Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS), harvinainen väestön tahansa syöpien, kuten paksusuolen syöpä, ovat kasvaimia synnyttäviä. On ajateltu, että CSCS ovat vastuussa syövän uusiutumiseen, etäpesäke, ja lääkeresistenssin. Isolating CSCS paksusuolen syöpiin on haastavaa, ja siten molekyylimekanismin säätelemällä itseuudistuvien ja erilaistumista CSCS edelleen tuntematon. Olemme viljeltiin DLD-1-solut, yksi tyyppisiä soluja, jotka ovat peräisin paksusuolen syövät, seerumittomassa väliaineessa, jolloin saatiin pallomainen soluihin. Nämä solut hallussaan ominaisuudet CSCS, jossa ilmaus CD133, CD166, Lgr5, ja ALDH1, suurempi kapasiteetti chemo-vastus, muuttoliike, invaasio, ja tuumorigeenisyystesti

in vitro

ja

in vivo

kuin kiinnittyvä DLD-1-soluissa. Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4) on olennainen tekijä ylläpitämiseksi itseuudistumisen aikuisten ja alkion kantasoluja. Sitä on käytetty indusoimaan pluripotenttien kantasolujen (iPS) somaattisista soluista. Koska Klf4 ilmaistaan ​​koolonkarsinoomasoluissa, tutkimme sen rooli sferoidiviljelmiä eristetyt solut DLD-1-soluissa ja totesi, että Klf4 yliekspressoitui vain sferoidiviljelmiä soluissa ja vähentää ilmentymistä Klf4 lyhyen hiusneula-RNA vähensi kapasiteettia näiden solujen vastustaa kemikaaleja, vaeltavat, hyökätä, ja tuottaa kasvaimet

in vitro

ja

in vivo

. Rakeiden solut pienentää Klf4 ilme oli myös vähentynyt ilmentyminen CSCS markkereita ja mesenkymaalisten markkereita. Yhdessä viljelemisen DLD-1-solut seerumivapaassa väliaineessa rikastaa CSCS ja ilmaus Klf4 on olennaista ominaisuuksien CSCS DLD-1; Näin Klf4 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde hoidettaessa paksusuolen syöpä.

Citation: Leng Z, Tao K, Xia Q, Tan J, Yue Z, Chen J, et al. (2013) Kruppel-Like Factor 4 toimii Oncogene Colon Cancer kantasolujen rikastetun Sferoidiviljelmiä solut. PLoS ONE 8 (2): e56082. doi: 10,1371 /journal.pone.0056082

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 03 tammikuu 2013; Julkaistu: 13 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Leng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat valtion Foundation for Natural Sciences of kansantasavallan Kiinan 81071541 /H1504 (jotta HZ) [https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm]. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, päivämäärä keruu ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yleinen syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1], [2]. Nykyiset hoitomuodot, kuten leikkaus, sädehoito ja kemoterapia, joiden kohteena olivat kaikki syöpäsoluja. Onnistuminen on hoitojen haittaa suuresti lähinnä olemassaolosta terapia-resistenttien kasvainsolujen jotka pystyvät kehittymään koko paksusuolensyöpä jälkeen hoitoihin [3]. On ajateltu, että nämä solut ovat syövän kantasoluja (CSCS), joka on kyky itse uudistaa ja erottaa kaikenlaisiin solujen paksusuolensyöpä [4]. CSCS olemassa erilaisia ​​syöpiä. Ne ovat harvinaisia ​​syöpiä, mutta erittäin tuumorigeenisemmiksi ja vastaa myös syövän etenemisen. Kun istuttaa immuunivajaissa hiirillä, CSCS suuri joko tumorigenecity. On myös osoitettu, että CSCS ovat soluja vastuussa syövän uusiutumiseen, etäpesäke, ja lääkeresistenssin [5], [6]. Näin ollen tehokas hoito hoitoon syövän edellyttää sitä tehokkaasti kohdistaa CSCS syövän [7].

CSCS eri syöpien oltava spesifinen pinta-markkereita, joiden avulla tutkijat voivat eristää ne. Paksusuolen syöpä, CSCS ovat positiivisia CD133 +, CD44 +, CD166, Lgr5, ALDH1, ja ESA. Colon CSCS myös kyky karkottaa Hoechst 33342 väriaine [8] – [19]. Kuitenkin CSCS ovat hyvin harvinaisia, ja monissa tapauksissa, niitä ei voida havaita. Siten eristäminen CSCS paksusuolen syövissä, joka perustuu niiden pinnalla markkereita on erittäin vaikea [20].

