Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehittyvät todisteet osoittavat syövän kantasolut (CSCS) voi aloittaa uusia kasvaimia anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC), yksi aggressiivinen kiinteitä kasvaimia ihmisissä. Kuitenkin osallistuminen CSCS ihmisen kasvaimien syntyyn ei ole aiemmin tutkittu todennettu ATC solulinjoissa. Täällä osoittavat toiminnallista roolia CSCS neljään uuteen validoitu ihmisen ATC solulinjoissa (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T ja THJ-29T). Havaitsimme ja rikastettu CSCS käyttämällä pallomaista muodostavaa määrityksessä. Noin 3-9% soluista neljä ATC solulinjojen muodostettu thyrospheres. Thyrospheres ilmaisi kantasolujen merkkiaineita Nanog ja Oct4 ja hallussaan kyky itse uudistaa. Injektio näistä thyrospheres osaksi kilpirauhasen NOD /SCID

Il2rg – /-

hiirille aiheutti muodostumista etäpesäkkeitä, että toisteta kliiniset piirteet ihmisen ATC. Tietääksemme tämä on ensimmäinen

in vivo

luonnehdinta kilpirauhasen CSCS käyttämällä validoituja ihmisen ATC solulinjoissa. Saatavuus tautikohtaisia ​​thyrospheres ja meidän potilaalle tehdä kasvainmuodoista mahdollistaa selvittäminen tautimekanismien ja ympäristön kapealla CSCS. Ne voivat myös olla hyödyllisiä prekliinisissä terapeuttista seulontaan ja vaikutuksia seuraava biologisen hoitomuotojen ATC.

Citation: Li W, Reeb AN, Sewell WA, Elhomsy G, Lin RY (2013) fenotyyppinen karakterisointi Metastasoitunut Anaplastic kilpirauhassyöpä Kantasolut. PLoS ONE 8 (5): e65095. doi: 10,1371 /journal.pone.0065095

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 18 lokakuu 2012; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 28, 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health Grant R01 DK068057 ja presidentin Research Fund of Saint Louisin yliopiston (RYL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC) on yksi kaikkein vaarallisin ihmisen syöpäsairauksia. Yhdeksänkymmentä prosenttia potilaista, joilla ATC kuolee kuuden kuukauden kuluessa diagnoosista. Vaikka se on suhteellisen harvinainen – se on vain 2% kaikista kilpirauhassyöpä tapauksissa – ATC aiheuttaa yli 50% kaikista kilpirauhassyöpä kuolemia joka vuosi. Nykyiset hoidot ATC ovat aggressiivisia, ja sisältää leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa. Kuitenkin ATC kestää kaikenlaisia ​​hoidon ja sairauden ennusteen on pysynyt muuttumattomana jo yli 50 vuoden ajan [1]. On selvää, ATC on merkittävä diagnostinen ja terapeuttinen haaste.

osajoukko syövän kantasoluja (CSCS) on oletettu liuotus ja ylläpitää kasvaimen kasvua ATC [2] – [7]. CSCS ovat kasvaimen aloittamista solut, jotka omistavat kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia. Niille on ominaista kyky läpikäydä sekä symmetriset ja epäsymmetriset jako, sekä erilaistua useiksi kasvainsolutyypit. Ne ovat suurelta osin lepotilassa, jonka avulla ne voivat paeta standardin chemotherapies joilla pyritään nopeasti jakautuvia soluja. CSCS voidaan eristää sekä vakiintuneiden kilpirauhassyöpä solulinjat ja kasvaimen yksilöitä. Kuitenkin vakava solulinjassa saastuminen kysymys on kyseenalaistanut tulosten monet viimeaikaiset tutkimukset ihmisen ATC solulinjoissa, mukaan lukien kaksi, jossa me ja muiden laboratorioiden kuvattu CD133-positiivinen CSC väestön ATC solulinjassa ARO että oli sekä tuumorigeenisia ja resistenttejä kemoterapialle [8], [9]. Tämä ARO solulinja on sittemmin osoitettu saastuttamia ihmisen koolonisyöpäsolulinja HT-29. Itse asiassa, Schweppe

et al

todettu, että jopa 42%: n kilpirauhassyövän solulinjoja käytetään yleisesti kilpirauhasen tutkimukseen aikana kahden viime vuosikymmenen ovat tunnistanut, tarpeeton tai rajat pilaantuneen [10]. Tämä hälyttävä havainto on ajanut kilpirauhasen tutkimusyhteisöä luomaan uusia, validoitu kilpirauhassyöpä solulinjoissa.

