Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Perimän epävakautta usein DNA: n kopioiden määrä muutoksia on yksi tärkeimmistä tunnusmerkeistä syövän . Kromosomaalinen alueet usein DNA: n kopioiden lukumäärä voitto ja tappio ihmisen mahasyövän ovat edelleen huonosti määritelty. On edelleen epäselvää, kuinka DNA kopioluvun vaihtelut edistää muutoksia geeniekspressioprofiilien, erityisesti maailmanlaajuisesti.

Keskeiset havainnot

Analysoimme DNA kopioluvun muutoksia 64 ihmisen mahasyövän näytteitä ja 8 mahasyövän solulinjoissa käyttämällä bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC) paneelit perustuvat vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH). Tilastollinen analyysi sovellettiin korreloivan aiemmin julkaistu geenien ilmentyminen saadut cDNA mikrosiruja vastaavien DNA kopioluvun vaihtelua data tunnistaa ehdokas onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Huomasimme, että mahasyövän näytteet osoittivat toistuvia DNA kopiomäärä muunnelmia, mukaan lukien vahvistukset 5p, 8q, 20p, 20q, ja tappiot 4q, 9P, 18q, 21 q. Yleisin alueiden monistuksen oli 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13.2 (11/72) ja 20q13.2-20q13.3 (6/72) . Yleisin poistettu alue oli 9p21 (8/72). Joka korreloi geenien ilmentyminen array tietoja aCGH tunnistettujen 321 ehdokasta onkogeenien, jotka olivat yli-ilmentynyt ja osoitti usein DNA kopiomäärä voitot; ja 12 ehdokas tuumorisuppressorigeeneille jotka alassäädetty ja osoittivat usein DNA: n kopioiden määrä menetyksiä ihmisen syöpien. Kolme verkostoja merkittävästi ilmaistu geenien mahasyövässä näytteet tunnistettiin kekseliäisyys koulutusjakson analyysi.

Johtopäätökset

Tutkimus tarjoaa tietoa DNA kopioluvun vaihtelua ja niiden vaikutusta muuttuneen geeniekspressioprofiilien aikana ihmisen maha- syövän kehittymisen. Se tarjoaa uusia Hakijan onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille ihmisen mahasyövän, hyödyllisiä koulutusjakson karttoja tulevaisuuden ymmärtämistä molekyylitason patogeneesin tämän maligniteetti, ja rakentaa uusia terapeuttisia kohteita.

Citation: Fan B, Dachrut S, Coral H, Yuen ST, Chu KM, Law S, et al. (2012) integrointi DNA Kopioi numero muutostyöt ja transkription Expression Analysis in Human syöpään. PLoS ONE 7 (4): e29824. doi: 10,1371 /journal.pone.0029824

Editor: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Ranska

vastaanotettu: 19 syyskuu 2011; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2011; Julkaistu 23. huhtikuuta 2012

Copyright: © 2012 Fan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan tarjoaman rahoituksen University of California Cancer Research Koordinaattien komitean XC. BF tukee China Scholarship neuvoston Sopimus No.2010601079. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syöpäsairauksia ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Suurimmat tyyppinen mahasyöpä on adenokarsinooma, jota voidaan edelleen luokitella suoliston tyyppi ja hajanainen tyyppi [2]. Suoliston-tyyppinen vauriot ovat usein haavaisen ja esiintyy distaalisessa mahassa. Diffuusi-leesioita liittyy huonompi ennuste kuin suoliston tyyppi. Kirurginen hoito on ainoa hoitomuoto, joka on mahdollisesti parantava vaikutus syöpään. Ennuste mahasyöpäpotilaista riippuu suuresti kliiniset ja patologiset vaiheessa taudin diagnoosi. 5 vuoden eloonjäämisluvut jälkeen parantava kirurginen resektio laskua 60-90% I vaiheessa vain 10-25% potilailla vaiheessa III taudin [3]. Useimmat mahasyöpäpotilaista tunnistetaan pitkälle edennyt, mikä johtaa synkkä ennuste.

geneettiset muutokset ovat keskeisiä tapahtumia kehittämisessä eniten kasvaimia, mukaan lukien mahasyöpä [4]. Tutkimukset viittaavat siihen, että syövän etenemiseen riippuu peräkkäisten hankinnasta kromosomipoikkeavuuksien johtavat voittoja tai tappioita osan kasvainsolun genomiin. Siksi luonnehdinta genomista poikkeavuuksia voi auttaa selvittämisessä molekyylitason patogeneesin mahasyövän sekä paljastaa geneettisiä markkereita etenemisen. Array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) on tehokas tapa käyttää tunnistamaan patogeenisten DNA kopioluvun muutoksia genomin laajuisesti [5]. aCGH on sovellettu useita kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien mahasyöpä [6], [7]. Sen on osoitettu olevan käyttökelpoinen tunnistaminen uusien onkogeenien ja kasvainten synnyssä, ja luokitella kasvainten, joka perustuu geneettisiin muutoksiin.