CSCS joissakin syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien paksusuolen syöpä, voidaan eristää viljelemällä soluja seerumittomassa elatusaineessa muodostamiseksi aloilla. Tässä tilassa Sferoidiviljelmiä soluja, jotka ilmentävät ”stemness” liittyviä geenejä ja niillä suuren kapasiteetin siirtyä, hyökätä, ja tuottaa kasvaimia [20], [21], [22], [23]. Kun seerumia, monet ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, mukaan lukien HCT116, HT29, LOVO, SW480 ja DLD-1-solulinjassa, voi muodostaa palloja [22].

mekanismeja, joilla CSCS erilaisista syövistä säilyttää ”stemness” on tutkittu laajasti. Kapasiteetti itseuudistumisen on ratkaisevaa CSCS ylläpitämiseksi ja syövän uusiutumisen [12], [23], [24], [25], [26], [27] Klf4 on tärkeää säilyttää ominaisuus CSCS ja tarvittava kyky siirtää ja hyökätä rintasyövässä [28]. Monet ryhmät raportoitu, että Klf4 ilmaistaan ​​ja toimii tuumorisuppressori paksusuolensyöpä [29], [30], [31], [32]. Kuten raportoitu, suurin solut kasvaimen eivät pysty tuottamaan uusia soluja. Vaikka CSCS voi uudistaa kaikki solutyypit kasvaimen kautta kantasolun kaltainen käyttäytyminen ja aiheuttaa uusiutumisen syöpä [6]. Näin ollen, CSCS ja suurin osa syöpäsolujen ovat erittäin heterogeenisiä. Nämä tutkimukset eivät eroa paksusuolen CSCS kokonaispakokaasuvirrasta syöpäsoluja.

Klf4 on sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä. On osoitettu, että Klf4 säätelee proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosia, ja aineenvaihduntaa thymocyto ja paksusuolen pikarisolutuottoon, vastaavasti [33], [34]. Hiiren, Klf4 on olennaista itseuudistumisen alkion kantasolujen [35]. Klf4 käytetään myös ohjelmoida hiiren fibroblasteja pluripotenttien kantasolujen, mikä rooli Klf4 ylläpitämiseen ominaisuudet kantasolujen [36]. Tärkeää on, että normaalit kantasolujen osoittaa yhteisiä ominaisuuksia syöpään kantasolujen, se on myös tärkeää määrittää, vastaavia sääntely tapahtuu kantasolujen ja syövän kantasoluja. Siten onko Klf4 ilmaistaan ​​paksusuolen CSCS ja sen toiminnot Klf4 paksusuolen syöpä on puututtava.

Tässä tutkimuksessa selvitimme mahdollisia rooleja Klf4 in CSCS rikastettua pallomainen soluissa. Ensin viljeltiin DLD-1-solut seerumivapaassa väliaineessa saada pallomainen soluja, joilla on ominaisuuksia CSCS, ja sitten kysyimme Klf4 oli yli-ilmentynyt vuonna pallomainen soluissa ja siitä vähennetään Klf4 ilmentymistä sferoidiviljelmiä soluissa häiritsisi niiden ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden yliopiston Huazhong tiede ja teknologia (Luvan numero: S255). Kaikki Leikkaus suoritettiin sekoitus ketamiinia ja klooripromatsiini anestesian, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Solulinjat

Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa DLD-1, SW480, SW620, LOVO ja ihmisen koolonin normaalissa epiteelissä FHC solulinja olivat kaupallisista lähteistä, ja väliaine kustakin solulinjasta päätettiin mukaan American type Culture collection (ATCC) tai julkaistun varten. DLD-1, SW620 ja SW480-soluja viljeltiin RPMI 1640 (Hyclone) täydellisessä väliaineessa [37]. Muut koolonsyöpäsolulinjoissa, HCT116 ja HT29 ystävällisesti toimitti Dr. LIU ja viljeltiin McCoyn 5A (Sigma) täydellisessä väliaineessa [38]. Ihmisen koolonin normaalissa epiteelissä FHC-soluja kasvatettiin DMEM /F12 (Hyclone) täydellisessä väliaineessa. LOVO-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Hyclone) täydellisessä väliaineessa [39].

alalla kulttuurin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, jokaisen rivin paksusuolen syövän soluja kasvatettiin tiheyteen 2 x 10

6 solua /ml seerumittomassa DMEM /F12-alustassa, joka sisälsi 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF, PeproTech), 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF, PeproTech), 5 ug /ml insuliinia (Sigma), 0,4% naudan seerumin albumiinia (Amresco), ja 2% B27 (Invitrogen). Kanavaan aloilla, keräsimme ne sentrifugoimalla niitä 73 g 5 minuuttia. Spheres hajotettiin yhden soluihin käyttäen trypsiinihajotuksen. Yhden sferoidi-soluja kasvatettiin kuten edellä on kuvattu. Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta.