Tässä tutkimuksessa arvioimme neljä todennettu ihmisen ATC solulinjoissa (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T ja THJ-29T) olemassaolon CSCS, joka voi aloittaa neoplastista kasvua. Yksityiskohtaisemmin raportin Marlow

et al

, kaikki ihmisen neljän ATC solulinjat perustettiin kasvaimia poistetaan ATC potilaista ja tutkittiin läsnäolo tunnetaan kilpirauhasen tumorigeneesin muutoksia, mukaan lukien mutaatiot

BRAF, KRAS, sääntelyviranomaisten

, ja

HRAS

; mutaatiot

RET /PTC1, RET /PTC2

, ja /tai

RET /PTC3

fuusio-onkogeenien; ja mitä tahansa tunnetuista variantteja

PAX8 /PPARy

fuusio-onkogeenin [11]. Ainutlaatuinen geneettisiä mutaatioita ja 12 lyhyt tandem DNA toisto (STR) sekvenssit käytettiin liittämään solulinjat niiden kasvaimet – tekemällä niistä ensimmäiset kilpirauhassyövän solulinjoja voidaan kiistatta jäljittää niiden kudoksen alkuperän [11].

tutkimaan, onko CSC väestö on olemassa näissä solulinjoissa, me ensin luotettavan sferoidin muodostava määrityksessä tunnistaa ja rikastuttaa kilpirauhasen CSCS. Seuraavaksi testasimme vaikutus kemoterapian sisplatiinia näiden solulinjojen. Sitten arvioitiin kyky näiden solujen aloittaa uusia kasvaimia aikana serial

in vivo

siirrostamalla rajoittamaan laimennoksilla immuunivajaissa NOD /SCID

Il2rg – /-

hiirillä. Lopuksi tutkimme, metastaattista potentiaalia ATC thyrospheres kaksi ksenotransplantaatio mallia: ortotooppisten kilpirauhasen transplantaation onko thyrospheres ovat tuumorigeenisiä ja kykenevät tunkeutumaan paikallisten kudosten, ja häntä-vein injektion malli kokeellisesti aiheutetun keuhkometastaasitestissä testata kykyä solujen etäpesäkkeitä kaukaisiin kohtiin.

tulokset

ATC-solujen ylläpitämiseksi klonogeeniset kapasiteetti

in vitro

ensin tutkittiin leviämisen ihmisen neljän ATC solulinjoja : THJ-11T (p67), THJ-16T (P88), THJ-21T (P56) ja THJ-29T (P89). Vaihe kontrasti kuvia näistä solulinjoista viljeltiin RPMI yksittäiskerroksina ja soluproliferaation käyrä yli 96 tunnin aikana on esitetty kuviossa. 1A ja 1B. Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-PCR: llä (qRT-PCR) analyysi osoitti, että kaikki solulinjat ilmensivät pariksi laatikko geenin 8 (

Pax8

), kilpirauhasta erityinen transkriptiotekijä. Yksi solulinjojen, THJ-21T, ilmaisi myös kilpirauhasen transkriptiotekijä 1 (

TTF1

). Sitä vastoin yksikään solulinjat ilmensivät kilpirauhasen erilaistumisen markkereita, kuten tyroglobuliiniin (

Tg

), natrium /jodidia symporter (

NIS

), kilpirauhasen peroksidaasi (

TPO

) tai reseptorin kilpirauhasta stimuloivan hormonin (

TSHR

) – vahvistetaan dedifferentoituneet tila näiden ATC solulinjoista (kuvio. 1 C).

(A) faasikontrastimikroskopiaa kuvia neljä ATC solulinjojen viljellyt yksittäiskerroksina RPMI. (B) Kasvu leviämisen käyrä yli 96 tuntia osoittaa proliferaatiopotentiaali näiden ATC solulinjoista. (C) qRT-PCT analyysi kilpirauhasen transkriptiotekijöiden

Pax8

ja

TTF1

ja kilpirauhasen Differentiaatiomarkkerien

TSHR

,

TG

,

NIS

, ja

TPO

. Ihmisen GAPDH käytettiin taloudenhoito geeni aikana liitetyt.

