Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nuclear factor-erytroidisiin 2 P45 liittyvä tekijä 2 (Nrf2) on transkriptiotekijä, joka säätelee ilmentymistä monista solua suojaavien geenien. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että ekspressio Nrf2 tukahdutettiin eturauhasen kasvain siirtogeenisiä Adenokarsinooma Mouse Prostate (TRAMP) hiirillä. Vastaavasti, ilmaus Nrf2 ja induktio NQO1 merkittävästi myös tukahdutettiin tuumorigeenisiä TRAMP C1-soluissa, mutta ei ei-tuumorigeenisiä TRAMP C3-soluja. Tutkiminen promoottorialueen hiiren Nrf2 tunnistetun geenin CpG saari, joka oli metyloitu erityisiä CpG sivustoja eturauhasen TRAMP kasvain ja TRAMP C1-soluissa, mutta ei normaalissa eturauhasessa tai TRAMP C3 soluja, mikä näkyy bisulfiitti genomista sekvensointia. Reportteri analyysit osoittivat, että metylaatio näiden CpG-sivustojen dramaattisesti inhiboivat transkriptionaalista aktiivisuutta Nrf2-promoottorin. Chromatin immunopreceipitation (chip) määritykset paljasti lisäsi sitoutumisen metyyli-CpG: tä sitova proteiini 2 (MBD2) ja trimetyyli-histoni H3 (Lys9) proteiinien näihin CpG sivustoja TRAMP C1 solut verrattuna TRAMP C3 soluihin. Sitä vastoin sitova RNA Pol II ja asetyloitu histoni H3 Nrf2-promoottorin väheni. Lisäksi hoito TRAMP C1-solujen DNA: n kanssa metyylitransferaasin (DNMT) estäjä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) ja histonideasetylaasi (HDAC) estäjä trikostatiini A (TSA) palautti ilmentymistä Nrf2 sekä induktion NQO1 in TRAMP C1 soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen Nrf2 vaimennetaan epigeneettiseltä mukaan promoottorin metylaation liittyy MBD2 ja histonimodifikaation eturauhasen tuumorin TRAMP-hiirissä. Nykyinen havainnot paljastavat uuden mekanismin, jolla Nrf2 ilmentyminen vaimennetaan TRAMP eturauhassyövän, uutta tietoa roolista Nrf2 syövän synnyssä ja mahdollisille uusia suuntia havaitsemista ja eturauhassyövän ennaltaehkäisyyn.

Citation: Yu S, Khor TO, Cheung KL, Li W, Wu TY, Huang Y, et ai. (2010) Nrf2 Expression säännellään Epigeneettiset mekanismeja Eturauhassyöpä TRAMP Mice. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10,1371 /journal.pone.0008579

Editor: Andy T. Y. Lau, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu 13 syyskuuta 2009; Hyväksytty: 06 joulukuu 2009; Julkaistu: 05 tammikuu 2010

Copyright: © 2010 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää R01-CA118947 ja R01-094828 jotta A.-N. T. Kong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä, samoin kuin monet muut ikääntymiseen liittyvien syöpien, on ominaista lisääntynyt solunsisäinen oksidatiivinen stressi [1], [2]. Krooninen oksidatiivisen stressin ja siihen liittyvien patologisten tilojen kuten tulehdus ja aineenvaihdunnan häiriöitä on oletettu ajaa somaattisten mutaatioiden ja neoplastisen transformaation, mikä voisi olla tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen eturauhassyöpä [3]. Lisääntynyt oksidatiivisen stressin tai reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot voivat johtua lisääntyneestä ROS sukupolvi ja /tai vähentynyt antioksidantti kapasiteettia ja tai ROS vieroitus. Äskettäin heikentynyt antioksidantti puolustusjärjestelmää karsinogeneesis- eturauhassyövän on saamassa lisääntynyt huomiosta.

Matkapuhelinverkko antioksidanttipuolustuksen käsittää akun antioksidantti /detoxifying entsyymejä ja proteiineja, kuten superoksididismutaasi (SOD), katalaasi, hemeoxgenase ( HO), UDP-glukuronosyylitransferaaseja (UGT), glutationiperoksidaasi (GPX), glutationi-S-transferaasit (GST), ja NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi (NQO) [4]. Down-regulation of GST DNA metylaatio näyttää olevan melko yleisiä ihmisen eturauhassyövän, että se on kehitetty diagnostisen markkerin [5]. Ilmaisu ja toimintaa SOD, katalaasi ja GPX on raportoitu laski prostatakarsinoomassa kudoksissa sekä plasman ja punasolujen [6] – [8]. Viimeaikaiset tutkimukset laboratoriossamme ja muut ovat havainneet, että ekspressiotasot SOD, UGT1A1, NQO1 ja useat GST perheen geenit merkittävästi tukahdutettiin eturauhaskasvaimissa siirtogeenisissä Adenokarsinooma Mouse Eturauhasen (TRAMP) hiirissä [9] – [11]. Vaikka alassäätöä GST entsyymien ihmisen eturauhassyövän on liitetty promoottori hypermetylaatiota GST geenien [5], [12]; promoottori DNA hypermetylaation ei näytä aiheuttavan GST geeni sorto TRAMP kasvaimissa [9]. Sen sijaan, alas-säätely Nukleaaritekijä-erytroidisiin 2p45 (NF-E2) liittyvien kertoimella 2 (Nrf2), keskeinen säätelijä solujen antioksidantti entsyymien, voi olla vastuussa transkription tukahduttamista GST ja muut vaiheen II myrkkyjä entsyymi geenejä [11 ].

