Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

siirrettävistä elementeistä (TES) käsittää lähes 45% koko genomin ja ovat osa kehittyneitä sääntelyverkon järjestelmiä ohjaavat kehitysprosesseja normaaleissa ja patologisissa tiloissa. Retroviruksen /retrotransposonin geeni koneet koostuu pääasiassa Long välissä Nuclear elementit (viivat-1) ja Human Endogeeniset retrovirukset (HERVs) että koodi omaa endogeenistä käänteiskopioijaentsyymin (RT). Mielenkiintoista on, RT ilmaistaan ​​tyypillisesti korkeilla tasoilla syöpäsoluja. Viimeaikaiset tutkimukset raportoivat, että RT esto ei-nukleosidisten käänteiskopioijaentsyymin estäjien (NNRTI) indusoi kasvun pysähtymisen ja solujen erilaistumista

in vitro

ja antagonisoi kasvua ihmisen kasvaimia eläinmallissa. Tässä tutkimuksessa analysoimme syövän vastaisen aktiivisuuden Abakaviiri (ABC), nukleosidi käänteistranskriptio estäjä (NRTI), on PC3 ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa.

Keskeiset havainnot

ABC vähentää merkittävästi solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio prosesseja, huomattavasti hidastaa S-vaiheessa etenemistä, indusoi vanhenemista ja solukuoleman eturauhassyövän soluissa. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, mikrosiruanalyysi on PC3-soluissa osoittaa, että ABC aiheuttaa spesifisten ja annoksesta riippuvat muutokset geenien ilmentyminen, johon sisältyy useita solureiteillä. Erityisesti kvantitatiivisella Real-Time PCR huomasimme, että LINE-1 ORF1 ja ORF2 mRNA tasot olivat merkitsevästi sääteli ABC hoitoon.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat potentiaalia ABC syöpää agentti pystyy aiheuttamaan antiproliferatiivista aktiivisuutta ja aiheuttaa vanhenemista eturauhassyöpäsoluissa. Huomionarvoista, osoitamme, että ABC saa aikaan säätely ylöspäin LINE-1 ilmentymisen, mikä viittaa siihen, näiden elementtien havaitut solumodifikaatiot.

Citation: Carlini F, Ridolfin B, Molinari A, Parisi C, Bozzuto G , Toccacieli L, et ai. (2010) käänteistranskriptioreagenssien Inhibitor Abakaviirilla Syövän Aktiivisuus eturauhassyöpäsolulinjoissa. PLoS ONE 5 (12): e14221. doi: 10,1371 /journal.pone.0014221

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2010; Hyväksytty: 15 marraskuu 2010; Julkaistu: 3. joulukuuta 2010

Copyright: © 2010 Carlini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia National Institute of Health Rooman (ISS), Ricerca Finalizzata 2004 Collaboration ohjelma ISS /NIH-USA ja Ricerca Corrente 2007-2008 ISS. Muita rahoituslähteitä ovat ministeriön yliopistosta ja tutkimus, Regione Campania, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) ja Tohtorinkoulutusohjelmiin: ”Pathology of solusignaalitransduktion” (OMVG) ja Napolin toinen yliopisto ja ”toksikologian, Oncology ja Molecular Pathology ”yliopiston Cagliari (MR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus ja sen äärimmäinen fenotyyppiä vaihtelua ei voida tulkita kuvataan ja selitetään pelkästään geeni ympäristön vuorovaikutukset. Yllättäen loppuun ihmisen genomin paljastaa, että todellinen monimutkaisuus genomin on vähän tekemistä kanssa lukumäärän ja heterogeenisuudesta sen geeneistä.

Vain 2% ihmisen genomin koodit proteiineja, kun taas 45% koostuu transposonien (TES) [1]. TES, aluksi ajateltiin olevan pelkkä solunsisäisiä loisia, jotka kutsutaan itsekkäitä tai ”roska” DNA, kunnes lisätutkimuksia paljasti, miten tämän valtavan ei-proteiini-koodaavat sekvenssit skaalautuu kanssa organismeihin monimutkaisuus, niillä on keskeinen merkitys osana sääntelyn työkalupakki genomin, muuttamalla geenien ilmentyminen ja ajo genomin evoluutiota sekä kehittämään organismin [2] – [10]. VäT voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: DNA-transposoneja (2,8%) ja retrotransposonit (42,2%). DNA-transposoneja täydentää ilman RNA väli, kun retrotransposoneja luottaa RNA-transkriptin että itse jäljittelee tuella käänteistranskriptaasi (RT).