eristäminen CD133 + ja CD133- Solut

CD133 + ja CD133- soluja eristettiin soluviljelmässä magneettihelmi lajittelu käyttämällä MACS-järjestelmän (Miltenyi Biotech) tai FACS [12], [40]. Sekä erotukset, soluja inkuboitiin monoklonaalisten CD133 /2-PE (Miltenyi Biotech), 15 min 4 ° C: ssa. Magneettierotukseen solut valitaan MS sarakkeet (Miltenyi Biotech), joka säilytti positiivisten solujen yhdistää helmiä. FACS erottaminen, CD133 /2-PE värjätyt solut lajiteltu BD FACSCanto II Flow Cytometer väline (BD Bioscience), ja isotyypin IgG2b (Miltenyi Biotech) käytettiin kontrollina.

Lentivirusvektorikonstruktit Infektio Sferoidiviljelmiä solut

Lentivirusvektorit laakeri Klf4 shRNA (NM004235.3, 1582-1610) tai salattu muille kuin kohde-shRNA ostettiin Shanghai GeneChem Co., Ltd pallojakaantuminen solut infektoitiin mukaan valmistajan ohjeiden.

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä mRNA: t uutettiin soluista ja sitten käänteisesti transkriboidaan cDNA kanssa PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Mitata mRNA-tasoja geenien kussakin näytteessä, interkalaattori-pohjainen reaaliaikainen PCR: ää käytettiin. Glyseraldehydi-3-phpsphate-dehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina. Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Green Master Mix (Takara, Japani) että StepOnePlus ™ Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, USA). PCR-monistus geenien suoritettiin olosuhteissa: denaturoi 95 ° C: ssa 30 s, annealing 60 ° C: ssa 60 s, ja laajennettu 95 ° C: ssa 5 s; Reaktiot suoritettiin 45 sykliä. Kunkin näytteen reaktiot monistaa ja keskimääräinen mRNA-tasolla kunkin geenin määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä. Alukeparit mittaamisessa jokaisen geenin on lueteltu taulukossa S1.

Immunofluoresenssivärjäys

ilmaisujen CD133, Klf4, E-kadheriinin ja vimentiinistä vuonna yksikerrossoluissa ja aloilla olivat myös analysoitiin immunofluoresenssitekniikkaa. Voit suorittaa immunofluoresenssianalyysillä, soluja kasvatettiin sopivassa väliaineessa lasi–peitelaseja 16 tuntia ennen kiinnitetty 2% paraformaldehydillä 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Kiinteä solut läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 15 minuuttia, minkä jälkeen inkuboimalla 4 ° C: ssa yön yli seuraavien primaaristen vasta-aineiden: CD133 /2 (Miltenyi Biotec), E-cadherine (Santa Cruz Biotec), vimentiinista (Cell Signaling Technology), ja Klf4 (Santa Cruz Biotec), tässä järjestyksessä. Seuraavana päivänä, solut inkuboitiin sitten PE- tai FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Boster) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Nämä kalvot Sitten asennetaan Prolong Gold 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Invitrogen). Fluoresoiva kuvat otettiin käyttäen Olympus IX71 epifluoresenssilla (Olympus, Japani).

Western blot -analyysi

proteiiniuutteet erotettiin elektroforeesilla eri pitoisuuksia SDS-polyakryyliamidigeelien riippuen odotettavissa koot mitataan proteiinit ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, USA). Sen jälkeen blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja 0,1% Tween 20 TBS: ssä 1 h, sitten membraania inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli primaarisen vasta-aineilla ja sen jälkeen inkuboimalla vuohen anti-kaniini-vasta-aineita. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä analyysissä ovat: kanin anti-E-kadheriinin, kanin anti-vimentiinin, kanin anti-ZO-1, ja kanin anti-Snail (Cell Signaling Technology); kanin anti-Klf4 ja kanin anti-Lgr5 (Santa Cruz Biotech).

Kemoterapia Herkkyys ja Resistance Pitoisuus

herkkyys koolonkarsinoomasoluissa 5-FU analysoitiin CCK-8 määritys kit (Dojindo, molekyyli technolonies, Inc, Japani) valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 2000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisille maljoille, jotka sisältävät elatusainetta, jota oli täydennetty eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (Sigma) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kosteutetussa kunnossa 48 tuntia. Imeytymistä kunkin kuopan luettiin 450 nm: ssä levylukijalla. Eloonjäämisaste solujen laskettiin seuraavasti: imeytyminen kokeilu /imeytymisen ohjaus x 100%.

anneksiini-V APC /PI Double Merkintä

Cell kerättiin, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuosta (PBS) ja värjättiin anneksiini-V-APC (Keygen, Kiina) ja PI (Sigma) sekä 30 min huoneenlämpötilassa pimeässä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki värjätyt solut tutkittiin sitten käyttämällä BD FACSCanto II -virtaussytometrillä väline (BD Bioscience).

