l, 2,5 umol /l, ja 15 umol /l, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että kaksi CaP solulinjat ovat herkempiä LBH589 kuin normaalin eturauhasen epiteelisolujen linja.

(A) Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LBH589 24, 48 ja 72 tuntia; (B) Soluja käsiteltiin RT tai yhdessä sädehoidon kanssa ja LBH589 analyysiä varten pesäkkeitä muodostavien tehokkuutta. Hengissäsäilymisosuudet vähensi merkittävästi PC-3 ja LNCaP CaP solut (

p

0,01), mutta ei normaalissa REWP-1-solut (

p

0,05); (C) tyypillisiä kuvia esitetään pesäkekasvun RT ja yhdistelmähoitoon (LBH589 ja RT) Cap ja normaalissa eturauhasessa soluissa. Kaikki tulokset olivat kolmen erillisen kokeen (N = 3). Points, keskiarvo; baareja, SD.

vaikutus yhdistelmän hoidon pesäkkeenmuodostus avulla korkki ja normaalissa eturauhasessa solut

säteilylle herkäksi vaikutus LBH589 PC-3 ja LNCaP osoitettiin merkittävästi vähentynyt selviytymisen jakeet (

p

= 0,0075 PC-3,

p

= 0,0074 varten LNCaP) ja DEF näissä kahdessa solulinjassa 1 (1.77 PC-3 ja 1,29 LNCaP) ( Kuvio 1B-C). Radioherkkyyttä ei merkittävästi lisääntynyt RWPE-1 LBH589 esikäsittelemällä DEF 1,18 (

p

= 0,0823) (kuvio 1 B-C). RT parametrit RT yksinään ja yhdistelmä kohtelun kussakin solulinjassa on koottu taulukkoon 2. SF2, ID90, ID

50 ja ID10 olivat kaikki merkittävästi vähentynyt PC-3 ja LNCaP mukaan LBH589 esikäsittelyn (

p

0,05), mutta yksikään näistä merkittävästi muuttunut RWPE-1.

Cell line

alakonserni

α arvo (Gy

-1) B β-arvo (Gy

-2 ) B α /β-arvo (Gy) B SF2

ID90

ID

50

ID10

DEF (suhde ID

50)

PC-3Radiation0.2590.0644.047*0.46*4.31*1.84*0.37*1.77LBH589-radiation0.5420.1194.5550.212.681.040.19LNCaPRadiation0.0280.0750.373*0.70*5.35*2.86*1.01*1.29LBH589-radiation0.0530.1180.4240.564.202.210.75RWPE-1Radiation1.0E-070.0382.6E-060.867.784.271.671.18LBH589-radiation0.0390.0420.9180.786.923.611.18Table 2. Radiobiological parametrit säteilyn ja LBH589-sädehoitoa.

Lyhenteet: SF2 = eloonjääntifraktion 2 Gy; ID90 = säteilyannos tuottaa eloonjääntifraktio 90%; ID50 = säteilyannos tuottaa eloonjääntifraktio 50%; ID10 = säteilyannos tuottaa eloonjääntifraktio 90%; DEF = annos lisälaite tekijä; *

p

0,05 vs. vastaava LBH589-säteilyn käsitellyt solut. CSV Lataa CSV

LBH589 yksin voi aiheuttaa apoptoosin ja histoni asetylointi korkki soluissa

matala-annos LBH589 hoidon (IC

20) 24 tunnin ajan indusoi pilkkominen täyspitkä kaspaasi-3: ja asetylointi histoni 3 (H3) ja histoni 4 (H4) sekä PC-3 ja LNCaP-soluja (kuvio S1), mikä viittaa LBH589 voi aloittaa apoptoosireitin liittyviä histoni asetylaatio.