RT koodaama Long lomassa Nuclear Element-1 (LINE-1 ) ja Human Endogeeniset retrovirukset (HERVs) havaittiin olevan yhteydessä patologinen ja fysiologisia prosesseja. Erityisesti korkeat ekspressiotasot RT havaittiin sukusolujen, alkiot, erilaistumaton ja transformoituja soluja, kun taas eriytettyä kuin sairaan kudoksen ne tuskin ilmaisivat, mikä viittaa suora korrelaatio proliferaatiopotentiaali solun [11] – [17 ].

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että luokan ei-nukleosidi RT-inhibiittorit (NNRTI), jota käytetään laajasti aIDS hoidossa, inhiboi endogeenisen RT-aktiivisuuden useissa hiiren ja ihmisen syöpäsolulinjoissa, vähentää solujen kasvunopeus ja erilaistumisen indusoinnissa [18] – [20]. Lisäksi samat biologiset vaikutukset toistettiin RNA häiritsee kokeissa erityisiä

si

RNA suunnattu LINE-1 ja HERV-K. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että molemmat luokat retroelements liittyvät toiminnallisessa verkossa, mukana solujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen, mutta erilliset hierarkkinen roolit, että LINE-1 pystyy hallitsemaan HERV-K ilmaisun [21]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että endogeeninen ei-telomeerisesti RT voivat edustaa uutta tavoitetta kehittämiseen terapeuttisten syövän vastaisten aineiden kanssa.

NNRTI sitoutuvat hydrofobiseen taskuun, lähellä RT aktiivisen. Sitova indusoi konformaatiomuutoksen proteiinissa, jotka vaikuttavat sen affiniteetti substraatille, ja näin ollen estämällä RT entsymaattista aktiivisuutta. NNRTI luokitellaan allosteric ilman kilpailua RT-inhibiittorit.

Toinen luokka antiretroviraalisten estäjien että tavoite RT edustaa nukleosidi käänteistranskriptio estäjien (NRTI). Verrattuna NNRTI, niillä on eri vaikutusmekanismi. NRTI ovat nukleotidianalogeille jotka estävät käänteistranskriptio sisällytettynä juuri syntetisoidun virus-DNA (cDNA) ja estää sen lisävenymistä. Ne luokitellaan ei-allosteric kilpailukykyinen alustan estäjiä. Näistä, abakaviiri (ABC) on onnistuneesti käytetty yhdessä muiden viruslääkkeiden HIV-infektion hoidossa. Se muunnetaan Solun entsyymit aktiivisen karboviiri triphosphorilated muodossa, analogi dGTP. Suhteessa muihin NRTI, ABC osoittaa hyvin alhainen affiniteetti solujen DNA-polymeraaseja [22]. Lisäksi, Jones et al. [23] osoittivat, joiden

in vitro

LINE-1 retrotranspositiossa määritys, joka NRTI on kyky tukahduttaa LINE-1 retrotranspositioon, osoittaa herkkyys LINE-1 RT tämän luokan huumeita.

perusteella nämä todisteet, olemme tutkineet antituumorivaikutuksen ABC on hormoniriippuvaisen LNCaP ja hormoni-tulenkestävien PC3 eturauhassyöpäsolulinjoissa. Nämä metastaattinen solut yleensä oletetaan edustavan aikaisin ja loppuvaiheissa eturauhassyövän vastaavasti. Tähän asti eturauhassyöpä edustaa yleisintä noncutaneous syöpä ihmisellä Yhdysvalloissa [24]. Tukipilari hoito on androgeeniablaatio, mutta sen jälkeen, kun aluksi hyvä vaste tauti etenee hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä [25]. Uusi hoito yksityiskohtaiset tarvitaan ehkäistä tai hoitaa tätä enemmän tappava muoto eturauhassyövän.

Tässä osoitamme, että ABC indusoi merkittävästi vähentää solujen kasvua ja viive solusyklin S-vaiheessa. Suuri osa senescent solujen havaittiin ja monet niistä sidottiin kuolemaan. Muutaman tunnin ABC altistuksen vähensi merkittävästi potentiaalia muuttoliikkeen ja invaasion eturauhasen syöpäsoluja. Lisäksi genomin laajuinen ilmentymisen analyysi PC3-soluissa paljasti annoksesta riippuvan geenisäätelyyn. Erityisesti ABC pystyi moduloimaan LINE-1 ilmentymisen molemmissa solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja Hoidot

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3 (ATCC CRL-1435) ja LNCaP (ATCC CRL-1740) ja ei-transformoitu ihmisen fibroblastisolulinja WI-38 (ATCC CCL-75) viljeltiin mukaisesti ATCC suosituksia. Abakaviiri puhdistettiin kaupallisesti saatavilla Ziagen tabletit (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC 27709) metanolilla uuttamalla ja puhdistamalla laatu arvioitiin HPLC: llä. Huumeiden kokeilut, ABC liuotettiin FBS-alustassa ja käytettiin pitoisuutena 15 tai 150 uM. Drug sisältävää tuoretta väliaine vaihdettiin joka 48. tunti. Synkronointia kokeissa soluja käsiteltiin 2 ug /ml afidikoliinilla 18 tuntia, pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja vapautetaan tuoreessa elatusaineessa, joka sisälsi tai ei ABC.