Expression profilointi kokeissa tunnistettu suuri määrä geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti normaalissa ja kasvaimen kudoksiin. Kuitenkin useimmat näistä geeneistä ovat todennäköisesti matkustaja geenejä, jotka on rajoitettu osuus kasvaimien syntyyn. Keskeinen haaste on tunnistaa kuljettajan oncogenes tai tuumorisuppressorigeeneille että tärkeä rooli aikana kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen, DNA-kopion numero vaihtelu on tärkeä tyyppi geneettinen muutos havaittiin kasvainsoluissa, ja se edistää kasvainten kehittymistä jonka korjauksilla geenien ilmentymistä alueella [8]. DNA kopiomäärä voittoja ja tappioita eivät ole satunnaisia, vaan edustavat johdonmukaista geneettisiä tapahtumia syövän syntymistä. Tunnistaminen geenit, jotka ovat sekä yli-ilmentää ja täydentää tai alle ilmaistaan ​​ja poistetaan voi olla hyödyllistä, koska nämä geenit voivat edustaa kuljettaja geneettiset muutokset.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet DNA: n kopioiden määrä muutoksia tai ekspressioprofiileja mahasyövän näytteissä . Tutkimukset ovat myös tunnistettu yhteisiä kromosomi voittoja ja tappioita sekä satoja geenejä, jotka saattavat erottaa kasvaimia normaaleista kudoksista [6], [9]. Kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat tutkineet yhdistyksen välillä DNA kopiomäärä variaatioita ja transkription ekspressioprofiileja. Tässä käsikirjoitus, teimme aCGH analyysi on suuri määrä ihmisen mahasyövän näytteitä. Lisäksi integroitu analyysi DNA kopioluvun vaihteluita ja vastaavan geenin ilmentymisen arvot suoritettiin tunnistaa merkittäviä geenejä, jotka saattavat edistää mahasyövän patofysiologiaan. Kaikkiaan 321 ehdokkaan onkogeenien ja 12 ehdokasta tuumorisuppressorigeeneille tunnistettiin analysoimalla.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

käyttö arkistointiin mahan näytteen kuluvan hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean University of Hong Kong ja sisäisen Review Boards of University of California, San Francisco.

Kasvain näytteet, Cell Lines ja DNA, RNA valmistelu

Tuumorinäytteet kerättiin gastrectomy yksilöitä Department of Surgery, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Kahdeksan mahasyövän solulinjoissa AGS, BGC823, N87, NUGC3, SNU16, SNU5, KATOIII ja MNK45 on kuvattu aikaisemmin julkaistu [10]. Genominen DNA uutettiin käyttäen genomista DNA: n puhdistusta (Qiagen, Valencia, CA).

kliinis-patologisia parametrit kasvaimia on aiemmin julkaistu [11]. Kasvaimet luokitellaan joko Lauren luokittelu suoliston, hajanainen, sekoitetaan, ja epämääräinen tyypit [2]. Läsnäolo helikobakteeri että maha on poistettu näytteistä määritettiin histologinen tutkimus ja täydennetään muutettu Giemsa-värjäyksellä. Läsnäolo EBV syöpäsoluissa määritettiin in situ -hybridisaatiolla eber kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kasvain vaiheet määriteltiin yleisten sääntöjen mahasyövän Tutkimus Japani Research Society mahasyövän [13].