vaikutus yhdistelmähoidon tai RT yksin solusyklin jakelu

Suhteellinen subG1 väestön lisääntynyt vakaasti ja merkittävästi yhdistelmä käsiteltyjä soluja verrattuna RT-käsitellyt solut molemmissa CaP solulinjoissa (kuvio 2 ja kuviot S2-S5), mikä osoittaa enemmän solukuolemaan myös apoptoosin yhdistelmä-käsitellyissä soluissa. Kun RT hoito yksinään, solut tehtiin väliaikainen solusyklin viive /G2 /M pidätyksen välillä 2-24 tuntia, ja sitten lopulta talteen 24 tunnin kuluttua. Niinpä RT alennetaan G1 väestön välillä 2-24 h, ja G1 jatkettiin 24 h (kuva 2). Kun taas hoidossa yhdistelmähoito (LBH589 + RT), The LBH589 esikäsittelyyn soluissa aluksi laukaissut augment G2 /M pidätys kera lasku G1 ja S osia. Yhdistelmähoidon jälkeen aiheutti myöhemmin ja asteittaisen poistamisen kaikkien G1, S ja G2 /M-populaatioissa käsiteltyjen solujen vähintään talteenotto (kuvio 2).

prosenttiosuus seur G1, G1, S ja G2 /M populaatiot analysoitiin virtaussytometrillä pre-RT 72 tuntia post-RT;

p

0,01 (*): merkittävä ero osuus solusyklin vaihe eroksi ajankohta ja ”Pre-RT” aika vaiheessa RT ryhmissä;

p

0,01 (

#): merkittävä ero osuus solusyklin vaihe väliin RT ryhmä ja yhdistelmä ryhmä ”Pre-RT” aika kohta;

p

0,01 (

): merkittävä ero osuus solusyklin vaihe eroksi ajankohta ja ”Pre-RT” ajankohtana yhdessä ryhmässä. Kaikki tulokset olivat kolmen erillisen kokeen (N = 3). Points, keskiarvo; baareja, SD.

Erot G2 /M subpopulaatio välillä yhdistelmä-käsiteltyjen ja RT-hoitoryhmissä kussakin CaP solulinjassa havaittiin myös. Solut, jotka saivat vain 2 Gy RT ollut merkittäviä G2 /M pidätys 6 ~ 12 h kuluttua RT sekä PC-3 ja LNCaP solulinjoissa, ja G2 /M pidätyksen itsepintaisesti LNCaP kunnes 48 tunnin kuluttua RT. Yhdistelmähoidossa käsitellyissä soluissa, alustava LBH589 hoito aiheutti merkittävää lisäystä G2 /M väestön prosenttiosuus ennen RT molemmissa CaP solulinjoissa, ja lakkautetaan edelleen G2 /M pidätyksen jälkeen myöhempien 2 Gy RT (kuva 2 ja kuviot S2-S5).

Yhdistelmähoito voi estää RT aiheuttamaa solukierron tarkastuspisteiden aktivaation Cap soluissa

ekspressiokuviot näille tarkistuspiste proteiinien erosivat kaksi CaP solulinjoissa jälkeen RT yksinään tai yhdistelmänä hoidon LBH589 ja RT ovat kuvassa 3. p53 on negatiivinen PC-3-solut, ilmaus molempien p21 ja p53 lisääntynyt kuluttua 2 Gy RT tai yhdistelmähoito LNCaP-soluissa, mutta ne ovat pysyviä RT hoito yksinään verrattuna yhdistelmähoitoon. Kuviot p21 ilmentymistä yhdessä tai yhdistelmänä hoitoja PC-3-solut ovat hyvin samankaltaisia ​​kuin LNCaP-soluissa. p21 joko PC-3 tai LNCaP-solujen ja p53 LNCaP-soluja ei ollut havaittavissa 24 tunnin kuluttua seos hoitoa, koska LBH589 esikäsittely johti asteittainen väheneminen p21 ja p53 ilmentymistä (kuvio 3). Expression of p-CDK1 havaittiin RT käsiteltyjä soluja ennen RT ja oli pysyviä vasta 72 h kuluttua 2 Gy RT sekä PC-3 ja LNCaP; Sitä vastoin sen ilme oli alassäädetty ja tuli jopa huomaamaton yhdistelmänä hoidetuissa ryhmissä (kuva 3). Ilmaisu kokonaismäärästä-CDK1 (t-CDK1) ei muutu ajan, ja pysyi samalla tasolla kerta RT ja yhdistelmä hoidon (kuva 3).