RT Activity Assay

RT-aktiivisuuden määritykset suoritettiin käyttäen vähäistä muunnelmaa menetelmästä, joka on kuvattu julkaisussa Mangiacasale et.al [18]. -Soluja (5 x 10

5-10

6) hajotettiin 40 ul: ssa jääkylmää lyysipuskuria (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM MgCI

2, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF: , 5 mM β-merkaptoetanolia, 0,5% CHAPS, 10% glyserolia). Kolmen jäädytys-ja-sulatus-syklit, soluja inkuboitiin 30 min jäillä ja sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 14 000 rpm 4 ° C: ssa. RT-aktiivisuus testattiin käyttäen Thermoscript RT-PCR-järjestelmä (Invitrogen), 20 ui reaktiot sisälsivät 10 ng MS2-faagin RNA: n (Roche Diagnostics) ja 30 pmol MS2 reverse-aluketta (katso alla) ja korvaamalla kaupalliset RT solun-uutos ( 24 ug kokonaisproteiinia). Reaktio seoksia inkuboitiin 55 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi 5 min 85 ° C: ssa. A1 ui

Escherichia coli

RNaseH (2 U /ul) lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin edelleen 37 ° C: ssa 20 min. Verrokkireaktiot perustettiin jättämällä solu-uute (negatiivinen kontrolli), tai lisäämällä 1 ui Thermoscript RT (Invitrogen) (15 U /ul, positiivinen kontrolli). A2 ui jokaista reaktiota sekoitettiin 30 pmol kutakin eteenpäin (5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3 ’) ja reverse (5′-CACAGGTCAAACCTCCTAGGAATG-3’), MS2 alukkeita ja PCR-monistettiin käyttäen Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 94 ° C 2 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 s, 58 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s. Monistustuote on 112 bp: n DNA-fragmentti, joka ulottuu asemasta 21-132 5’pää MS2 RNA: ta (GenBank V00642). PCR-tuotteet fraktioitiin 1,5% agaroosigeelissä elektroforeesilla.

proliferaatiomääritystä

PC3, LNCaP ja WI-38-soluja ympättiin tiheydellä 20000 kuoppaa kohti 12-kuoppalevyille, viljeltiin 24 tuntia ja käsiteltiin sitten ABC pitoisuus 15 tai 150 uM. 0, 24, 48, 72 ja 96 tunnin määrä trypaanisinisellä-ilman solut laskettiin Burker-kammiossa. Kokeet suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena.

Cell Cycle Analysis

Käsitellyt ja käsittelemättömät solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin jääkylmällä PBS: llä. DNA värjäys suoritettiin käyttäen Cycle TEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Sitten solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson).

Vanheneminen määrittäminen

Suhteellinen senescent solujen mitattiin havaitsemalla β-galaktosidaasin aktiivisuus pH: ssa 6 kanssa Calbiochem Vanheneminen Detection Pakki. Aineisto määrällisesti yli 500 solumäärää kolmen erillisen kokeen.

fluoresenssimikroskopiaan

morfometrisiin analyysi ytimet, käsitellyn ja käsittelemättömän solut kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä ja inkuboitiin Hoechst 33258 -liuosta (1 ug /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa. Värjäämiseen nucleoli, soluja kasvatettiin 12 mm: n lasipeitinlevyjä kiinteitä ja läpäiseviksi metanolilla -20 ° C: ssa 10 minuutin ajan, inkuboitiin antinukleaarinen seerumia autoimmuunisairaus potilaan (ystävällisesti toimittanut Dr. Maria Antonietta Amendolea) ja inkuboitiin sitten fluoreseiini-kytketty vuohen anti-ihmis IgG: tä (Bio-Rad). Näytteet analysoitiin CCD-kamera Nikon varustettu Optiphot mikroskooppi (Tokio, Japani). Morfometrisiin analyysi suoritettiin Image J 1,37 ohjelmisto (Wayne Rasband, NIH, USA). Jotta tilastollinen analyysi Studentin t-testiä sovellettiin.