Soft Agar Pitoisuus

Soft agar-määritys suoritettiin pallomainen soluista, kuten aikaisemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyllä lisättiin 2 ml 0,5% agaria (w /v) RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää emäksenä. Polymeroinnin jälkeen pohja agar, 1 x 10

4 solut sekoitetaan 2 ml: ssa 0,375% agaria (w /v) RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää lisättiin. Viljelmiä pidettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 2 viikkoa ennen pesäkkeet laskettiin ja valokuvattiin.

Colony muodostumisen määritys

Pesäkkeenmuodostusta määritys suoritettiin kiinnittynyt DLD-1-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Lyhyesti, yksittäisistä soluista (2000 solua per kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 2 viikkoa. Sen jälkeen värjätään violetti solut valokuvattiin ja analysoitiin niiden leviäminen ja pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Cell Migration ja invaasiomääritys

Muuttoliike ja invaasiomääritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla [42]. Lyhyesti, 10

6 maljattiin soluviljelmissä lisätään 8 um mikrohuokoisen suodattimet (BD Bioscience) päällystetty (invaasio) tai ilman (siirtymä) matrigeelin (Sigma) ja inkuboitiin 20 h. Siirrettyjä tai tunkeutuneet solut värjättiin 0,1% kristalliviolettia ja laskettiin viisi satunnaisessa aloilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In vivo

tuumorigeneesiä

Solut saatiin trypsiinillä korjattu aloilla. Eri määriä soluja (1 x 10

4, 5 x 10

4, 1 x 10

5, 5 x 10

5, tai 1 x 10

6 solua) 200 ul: ssa PBS: ää ihonalaisesti istutetaan 4- 6 viikon ikäisiä kateenkorvattomia naaras, Balb /c nu /nu-hiiriä (Beijing HFK Bioscience). Tuumorin koko mitattiin joka 4päivä käyttäen paksuus. Tilavuus kunkin kasvaimen määritettiin käyttäen kaavaa: pituus x leveys

2 x 0,5. Kaikki eläin työ oli tehty mukaisesti guidline eettisen komission Huazhong Science and Technology (S255). Hiiriä pidettiin tietyssä patogeenittomassa, ympäristöllisesti kontrolloitujen laitokseen. Hiiret tapettiin pentobarbitaalinatriumilla vatsaonteloon ja siirteet poistettiin, kun kasvaimet saavuttivat pituus 2,0 cm, tai 60 päivää injektion jälkeen, kun oli ensimmäinen [41]. Hakkuut kasvaimet valmistettiin histopatologista analyysiä.

histopatologinen Analysis

Kasvaimet kerättiin ja kiinnitettiin 4% formaliiniin 24 tunnin ajan ennen upotettu parafiineja. Osiot (2,5 pm) saatiin ja värjättiin H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Generation of Sferoidiviljelmiä Cells alkaen Colon Cancer Cell Lines

Aiemmat tutkimukset osoittivat, HCT116 ja HT29 paksusuolen syövän solut muodostavat aloilla silloin, kun niitä viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa ja sferoidi solut hallussaan ominaisuudet CSCS [22], [43], [44]. Kysyimme HCT116, HT29, SW620, SW480, LOVO, ja DLD-1-solut voivat muodostaa palloja kun niitä viljellään seerumittomassa väliaineessa, vastaavasti. Solut kustakin solulinjasta viljeltiin tiheydellä 2 x 10

6 /ml seerumivapaassa väliaineessa. Päivänä 3, voisimme nähdä pallo muodostumista HCT116, HT29, SW620, LOVO, ja DLD-1, mutta ei SW480 (kuvio 1 ja tuloksia ei esitetty). Pallot koko kasvoi pitkin aikaa. Lisäksi sferoidi solut aloilla voitaisiin kuljetettiin yli 25 kertaa menettämättä mitään testattuja ominaisuuksia alla, mikä osoittaa, että he saattavat hallussaan kyky itse uudistaa. Koska DLD-1-solut muodostavat pallojen helpommin kuin muut paksusuolen syöpä linjat testattu edellä, käytimme vain keskittyneet DLD-1 soluja seuraavissa kokeissa. Meidän kätevä kuvaus, me nimettiin pallomainen soluja DLD-1 DLD-S.