Cell cycle liittyvät proteiinit (p21, p-p53, p53, p-CDK1, t-CDK1, p-Chk1, t-Chk1, p-Chk2, t-Chk2, p-Rb795, p-Rb807 /811, t-Rb) ja DNA-vaurion ja korjaus siihen liittyvät proteiinit (γH2AX, Ku70, Ku80, BRCA1, BRCA2, ja RAD51) määritettiin western blottauksella. t: Muutokset kokonaisproteiinipitoisuus tasojen päälle DNA-vaurioita; p: aktivointi DNA tai solusyklin Checkpoint proteiineja (fosforyloitu muoto). Tyypillisiä kuvia on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta (N = 3).

ekspressiotasoja kaikista-Chk-1 (t-Chk-1) ja yhteensä-Chk-2 (t-Chk- 2) (kaksi tärkeää tarkistuspiste kinaaseja solusyklikontrollin) kun DNA-vaurioita olivat kasvaa post RT ajan RT yksin ryhmä. Lisäämällä LBH589 ei muuttanut säteilyn aiheuttama kasvu t-Chk-1 ja t-Chk-2, mutta kumosi kasvu kaikissa aikapisteissä (kuvio 3). Yhdistelmähoidon LBH589 ja RT johti merkittävästi vähentynyt taso aktivoitu Chk-1 ja Chk-2 (p-Chk-1 ja p-Chk-2) 6 tunnin jälkeen post RT hoitoa, verrattuna RT hoito yksinään (kuvio 3) . Ilmentyminen Checkpoint proteiinien odotetaan suojaavan soluja säteilyltä. Tuloksemme viittaavat siihen, että LBH589 voivat vaikuttaa sekä ilmaisun ja toiminnan Chk-1 ja Chk-2 siten häiritsee solusyklin hallinnan yhdistettynä RT hoitoon. p-Rb795 ja p-Rb807 /811-proteiinit ovat tärkeitä tarkistuspisteitä vastaa G2 /M pidätys syöpäsolujen RT. Aktivoituminen näiden kahden proteiinin havaittiin RT-käsitellyissä soluissa, kun taas ei ollenkaan tai hyvin heikkoa ilmentymistä näiden kahden proteiinin havaittiin yhdistelmänä-käsitellyissä soluissa, kun taas ei ollut mitään selvää muutosta havaittu ekspression koko-Rb (t-Rb) (kuvio 3), mikä tarkoittaa, että LBH589 esikäsittely esti RT-indusoidun aktivaation p-Rb795 ja p-Rb807 /811. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen ja aktivaatio näiden solusyklin liittyvät tarkastuspiste proteiinit muuttuvat yhdistelmässä saaneissa ryhmissä verrattuna pelkkään sädehoitoon hoidetuissa ryhmissä.

Yhdistelmähoito voi aiheuttaa pysyviä DNA kaksijuosteisen tauko (DSB ) korkki soluissa