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) B

Käsitellyt ja käsittelemättömät PC3 solut kiinnitettiin 2% glutaraldehydillä 0,1 M kakodylaattipuskurissa pH 7,4 huoneen lämpötilassa 30 min, post-kiinnitettiin 1% OsO

4 samassa puskurissa, kuivattu kautta porrastettu etanolia sarja, kuivattiin kriittisessä pisteessä, jossa CO

2 ja kulta päällystetty ruiskuttamalla. Näytteitä tutkittiin Cambridge Stereoscan 360 pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Cambridge Instruments Ltd, Cambridge, UK).

Solujen migraation ja invaasion määritykset

Kokeet suoritettiin käyttäen muunnelmaa menetelmästä kuvataan Albini ja työtovereiden [26]. Siirtolaisuuden ja invaasio määrityksissä, suodattaa 8,0 um huokoskoko (Falcon) käytettiin. Solut, kerättiin ja suspendoitiin RPMI pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml, lisättiin kuhunkin suodattimen ja 3 ml RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin hyvin alla lisää. Sillä invaasiomääritys suodattimet päällystettiin Matrigel ™ (Sigma) laimennettuna 1 mg /ml seerumivapaassa RPMI. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 18 tuntia. Sen jälkeen, sisäpuolelle suodattimen pyyhittiin märällä vanupuikolla solujen poistamiseksi, kun taas ulkosivulla insertin huuhdeltiin PBS: llä ja värjättiin 0,25% kristalliviolettia (Sigma) 10 min. Sitten suodattimet tarkasteltiin CCD-kamera Nikon varustettu Optiphot mikroskooppi (Tokio, Japani) ja prosenttia pinta-ala siirtynyt tai tunkeutuvat soluihin analysoitiin Optilab ohjelmisto (Graftek Mirmande, Ranska).

Microarray Analysis

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNaasi Kit (Qiagen). Jokaisesta näytteestä, 500 ng RNA: ta syntetisoitiin ja biotinyloitiin cRNA käyttäen Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). RNA ja cDNA pitoisuus määritettiin Nanodrop spektrofotometrillä (NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA) ja sen laatu arvioitiin kanssa Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italia). Kustakin näytteestä, tekninen rinnakkaisnäytteiden tuotettiin ja 750 ng cRNA hybridisoitiin 18 h HumanRef-8 v2 Expression BeadChips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) valmistajan protokollan. Intensiteetti tiedostot ladataan Illumina BeadStudio 3.0.19.0 ohjelmiston ja normalisoidaan keskimääräisen algoritmin. Tekninen rinnakkaisnäytettä kustakin näytteestä koottiin ja geenien havaitseminen p-arvo 0,05 katsottiin havaittu. Geenit Diff Pisteet ± 40 (p-arvo 0,0001) pidettiin ilmentyvät eri geeneistä. Microarray tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja raaka tiedot on talletettu ArrayExpress tietokannassa (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae), jossa Liittymisnumero: E-TABM-532.

Nerokkuus Pathway Analysis 7 (Ingenuity Systems®, www.ingenuity.com) käytettiin analysoimaan biologinen sukulaisuus erilaisesti ilmaistuna geenejä. Biologisten toimintojen arvioitiin ohjeiden mukaisesti ohjelmiston. Fisherin testiä käytettiin laskemiseen p-arvo määrittää todennäköisyys, kunkin biologisen tehtävän eli että datasarja johtuu mahdollisuus yksin. GO (Gene ontologia) rikastamiseen analyysi suoritettiin myös käyttäen DAVID ohjelmistojen [27], [28].

RT Assay ja kvantifiointi LINE-1 mRNA Expression

Yhteensä-RNA eristettiin soluista käsittelemättömät ja käsiteltiin 15 ja 150 uM ABC 24, 120 tuntia. RNA käsiteltiin TURBO DNaasia (Ambion) poistamiseksi kontaminoivan genomista DNA. cDNA syntetisoitiin TaqMan High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems). Suhteellinen kvantitointi PCR-reaktiot suoritettiin TaqMan kemia. LINE-1-transkriptit havaittiin muokatuilla alukkeita ja FAM-MGB-koettimien LINE-1 ORF1 ja ORF2 (PE Applied Biosystems), joiden avulla Primers Express -ohjelmiston (taulukko S1). LINE-1-sekvenssin tietokantaa käytetään tässä työssä on L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [29]. Määrä LINE-1-sekvenssit kohdennetaan koettimet on esitetty taulukossa S1. Jokainen reaktio suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 1 ui cDNA: ta ja 12,5 gl TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Monistukset suoritettiin alkaen 2 min aktivointi vaihe AmpErase UNG 50 ° C: ssa, 10 min templaatin denaturointivaihe 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min. Pre-kehitetty TaqMan-määritys reagenssi GAPDH (4310884E) käytettiin endogeeninen kontrolli. Puuttuessa monistuksen ei-käänteistranskriptoituneet RNA varmistettiin jättää genomista DNA vahvistusta. Erot geenien ilmentyminen laskettiin standardin 2

-ΔΔCt menetelmällä. Jotta tilastollinen analyysi Studentin t-testiä käytettiin.