Nrf2 on helix-loop-helix perus leusiinivetoketjun transkriptiotekijä, joka säätelee ilmentymistä monista vaiheen II myrkkyjä ja antioksidantti entsyymien sitoutumisen välityksellä antioksidantti-vaste-elementti (ARE) promoottorialueella [ ,,,0],4]. Knockout of Nrf2 hiirillä merkittävästi kumosi indusoituvan ilmentymisen ARE-välitteisen detoxifying ja antioksidantti entsyymejä, ja sulatettu nämä hiiret erittäin alttiita karsinogeeneja ja /tai oksidatiivisen vahingoista [13], [14]. Näiden yhteydessä on aiemmin olemme havainneet, että proteiini ekspressiotasot Nrf2 ja Nrf2-kohdegeeni hemin-oksigenaasi-1 (HO-1) oli vaimentunut ihon kasvaimet hiiren ihon karsinogeneesissä malli [15]. Vastaavasti ilmaus Nrf2 sekä sen alavirran kohdegeenien kuten UGT1A1, GSTM1 ja NQO1 todettiin vähitellen alassäädetty eturauhastuumoreissa kanssa etenemisen eturauhasen tuumorigeneesiä TRAMP hiirissä [10]. Frölich et ai. raportoi äskettäin ilmaus Nrf2 ja GST mu perheen geenit ovat pienentyneet merkittävästi TRAMP eturauhasen kasvain, ja liittyy tämä ilmiö lisääntyneeseen oksidatiivisen stressin ja DNA-vaurioita eturauhassyövässä. Meta-analyysi kudosilmentämisen profilointi tietoja Oncomine tietokannasta (www.oncomine.org) ehdotti, että ilmaukset Nrf2 ja useiden GST mu geenit ovat myös vähitellen alassäädetty ihmisen eturauhasen syövissä [11].

transkriptio Nrf2 on äskettäin osoitettu säänneltävä aryylihiilivetyreseptori (AhR) ja Nrf2 itse [16], [17]. Kuitenkin tällä hetkellä hyväksytty paradigma Nrf2 sääntelyn näyttää saavutetaan pääasiassa kautta translaation jälkeisiä mekanismeja. Sinänsä Nrf2 on toiminnallisesti tukahdutti Kelch kaltainen Erytroidispesifiset-soluista peräisin proteiinin CNC homologia (ECH) -Associated Protein 1 (Keap1), joka sitoutuu ja sitoo Nrf2 sytoplasmassa johtaa hajoamista Nrf2, ja siten ehkäisee Nrf2 tumaansiirtymiseen ja transaktivaatio sen kohdegeenien [18]. Kun haasteita oksidatiivisen tai elektrofiilisellä rasitukset voi liittyä mahdolliseen muuttamiseen ja kriittisten kysteiinitähteiden Keap1 ja tai Nrf2 itse yhdessä fosforylaatio kinaasien, Nrf2 vapautuu KEAP-1, translokoituu tumaan, dimerisoituu pieniä Maf proteiineja, sitoutuu ARE ja kopiointia aktivoi Nrf2-ARE kohdegeenien [4]. Tähän mennessä ei ole selvää, kuinka ilmaus Nrf2 ihmisen eturauhassyövän tai TRAMP hiiren kasvain on tukahdutettu.