Luonnehtia CSCS näissä solulinjoissa, arvioimme niiden kyky muodostaa pesäkkeitä ja thyrospheres

in vitro

. Kuva. 2A osoittaa, että kaikki solulinjat muodostivat pesäkkeitä in metyyliselluloosapohjaisia ​​media seitsemän päivän viljelyn. Ne muodostivat myös vapaasti kelluva thyrospheres kun ympättiin kantasoluja-viljelyolosuhteiden ultra-low kiinnityslevyjä. Rajoittavan laimennuksen analyysi osoitti, että keskimääräinen prosenttiosuus thyrospheres muodostettu oli 9,4 ± 0,8% THJ-11T-soluja, 4,5 ± 0,9% THJ-16T-soluja, 3,1 ± 0,6% THJ-21T-soluja ja 8,8 ± 1,0% THJ-29T solut (Fig. 2B). Halkaisija ensisijaisen thyrospheres vaihteli 100-150 um. Näitä thyrospheres voidaan laajentaa usean kohtia. Keskimääräinen prosenttiosuus toissijaisten thyrospheres väheni kaikissa solulinjoissa: 5,5 ± 0,4% THJ-11T soluja, 3,3 ± 0,5% THJ-16T soluja, 1,2 ± 0,5% THJ-21T soluja, ja 4,9 ± 0,2% THJ -29T solut (Fig. 2B). Tämä vähennys voi olla seurausta alkuvaiheen symmetrinen laajentaminen ympätty kilpirauhasen kantasoluja, jota seuraa epäsymmetrinen jako, joka synnyttää eriytetyn jälkeläiset, jotka muodostavat suurimman osan thyrosphere soluja. Me seuraavaksi arvioidaan epäsuoralla immunofluoresenssilla ilmentymistä pluripotenttisuuden markkereita Nanog ja Oct4 sisään thyrospheres tuotetaan kaikkien neljän ATC solulinjoissa. Edustavia konfokaalimikroskopia kuvia THJ-21T thyrospheres osoitti ilmentymistä Nanog ja Oct4 (Fig. 2C). Tyypillinen vaihe kontrasti kuvia THJ-21T vanhempien yksikerrossoluissa osoittivat, että ilmentyminen näiden kantasolujen merkkiaineita on ainutlaatuinen thyrospheres, ja kuten edellä todettiin, ei näy vanhempien yksikerrossoluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kaikki ATC solulinjoilla on kyky itse uudistaa

in vitro

. Lisäksi on selkeää näyttöä ilmentymisen kantasoluja liittyvien geenien thyrospheres.

(A) edustaja faasikontrastimikroskopiaa analyysi pesäkkeiden (vasemmalla) ja thyrospheres (oikealla) seitsemän päivän viljelyn. Mittakaava, 100 pm. (B) Prosenttia ensisijaisen ja toissijaisen thyrospheres kaikissa neljässä ATC solulinjoissa. (C) edustaja konfokaalimikroskopia kuvia THJ-21T thyrospheres osoitti ilmentymistä Nanog (punainen), Oct4 (vihreä) ja DAPI (sininen). Asteikko bar, 10 mikrometriä (ylempi paneeli). Edustavia vaihekontrasti kuvia THJ-21T vanhempien yksikerrossoluissa osoitti ilmentymistä Nanog ja Oct4 on ainutlaatuinen thyrospheres ja ei näy vanhempien yksikerrossoluissa (alempi kuva).

vaikutus kemoterapeuttisen sisplatiinia lennonjohdon soluissa

tutkittiin, mikä vaikutus kemoterapeuttisen aineen sisplatiini, jota testataan parhaillaan vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa potilailla, joilla ATC, meidän ATC solulinjoissa. Kuva. Kuvio 3A esittää edustavia faasikontrastimikroskopiaa kuvia THJ-11T-soluja osoitetuilla Sisplatiinin 48 tuntia. Tuloksemme osoittavat annos-reagoiva inhiboi sisplatiinin solun kasvun ja vahvistettu IC

50 kunkin solulinjan (Fig. 3B). Olemme lisäksi määritetään, onko thyrospheres näytteille sisplatiini chemoresistance vertaamalla herkkyys thyrospheres peräisin THJ-11T ja THJ-16T-soluja, jotka on vanhempien yksikerrossoluissa (Fig. 3C). 24 tunnin kuluttua, kun läsnä on 10 uM sisplatiinin, eloonjäämisaste THJ-11T thyrospheres oli -1,7-kertainen kuin THJ-11T yksikerrossoluissa (52,5 ± 3,5

vs.