Array-pohjainen CGH

Ihmisen 1,14 paneelit saatiin UCSF Cancer Centerin Array Core (https://cc.ucsf.edu/microarray/). Ne koostuivat 2353 bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC) kloonia, jotka kattoivat ihmisen genomin 1,5 Mb resoluutio. Hybridisaatiota varten 1 ug kasvaimen DNA ja 1pg sukupuoleen sovitetun viite DNA leimattiin satunaisaluke- käyttäen Cy3-dCTP ja Cy5-dCTP, vastaavasti, jossa Bioprime Kit (Invitrogen). Rekisteröimätön fluoresoivat nukleotidit poistettiin käyttämällä Sephadex G-50-kolonnia (Amersham, Piscataway, NJ). Näyte ja viite DNA sekoitettiin 100 ug Cot-1, saostettiin ja suspendoitiin uudelleen hybridisaatioliuoksessa. Hybridisaatioliuos denaturoitiin 10 minuuttia 72 ° C: ssa ja sen jälkeen inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Hybridisaatio suoritettiin 48-72 tuntia kosteassa kammiossa hidas keinutuoli pöytä. Arrays pestiin 10 minuutin ajan 50% formamidissa ja 2 x SSC: ssä 45 ° C: ssa, ja 10 min fosfaattipuskurilla huoneenlämpötilassa. Objektilasit kiinnitettiin asennusratkaisuja sisältää 0,3 ug /ml DAPI. Kolme yksivärisiä intensiteetin kuvia (DAPI, Cy3 ja Cy5) kerättiin kunkin array käyttäen CCD-kamera.

Array-pohjainen CGH Data Analysis

UCSF SPOT ohjelmisto [14] käytettiin automaattisesti segmenttiin paikkoja perustuu DAPI kuvia, suorita paikallinen tausta korjaukset, ja laskea erilaisia ​​mitattavia suureita kuten log2 suhteet koko yhdistetyssä Cy3 ja Cy5 intensiteetit kunkin täplän. Raakatietoja aCGH ovat saatavilla GEO (hakunumero: GSE33501).

Ohjelman SPROC käytettiin liittää kloonin identiteetit ja kartoitus tietopaketti kunkin paikalla siten, että data voidaan piirtää suhteessa asemaan BAC. Kromosomimuutokset luokiteltiin voitto, kun normalisoitu log2 Cy3 /Cy5-suhde oli 0,225 ja tappio, kun suhde oli -0,225. Numero määritettiin 3-kertainen keskimääräisen SD normaalin ja normaalissa aCGH hybridisaatio. Amplifikaatiot tunnistettiin kun normalisoitu log2 Cy3 /Cy5-suhde oli 0,8. Samoin homotsygoottisia deleetioita havaittiin, kun normalisoitu log2 Cy3 /Cy5-suhde oli -0.7. Useita voitot, tappiot, ja tiomonistukset lasketaan erillisinä tapahtumina. Kynnys voitto tai tappio kokonaisen kromosomin varsi määriteltiin mediaani log2 suhde 0,225 tai -0,225 kaikkien kloonien kromosomissa käsivarteen.

Statistical Data Analysis

näytteet luokiteltiin koetuloksiin ja verrataan kliiniset tiedot (taulukko S1) käyttäen merkittävä analyysi microarray (SAM) analyysi [15]. DNA kopioluvun muutoksia myös mediaani prosentteina herkkyydestä ja tappion. Usein vahvistus ja poisto analysoitiin CGH tutkimusmatkailija 3,2 (https://www.ifi.uio.no/forskning/grupper/bioinf/Papers/CGH/). ”Analyysi Copy Errors” (ACE) suoritettiin käyttäen väärää löytö määrä (FDR) 0,0001 ja keskisuurten herkkyys. Klusterointi kaikista näytteistä suoritettiin TreeView versiossa 1.60.

R /Bioconductor ohjelmisto, kuten CBS-ohjelma, käytettiin laskemaan korrelaatio kopiomäärä muutoksen ja geenien ilmentyminen. Ilmaisu data 6688 cDNA-kloonien käytetään edellisen geenin ilmentymisen analyysi [11], [16] (GEO hakunumero: GSE2701) on haettu. Mapping asento Näiden cDNA-kloonit osoitetaan käyttäen NCBI genomin kokoonpano, pääsee läpi UCSC genomin selaimen tietokannan (NCBI rakentaa 35). ACGH Aineisto segmentoituja pyörivin binary segmentointi (CBS) kuten toteutettu DNA-kopion paketin R /Bioconductor kääntää kokeellisiin voimakkuuden mittauksia alueisiin yhtä kopio numeroita. Puuttuvat arvot kloonien kartoitus sisällä segmentoida alueilla yhtä kopiolukujen imputoitiin käyttämällä arvoa vastaavan segmentin. Geenin ilmentyminen kloonit kartoitetaan BAC-kloonin kuluessa 1 Mb geenin ilmentymisen kloonin, jolla oli korkein Pearson korrelaatio kopioluku ja geenin ilmentymistä. ”Tasoitetussa” arvoja CBS kanssa alun perin havaittu log2 kulusuhde harha kloonien edellä kuvatut ja laskennalliset arvot puuttuvat arvot katsottiin laskettaessa korrelaatio geenien ilmentyminen. Korrelaatio laskettiin vain kloonit, ja korrelaatiokerroin 0,29 käytettiin cut-off-kloonien tunnistamiseksi, joilla on positiivinen korrelaatio kopioluku ja geenin ilmentymistä.