Epigeneettiset tai epigenomic mekanismeja, erityisesti DNA: n metylaatio, on usein liitetty muutokset geeni- ilmentyminen eturauhassyövässä [19], [20]. Koordinoitu hypermetylaatiota APC ja GSTP1 alussa karsinogeneesissä on hyödynnetty mahdollisina diagnostisia markkereita havaitsemaan eturauhassyövän [21]. Lisäksi muutos DNA metylaatio profiilien on yhteydessä syövän etenemisen [20]. DNA: n metylaatio, yhdistettynä histonimodifikaation, vaikuttaisi vuorovaikutukset promoottorit kriittisten geenien kanssa transkription korepressoreiden ja koaktivaattoreiden johtaa muutoksiin geeniekspressioiden, mikä voisi olla yksi niistä voimista eturauhasen syövän synnyn. Hiljentäminen useiden geenien DNA: n metylaatio on raportoitu TRAMP eturauhasen kasvaimia ja solulinjoissa, jotka ovat peräisin TRAMP eturauhasen kasvaimista [22] – [24]. Estämällä DNA-metyylitransferaasi-aktiivisuuden 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) on osoitettu estävän eturauhasen tuumorigeneesiä TRAMP-hiirissä [25]. Lisäksi, ekspressio Keap1 on raportoitu säätelevän DNA: n metylaation keuhkosyövän [26]. Tässä tutkimuksessa, ensin tunnistaa CpG saari ylävirran 5′-reunustava alue hiiren Nrf2 geeni seuraa kuulusteluun DNA metylaatiostatuksen koko CpG-saarekkeen kautta bisulfiitin genomista sekvensointia. Olemme havainneet, että tietyt CpG sivustoja distaalinen alueella CpG-saarekkeen oli hypermetyloitunut TRAMP tuumorikudoksissa sekä tuumorigeenisiä TRAMP-C1 ja C2 soluja, mutta ei normaalissa eturauhaskudoksessa ja ei-tuumorigeeniset TRAMP-C3-soluja. Hyödyntämällä metyloitu reportterianalyysi, kromatiinin immunosaostus (chip) määritys ja hoitoja trikostatiini A (TSA) /5-atsa, me avulla on saatu näyttöä siitä, että ilmaus Nrf2 on epigeneettiseltä säädellään kehityksen aikana eturauhasen kasvaimia TRAMP hiirillä. Nrf2 ilmentyminen vaimeni metylaatio tiettyjen CpG sivustoja ja tämä liittyi rekrytointi MBD2 ja trimetyyli-histoni H3 (Lys9) muuttamisesta Nrf2 geenin promoottorin eturauhasen kasvain TRAMP hiirillä.

Tulokset

hypermetylaatiota Erityiset CpG sivustot CpG Island Hiiren Nrf2 Gene

genominen sekvenssi Nrf2 geenin (NC_000068.6: 75544698-75513576 Mus musculus kromosomissa 2, viite kokoonpano (C57BL /6J), mukaan lukien 2 kb 5′-ylävirran sekvenssi) analysoitiin CpG-saarekkeen käyttäen CpG-saarekkeen Finder (https://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Koska useat mRNA variantit eri transkription aloituspaikkoja (TSS) on raportoitu kirjallisuudessa [16], [27], [28], siis esillä olevassa tutkimuksessa määrittelemme translaation aloituskohdan (TIS) kuin kanta 1 välttämiseksi mahdollinen sekaannus. CpG island välillä havaittiin -1175 ja +1240, jossa on GC-pitoisuus 61,53%, CpG havaittu /odotettu-suhde 0,66 ja yhteensä 150 CpG: t. CpG island sisältää hiiren Nrf2-promoottori, ensimmäinen eksoni ja osa ensimmäisen intronin (kuvio 1A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun käytetään muita kriteerejä ja algoritmi (https://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, tuloksia ei ole esitetty). 10 sarjaa bisulfiitin genomisen sekvensoinnin (BGS) alukkeet suunniteltiin käyttämällä BiSearch web-palvelimen (https://bisearch.enzim.hu/, [29]), joka kattaa 5′-reunustavan alueen ulottuu -1226-844, että hiiren Nrf2 geeni (taulukko S1). Bisulfiitti-muunnetaan genomista DNA on peräisin 12 kouraantuntuva eturauhasen kasvaimia 24 viikon ikäisiä TRAMP hiirille ja 10 normaalisti eturauhaskudoksiin C57BL /6J hiiriä käytettiin malleina. Kuten kuviossa 1B on esitetty, vaikka suurin osa CpG-saarekkeen on tuskin metyloitu, ensimmäiset 5 CpG-sivustoja havaittiin hypermetyloitunut (96%), eturauhasen kasvaimissa verrattuna ilmeisesti normaalissa eturauhasessa kudoksissa (4%). Edustaja sekvensointi kromatografit näkyy ensimmäinen 5 CpG: t on eturauhassyövän ja normaalissa eturauhasessa on esitetty kuviossa S1. Seuraavat 10 CpG: t, jotka on erotettu kahdella CpG vapaiden välien (-1131–1060 ja -886–798) näytetään myös ero metylaatiostatuksen kasvaimissa (34%) verrattuna normaaleissa kudoksissa (2%). Lisäksi toinen alue sijaitsee ensimmäisen intronin näyttää olevan harvaan CpG-metyloitu eturauhassyövän (4,5%).