DNA: n DSB tutkittiin käyttäen γH2AX merkkiaineena western-blottauksella ja fluoresenssivärjäyksellä. 2 Gy RT-käsiteltyjen CaP soluja, ilmaus γH2AX alkoivat nousta 10-15 min kuluttua RT, korkeimmillaan 48 h ja 2 h, ja PC3 ja LNCaP vastaavasti, kuten on esitetty western blottauksella (kuvio 3). ΓH2AX tulokset western blotting vahvistettiin edelleen immunofluoresenssivärjäyksen (kuvio 4). Sen sijaan, että käsiteltyjen solujen yhdistelmähoidon, γH2AX kohtalaisesti ilmaistiin edeltävässä RT ajankohta ja oli säädelty Aikamittarin sekä PC-3 ja LNCaP kunnes 72 h (kuva 3). Lukumäärä γH2AX pesäkkeitä vuonna ytimien kvantitoitiin kuten kuvassa 4. Positiivinen γH2AX pesäkkeitä oli vielä havaittavissa 72 h kuluttua 2 Gy RT PC-3 ja LNCaP yhdistelmähoidolla. Nämä tulokset osoittavat, että DNA: n DSB poistu yhdistelmähoito verrattuna pelkkään sädehoitoon.

(A) jälkeen 2 Gy RT, keskimäärin γH2AX pesäkkeitä määrä kasvoi merkittävästi 24 tunnin sekä PC-3 ja LNCaP-soluissa ja laskenut alemmalla tasolla 72 h, kun taas keskimääräinen γH2AX pesäkkeitä määrä yhdistelmänä-käsiteltyjen (LBH589 + 2 Gy RT-solut) oli merkittävästi korkeampi kuin RT-käsitellyissä soluissa tahansa pistettä ja jatkoivat nousuaan, kunnes 72 h. (B) edustavat kuvat γH2AX värjäyksen jälkeen 2 Gy RT tai yhdistelmähoito (LBH589 + 2 Gy RT) PC-3 ja LNCaP.

p

0,05 (†) osoittaa merkittävää eroa RT-käsiteltyjä soluja, ja yhdistelmä-käsiteltyjä soluja samaan aikaan pisteen.

p

0,05 (*) osoittaa merkittävää eroa solujen tiettyinä ajankohtina ja solut saavat saman kohtelun ”Pre-RT” ajankohtana. Points, keskiarvo; baareja, SD. N = 50. Tyypillisiä kuvia on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta (N = 3). Suurennus × 60 kaikissa kuvissa.

Yhdistelmähoito voi pienentää aktivoitumista ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) korjaukseen liittyvän reitin Cap soluissa

Koska pysyviä DNA: n DSB nähtiin yhdistelytoimenpiteistä käsitellyt solut, kaksi NHEJ reitin proteiinit (Ku70 ja Ku80), jotka ovat vastuussa korjaamiseen RT aiheuttaman DSB tutkittiin edelleen western blotting in RT ja yhdistelmänä käsiteltyjä soluja. Ekspressiomalleja Ku70 ja Ku80 olivat erilaisia ​​PC-3 ja LNCaP-soluja (kuvio 3). PC-3-solut, positiivinen ilmaus Ku70 ja Ku80 todettiin 6 tunnin kuluttua RT ja nostetaan asteittain, kunnes 72 tunnin kuluttua RT taas ilmaus Ku70 ja Ku80 oli havaittavissa 48 tunnin kuluttua hoidossa yhdistelmähoito (kuva 3). LNCaP-solut, positiivinen ilmaus Ku70 ja Ku80 havaittiin kaikkina ajankohtina RT yksinään ja yhdistelmä hoidon LBH589 ja RT, mutta ekspressiotasot Ku70 ja Ku80 olivat paljon korkeammat, kun RT yksinään verrattuna yhdistelmähoidon kaikkina ajankohtina (kuvio 3). Nämä tulokset osoittavat NHEJ polku oli mukana RT CAP soluissa ja että esikäsittely LBH589 voi vähentää sen aktivoinnin verrattuna pelkkään sädehoitoon.