Tulokset

abakaviiri estää solujen kasvua, vaikuttaa solusyklin etenemisen ja aiheuttaa vanhenemista eturauhassyövässä solulinjoissa

Ensin arvioidaan endogeenisen RT aktiivisuus ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja ei-transformoitujen WI-38 ohjaus soluissa. Solut uutteet käytettiin Luottoluokitusvälinepalveluilla kääntää puhtaaksi synteettinen RNA. Kuten kuviossa 1A, RT-aktiivisuuden havaittiin PC3 ja LNCaP, kun taas Wi-38-solujen RT aktiviteetti oli havaitsemattomalta tasolla.

(A) Endogeeninen RT-aktiivisuuden havaittiin PC3, LNCaP ja WI -38 soluja kuten kuvataan aineisto ja menetelmät; (+) Positiivinen kontrolli reaktion kaupallinen RT. (B) Eturauhassyöpä ja normaaleihin ihmisen fibroblasti WI-38-soluja käsiteltiin ABC pitoisuudella 15 ja 150 uM, ja niitä viljeltiin osoitetuissa aikapisteissä. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen; baareja, ± SD.

vaikutuksen analysoimiseksi ABC soluproliferaation nopeus, soluja kasvatettiin läsnäollessa lääkeaineen pitoisuuksina 15 ja 150 uM. Annoksesta riippuva kasvun estämistä havaittiin molemmissa solulinjoissa (kuvio 1 B). 15 uM ABC vähentämiseksi huomattavasti solujen kasvun paljastui jälkeen 72 ja 96 tuntia hoidon PC3 ja LNCaP vastaavasti. 150 uM inhiboi voimakkaasti kasvua sekä solulinjoissa (kuvio 1 B). Sytotoksisuus ABC tutkittiin myös ei-transformoidut WI-38-soluissa. Mielenkiintoista, emme löytäneet merkittävä väheneminen solujen kasvua 15 uM ABC taas 150 uM ABC pitoisuus indusoi vain 20% solujen kasvun esto jälkeen 120 h (kuvio 1 B).

Sen tutkimiseksi, ABC voisi vaikuttaa solusyklin etenemistä, eturauhassyövän soluja käsiteltiin 150 uM ABC ja analysoidaan eri ajankohtina aina 120 tuntia. PC3-soluissa erittäin kerääntyminen solujen S-vaiheessa nähtiin jälkeen 18 ja 24 tuntia hoidon (56,3 ja 78,6% vastaavasti). Tämä lisäys seurasi augment on G2 /M-soluissa, jotka tuli 23,4-26,9% koko väestöstä, kun 96 ja 120 h hoito (kuvio 2A, B). LNCaP käsitellyt solut osoittivat pääasiassa S vaihe kertymistä saavuttaa 40,5-54,3% sen jälkeen 48 ja 72 tuntia hoidon, mutta ei G2 /M vaiheinkrementti havaittiin. Pikemminkin, S-vaiheessa kertyminen näyttää pysyvän vakiona ajan mittaan (kuvio 2A). Edelleen karakterisoimiseksi S-vaiheeseen muutos, solut synkronoitu alussa S-vaiheessa altistamalla ne DNA-synteesin estäjä afidikoliinia. Vapautumisen jälkeen afidikoliinilla lohkon, soluja käsiteltiin 150 uM ABC ja analysoitiin solusyklin jakautuminen eri ajankohtina. Kuviossa 2C on esitetty, että 3 tuntia sen jälkeen vapauttaa molemmat synkronoitu ohjaus soluja oli siirtynyt kohti keskellä S-vaiheeseen, jota edustaa Keski huippu kuvaajan, kun taas ABC käsitellyt solut osoittivat selvää viivästynyt etenemisensä S-vaiheeseen. 18 tunnin jälkeen, on suuri määrä PC3-käsiteltyjä soluja oli edelleen läsnä myöhäisessä S- ja G2 /M-vaiheessa, kun taas LNCaP, kuten odotettua, oli suuntaus kerääntyä S-vaiheeseen (kuvio 2C). Huomionarvoista, ABC pystyi pidentämään S-vaiheeseen etenemisen myös jos lisätty keskellä S-vaiheeseen, 3 h kuluttua afidikoliinia lohko release (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että ABC voisi konkreettisesti vaikuttaa DNA: n kahdentuminen.