HT29, HCT116, SW620, LoVo, ja DLD-1-solut voisivat muodostaa suuri pyöreä, irrallinen kelluva colonsphere 50-100 um, kun viljeltiin SFM (kuten on esitetty DLD-1 ryhmä). Vaikka SW480 pystynyt.

karakterisointi Sferoidiviljelmiä Cells

ensimmäinen kysyttiin DLD-S ilmaisi pinnan markkereita CSCS paksusuolen syövän ja kantasolujen ydin geenejä. Olemme havainneet, että ilmentyminen kantasolujen ydin geenejä, kuten Oct4 /3, Sox2 ja Nanog ja markkerigeenit paksusuolen CSCS, kuten CD133, CD166, Lgr5, ja ALDH1 korotettiin DLD-S-soluissa verrattuna niiden ilmentymistä tasot DLD-1 (kuvio 2A), mikä viittaa siihen, että pallojakaantuminen solut saattavat olla suuri prosenttiosuus CSCS.

(A) ilmentymistä CD133, CD166, Lgr5, ALDH1 ja kantasolujen ydin geenien Oct4 /3, Sox2 ja Nanog in sferoidiviljelmiä soluja säädelty verrattuna DLD-1 tarttuvien solujen. (B) Enemmän sferoidiviljelmiä soluja ilmeisesti havaittiin verrattuna niiden vanhempien DLD-1-soluissa, analysoidaan siirtokuoppaan maahanmuutto- ja invaasiomääritys, vastaavasti. (C) arvioituna pehmeä agar määrityksen ja pesäkkeiden muodostumista määrityksessä pallomainen soluilla suurempi kapasiteetti pesäkemuodostuksen. (D) Kuten arvioi CCK8 määritystä eloonjäämisluku sferoidiviljelmiä solujen lisääntynyt verrattuna tarttuneet solut eri pitoisuuksia 5-FU. (E) arvioituna hiiren ksenografti mallissa pallomainen solut oli korkeammat tuumorigeenisia kyky kuin vanhemman DLD-1-soluissa. * P 0,05.

Sitten tutkittiin pahanlaatuinen profiilia DLD-S-solut, mukaan lukien niiden kyky siirtää ja hyökätä, muodostaen pesäkkeitä, vastata 5-FU, ja tuottaa kasvaimia immuunipuutos hiirillä. Käyttämällä siirtokuoppaan muuttoliike /invaasiomääritys, huomasimme, että DLD-S-soluissa oli merkittävästi suurempi kapasiteetti siirtää ja hyökätä Matrigel päällystetty teriä kuin vanhemman soluja, DLD-1, ei (kuvio 2B).

käyttäminen pehmeä agar määritys ja pesäkemuodostusta, huomasimme, että DLD-S oli merkitsevä korkeampi pesäkkeiden muodostumisen kapasiteettia kuin vanhemman soluja, DLD-1 (kuvio 2C).

Voit testata herkkyys DLD-S kemoterapiaa, käsittelimme soluja 5-FU eri pitoisuuksina. Eloonjäämislukuja DLD-S ja DLD-1 kasvatusliuoksessa, jossa oli sama pitoisuus on 5-FU verrattiin, ja huomasimme, että DLD-S oli merkittävästi korkeammat eloonjääntiaste testattiin pitoisuuksina 5-FU kuin vanhemman soluja, DLD- 1 solut teki, mikä osoittaa, että DLD-S olivat vastustuskykyisempiä kemoterapiaa (kuvio 2D).

Lopuksi tutkimme kasvaimia kykyä DLD-S-solujen

in vivo

. Eri määrä DLD-S tai DLD-1 (1 x 10

4, 5 x 10

4, 1 x 10

5, 5 x 10

5, tai 1 x 10

6 solua) ihon alle ruiskutettiin Balb /c nu /nu hiirille ja hiirille, joilla kasvainten muodostumiseen laskettiin 60 päivän kuluttua solujen siirtoa. Huomasimme, että DLD-S-soluissa oli korkeammat tuumorigeenisia kyky kuin vanhemman soluja, DLD-1 (taulukko S2). Hiiren istutetaan 1 x 10

5DLD-S tai DLD-1-soluja 60 vuorokauden ajan kuvassa 2E.

ilmentäminen Klf4 vuonna koolonkarsinoomasoluissa ja CSCS rikastettu populaatio

Me yritti ensin vahvistaa, että ilmauksia Klf4 erilaisissa koolonsyöpäsolulinjaa olivat pienempiä kuin tavanomainen paksusuolen epiteelin solulinjojen kuten aiemmin on raportoitu [45]. Ilmentymistasojen Klf4 in SW620, HT29, SW480, HCT116, DLD-1, ja LOVO ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa sekä FHC, normaali paksusuolen epiteelisolulinjaa, analysoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR: ää ja Western blotting -analyysi. Kuten odotettua, Klf4 ilmentyi kaikissa testatuissa solulinjoissa ja mRNA-tasoja (kuvio 3A) ja proteiini tasoilla (kuvio 3B ja 3C) näissä syöpäsolulinjoissa oli merkittävästi pienempi kuin FHC solulinjassa.