p

-arvot varten geenien ilmentymisen ja kopioluvun korrelaatioita saatiin perustuvat permutaatio. Merkinnöissä ilmaisun tietoja arvotaan uudestaan ​​ja Pearsonin korrelaatio geenien ilmentymisen kloonien ja kopioluvun BAC-klooneja laskettiin edellä kuvatulla tavalla. Tämä toistettiin 1000 kertaa. Kunkin geenin ilmentymisen klooni, p-arvo määritettiin osuus kertaa permutaatio perustuu korrelaation oli suurempi tai yhtä suuri kuin havaittu korrelaatiota.

p

-arvot korjattiin sitten useampia Teknisesti ohjaamalla varten väärien löytää rate (FDR) käyttäen Benjamini-Hochberg menetelmä [17].

toiminnallinen analyysi merkittävien geenien suoritettiin käyttämällä Nerokkuus Pathway ohjelmistoa (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

tulokset

Array-pohjainen CGH analyysi Ihmisen mahasyövän

tunnistamiseksi DNA: n kopioiden määrän muutoksia mahalaukun syövät, haimme BAC aCGH 64 ihmisen mahasyövän kudosnäytteitä ja 8 mahasyövässä solulinjoissa. Raaka tiedot ovat saatavilla taulukossa S2. Havaitsimme toistuva kromosomi vaihtelut näistä näytteistä, ja alueet, joilla on huomattava DNA kopioluvun muutoksia havaittiin. Tuloksena taajuus juoni ja poikkeamaa tontti voitot ja tappiot on esitetty kuviossa 1A ja kuvio 1B vastaavasti. Kaksi edustavaa genominlaajuisten suhde tonttien yksittäisten mahakasvaimen on esitetty kuvassa S1. Yleisin DNA kopioluvun vaihteluita tämä asettaa ihmisen mahalaukun kasvaimet määritetty mediaani prosenttiosuus voitto tai tappio sisällytetään voittoja 5p, 8q, 20p, 20q, ja tappiot 4q, 9P, 18q, 21 q.

(A) Yleinen taajuus DNA kopioluvun muutoksia by aCGH. Frekvenssianalyysiä mitattuna osa tapauksista saanut tai menettänyt kaikkien BAC-klooneja on paneelit. Tiedot esitetään tilasi kromosomaalinen karttasijainnin kloonien. Alempi baareja edusti tappioita ja ylempi baareja edustettuina voittoja. Violetti pystypalkit edusti rajan jokaisen kromosomin. (B) DNA: n kopioiden määrä muutoksia kussakin mahasyövässä näytteitä. 72 kasvainnäytteestä käskettiin ylhäältä alas. Red sarakkeet edusti kopiomäärä voitot ja vihreät pylväät edusti kopiomäärä tappioita.

Seuraavaksi analysoitiin DNA kopioluvun vaihtelut mahasyövän näytteitä eri kliinis-patologisia ominaisuuksia, kuten kasvain vaiheessa kasvaimen tyyppi, kasvain sivusto kasvaimen erilaistumiseen, Helicobacter pylori ja EBV-infektio, sekä eroa mahakasvaimen näytteiden ja solulinjojen (kuvio S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 ja taulukko S3). Löysimme erityisiä kromosomipoikkeamakoe rikastettu tiettyjen kliinis-patologisia piirteitä. Esimerkiksi menetys 19p havaittiin useammin vaiheessa 1 vaihe 2 kasvaimet (20%) kuin vaiheessa 3 vaihe 4 näytettä (3,41%) (taulukko S3). 16P menetys todettiin 10% Helicobacter pylori negatiivisista näytteistä verrattuna 0%: Helicobacter positiivista näytettä, kun taas 16p vahvistus havaittiin 14,71%: n Helicobacter pylori positiivista näytettä vaan ainoastaan ​​3,33%: n Helicobacter negatiivisista näytteistä (taulukko S3 ). Nämä tulokset viittaavat mahdolliseen osallistumiseen geenien tiettyjen alueiden tiettyihin kasvain fenotyypit.