30,0 ± 1,4,

P

0,05). Sen sijaan eloonjäämisaste THJ-16T thyrospheres samanlaisissa olosuhteissa oli samanlainen kuin THJ-16T yksikerrossoluissa ((49,7 ± 2,7

vs.

48,6 ± 1,5,

P

= 0,73 ) (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että alapopulaatio pallomaisten muodostavien solujen THJ-11T-soluja, mutta ei THJ-16-solut, ovat resistenttejä sisplatiinihoitoon.

(A) edustaja vaihekontrasti mikroskopia kuvia THJ-11T vanhempien yksisolukerroksen peräisin olevien solujen osoitetuilla sisplatiinin 48 tuntia. (B) annos-riippuvainen kasvun esto kaikilla ATC solulinjoissa. IC

50 arvot, kuten on esitetty kunkin solulinjan . (C) vertailu

in vitro

resistenssin sisplatiinia parentaalisten yksikerrossoluissa ja pallomainen muodostavia soluja. THJ-11T ja THJ-16T vanhempien yksisolukerroksen peräisin olevia soluja ja thyrosphere peräisin olevat solut käsiteltiin 10 uM sisplatiinin ja osa lisääntyvien solujen jäljellä sen jälkeen arvioidaan perustuen Alamar Blue-solujen lisääntymisen määrityksessä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. ****,

P

0,0001; ***,

P

0,001; **,

P

0,05.

ATC-solut aloittaa kasvaimia sarjatuotannossa siirrettyjen immunodefisienttien hiiret

Voit testata hypoteesia, että vain pieni väestö CSCS on vastuussa kasvaimen muodostumisen, me istuttaa kukin neljästä ATC solulinjojen ryhmiin NOD /SCID

Il2rg – /-

hiiret – erittäin immuunivaste on kanta, joka ei ole T-solujen, B-solujen ja NK-solujen [12] . Taulukko 1 osoittaa, että ihon alle tahansa solulinjojen aiheuttaman kasvaimen muodostumista hiirissä. Kuitenkin niin pitkään, injektio kasvaimen muodostumisen, tai latenssi solulinjat, monipuolinen: 28 päivää varten THJ-11T, 28-70 päivää ja THJ-16T, 56-77 päivää ja THJ-21T, ja 56 91 päivää varten THJ-29T. Nämä havainnot viittaavat siihen, että THJ-11T solut aloittaa kasvaimen kasvua tehokkaammin kuin muut ATC solulinjat.

Seuraava sarjatuotantona istutetut nämä ensisijainen ksenografteissa muihin NOD /SCID

Il2rg – /-

hiiret määrittää pitkän aikavälin Tuumorigeenisuustutkimuksissa näissä soluissa. Rajoittavan laimennuksen elinsiirron kokeet osoittivat, että kasvaimen kasvunopeus kasvoi sarja ksenografti. Esimerkiksi latenssi toissijaisten ksenograftien 5 x 10

5 ATC-solut (riippumatta solulinja) oli 14-28 päivää, kun taas vastaava määrä soluja asteen ksenografteissa oli 7-14 päivää (taulukko 1) . Havaitsimme myös, että koko ihonalaisen kasvainten määrä heijastelee solujen ruiskutetaan (fig3. 4 A ja B). Kasvaimet johdettu toinen ja kolmas ksenografteissa of THJ-11T solujen toistaa yhdenmukaisesti ensisijainen kasvaimia histologinen tasolla, ja Western blotting ja immunohistokemiallinen analyysi vahvisti ilmaus kasvainmerkkiaineet ALDH, CD44 ja CXCR4 että ksenografteissa (Fig. 4 C-E). Huomaa, että hiiren ksenografteissa eivät ilmaise CD133, sopusoinnussa aiemman löydös primääriviljelmissä syntyvät kirurgisen näytteistä ihmisen ATC [5]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kaikki neljä näistä ATC solulinjaa on pitkäaikainen Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja että ksenograftimalleja määrällisesti ja laadullisesti kerrata kasvaimen kehittymisen

in vivo

. Havainto, että kukin solulinja voidaan lisätä kolme kohdat osoittaa niiden itseuudistumisen potentiaali

in vivo

. Erityisesti, 42-77 päivää tarvittiin kasvaimen muodostumisen jälkeen ihonalaisen 10000 THJ-11T thyrosphere peräisin olevia soluja (taulukko 1). Tämä latenssin lisääntymistä viittaa siihen, että ihon alle tilaa ei voi tarjota sopivan mikroympäristön varten thyrosphere peräisin olevat solut.