(A) arvioituna Reaaliaikainen PCR, ilmaus Klf4 useissa koolonsyöpäsolulinjaa oli huomattavasti pienempi kuin normaali paksusuolen epiteelisolujen linja. (B ja C) arvioituna Western-blot, ilmaus Klf4 useissa koolonsyöpäsolulinjaa oli huomattavasti pienempi kuin normaali paksusuolen epiteelisolujen linja. (D) ilmentymistä Klf4 oli merkitsevästi korkeampi sferoidiviljelmiä soluissa kuin DLD-1, HT29, HCT116 tarttuneet solut arvioituna Reaaliaikainen PCR ja Western-blot, vastaavasti (kuten on esitetty DLD-1 ryhmä). (E) arvioituna Reaaliaikainen PCR, ilmaus Klf4 oli merkitsevästi korkeampi CD133 + soluissa kuin CD133-soluja DLD-1. * P 0,05.

verrataan sitten ilmentymisen tasot Klf4 on pallomainen soluissa ja kiinnittyneet solut DLD-1, HT29, ja HCT116-solut, ja totesi, että mRNA: n ja proteiinin tasot Klf4 oli merkitsevästi suurempi sferoidiviljelmiä soluissa kuin kiinnittyneitä soluja (kuvio 3D ja päivämäärä ei ole esitetty). Olemme edelleen järjestetty CD133 + ja CD133- solut DLD-1-solut MACS erottaminen teknologian ja mitattiin mRNA-tasot molemmissa alaryhmissä DLD-1-soluihin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Havaitsimme, että mRNA: n taso Klf4 oli merkitsevästi korkeampi CD133 + soluissa kuin CD133- soluissa (kuvio 3E). Expression of CD133 ja Klf4 DLD-S soluissa varmistettiin lisäksi immunofluoresenssivärjäyksellä (kuva 4). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Klf4 on todennäköisesti ilmaistaan ​​CD133 + alaryhmässä ja DLD-1-johdettu pallomainen soluja, jotka rikastettu CSCS, haastava edellisen tekemisestä että Klf4 toimii tuumorisuppressorina paksusuolen syövän etenemisessä.

Immunofluoresenssianalyysi läsnäolon vahvistamiseksi CD133 ja Klf4 on DLD-1 ja DLD-S-solut, tuma värjätään DAPI.

knockdown n ilmentyminen Klf4 vuonna Sferoidiviljelmiä solut muuttivat Stemness

sitten kysytään Klf4 on olennaista itseuudistumisen ja /tai pahanlaatuisen profiilia sferoidiviljelmiä solujen DLD-1. Tätä varten me syntyy DLD-S siKLF4 infektoimalla DLD-S-solujen Klf4-shRNA lentivirusvektorilla ja DLD-S SICON infektoimalla DLD-S-solujen kanssa kuin siirrettävien shRNA lentivirusvektorilla. Ensin tutkittiin apoptoosin DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 solujen sulkea pois sitä mahdollisuutta, että alentunut kyky chemo-vastus, muuttoliike, invaasion ja aiheuttavan kasvaimia siKLF4 DLD-S-soluissa oli lisääntyneen apoptoosin lakkauttamalla Klf4 ilme ja totesi, että eloonjäämisprosentti oli samankaltainen molemmissa DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 soluja (kuvio 5A). Sitten tutkittiin mRNA ja proteiini tasot Klf4 näissä viruksen tartunnan DLD-S-soluja ja havaittiin, että sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot Klf4 olivat merkittävästi alemmat DLD-S siKLF4 soluissa kuin DLD-S SICON soluissa (kuvio 5B), viittaa siihen, että Klf4 geeniekspressiota onnistui pudotettiin.

(A) eloonjäämisaste oli samankaltainen molemmissa DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 solujen arvioituna anneksiini V APC /PI Double Merkinnät määrityksessä. (B) ilmentymistä Klf4 oli tehokkaasti kaatamalla DLD-S soluissa. (C) rianalyysit CD133 + -solujen. CD133 + jae pieneni merkitsevästi jälkeen kaatamalla Klf4 DLD-S soluissa. (D) ilmentymistä CD133, CD166, Lgr5, ja ALDH1 oli merkitsevästi pienempi DLD-S siKLF4 kuin DLD-S SICON. (E) viljeltiin SFM, DLD-S siKLF4 solut muodostivat pieniä palloja on huomattavasti harvemmin kuin DLD-S SICON solujen teki. * P 0,05.