Korkean tason monistukset ja homotsygoottisia deleetioita on koottu taulukkoon S4. Yleisin vahvistus löydettiin pitkän varren kromosomin 20. Tällä alueella, neljä erillistä polttoväli amplikonien voitiin tunnistaa: 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13. 2 (11/72) ja 20q13.2-20q13.3 (6/72). Toiseksi yleisin vahvistusta, esiintyy pitkän varren kromosomin 8, oli myös neljä erillistä polttoväli amplikoneihin: 8q23.1 (3/72), 8q24.1 (7/72), 8q24.12-8q24.2 (6 /72) ja 8q24.2 (6/72). Yleisin homotsygoottinen deleetio alueella löydettiin 9p21 (8/72) ja 18q22 (6/72). Muita korkean tason monistukset ja homotsygoottisia deleetioita esiintyi suhteellisen matalilla taajuuksilla. Esimerkkejä usein poikkeamia on esitetty kuviossa 2. Joitakin hyvin tunnettu onkogeenien (esim

HER2, TOP2A, sykliini, TGFB1, AKT2, MYC

) ja kasvaimen synnyssä (esim

P16, Smad4, Smad7

) on todettu sijaitsevat näissä loci. Mielenkiintoista, suurempi määrä monistukset ja homotsygoottisia deleetioita tunnistettiin solulinjoja kuin ensisijainen mahasyövän kasvain näytteissä.

Kloonit määräsi heidän asemaansa pter (vasemmalla) qter (oikealla). Log2 suhteet jokaisen kloonin näissä erityistapauksissa piirrettiin rikki linja kaavioita eri väriä. Useita kirkas kopioluvun muutoksia (voitot, tappiot, monistukset ja poistot) voidaan tunnistaa. Keskusta amplikonin ja homotsygoottinen poisto ytimet merkitty yhdessä geenien kullakin ydinalueella. (A) Amplification in 17q11.2-17q21. (B) Amplification in 19q12-19q13.1. (C) Amplification in 8q24.1-8q24.2. (D) Homotsygoottinen deleetio 18q21.1. (E) Homotsygoottinen deleetio 9p21. (F) Homotsygoottinen deleetio 16q23. (G) Homotsygoottinen deleetio 18q12.

Osuus Genomisen DNA Kopioi numero vaihtelu Global Gene Expression Muutokset ihmisen mahasyövän Näytteitä

Meidän Edellisessä tutkimuksessa raportoimme geeniekspression profiili 90 ensisijainen mahasyövän näytteitä verrattiin niiden 14 metastasoitunut kollegansa ja 22 ei-neoplastisia mahalaukun limakalvoja, jossa 6688 cDNA-kloonit osoittaa merkittävää vaihtelua nämä näytteet [11], [16]. Niistä 90 mahasyövän näytteitä, 62 yksilöt sisällytettiin nykyiseen aCGH tutkimuksessa. Sen määrittämiseksi, onko DNA-kopion määrä variaatioita edistää maapallon geeniekspressiomalli muutoksia, päätimme korrelaatio geenien ilmentymisen arvojen ja vastaavan DNA: n kopioiden määrä muuttuu näissä 62 ihmisen mahasyövän näytteet on geenin geeni perusteella. Niistä 6688 cDNA alkuperäisessä ilmentämistutkimuksissa, 5719 cDNA kloonit sijaintitiedon haettiin tähän analyysiin. Näistä 5719 cDNA-kloonien, 1352 cDNA-klooneja (23,6% koko cDNA-kloonit analysoidaan), mikä vastaa noin 973 ainutlaatuinen geenejä, osoittivat tilastollinen merkittävä korrelaatio ilmaisu arvojen ja DNA kopioluvun vaihtelut (korrelaatio 0,29 ja säätää p-arvo alle 0,01 jossa FDR alle 3,4%. taulukossa S5 on luettelo geenejä). Kuvaamaan, onko DNA-kopion määrä vaikuttaa geenin ilmentymisen, vertasimme pareittain korrelaatio geenien ilmentyminen tietoja joko aCGH arvojen BAC-kloonien lähellä paikkaan, jossa kukin geeni sijaitsee (lävistäjä), tai aCGH arvot BAC-kloonien sijainti on muu genomin alueita. Löysimme paria alueiden pitkin lävistäjä on korkeampi positiivinen korrelaatio (mediaani korrelaatio ~0.12) kuin off-lävistäjä parit (mediaani korrelaatio ~0.0) (Kuva S9A). Lämpökarttana on pairwise korrelaatio geenien ilmentyminen ja kopioi numero osoittaa myös positiivinen korrelaatio pitkin lävistäjä (kuva S9B).