(A) CpG-saarekkeen todettiin 5′-reunustavan alueen hiiren Nrf2-geenin , joka ulottuu asemasta -1175-1240 kanssa translaation aloituskohdan asetetaan asentoon 1. kattamien sekvenssien bisulfiitti genominen sekvensointi (-1226-844) ja sisältävät metyloituja CpG: t on esitetty kaavamaisesti CpG tarkoitetuissa tiloissa pystyviivoilla. (B) toinen metylaation ja laajuudet CpG sivustoja edistäjä Nrf2 geenin TRAMP eturauhasen kasvain ja ilmeisesti normaalissa eturauhasessa määritettiin bisulfiitti genomista sekvensointia kuvatulla Material Menetelmät. Mustat pisteet osoittavat metyloitu CpG: t ja avoimet ympyrät osoittavat metyloitumattomien CpG: t. (C) Metylointi kuviot ja laajuudet CpG sivustoja promoottori Nrf2-geenin TRAMP C1 ja C3-soluja määritettiin. CpG: t järjestyksessä välillä 296-594 eivät ole näkyvissä, koska metylaatio on merkityksetön.

TRAMP C1, C2 ja C3 solulinjat ovat peräisin heterogeeninen kasvain 32 viikon TRAMP hiiren [30 ]. Vaikka TRAMP C1 ja C2-solut ovat tuumorigeenisia kun oksastettu syngeeninen C57BL /6J isännät, TRAMP C3 solut eivät ole. Genomi-DNA C1 ja C3-soluissa oli bisulfiitti-sekvensoitiin kuten edellä havaita metylaatiostatuksen CpG saaren Nrf2-geenin. Yllättäen metyloitu CpG ”hot spot”, kuten edellä on todettu, että TRAMP eturauhassyövän myös metyloitavaa tuumorigeenisia C1 soluissa, mutta ei ei-tuumorigeenisiä TRAMP C3 soluihin (kuvio 1 C).

metylointi First 5 CpG: t suppressoi merkitsevästi transkriptionaalista aktiivisuutta Mouse Nrf2 promoottori

tutkimiseksi toiminnallista roolia metylaation spesifisten CpG sivustoja, varsinkin ensimmäinen 5 CpG: t on CpG-saarekkeen, lusiferaasin Toimittajat vetämänä Nrf2 promoottori tai ilman ensimmäisen 5 CpG: t (nimetty -1367 ja -1065, vastaavasti) rakennettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (kuvio 2A). Plasmidit metyloitiin käyttäen M. SSSI CpG metyylitransferaasi

in vitro

ja metylaatiostatuksen varmistettiin Hpal /HhaII ruoansulatus (kuva S2). Kuten on esitetty kuviossa. 2B -1065 Nrf2 promoottori, joka oli raportoitu aiemmin [17], [28], lisäsi huomattavasti lusiferaasiaktiivisuutta noin 200 taittuu. Sen sijaan -1367 Nrf2-promoottori oli vähemmän voimakas transkriptionaalinen aktiivisuus (-67 taittuu). Tärkeää on,

in vitro

CpG-metylaation reportteri-konstrukti johti dramaattiseen laskuun transkriptionaalisen aktiivisuuden -1367 Nrf2-promoottorin (84%: n lasku); kun taas aktiivisuus -1065 promoottorin väheni vain 23,4% CpG-metylaation. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Hep G2 hepatoomasolujen ja ihmisen alkion munuaisen HEK 293-soluissa (kuvio S3).

(A) rakenne lusiferaasi Toimittajat on esitetty kaavamaisesti. Nrf2 promoottorit kanssa (-1367-1) tai ilman (-1065-1) ylimääräiset sekvenssi, joka sisältää ensimmäisen 5 CpG: t monistettiin hiiren genomisesta DNA: sta ja insertoitiin pGL 4.15 vektoriin. Saatu toimittajat nimettiin pGL-1367 ja pGL-1065, vastaavasti. (B) pGL-1367 tai pGL-1065 toimittajat, joko metyloitu CpG-metyylitransferaasi tai ei, kotransfektoitiin kanssa pGL 4,75 vektori, joka sisältää Renilla reniformis lusiferaasigeeni ohjaa CMV-promoottori osaksi TRAMP C1 soluihin, ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin 24 tunnin kuluttua. Transkription toiminta Kunkin konstruktioita laskettiin normalisoimalla tulikärpäsen lusiferaasi toimintaa vastaava Renilla lusiferaasiaktiivisuudet, ja ovat edustettuina poimuihin induktion verrattuna aktiivisuuteen tyhjän pGL 4,15 vektori. Arvot ovat keskiarvoja ± SD neljästä erillisestä näytteistä.