Sitten kysytään knockdovvn Klf4 ilmentymisen DLD-S muuttaneet CSC-markkerigeenin ilmentymisen käyttämällä FACS-analyysiä, reaaliaikainen PCR, ja Western blotting-analyysi. Olemme havainneet, että määrä CD133 + -solujen on huomattavasti alhaisempi DLD-S siKLF4 soluissa kuin DLD-S SICON soluissa (kuvio 5C) ja ilmaisu kaikkien CSC-markkerigeeni, kuten CD133, CD166, Lgr5, ja ALDH1, huomattavasti alhaisempi DLD-S siKLF4 kuin DLD-S SICON (kuvio 5D). Lopuksi kysyttiin knockdovvn Klf4 vaikutti itsestään uusiminen DLD-S. Kun viljelty seerumittomassa väliaineessa, DLD-S siKLF4 solut muodostivat pieniä palloja on huomattavasti harvemmin kuin DLD-S SICON solujen teki (kuvio 5E), mikä viittaa siihen, että Klf4 on olennaista itsensä uudistamista DLD-S soluissa.

knockdown n ilmentäminen Klf4 muutti maligni profiili Sferoidiviljelmiä solut DLD-1 solut

tutki tarkemmin sitä knockdovvn Klf4 ilmentymisen DLD-S muuttaisi niiden pahanlaatuinen profiilin vertaamalla kyky of DLD-S siKLF4 ja DLD-S SICON siirtyä ja hyökätä, muodostaen pesäkkeitä, vastata 5-FU, ja tuottaa kasvaimia immuunipuutos hiirillä. Ensinnäkin, käyttämällä transwell määritystä, olemme huomanneet, että DLD-S siKLF4 siirretty ja tunkeutuu huomattavasti hitaampi kuin DLD-S SICON soluissa (kuvio 6A). Toiseksi, testasimme eloonjäämislukuja DLD-S siKLF4 solujen kasvatusliuoksessa, jossa oli 5-FU: n ja totesi, että DLD-S siKLF4 oli merkittävästi pienempi eloonjäämisaste kuin DLD-S SICON solut (kuvio 6B). Kolmanneksi, pehmeällä agar määritystä ja pesäkemuodostusta, olemme huomanneet, että DLD-S siKLF4 solut muodostivat merkittävästi pienempi määrä pesäkkeistä ja pienempiä pesäkkeitä kuin DLD-S SICON (kuvio 6C). Lopuksi, käytimme hiiren ksenograftimallissa kysyä Klf4 vaaditaan

in vivo

kasvainten synnyssä CSC rikastettu DLD-S soluissa. Yksi miljoonaa DLD-S siKLF4 tai SICON solut ihon alle injektoitiin kuhunkin Balb /c nu /nu hiiri, vastaavasti. Olemme havainneet, että kasvaimet muodostettiin hiirissä, joihin on siirretty DLD-S SICON solut aikaisemmin ja merkittävästi suurempi kuin hiirissä, joihin on siirretty DLD-S siKLF4 soluissa (kuvio 6D). Esimerkiksi päivänä 56 post solujen injektion, hiirissä sai DLD-S SICON kasvoi keskimäärin 1256,52 mm

3 tilavuudessa, kun taas hiirissä sai DLD-S siKLF4 kasvoi vain keskimäärin 374,11 mm

3. Histologiaa ksenograftikasvaimissa tutkittiin HE värjäys. Ei ollut merkittävää histologista eroa DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 ryhmät (kuvio 6E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että knockdovvn Klf4 ilmentymisen DLD-S soluissa rujo kapasiteetit näiden solujen siirtyä, hyökätä, vastustaa 5-FU, ja tuottaa kasvaimia.

(A) DLD-S siKLF4 siirtyneet ja hyökkäsi huomattavasti hitaammin kuin DLD-S SICON soluissa, arvioi Transvvell- määrityksessä. (B) Kuten arvioi CCK8 määrityksen, DLD-S siKLF4 oli merkitsevästi vähemmän eloonjäämisaste kuin DLD-S SICON solujen eri pitoisuuksia 5-FU. (C) DLD-S siKLF4 solut muodostivat huomattavasti alempi pesäkkeiden määrä ja pienempiä pesäkkeitä kuin DLD-S SICON. (D ja E) DLD-S SICON solut muodostivat kasvaimia aikaisemmin ja merkittävästi suurempi kuin hiirissä, joihin on siirretty DLD-S siKLF4 soluissa. Ei ollut merkittävää histologista eroa DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 ryhmiä. Alkuperäiset suurennokset × 200. * P 0,05.