Kaiken meidän tiedot vahvistavat, että DNA-kopion määrä variaatioita edistää sääntelyä alueellisten geeniekspression profiilit ihmisen mahasyövän näytteitä.

tunnistetiedot Candidate Oncogene tai tuumorisuppressorigeeneille ihmisille mahasyövistä

paikantaa ehdokas onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille, haimme kaksi kriteeriä luetteloon 1352 cDNA kloonit, jotka osoittivat tilastollisesti merkitsevä korrelaatio geenien ilmentyminen ja vastaava DNA kopioluku muutoksia. Ensin etsittiin geenejä, joka osoitti 5 enemmän voittoja kuin tappioita tai 5 enemmän tappioita kuin voittoja mahasyövässä näytteissä. Seuraavaksi sovitettu geenin listan kanssa 3329 cDNA-kloonit, jotka oli identifioitu ilmentyvät differentiaalisesti välillä ei ollut kasvainta, mahalaukun kudosten ja ihmisen mahasyövän näytteitä [11]. Niinpä kaventunut lista 363 klooneja, jotka edustavat 333 ainutlaatuinen geenejä (taulukko S6). Näistä geeneistä, 321 geenejä säädellään ylöspäin mahasyövän näytteiden ja olivat usein saaneet tai ulkoiset at genomisesta DNA-tasolla. Loput 12 geenit alassäädetty mahasyövän näytteiden ja olivat usein hävitettävä genomi-DNA-tasolla. Nämä kaksi geenit siis edustavat mahdollisten ehdokas onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille, vastaavasti, jotka saattavat olla osallisina mahasyövän synnyssä ja kehityksessä.

DNA Kopioi numero Muutokset kanssa vastaavan geenin ilmentyminen arvot Valittu Gene Clusters Human mahasyövistä

paremmin kuinka DNA kopiomäärä vaihtelut vaikuttavat geenien ilmentyminen, analysoimme ilmaisun kuviot 333 ehdokkaan onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille vuonna 62 mahasyövän näytteitä hierarkkinen klusterointi (kuvio 3A). Ei yhdistysten havaittu välillä klustereiden kuvio ja kliiniset piirteet (kuva S10), mikä viittaa siihen, että nämä geenit eivät tarjoa ylimääräisiä arvoja molekyylitason luokittelu ihmisen mahasyöpä. Mielenkiintoista on, että useita geeniklusterit havaittiin sijaitsevat samassa kromosomissa samalla alueet, mukaan lukien geenit sijaitsevat 6p21.3-p21.1, 7q21-q22, 8q21-q24, 8q24.3, 12q14-q15, 20q11-q13 ja 20q13. 3 (kuvio 3B 3H). Yleistä vahvan korrelaation koordinoi voimistunut ilmentyminen näiden geeniklustereita ja DNA kopioluvun voittoja vastaava kromosomialueita havaittiin (kuvio 3B 3h). Se ehdottaa, että DNA kopiomäärä vaihtelu on keskeinen tekijä ilmaisua vaihtelua näiden geenien klusterissa.

(A) Hierarkkinen klusterointi kuviot vaihtelua ilmentymisen 333 ehdokkaan onkogeenin ja tuumorisuppressorigeeneille (taulukon S6) 62 mahalaukun kasvaimet. Jokainen rivi edustaa erillistä cDNA-kloonin microarray ja kukin sarake edustaa ekspressiokuviota erillisessä kasvain tai kudosnäytteestä. Suhde runsaus selostukset kustakin geenistä sen keskimääräinen runsaus kaikissa kudosnäytteitä kuvattiin värin mukaan mittakaavan alareunassa. Gray ilmoitti puuttuvat tai ulkopuolelle tiedot. Dendrogrammi yläosassa luku edustaa hierarkkisen klusterointi kasvainten samankaltaisuuden perusteella niiden rakenteessa näiden geenien ilmentymistä. (B) ja (H) verrattuna DNA: n kopioiden lukumäärä muuttuu vastaavan geenin ilmentymisen arvot valitun geenin klustereiden kunkin yksittäisen kasvaimen näytteestä. Katso taulukko S8 täyden datan.