hypermetyloitunut CpG Island liittyi metyyli-CpG-Binding Domain (MBD2) ja histonimodifikaation, vaikutus on palautuva 5-atsa /TSA hoito

tukahduttaminen geenin ilmentymisen CpG metylaatio saadaan yleensä MBD proteiineja, jotka sitoutuvat metyloidut DNA johtaa rekrytointiin chromatin remontin ja transkription repressori kompleksit [31]. Esillä olevassa tutkimuksessa, ChIP määrityksiä käytettiin tutkimaan proteiineja, joita voitaisiin mahdollisesti liittyy Nrf2 promoottorin TRAMP C1 ja C3-soluja. Perustuen metylaatiostatuksen Nrf2 promoottorin alukesarjoista suunniteltiin kattamaan ensimmäiset 5 CpG: t ja TSS havaita yhdistys määritellyn DNA-sitovia proteiineja sekä RNA-polymeraasi II (Pol II). Spesifisyys ChIP määritykset varmistettiin epäspesifinen IgG joka ei vedä alas mitään. Positiivisena kontrollina, β-aktiinin promoottori on yhtä liittyy Pol II C1 ja C3 (kuvio 3A). Sitominen Pol II Nrf2 geeni TSS oli merkittävästi vähentynyt C1 soluissa verrattuna C3 soluihin, mikä osoittaa tukahdutti transkriptio Nrf2 C1 soluissa (kuvio 3A B). Suostumuksella tämän havainnon, sitoutuminen MBD2 ja tri-metyloitu histoni 3-Lys9, (H3K9me3) on metyloitu CpG: t vuonna Nrf2 promoottori oli suurempi C1 soluissa kuin C3 soluissa, kun taas yhdistys asetyloitua histoni 3 (H3Ac) näytössä käänteinen kuvio (kuvio 3A B). Metyyli CpG sitova proteiini 2 (MeCP2) ja nisäkkään Sin3A (mSin3A) testattiin myös niiden sitoutuminen tämän Nrf2-promoottori; kuitenkaan mitään havaittavaa sitoutuminen havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

(A) ChIP määritys suoritettiin sitoutumisen havaitsemiseksi osoitti proteiinien erityisiin alueisiin Nrf2-geenin silloitetun ja immunosaostettiin TRAMP C1 ja C3-soluja. Tulokset 3 itsenäistä koetta kvantitoitiin densitometrillä, kuten on esitetty (B). (C) TRAMP C1-soluja käsiteltiin ajoneuvon, 5-atsa tai 5-atsa + TSA, kuten on kuvattu, sitten solut altistettiin ChlP määritystä. Tulokset 2 riippumattomasta kokeesta kvantitoitiin densitometrillä, kuten on esitetty (D). ChIP-määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja amp; Menetelmät, joissa käytetään vasta-aineita Pol II, MBD2, H3K9m3 ja AcH3. 3 sarjaa siru alukkeita (taulukko S2), jossa Nrf2P1 kattaa ensimmäiset 5 CpG: t (-1190–1092) on CpG-saarekkeen ja Nrf2P2 kattaa alueen lähellä TSS (-62-20). Epäspesifinen IgG käytettiin negatiivisena kontrollina ja sitoutumisen Pol II P-aktiini-promoottorin avulla tarkistetaan tehokkuuden ChIP määrityksessä. Kokeet toistettiin vähintään kahdesti samanlaisin tuloksin.

metylaatiostatuksen DNA säätelee DNA metyyli-transferaasit (DNMTs) ja 5-atsa on DNMT inhibiittori, käytetään usein tarkastelemaan vaikutukset DNA: n metylaatio [32]. Kuten kuviossa 3C D, 5-atsa hoidossa C1-solujen vähentää sitoutumista MBD2 ja H3K9me3 että Nrf2 promoottori, kun taas H3Ac esiintyy havaittavaa vaikutusta. Kuitenkin yhdistelmähoito C1 soluja 5-atsa ja histoni deactylase (HDAC) estäjä, TSA, lisää olennaisesti sitoutuminen H3Ac että Nrf2 promoottori, ja edelleen vähentää siteet MBD2 ja H3K9me3 että Nrf2 promoottori. Yhdenmukainen edellä esitetyt tulokset, rekrytointi Pol II Nrf2 promoottori lisää myös vastaavasti, kun taas Pol II: n sitoutumisen P-aktiini-promoottori ei muuttunut (kuvio 3C).

transkriptionaalista induktio Nrf2 ja NQO- 1 TRAMP Cell Lines korreloi CpG saarten metylaatiostatuksen ja voidaan palauttaa 5-atsa /TSA hoito