Yhdistelmähoito voi vähentää aktivoinnin homologisen rekombinaation (HR) korjaukseen liittyvän reitin korkki soluissa

BRCA-1, BRCA-2 ja Rad-51 ovat DSB korjaus proteiineja HR kautta. Ekspression näiden proteiinien on yhä indusoida 2 tuntia, kunnes 72 tunnin kuluttua yhden RT Western blottauksella (kuvio 3). Verrattuna RT yksin ryhmä, ilmaus BRCA-1 ja BRCA-2 proteiinien yhdistelmä hoitoryhmissä noudattivat samaa suuntausta mutta kumottiin kuluttua 6 tunnin kuluttua RT molemmissa solulinjoissa. Erityisesti ilmaus RAD51 proteiinin pidettiin alemmalla tasolla, kunnes 72 h PC-3-soluissa ja oli merkittävästi pienennetään, kunnes 24 h LNCaP-solujen yhdistelmä ryhmissä (kuvio 3). BRCA-1, BRCA-2 ja Rad-51 tulokset western blotting lisävahvistusta immunofluoresenssivärjäyksen (kuviot 5-7). Number pesäkkeitä kolmesta proteiini korjaus merkkiaineiden ytimien kvantitoitiin kuten kuvioissa 5-7. Tulokset Western blot olivat yhdenmukaisia ​​immunofluoresenssivärjäyksellä tuloksia. Tulosten perusteella näyttää, että sen lisäksi, että ne vaikuttavat NHEJ korjaukseen liittyvä reitti, LBH589 voi myös herkistää RT kautta häiritsee HR koulutusjakson heikentäen DSB korjaus kyky korkin solujen.

(A) jälkeen 2 Gy RT, keskimäärin BRCA1 pesäkkeitä määrä kasvoi merkittävästi 24 tunnin sekä PC-3 ja LNCaP ja ylläpidetään kasvoi 72 h, kun taas keskimääräinen BRCA1 pesäkkeitä sarjanumeroa saaneilla (LBH589 + 2 Gy RT) soluja lisättiin myös 24 ja 72 tuntia, mutta oli huomattavasti pienempi kuin että RT-käsitellyissä soluissa. (B) edustavat kuvat BRCA1 värjäyksen jälkeen 2 Gy RT tai yhdistelmähoito (LBH589 + 2 Gy RT) PC-3 ja LNCaP.

p

0,05 (†) osoittaa merkittävää eroa RT-käsiteltyjä soluja, ja yhdistelmä-käsiteltyjä soluja samaan aikaan pisteen.

p

0,05 (*) osoittaa merkittävää eroa solujen tiettyinä ajankohtina ja solut saavat saman kohtelun ”Pre-RT” ajankohtana. Points, keskiarvo; baareja, SD. N = 50. Tyypillisiä kuvia on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta (N = 3). Suurennus × 60 kaikissa kuvissa.

(A) jälkeen 2 Gy RT, keskimäärin BRCA2 pesäkkeitä määrä kasvoi merkittävästi 24 tunnin sekä PC-3 ja LNCaP ja ylläpidetään kasvoi 72 h, kun taas keskimääräinen BRCA1 pesäkkeitä sarjanumeroa saaneilla (LBH589 + 2 Gy RT) soluja lisättiin myös 24 ja 72 tuntia, mutta oli merkittävästi pienempi kuin RT-käsitellyissä soluissa. (B) edustavat kuvat BRCA2 värjäyksen jälkeen 2 Gy RT tai yhdistelmähoito (LBH589 + 2 Gy RT) PC-3 ja LNCaP.

p

0,05 (†) osoittaa merkittävää eroa RT-käsiteltyjä soluja, ja yhdistelmä-käsiteltyjä soluja samaan aikaan pisteen.

p

0,05 (*) osoittaa merkittävää eroa solujen tiettyinä ajankohtina ja solut saavat saman kohtelun ”Pre-RT” ajankohtana. Points, keskiarvo; baareja, SD. N = 50. Tyypillisiä kuvia on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta (N = 3). Suurennus × 60 kaikissa kuvissa.