Pathway Analyysi Huomattavasti ilmentyvien geenien

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto käytettiin tutkimaan vuorovaikutus ehdokas onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille tunnistetaan ilmaisun array ja aCGH. Kuvio 4 esittää kolmen tärkeimmän verkkojen vuorovaikutuksen mahasyövän näytteissä. Verkko 1 oli nimenomaan liittyy syövän, munuaisten urologiset sairaus, ja solusyklin. Verkko 2 oli nimenomaan liittyy sidekudoksen kehityksessä ja toiminnassa, syöpä, ja ruoansulatuskanavan sairaus. Verkko 3 oli nimenomaan liittyy geneettinen sairaus, luuston lihassairaus, ja tulehduksellinen sairaus (taulukko S7). Kaikki verkot saavutti pisteet 21 tai korkeampi ja se sisälsi 11 tai useamman geenin, joka osoitti laajaa suhteita ja vuorovaikutusta merkittävästi geenien mahasyövän. Top biologisiin toimintoihin näistä geeneistä liittyi solusykliä, DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio ja korjaus, energiantuotannon ja nukleiinihappometaboliassa (kuva S11). Kaikki nämä toiminnot tiedetään olevan osallisena kasvainten synnyssä, joka tarjoaa mahdollisiin yhteyksiin kartoitetut onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille aikana mahalaukun syövän kehittymisessä.

Ingenuity verkostot luodaan kuvaamalla ehdokkaan onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille tunnistaa integroitua analyysiä ilmaisun array ja aCGH tiedot. Kukin verkko on graafisesti kanssa geenien tai geenituotteiden, kuten solmuja (eri muotoja edusti toiminnallisiin luokkiin geenin tuotteiden) ja biologisen suhteet solmujen reunojen (riviä). Pituus reunan heijasti todisteita kirjallisuudessa tukemisessa että solmusta-solmuun suhteeseen. Intensiteetti solmun väri osoitti asteen ylä- (punainen) tai downregulation (vihreä) vastaavan geenin. Geenejä väritöntä muistiinpanoja ei tunnistettu ilmennetty eri meidän kokeessa ja integroitiin laskennallisesti syntyy verkkojen pohjalta todisteiden tallennettu IPA tiedon muisti osoittaa merkitystä tähän verkkoon. Kiinteä viiva ilman nuoli osoitti proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen. Nuolet osoitti suuntaa toimintaa (joko ilman sitovaa) yhdestä geenistä toiseen.

Keskustelu

geenikopiomäärä muutokset ovat erityisen tärkeitä kuin purkamalla tapahtumia syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin Copy Number Aberrations (CNAs) by array CGH. Usein voitot ja tappiot tunnistettiin tutkimuksesta. Lisäksi kromosomialueita joilla on korkea monistukset ja homotsygoottisia deleetioita myös kuvattu. Lisäksi korrelaatio geenien ilmentyminen ja DNA CNAs tutkittiin. Ehdokas onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille tunnistettiin suorittamalla integroitu analyysien genomin kopioluvun ja geenien ilmentymisen. Lopuksi suhteet näistä kandidaattigeenit ja niiden biologinen toiminta kuvattiin 3 verkoissa käyttämällä Ingenuity polku analyysi. Tulokset tukevat että yhdistämällä aCGH ja geenien ilmentymisen erilaisia ​​analyysi on tehokas tapa tunnistaa ehdokas oncogenes tai tuumorisuppressorigeeneille ihmisen mahasyövän. Yhdenmukainen tämä paperi, aiemmat tutkimukset ovat hakeneet samanlaisia ​​lähestymistapoja tunnistaa kuljettajan geneettisiä tapahtumia muissa elimissä, kuten maksasyövän [18] ja rintasyövän [19]. Mielenkiintoista, lisää ehdokas onkogeenien tunnistettiin kuin ehdokas tuumorisuppressorigeeneille tutkimuksessamme. Se voisi selittää suuremman mahdollisen suuruuden välillä voiton verrattuna tappio Tuumorinäytteissä yhdistettynä pakattuja suhteet peräisin sekoitettuna ei-kasvainsoluja. Ero geenilukumääriin voi myös ehdottaa, että ilmaus onkogeenien voidaan syvällisemmin säädellä CNAs kuin tuumorisuppressorigeeneille ovat.

aCGH analyysi, usein voitot ja monistukset havaittiin mahasyövässä näytteissä. Huomattavaa on, että yhdenmukainen aiempien tutkimusten [20], [21], 20q oli yleisin sivuston vahvistuksen havaittu mahasyövässä näytteissä. Monistuksen 20q on myös raportoitu useissa muissa syövissä, kuten rintasyöpä [22] ja haimasyövän [23]. Tutkimuksessamme korkean tason tiomonistukset löydettiin 20q12-q13.3 mahasyövän. Useat geenit sijaitsevat tässä lokuksessa, kuten

Aib1

ja

BCAS1

.

Aib1

(20q12), steroidi reseptorin koaktivaattoria ensimmäinen löydetty monistettiin rinta- ja munasarjasyövän, on mukana mahasyövässä soluproliferaatiota vuorovaikutuksessa tumareseptoreista [24].