ja muut ovat aikaisemmin raportoitu, että ilmaus Nrf2 ja sen kohdegeenien vaimennetaan TRAMP eturauhaskasvaimissa [10], [11]. Marvis et ai., Oli raportoitu, että ilmaisu GST perheen geenien tukahdutettiin TRAMP-C2-soluja ja 5-atsa ja TSA hoito voisi palauttaa ilmaisun [9]. Tässä me tutkimme ilmentymisen Nrf2 ja yksi sen alavirrassa oleva kohde geenien NQO1 TRAMP-C1 ja C3-soluja. Kuten kuviossa 4A on esitetty, mRNA: n taso Nrf2 on huomattavasti alhaisempi C1 soluissa kuin C3-soluissa. Ilmentyminen NQO1 oli helposti indusoitiin TBHQ, klassinen Nrf2-agonisti, C3-soluissa, kun taas tällaista induktio on pyöristetty C1-soluissa (kuvio 4A & C). Hoito C1 solujen 5-atsa ja TSA vaatimattomasti kunnostettu Nrf2 ilmaisun ja paransi merkittävästi induktion NQO1 mukaan TBHQ. Kuitenkin hoito C3 soluja samoissa olosuhteissa ei esiintynyt vaikutusta ekspression Nrf2 tai NQO1 (kuvio 4A, B & C). Western-blottaus suoritettiin tutkia proteiinin ekspressiotasot Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac ja H3K9me3 (kuvio 4D). Proteiinin tasot Nrf2 ja NQO1 oli pienempi C1-soluissa kuin C3-soluissa, ja 5-atsa ja TSA hoito parantaa induktion NQO1 proteiinin TBHQ. Vaikka 5-atsa ja TSA hoito ei lisätä pohjapinta tasoa Nrf2-proteiinin käsittelyä merkittävästi täydennetty TBHQ aiheuttama Nrf2-proteiinin ilmentyminen. TSA hoito lisäsi voimakkaasti Asetyloitu histoni 3-proteiinin, kun ei ollut vaikutusta histoni 3 metylaatiostatuksen. Mielenkiintoista on, että vaikka proteiinin taso MBD2 ei vaikuttanut 5-atsa ja TSA hoito, se oli paljon suurempi C1 soluissa kuin C3-soluissa (kuvio 4D).

TRAMP C1 ja C3-soluja käsiteltiin 2 uM 5-atsa, 200 nM TSA, tai 1 uM 5-atsa plus 100 nM TSA 60 tuntia tai 48 tuntia, jota seuraa inkubaatio, kun läsnä oli 5 uM TBHQ edelleen 12 tunnin ajan. Käsittelyjen jälkeen solut kerättiin kokonais- proteiini- tai RNA uuttoja. (A) mRNA tasot Nrf2 ja NQO1 määritettiin RT-PCR: llä, jossa GAPDH palvelee sisäisenä kontrollina, ja tulokset 3 erilliselle kokeelle kvantitoitiin densitometrialla ja tulokset on esitetty B ja C. (D) proteiini tasot Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 ja H3Ac määritettiin Western-blottauksella, aktiini latauskontrollina. Jokainen koe toistettiin ainakin kahdesti samanlaisin tuloksin.

Keskustelu

Edellinen havaintoja useista laboratorioista lukien laboratoriossamme ovat osoittaneet, että Nrf2 olennainen rooli kehitettäessä eri syöpiä [ ,,,0],33]. Nrf2 säätelee ilmaus antioksidantti ja vaiheen II detoxifying entsyymejä kuten NQO1, HO-1: n ja GST [33]. Siksi valvontaa transkription aktivaation Nrf2 ja Nrf2-kohdegeenien näyttäisi olevan tärkeä homeostatic mekanismi, joka suojaa solu- tai muiden vammojen johtui oksidatiivisen stressin [33]. Nrf2 puutos voi johtaa vika solujen puolustusjärjestelmää vastaan ​​oksidatiivisen stressin, aiheuttaa mahdollisesti syöpää aloittamista, edistäminen ja eteneminen [34]. Tukahdutettu ilmaus antioksidantti ja detoxifying entsyymejä, kuten GSTP1 eturauhasen syöpä on laajasti tutkittu [2], [5]. Kuitenkin rooli Nrf2 eturauhassyövässä eivät ole saaneet riittävästi huomiota viime aikoihin asti [10], [11].

Frölich et al. raportoitu, että alas-säätely Nrf2 näyttää olevan vastuussa alennettua GST ilmaisua, kohonnut oksidatiivisen stressin ja DNA-vaurioita eturauhasen tuumorigeneesiä TRAMP hiirissä [11]. Olemme äskettäin havainneet, että ilmaus Nrf2 sekä Nrf2-kohdegeenien on vähitellen alassäädetty etenemisen aikana eturauhassyövän TRAMP hiirillä [10]. Edellinen analyysi verkossa ihmisen eturauhasen geenien ilmentyminen aineistoja osoittivat, että ilmentyminen Nrf2 ja GST [11] sekä NQO1 vähitellen vähenee aikana ihmisen eturauhasen syövän synnyn (kuva S4). Lisäksi on raportoitu, että useat GST geenejä säädellä vähentävästi ensisijainen muttei metastaattisessa TRAMP kasvaimissa [9]. Nykyisessä tutkimuksessa havaittiin, että ilmaus Nrf2 ja induktio NQO1 vaarantunut tuumorigeenisiä TRAMP C1-soluissa, mutta ei ei-tuumorigeenisiä TRAMP C3-soluja (kuvio 4A). Tämä tukahduttaminen Nrf2 ilmaisun ja Nrf2-kohdegeenin NQO1 molemmissa TRAMP solulinjojen sulkisi pois sitä mahdollisuutta, että Nrf2 ilmaisua vaikuttaisi SV40 siirtogeenin, koska nämä TRAMP solulinjat eivät ilmennä SV40 siirtogeenin [30].