(A) jälkeen 2 Gy RT, keskimäärin RAD51 pesäkkeitä määrä kasvoi merkittävästi 24 ja 72 h sekä PC-3 ja LNCaP, kun taas keskimääräinen BRCA1 pesäkkeitä numero yhdistelmä-käsiteltyjen (LBH589 + 2 Gy RT) soluja lisättiin myös 24 ja 72 h, mutta oli merkittävästi pienempi kuin RT-käsitellyissä soluissa. (B) edustavat kuvat RAD51 värjäyksen jälkeen 2 Gy RT tai yhdistelmähoito (LBH589 + 2 Gy RT) PC-3 ja LNCaP.

p

0,05 (†) osoittaa merkittävää eroa RT-käsiteltyjä soluja, ja yhdistelmä-käsiteltyjä soluja samaan aikaan pisteen.

p

0,05 (*) osoittaa merkittävää eroa solujen tiettyinä ajankohtina ja solut saavat saman kohtelun ”Pre-RT” ajankohtana. Points, keskiarvo; baareja, SD. N = 50. Tyypillisiä kuvia on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta (N = 3). Suurennus × 60 kaikissa kuvissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että LBH589 esti kasvua PC-3, LNCaP CaP solut ja RWPE-1 normaalin eturauhasen epiteelisolujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, joka on samanlainen kuin aiemmin raportoitu toksisuutta muita hydroksamaateiksi [15]. Normaalin eturauhasen epiteelisolujen line RWPE-1 oli kaikkein resistentti LBH589 kun LNCaP oli herkin kolmesta solulinjoissa, mikä viittaa siihen, CaP solut ovat suhteellisen herkkiä LBH589.

On havaittu, että α /β arvo on huomattavasti pienempi Cap kuin useimmat muut syövät. Α /β arvot PC-3 ja LNCaP nykyisessä tutkimuksessa ovat linjassa aiempien raporttien, joka on välillä 0,5 ja 4 Gy [16]. Kun solut, jotka yhdistelmähoitona (LBH589 ja RT), The α /β-arvot PC-3 ja LNCaP-soluja lisättiin 4,555 ja 0,424 Gy, vastaavasti. DEF oli 1,77 PC-3 ja 1,29 LNCaP. Α /β arvo RWPE-1 normaalin eturauhasen solulinja oli 0,243 ja 0,257 Gy jälkeen RT yksin tai yhdistettynä hoito, joka on vastaavasti pienempi kuin kahta CaP solulinjoista. DEF oli 1,18, joka on pienempi kuin PC-3 ja LNCaP solulinjat. Nämä tulokset takaa edelleen

in vivo

tutkimuksessa ja kliinisissä kokeissa.

Nykyisessä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että jopa pieni annos LBH589 (IC

20) 24 tunnin hoito voi laukaista apoptoosin korkki soluissa (kuvio S1) ja prosenttiosuus subG1 populaation solut yhdessä hoidossa LBH589 ja RT vähitellen kasvanut, kun se oli johdonmukaisesti melko alhainen RT käsitellyissä soluissa, mikä tarkoittaa, että yhdistelmähoito voi aiheuttaa lisää solukuolemaa.

Solusyklianalyysiä vahvistivat lisäksi, että enemmän PC-3 ja LNCaP blokattiin G2 /M vaiheessa kuluttua 24 h LBH589 käsittely ja solujen prosenttiosuus G1 vaiheessa vähentynyt merkittävästi. Lisäksi hoito LBH589 24 tunnin vähensi S-faasin pitoisuus LNCaP alemmalle tasolle. Kaikissa solusyklivaiheista, G2 /M vaiheessa solut ovat herkkiä säteilylle ja S-vaiheessa olevien solujen ovat resistenttejä [17]. Tuloksemme viittaavat siihen, että solusyklin pysähtymiseen G2 /M ja lasku S-faasin prosenttiosuus voisi olla syynä säteilylle herkäksi vaikutusta LBH589.