(A) Kasvaimen kasvu käyrän syntyy ihonalaisella THJ-11T vanhempien yksisolukerroksen peräisin olevat solut. Solujen lukumäärä injektoidaan on merkitty. (B) Edustava ihonalainen kasvain poistettiin hiiren ksenograftin. (C) Western blot-analyysi osoittaa ilmaus ALDH, CD44, ja CXCR4 soluissa peräisin ensimmäisen, toisen ja kolmannen asteen ksenograftit. (D) H S, sileän lihaksen; tähti, kilpirauhasen kasvaimet; E, ruokatorvi. (C) Orthotopic kasvaimia, jotka johtuvat thyrosphere peräisin olevia soluja oli suurempi kasvaimen tilavuus kuin teki ne, jotka johtuvat vanhempien yksikerroksista peräisin olevia soluja (60 ± 30 mm

3

versus

40 ± 20 mm

3

P

= 0,25). (D) immunohistokemiallinen värjäys ALDH, CD44, CXCR4 ja CD133 in potilaalle tehdä kasvaimet syntyvät monolayer- ja thyrosphere peräisin olevat solut. Huomaa voimakas immunoreaktiivisuus ALDH, CD44 ja CXCR4 thyrosphere johdettu kasvaimia Neljä viikkoa injektion. (E) Kaavioesitys keuhkojen kolonisaation määrityksessä tail-vein injektiomalliin. Edustavia histologia kuvia hiirten keuhkojen etäpesäkkeiden aiheuttama THJ-11T yksikerrossoluissa. Huomaa, että hiiriä, joihin injektoitiin thyrosphere peräisin olevia soluja, ei kehittynyt keuhkojen etäpesäkkeiden. Mitta-asteikko, 100 um.

ATC thyrosphere peräisin olevat solut eivät aiheuta keuhkometastaasitestissä

Kuten ortotooppisten elinsiirtojen malli ei voi aina tuota etäpesäkkeiden keuhkoihin (merkittävä kuolinsyy ATC), me ruiskutetaan 10000 thyrosphere peräisin olevat solut tai 500000 THJ-11T-soluja viljeltiin yksikerroksisessa häntälaskimoihin NOD /SCID

Il2rg – /-

hiirillä kokeellisesti aiheuttaa keuhkojen etäpesäkkeiden. Hiiret tapettiin ja keuhkoleikkeissä analysoitiin kuuden viikon jälkeen. Lukuisia etäpesäkenystyröiden havaittiin hiirten keuhkoissa, injektoitiin THJ-11T-soluja viljeltiin yksikerroksisessa, mutta ei todettu keuhkoissa hiiriä, joihin injektoitiin thyrosphere peräisin olevia soluja (kuvio. 5E). Nämä havainnot viittaavat siihen, että thyrosphere peräisin olevat solut eivät edistää keuhkojen etäpesäkkeiden tässä kokeellisesti aiheutettua keuhkometastaasitestissä malli.

Keskustelu

ATC on kaikkein aggressiivinen alatyyppi kilpirauhassyöpä. Koska sen vastustuskykyä kaikenlaisia ​​syöpähoidon, mediaanielossaolosta ATC on vain kuusi kuukautta. Kuitenkin kehittää entistä tehokkaita hoitoja on vaikeuttanut puute validoitu kilpirauhassyövän solulinjoissa laajamittaiseen huumeiden seulontaan. Sen jälkeen vuonna 2008 raportin vakavan kilpirauhassyövän solulinja ristikontaminaation kysymyksiä [10], oli tarpeen luoda uusia, validoitu solulinjat yksityiskohtainen luonnehdinta solulinjassa eheys ja STR profiileja että geneettisesti yhdistää linjat niiden kudokseen alkuperä. Neljä ATC solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa edustaa ensimmäinen paneeli kilpirauhassyövän solulinjojen joka täyttää nämä tiukat uudet standardit. Tuloksemme osoittivat, että kaikki neljä ATC solulinjat sisältävät pienen populaation CSCS kanssa itseuudistumisen potentiaalia. Olemme kehittäneet yksinkertaisen ja vankka tapa tuottaa metastaattisen ATC käytettäessä potilaalle tehdä hiirimallissa käyttämällä ihmisen thyrospheres johdettu näistä solulinjoista. Injektio thyrosphere peräisin olevien solujen osaksi kilpirauhasen NOD /SCID

Il2rg – /-

hiirille aiheutti muodostumista etäpesäkkeitä, että toisteta kliiniset piirteet ihmisen ATC.