(A) Cell cycle jakelu PC3 ja LNCaP altistettiin 150 uM ABC. Solut otettiin talteen osoitettuina ajankohtina, inkuboitiin propidiumjodidilla ja DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa on raportoitu. (ND, ei tehty). Tiedot edustavat viittä riippumatonta koetta. (B) Edustava koe on solusyklin etenemisen PC3 käsitellyissä soluissa. Nuolet osoittavat solun kerääntyminen G2 /M vaiheessa. (C) PC3 ja LNCaP-solut synkronoitu alussa S-vaiheessa afidikoliinia ja solukierron jakelun analysoitiin käsitellyissä (150 uM ABC) ja käsittelemättömät solut.

Yhdessä leviämisen estäminen, huomattava lisäys solukuoleman aikana 6 päivä havaittiin 150 uM ABC (kuvio 3A, B). Sen arvioimiseksi, ovatko nämä ilmiöt liittyivät apoptoosin induktioon tai Vanheneminen, eturauhassyövän solut käsiteltiin 150 uM ABC 5 päivää ja arvioidaan joka 24. h anneksiini ulkoistamista, ydin- tiivistyminen /pirstoutumista ja ß-galaktosidaasin aktiivisuus pH: ssa 6. ei merkittävää kasvua anneksiini positiivisten solujen tai apoptoottisten tumien havaittiin käsiteltiin näytteitä tahansa vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty), kun taas vanhenemista liittyy ß-galaktosidaasin aktiivisuus merkittävästi indusoitiin ABC ja lisääntyi ajan ja oli noin 80% ja 50% positiivisia soluja upon 5 hoitopäivän PC3 ja LNCaP (kuvio 3C, D). Lisäksi vertailu solujen vanhenemista ja solukuoleman kinetiikan viittaa siihen, että nämä kaksi ilmiötä liittyvät vahvasti. Päinvastoin, emme tarkkailla solukuolemaa eikä eroja vanhenemista tasolla Wi-38 ohjaus soluja käsiteltiin 150 uM ABC, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (tuloksia ei ole esitetty).

(A ja B) 5 x 10

4-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille 150 uM ABC. Sen jälkeen 0, 2, 4 ja 6 päivää kiinnittyneet ja kelluvat solut otettiin talteen ja uudelleensuspendoitiin viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 0,2% trypaanisinisellä varten lasken elinkelpoisten ja kuoleman soluja. (C ja D) ß-galaktosidaasin aktiivisuus arvioitiin PC3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin 150 uM ABC ja analysoidaan eri ajankohtina.

morfologiset muutokset PC3 käsiteltyjen solujen

PC3 solut analysoitiin edelleen osoitteessa morfologiset tasolla. Mukaan solusyklin muutos- ja vanhenemista induktio, useita solun morfologiset muutokset havaittiin altistuttuaan lääkettä molemmilla annoksilla. Klo pyyhkäisyelektronimikroskoopilla PC3 soluja käsiteltiin 15 uM ABC jo näkyvissä hieman litistetty muoto (kuvio 4A a, d) ja esteettä jako prosessissa kuluttua 48 h altistuksen (kuvio 4A b, e). Lisäksi, käsiteltiin PC3-solut osoittavat menetys pinnan mikrovillusten viittaavat siihen, että vaikutus on lääkkeen solun tukirangan organisaatiossa (kuvio 4A c, f). Ydinlaitosten tasolla, morfologinen analyysi korostaa läsnäolon kaksilohkoinen ja laajentuneen ytimet, joiden kasvua ydinalan tulossa ilmeistä 48 h inkubointi 15 uM ABC ja 24 tuntia hoidon jälkeen 150 uM ABC (kuva 4B). Morfometrisiin ja tilastollinen analyysi osoitti, että ydin- alueilla noin kaksinkertaistui 48 h 150 uM ABC (taulukko S2). Klo nucleolar tasolla merkittäviä rakenne muutoksia havaittiin soluissa altistuvat 72 h sekä ABC annoksia. Lisäksi PC3 käsitellyt solut nucleoli näyttämään vähemmän kompakti ja joissakin tapauksissa hajallaan suhteessa kontrolliin (kuvio 4C).