kaatamalla Klf4 Expression vaimentaa epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon in Sferoidiviljelmiä Solut

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) prosessi liittyy läheisesti metastaattista ominaisuus syöpäsolujen [46], [47]. Syöpäsolut harjoittaa EMT prosessi ilmaista mesenkymaalisten geenejä, kuten vimentiinistä, etana, ja etana, kun taas ilmaisuja epiteelin markkerigeeni, kuten E-kadheriinin ja ZO-1 pienenevät. Nämä solut myös samanlaisia ​​pahanlaatuinen profiilia CSCS tai syöpä-aloittavat solut eivät. Ensin osoitettiin, että toisin kuin DLD-1-solut, DLD-S ilmaistaan ​​tyypillinen epiteelin markkeri, E-kadheriinin ja tyypillinen mesenkymaaliset markkeri, vimentiinistä immunofluoresenssilla ja Reaaliaikainen PCR-analyysi (kuvio 7A ja 7B), mikä viittaa siihen, että DLD-S ei ominaisuuksiltaan solujen läpi EMT. Sitten verrataan ilmaus epiteeli- ja mesenkymaalisten merkkiaineiden joukossa DLD-S siKLF4 ja DLD-S SICON solujen ja havaitsi, että DLD-S siKLF4 soluilla oli merkittävästi korkeampi proteiinin tasot ZO-1, mutta huomattavasti alempi proteiinin tasot E-kadheriinin ja vimentiinin kuin DLD-S SICON (kuvio 7C). Mielenkiintoista on, että ilmaus etana oli samankaltainen molemmissa DLD-S siKLF4 ja DLD-S SICON. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Klf4 tarvitaan edistämään EMT prosessin paksusuolen sferoidiviljelmiä soluissa.

(A) Immunofluoresenssianalyysi on DLD-S SICON ja DLD-S siKLF4 solujen E-kadheriinin ja vimentiinista, tuma värjätään DAPI . (B) arvioituna Reaaliaikainen PCR, DLD-S-solut olivat merkittävästi korkeammat mRNA tasoja E-kadheriinin, vimentiinistä ja Snail. Ekspressio ZO-1 on vähentynyt. (C) DLD-S siKLF4 soluilla oli merkittävästi korkeampi proteiinin tasot ZO-1, mutta huomattavasti alempi proteiinin tasot E-kadheriinin ja vimentiinin kuin DLD-S SICON. Ilmaisu on etana oli samanlainen joukossa. * P 0,05.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa pystyimme rikastuttaa CSCS useista koolonsyöpäsolulinjaa viljelemällä niitä seerumia. Pallot muodostettu seerumia sisälsi pallomainen soluja, joilla oli ominaisuudet paksusuolen CSCS: ensin, nämä solut oli korkea markkerigeenien ilmentyminen paksusuolen CSCS ja kantasolujen (kuvio 2A); Toinen, nämä solut olivat enemmän pahanlaatuisten ominaisuuksia kuin vanhemman DLD-1-soluissa (kuvio 2B, 2C ja 2D); Lopuksi, nämä solut osoittivat lisääntynyttä kasvainten muodostumiseen kun ihonalaisesti osaksi immuunivajaisiin hiiriin (kuvio 2E). Muut käytetään myös seerumia järjestelmä saada CSCS rikastettua pallojen HCT116, HT29 koolonsyöpäsolulinjoissa [22], [43], [44]. On syytä korostaa, että tämä CSCS-rikastuttava menetelmä ei sovellu kaikille koolonsyöpäsolulinjaa. Esimerkiksi Tutkimuksessamme emme pystyneet rikastuttaa pallojen SW480 tällä menetelmällä.

totesi myös, että Klf4 tarvittiin ominaisuuksien paksusuolen CSCS. Ensimmäinen, Klf4 oli vain hyvin ilmaistu CSC-rikastettu pallomainen soluja DLD-1, HCT116, HT29-solut ja CD133 + -soluja eristettiin DLD-1-soluissa (kuvio 3D, 3E, ja päivämäärä ei ole esitetty). Toiseksi lakkauttamalla Klf4 ilmentymistä DLD-S soluissa vähensi CD133 + solujen ja vähensi ekspressiotasot paksusuolensyöpä kantasolujen markkerigeeni (kuvio 5C ja 5D) ja nämä solut eivät voi tehokkaasti muodostaa palloja seerumittomassa väliaineessa ( Kuva 5E). Kolmanneksi, DLD-S-solujen vähentynyt Klf4 ilme osoitti rujo kyky siirtyä, hyökätä, vastustaa 5-FU, ja tuottavat kasvaimet (kuvio 6A, 6B, 6C, 6D, ja 6E).