Kilpirauhasen CSCS ovat harvinaisia, ja jos erityisiä solun pinnan markkereita tekee niiden eristäminen haastavaa. Useat markkereita, kuten CD44, ALDH ja CD133, on käytetty menestyksellisesti eristää CSCS rinta-, eturauhas-, peräsuolen, glioblastooma, ja haimasyöpiin [13] – [17], ja CD133 on aikaisemmin todettu otaksutun CSC merkkiaine ATC . Kuitenkin julkaisuissa raportointi nämä havainnot on arvosteltu niiden käytöstä saastuneen koolonisyöpäsolulinja [8], [9]. Esillä olevassa tutkimuksessa yksikään ATC solulinjat ilmensivät CD133, sopusoinnussa aiemman löydös primääriviljelmissä syntyvät kirurgisen näytteistä ihmisen ATC [5].

Edut ATC solulinjoja ovat kyky kulttuuriin niitä pitkiä aikoja ja kasvattaa niitä suuria määriä korkean suoritustehon huumeiden seulonta sovelluksia. Huolimatta näistä eduista, on välttämätöntä vahvistaa havaintomme primaarisissa ATC-soluissa, koska solulinjat eivät aina kerrata kaikkia näkökohtia primaarikasvaimia. Kuitenkin harvinaisuus ja nopeasti kuolemaan johtava luonne maligniteetin on tehnyt tämän vaikea saavuttaa laboratorio-olosuhteissa.

CSCS voidaan eristää useilla eri tekniikoilla, mukaan lukien virtaussytometria, joka perustuu spesifisten solun pinnan merkkiaineiden kuten edellä käsiteltyjä [18] – [21]. Lajittelun puoli populaatioiden syöpäsolujen kautta Hoechst 33342 eksluusio on vaihtoehtoinen lähestymistapa [22]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että pallomainen muodostava määritys ja kulttuuri on yhtä tehokas menetelmä erottaa CSCS monien kiinteiden kasvainten tai syövän solulinjat [23] erityisesti silloin, kun – kuten on laita ATC – luotettava solun pinnan CSC markkeri ei ole vielä tunnistettu.

thyrosphere määritys on hyvin tutkittu

in vitro

kantasolujen määritys määrittää klonaalisuuden ja multipotenttisuus potentiaalisten kilpirauhasen kantasolujen [2]. Dissosioivan thyrospheres yksittäisiksi soluiksi, pinnoitus niitä rajoittavan laimennuksen ja sitten alistamalla ne serial johtamisella kulttuuri voi edelleen arvioida pitkän aikavälin leviämisen potentiaalin näiden solujen. Tuloksemme osoittavat, että kaikki neljä ATC solulinjoja voidaan viljellä niin thyrospheres ja uudelleen siirrostettiin useita kertoja, mikä vahvistaa niiden itseuudistumisen potentiaali

in vitro

. Meidän sytotoksisuus tutkimukset osoittivat, että pieni väestö thyrospheres peräisin THJ-11T solulinja oli resistentti sisplatiinihoitoon. Kuitenkin samoissa olosuhteissa, thyrospheres ja yksikerrossoluissa peräisin THJ-16T solut olivat yhtä herkkiä sisplatiinia. Nämä erot voivat johtua molekyyli- ja geneettisiä eroja kahden ATC solulinjojen ja voivat oikeuttaa lisätutkimukset.