(A) SEM-kuva havainnollistaa muutos esiintyy PC3-soluissa käsiteltiin 15 uM ABC 48 h. (B) Morfologiset muutokset ja morfometristä analyysi ytimien Hoechstilla. Annokset ja ajankohtina on merkitty. (C) Immunofluoresenssi of nucleoli värjättiin anti-tuma ihmisen seerumia.

Abakaviiria Estää Migration and Invasion

Koska PC3 ja LNCaP-solut ovat metastaattisen alkuperää ja niillä vaeltavat ja invasiivisuus potentiaali , tutkimme vaikutuksia ABC motiliteettia ja hyökkäyksen prosesseja. Solut siirrostettiin transwell kammioiden läsnä ollessa tai poissa ollessa 15 tai 150 uM ABC, ja sen annettiin kulkeutua 18 h 37 ° C: ssa. Annoksesta riippuva vähennys varatun tilan siirtämällä ja tunkeutuvat soluihin havaittiin jälkeen ABC hoidon (kuvio 5A, B). Solumigraation väheni merkittävästi eturauhassyövän solut 15 ja 150 uM ABC annoksia (p 0,001). Matrigel soluinvaasion inhiboitui merkittävästi vain suurempi ABC annos (kuvio 5B).

PC3 ja LNCaP-solut ympättiin kalvon läsnä ollessa tai puuttuessa Matrigel ja inkuboitiin 15 ja 150 uM ABC: ssa 18 tuntia. (A) edustava kuva muuttavia ja hyökkääviä PC3-solut värjättiin kristallivioletilla. (B) Prosenttia muuttoliikkeen ja invaasion pienenee suhteessa käsittelemättömiin soluihin analysoitiin Optilab ohjelmisto. (*) Vastaa p 0,001 laskema Mann-Whitney testi.

Gene Expression muutos indusoima Abakaviiri PC3 käsitellyissä soluissa

pyrkimys löytää geeniekspression allekirjoitus taustalla morfologiset ja toiminnalliset muutokset havaitaan ABC käsitelty PC3-solut, neljä biologista toistomäärityksiä molempien ryhmien solut analysoitiin koskevasta Illumina microarray alustan 48 tuntia hoidon jälkeen.

analyysi microarray tiedot osoittivat, että 192 geenit ulos of 12605 havaitaan ja 3246 pois 12930, oli ilmennetty eri (p 0,0001) 15 ja 150 uM ABC pitoisuudet vastaavasti, joista suurin osa johti sääteli (kuvio 6A ja taulukko S3).

(A) yhteenveto kaavio ilmaisi ja ilmennetty eri geenin numerot johtuvat mikrosiru määritys (neljä biologinen rinnakkaisnäytettä kustakin kunnossa). (B) vertailu top-ten biologisten toimintojen 15 ja 150 uM ABC saatu IPA analyysi. Y-akselilla tilastollista merkitsevyyttä, joka ilmaistaan ​​-log /p-arvo, on raportoitu. Kynnys p-arvo = 0,05 (keltainen viiva). Numero osallistuvien geenien kunkin toiminnon raportoidaan päällekkäin bar. (C) Venn kaavio esittäen osa yhteisten geenien differentiaalisesti ilmaistut PC3-soluissa 15 ja 150 uM ABC.

Funktio analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien suoritettiin käyttäen Ingenuity Pathways Analysis (IPA) järjestelmä (kuvio 6B). Mielenkiintoista, vertaileva analyysi top-ten biologisia toimintoja osoittaa, että huomattavan solutoiminnoille Hoidon vaikutus oli sama kaksi pitoisuuksien, mikä osoittaa tiettyä ja annoksesta riippuva vaikutus lääkkeen. Toiminnot on kuvattu kuviossa 6B ovat johdonmukaisia ​​ja edustavia sekä morfologiset ja toiminnalliset muutokset havaittiin fenotyypin tasolla: toipuminen solukuoleman polkuja, korjauksilla solusyklin ja lisääntymistä korko, muutokset solun morfologiassa. Muut vaikutti merkittävästi toiminnot olivat ”RNA transkription jälkeinen Muutokset”, ”Gene Expression” ja ”DNA Replication, rekombinaatio ja korjaus”. Geenit ryhmittyneet eri toiminnot on lueteltu taulukossa S4.