DNA: n metylaatio on osallisena hiljentäminen GSTP1 geenin ihmisen eturauhassyövän, ja vastaavasti DNA-metylaatio hiljentäminen useiden muiden geenien myös osallisena TRAMP eturauhassyövän [5], [23], [24]. Kuitenkin kiinnostavasti MassARRAY Quantitative DNA Metylointi Analyysit (MAQMA) analyysi 5′-alueen useiden GST geenien ei ollut mitään merkittäviä eroja normaalin eturauhasen epiteelisolujen ja eturauhasen kasvaimen TRAMP-hiirissä [9]. Viime aikoina useat raportit osoittavat, että molemmissa TRAMP ja Rb – /- eturauhaskasvaimissa, Rb /E2F-riippuvaisen lisäystä DNMT1 ilmaisun ja metylaation toimintaa [25], [35]. Hypermetylaation Nrf2 promoottori hallitsi käyttäen MSP ja että 5-atsa hoito ei vaikuttanut Nrf2 lauseke (tietoja ei esitetty) [11]. Analysoimme 5′-reunustavan alueen Nrf2-geenin ja määritettiin CpG-saarekkeen, joka ulottuu asentoon -1175 (kuvio 1A). Käyttämällä bisulfiitti sekvensointi, joka olisi erityinen tunnistamaan CpG metylaation ja paljastaisi lisätietoja DNA: n metylaatio kuin MSP, huomasimme, että ensimmäinen 5 CpG: t että CpG-saarekkeen ovat hypermetyloitunut TRAMP eturauhasen kasvaimia ja kasvaimia TRAMP C1-soluissa, mutta ei normaalissa eturauhasessa kudoksissa ja ei-tuumorigeeniset TRAMP C3 soluihin (kuvio 1 B). Yllättäen nämä 5 CpG: t sijaitsevat lähellä aikaisemmin raportoidun Nrf2-promoottori [17]. Näin ollen, metylaatiostatuksen nämä erityiset CpG: t näyttää korreloivan tuumorigeenisyyden kanssa sekä Nrf2 ilmaisun ja NQO1 induktio (kuviot 1 ja 4). Erityisesti, samanlaisen erityisiä metylaation distaalisen CpG-saarekkeen on myös havaittu Keap1 geenin keuhkosyövän soluihin [26]. On tärkeää huomata, että jotkut nykyiseen havainnot näyttävät olevan jossain määrin ristiriitaisia ​​tuloksia on raportoitu aiemmin [11], mutta aiempia havaintoja laaja alas-säätely Nrf2 ja GST aikana eturauhasen syövän etenemisen TRAMP hiirillä [11], ovat johdonmukaisia meidän nykyinen tuloksia.

määrittämiseksi toiminnallista roolia metylaation näiden 5 CpG: t tukahduttamiseen Nrf2 ilmentymismäärä, lusiferaasin Toimittajat on Nrf2 promoottorin kanssa tai ilman näitä 5 CpG: t rakennettiin (kuvio 2A). Nrf2-promoottori on hallussaan hyvin GC-rikas ei-kanoninen promoottori, joka ei sisällä TATA eikä CCAAT box [28], mutta tämä Nrf2-promoottorin voimakkaasti aktivoitua transkriptiota lusiferaasireportterigeenin (kuvio 2B). Mielenkiintoista on, että lisäämällä sekvenssien -1065–1367 näyttää olevan tukahduttavaa transkription aktiivisuutta Nrf2-promoottorin (kuvio 2B). Tällaiset tukahduttavaa sarja voisi toimia rekrytoimalla erityisiä repressoiva tekijät [36], mutta tarkka mekanismi osuus tästä tukahduttavia tehtävä tämä sekvenssin vaikkei metylaation vaatisi lisätutkimuksia. Kuitenkin, kun toimittajat metyloitiin

in vitro

CpG metyylitransferaasi, lusiferaasireportteri aktiivisuutta Nrf2 promoottorin lisäksi sekvenssi, joka sisältää 5 CpG: t (pGL-1367) väheni noin 84%. Sen sijaan, metylaatio reportteri ilman ylimääräistä sekvenssiä johti noin 23%: n vähennys (kuvio 2B). Tämä johtuu todennäköisesti raskas metylaation koko konstruktin, kuten lusiferaasigeeniin (mutta lisätutkimuksia olisi tarpeen todistaa tämän). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että ylimääräisen 5 CpG: t (-1065–1367) voisi olla ratkaiseva merkitys metylaatio riippuva tukahduttaminen Nrf2 promoottorin aktiivisuutta.