CSCS pystyvät toistamaan koko heterogeenisyys vanhemman kasvain ja kasvaa jatkuvasti, vaikka useita kohtia. Siten lopullinen tapa vahvistaa itseuudistumisen ja multipotenttisuus potentiaalia CSC

in vivo

on uudistua kasvain immuunivajausta eläimillä. Huomasimme, että kasvaimia kustakin neljästä ATC solulinjat paitsi kertasi histologian ja rakenne vanhemman kasvaimia, mutta se voi myös levittävät

in vivo

kolme kohtia. Nämä tulokset tukevat tärkein hypoteesia, että jotkut ATC soluilla kantasolujen ominaisuudet

in vivo

. Olemme lisäksi havainneet, että kolmannen asteen ksenograftien kaikista neljästä ATC solulinjat kasvoivat nopeammin NOD /SCID

Il2rg – /-

hiirillä kuin teki ensisijainen ksenograftit. Vaikka nämä tulokset eivät välttämättä osoittaa kantasolujen rikastamiseen, ne voisi osoittaa, että jotkut syöpäsoluja tertiäärisen ksenografteissa ovat erittäin proliferatiivisen. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään entistä-aggressiivinen kolmannen asteen tuumoriksenografteja ATC ja määrittää seuraukset, jos lainkaan, sillä toistuvat kasvaimia ihmispotilaille.

Tässä tutkimuksessa käytimme NOD /SCID

Il2rg – /-

hiiriä testaamaan ATC solulinjoja ksenograftin kasvun. Tämä Hiirikanta puuttuu kypsät T-ja B-solujen ja on puutteellinen usean suuren affiniteetin sytokiinireseptorit – kuten IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 ja IL21 – kehittäminen edellyttää NK-solujen ja synnynnäisen immuniteetin vastauksia. Tämän seurauksena immuunijärjestelmä tämän kannan on enemmän vakavasti heikentynyt kuin standardin NOD /SCID-hiiriin. Esimerkiksi on raportoitu, että yksi neljästä satunnaisesti valitusta yksittäisiä soluja ihmisen melanooma näyte voi muodostaa kasvaimen tässä hiirimallissa, joka on useita kertaluokkia suurempi kuin yksi-in-a-miljoonaa solua ehdotti tutkimukset vakio NOD /SCID [12]. On selvää, valinta muuntogeenisten hiirimalleja ksenografti tutkimuksia otaksuttu CSCS voi merkittävästi vaikuttaa herkkyyttä ja on harkittava tarkkaan tulkittaessa tietoja. Tämä NOD /SCID

Il2rg – /-

hiiri kanta on tullut kultainen standardi testaus CSC mallin ansiosta ylivoimainen ksenografti valmiudet.

Olemme hyödyntäneet kolmea eri transplantaatioratkaisut tutkia kasvaimia ja metastaattisen potentiaalin thyrosphere peräisin olevien solujen. Kolmesta elinsiirtojen sivustoja osoitimme tässä raportissa – ihonalainen, kilpirauhasen ja pyrstö vein – vain potilaalle tehdä kilpirauhasen elinsiirtojen malli syntyy aggressiivinen ja etäpesäkkeitä kahden viikon kuluessa injektion. Vertailun, ihonalainen malli, mutta pystyy tukemaan tuumorin aloittamista, vaatii enemmän kuin 40 päivää tuottaa havaittavia kasvaimia sama määrä soluja. Lopuksi hännän vein injektiomalliin voi aloittaa kasvaimia jälkeen jopa kuusi viikkoa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kyseessä on paikkansa kilpirauhanen joka osallistuu suoraan sääntelyn thyrosphere peräisin olevien solujen. ATC etäpesäke on monimutkainen ja erittäin säännelty prosessi välittyy eri kasvain johdettuja tekijöitä. Ymmärtäminen thyrosphere peräisin olevat solut edistää paikallista, mutta ei keuhkoissa, etäpesäke voi olla ratkaiseva kehittää tehokkaampia hoitoja metastaattisen ATC.

Yhteenvetona saatavuus ATC-specific thyrosphere peräisin olevia soluja ja potilaalle tehdä kasvainmuodoista että kerrata metastaattinen niin tappava ihmispotilaille antaa kilpirauhassyöpä tutkijoita paneeli ennennäkemättömän kliinisen työkaluja. Meidän havainnot voivat osoittautua hyödyllisiksi selvittämisessä molekyylitason mekanismit levittämistä metastaattisen CSCS ja etsintä hoitostrategioiden jotka vaikuttavat välittömästi kilpirauhasen CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmisen ATC soluviljelmässä, pesäkemuodostusta, ja thyrosphere määritys

ihmisen ATC solulinjat THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T ja THJ-29T [11] saatiin tohtori John A. Copeland (Mayo Clinic). Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Cellgro, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ei-välttämättömiä aminohappoja, natriumpyruvaattia, ja penisilliini-streptomysiiniä-amfoterisiini B. Viljelmiä pidettiin kosteutetussa kammiossa on 5% CO