tietojoukot saadaan kahden annoksen peräkkäin vertailtu Venn-kaavio ja 144 geenejä johti jaettava kaksi luetteloa (kuvio 6C, taulukko S5 ). Niistä parhaiten edustettuina Gene ontologia (GO) ehdot tunnistettiin käyttämällä DAVID ”Functional Annotation Chart” työkalu sisältää kolme luokkaa: biologisia prosesseja, Cellular komponentit ja Molecular toiminnot. Toiminnalliset merkintä klustereita havaittiin kussakin luokassa, joissa rikastus tulokset vaihtelevat 1,33-8,63 (taulukko 1). Mielenkiintoista, GO ”Cellular Component” luokkaan tunnistettu 20 geenejä, jotka kaikki kuuluvat ydinaseiden osastoja ja erityisesti ydin- osaan, chromatin remodeling monimutkainen ja kromosomin suhteen (taulukko 2).

abakaviiri säätelee LINE -1 mRNA Expression

Koska todisteita suhdetta RT-aktiivisuuden, LINE-1 ilmentymisen ja syöpäsolujen uudelleenohjelmointi [18] – [21], päätimme tutkia ABC vaikutus ilmentymisen tämän luokan retrotransposonien. Erityisesti LINE-1 koostuu 5 ’UTR (transloimaton alue), kaksi avointa lukukehystä (ORF1 ja ORF2) ja 3’ UTR, joka päättyy poly (A) häntä. ORF1 koodaa proteiinia, RNA sitomiskyky samalla ORF2 koodaa proteiinia endonukleaasilla ja käänteistranskriptaasia toimintoja [7]. CDNA: t on saatu eturauhasen syöpäsolujen, käsittelemätön ja käsitelty kaksi ABC annokset ja talteen 24, 48, 72, 96 ja 120 h, monistettiin Real-Time PCR alukkeiden ja koettimien, jotka tunnistavat säilyneisiin alueisiin LINE-1 ORF1 ja ORF2 koodaussekvenssit. Kuten kuviossa 7, annos ja aikariippuvainen lisäys mRNA ekspressiotason havaittiin joko PC3 ja LNCaP sekä ORF1 ja ORF2 selostukset, mikä osoittaa, että LINE-1 voisi olla rooli molekyyli- ja toiminnalliset muutokset huomioitava ABC hoitoon.

suhteelliset tasot LINE-1-mRNA-transkriptit (ORF1 ja ORF2) PC3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin 15 ja 150 uM ABC eri ajankohtina. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. The (*) ja (**) symbolit merkitsevät merkittävää eroa verrattuna käsittelemättömiin soluihin, joissa ap arvo 0,05 ja 0,01 vastaavasti.

Keskustelu

Useita todisteiden on vahvistanut yhdistyksen välillä korkea endogeenisen RT ilmaisun ja transformoitu /kasvainten solujen fenotyyppiin [11], [17]. Aiemmat tutkimukset allosteeristen RT-estäjien, NNRTI, viittaavat siihen, että LINE-1-koodattu RT voidaan pitää uutena molekyylikohteena syövän hoidossa.

Tässä työssä osoitamme antituumorivaikutuksen Abakaviiri, nukleosidin käänteistranskriptio estäjä (NRTI) on PC3 ja LNCaP ihmisen eturauhasen solulinjojen metastaattisen alkuperää. Lisäksi raportoimme ensimmäistä kertaa, että ABC hoito voi moduloida LINE-1 mRNA: n ilmentymisen.

ABC merkittävästi vähentää solujen kasvua, joka indusoi viivästymisestä solusyklin S-vaiheessa etenemisen eturauhasen syöpäsoluja. Tämä hidastaa johtaa sen myötä pidätyksen G2 /M vaiheessa PC3-soluissa, kun taas LNCaP kertyy S-vaiheessa. Vaikutus solusyklin kävi ilmi muutaman tunnin kuluttua hoidon ja solut vähitellen siirtyä tilaan vanhenemisen. Ulkonäkö vanhenemista liittyvien morfologisia muutoksia ja SA-β-gal ilmentyminen kasvoi vähitellen PC3 ja LNCaP oli 80% ja 50% vastaavasti 5 päivää tuloksena solukuolema.

Contrasting kasvainsolun muuttoliike ja invaasio on keskeinen kysymys eturauhassyöpää. On tunnettua, että läsnäolo etäpesäkkeiden vähentää potilaan todennäköisyys selviytymisen ja että hoitovaihtoehtoja tällä hetkellä saatavilla vain harvoin voidaan parantaa metastaattisen muotoja. Kirjoittajat raportoivat, että yhdessä vaikutus solusyklin, ABC heikentää hyökkäystä ja muuttopotentiaalia PC3 ja LNCaP.

Perustuu geeniekspressioprofiilien PC3-solujen, tarjoamme alustava oivalluksia suhdetta ABC hoito