BCAS1

(20q13.2), rintasyöpä monistettu sekvenssi 1, monistetaan eri kasvaintyypeissä ja liittyy tuumorien aggressiivisempaa fenotyyppejä. Sääteli ilmentymä

BCAS1

on korreloi merkitsevästi korkea monistamisen 20q13 vuonna adenokarsinoomat maha-ruokatorven risteyksessä [25]. 8q oli toiseksi yleisin sivustolla voitto kuin se havaittiin 26.39% näytteistä. Monistuksen 8q on tunnistettu monissa syövissä, kuten rintasyöpä ja haimasyövän [23], [26]. Tutkimuksessamme korkean tason tiomonistukset löydettiin 8q24.1-q24.2 mahasyövän. Useita geenejä sijaitsevat tässä lokuksessa.

MYC

on edustavin yksi. Se on yksi eniten tutkittu onkogeenien, joka edistää pahanlaatuisuuden monia eri aggressiivinen ja erilaistumaton ihmisen syövissä [27]. Patologisen vaikutus

MYC

on johtuvan sen kyvystä hallita multiplecellular prosesseja, kuten solun kasvua, erilaistumista, apoptoosia, DNA-vaurion vaste, genomin epästabiilisuuden, angiogeneesi ja kasvaimen invasiivisuus [28].

Toinen tärkeä korkean tason vahvistus löydettiin 17q12-q21. Edustaja sijaitsevat geenit tämä paikka on

erbB2

. Yliekspressio ja /tai monistus on havaittu monenlaisia ​​syöpiä, mukaan lukien mahasyöpä [29], [30], [31]. Korrelaatio

ErbB2

vahvistusta ja yliekspressio on huomattava vertaamalla aCGH ja ilmaisun array tiedot meidän mahasyövässä datajoukon (kuva S12). Yliekspressio ja monistukset tunnistettiin vain pieni määrä (~6 72) mahasyövän näytteitä. Tämä saattaa selittää, miksi ErbB2 ei valittu korreloivat ehdokas onkogeeni lista, koska se ei läpäise kriteereitä yhtenä differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Kuitenkin, tulos viittaa selvästi siihen, että monistuminen 17q12-q21 saattaa olla keskeinen mekanismi korkeita ErbB2 ilmentymisen osajoukko ihmisen mahasyövän näytteitä. Mahalaukun syöpäpotilaat 17q12-q21 vahvistus voivat hyötyä Herceptin-hoidon, humanisoitu vasta, jonka tarkoituksena on kohdistaa ja estää toiminta ErbB2.

Yhdenmukainen tutkimus

Gorringe KL, et al

, monistukset klo 6p21 ja 5p13 havaittiin myös meidän array CGH tulokset [7]. On kiehtovaa huomata, että suhteettoman Useammat korkean tason monistukset ja homotsygoottisia deleetioita havaittiin mahasyövässä solulinjoissa verrattuna kudosnäytteitä. Havainto viittaa siihen, että nämä lisäyksiä tai deleetioita voidaan tarjota kasvua etuja aikana

in vitro

soluviljelmässä, ja siksi ovat rikastuneet solulinjoissa. Tulokset korostavat näiden korkean tason monistukset ja homotsygoottisia deleetioita säätelyssä solujen lisääntymisen tai selviytymistä. Solulinjat näitä lisäyksiä tai deleetioita tarjoavat erinomaiset resurssit auttaa lisätutkimuksia toiminnallisten roolien geenien näillä alueilla aikana mahalaukun syövän kehittymisessä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat tarjonneet oivalluksia merkitystä tietyn kopioluvun muutoksia vuonna kehittäminen epiteelin kasvaimissa, joka osoittaa, että nämä muutokset voivat johtaa siihen, että muuttunut ilmentyminen kriittisen onkogeenien tai tuumorisuppressorit [21], [31], [32]. Tutkimuksemme vahvistaa siksi nämä aikaisemmat raportteja ja tarjoaa todisteita, joiden mukaan CNA on tärkeä tekijä säätelyssä epänormaali ylös tai alas-näiden geenien ilmentymistä aikana mahasyöpä syövän synnyn. Kuitenkin useimmat geenit tunnistettiin myös tutkimukset ovat vielä todennäköisesti matkustaja geenejä, joiden ilmentyminen on erittäin geenin annoksesta riippuvaisia, ja on rajoitettu toiminnallisten roolien aikana tuumorigeneesiä.