2 /ilmaseos 37 ° C: ssa. Jotta pesäkkeitä muodostumista määrityksessä, soluja viljeltiin metyyliselluloosa-pohjainen media MethoCult mukaisesti valmistajan ohjeiden (StemCell Technologies, Vancouver, Kanada). Sillä sferoidi muodostava määritys, yhden solut maljattiin 5000 solua /kuoppa ultra-low-kiinnitys kuusi-kuoppalevyille (Fisher Scientific Co., Hampton, NH). Spheres laskettiin seitsemän päivän kuluttua. Prosenttiosuus soluja, jotka muodostavat thyrospheres lasketaan kokonaismäärästä solujen kylvetään. Osoittaja on määrä thyrospheres muodostunut kuoppaa kohti, ja nimittäjä on 5.000.

in vitro

serial johtamisella, thyrospheres kerättiin varovasti sentrifugoimalla 800 rpm 5 minuutin ja hajotettiin entsymaattisesti 0,05% trypsiini /EDTA. Dissosioidut Solut johdettiin 40 pm mesh suodattimia (BD Falcon Cell Siivilä, Franklin Lakes, NJ) poistamiseksi dupleteiksi tai kolmoset. Yhden solut maljattiin 5000 solua /kuoppa ultra-low-kiinnitys kuuden kuoppalevyillä tuottaa toissijainen thyrospheres. Kolme tällaista kierrosta serial passage tehtiin. Joissakin kokeissa palloja kerättiin seitsemän päivän kuluttua, trypsinoitiin osaksi yksisoluiset suspensiot ja sekoitetaan sitten matrigeelin /RPMI on 1:01 laimennus injektiota hiiriin.

RNA: n eristys ja qRT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin 1 x 10

6 solua kanssa RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA) ja käsiteltiin RNaasi-vapaata DNaasia (Qiagen). Kaksi mikrogrammaa kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen Thermoscript First Strand Synthesis System (Invitrogen, Grand Island, NY). Oligonukleotidi Alukkeiden sekvenssit (

Pax8

,

TTF1

,

TSHR

,

TG

,

NIS

ja

TPO

) on julkaistu muualla [24], [25]. MRNA kvantitoitiin kolmena kappaleena qRT-PCR on ViiA7 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR suoritettiin SYBR Green PCR Master Mix. Ihmisen GAPDH käytettiin taloudenhoito geeni aikana liitetyt.

In vivo

tuumorigeenisyystesti kokeita

Kahdeksan viikkoa vanhat naaraspuoliset NOD /SCID

Il2rg

– /-

hiiret saatiin Taconic Farms Inc. ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa suostumuksella Institutional Animal Care ja käyttö komitean Saint Louisin yliopiston School of Medicine. Ihon alle elinsiirrot, single solut suspendoitiin uudelleen 100 ui Matrigel /RPMI sisään 1:01 laimennus ja injektoitiin subkutaanisesti NOD /SCID

Il2rg

– /-

hiirillä. Tuumorimassa mitattiin kahdesti viikossa tunnustelu ja satulat, ja kasvainten tilavuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaan: (π /6) x suuri halkaisija x (pieni halkaisija)

2. Hiiriä seurattiin kolmesta viiteen kuukautta ulkonäkö ja kasvainten kehittymisen. Hiiret tapettiin, kun kasvaimet saavuttivat 1,5 cm

3.

serial passage, kasvaimet kerättiin, jauhettu, kollagenaasi-digestoituun ja johdettiin 40 pm mesh suodattimia, jotta saadaan yhden-solususpensio. Saatu solupopulaatio kutsuttiin ”toissijainen passage” ja viljeltiin kolmesta seitsemän päivän RPMI /10% FBS: ia ja sitten uudelleen ympätään NOD /SCID

Il2rg

– /-

hiirillä. Myöhemmät kasvaimet käytettiin useaan kertaan ATC solujen eristykseen ja sukupolven lisäksi sarjatuotannossa siirrostettiin ATC solujen enintään kolme kanavaa.