rooli CpG metylaation tukahduttamaan Nrf2 ilmaisun ja aktivointi oli testattu käsittelemällä 5-atsa in TRAMP soluissa. 5-atsa on aiemmin osoitettu pystyä estämään aikaisin taudin etenemiseen, viivästyttää androgeeni-riippumaton taudin ja parantavat eloonjäämistä TRAMP-hiirissä [25], [37]. Lisäksi vaiheessa ja fenotyypin erityisiä CpG-saarekkeen metylaation ja DNA metyylitransferaasi ilme on hyvin dokumentoitu aikana eturauhassyövän etenemistä TRAMP hiirillä [38], [39]. Nämä julkaistut havainnot viittaavat merkitystä tällä TRAMP järjestelmä kysellä mahdollista roolia epigeneettiset muutokset eturauhasen syövän synnyn. 5-atsa hoidossa TRAMP C1-solujen hieman korkeampi mRNA tasolla Nrf2, kun taas yhdistetyt hoidot 5-atsa ja TSA indusoi näkyvämpi lisäys Nrf2 (kuvio 4A). Tämä tulos on yhdenmukainen raportin Mavis et al., Jossa yhdistetään 5-atsa ja TSA hoitojen merkittävästi parannettu ilmaus GST geenien [9]. Proteiini taso Nrf2 TRAMP-C1-soluja pysyi muuttumattomana joko 5-atsa tai 5-atsa /TSA hoitoja, kuitenkin lisäämällä voimakas Nrf2-aktivaattori TBHQ lisäisi kertyminen Nrf2-proteiinin (kuvio 4B). Kuten odotettua, induktio NQO1 mRNA: ta ja proteiinia tasot näkyvät samansuuntaisesti kanssa, Nrf2-proteiinin. On erittäin todennäköistä, että koska Nrf2 signalointi ensisijaisesti säädellään translaation jälkeiset mekanismit, ei haasteet Nrf2-aktivaattoreita, kuten TBHQ, Nrf2-proteiini nopeasti luovutettiin by proteosomin riippuvaisen hajoaminen [18]. Tarkka syy, miksi TBHQ tarvitaan NQO1 induktioon vaatisi lisätutkimuksia.

määritellä tarkemmin molekyylitason mekanismi, jonka erityisiä CpG-metylaation tukahduttaa Nrf2 ilme, siru määritykset suoritettiin. Tuloksena osoittaa, että sitoutumisen MBD2 ja H3K9m3 erityisiin CpG: t oli huomattavasti korkeampi TRAMP C1 soluissa kuin TRAMP C3-soluissa korreloi siihen, että CpG: t oli minimaalisesti metyloitu TRAMP C3-soluissa (kuvio 3A). Sen sijaan, AcH3 näkyy vastakkainen sitovia kuvio sama CpG: t sekvenssin TRAMP C1-soluissa verrattuna TRAMP C3-soluja, ja samoin sitoutuminen Pol II transkription aloituskohdasta osoitti samanlaista mallia kuin AcH3 (kuvio 3A). Nämä metylaatio riippuva yhdistysten korepressoreiden voitaisiin moduloida 5-atsa ja TSA hoitoja ja tuloksemme (kuvio 3B) korreloivat erittäin hyvin transkription tasoa Nrf2 (mRNA-tasolla) näissä kahdessa solulinjassa (kuvio 4A). MBD2 on raportoitu välittävän epigeneettiset vaiennettu 14-3-3σ TRAMP C1 soluissa ja ihmisen LNCaP eturauhasen solujen [24], ja sen on osoitettu olevan osallisena transkription tukahduttaminen GSTP1 MCF-7 rintasyöpäsolujen [40] . MBD2 ja muut MBD proteiinit sitoutuvat metyloidut CpG: t ja rekrytoida corepressor komplekseja, jotka sisältävät HDAC, kromatiinin remodeling proteiineja sekä muita proteiineja johtaa tukahduttaminen ilmentymisen hypermetyloitunut geenien [31]. Mielenkiintoista, proteiini taso MBD2 oli paljon suurempi TRAMP C1 soluissa kuin TRAMP C3 soluissa (kuvio 4A), mikä viittaa mahdolliseen yhteiseen MBD2 välittämää epigeneettisellä tukahduttaminen Nrf2 TRAMP C1 soluissa. Sitä vastoin proteiini taso AcH3 oli ilmeisesti pienempi TRAMP C1 soluissa kuin TRAMP C3-soluissa, mutta on kasvanut valtavasti TSA käsittely (kuvio 4D). Koska ilmaus MBD2 olisivat riippuvaisia ​​HDAC toimintaa, meidän edellä tulokset olisivat mahdollisesti selittää vaatimus HDAC-estäjien jotta tehokkaasti moduloimaan korepressoreiden sitovia ja maksimaalisesti palauttaa reexpression on Nrf2 sekä induktion NQO1 TRAMP C1 soluissa. Lisäksi, kun tämä tukahduttava sekvenssi, joka sisältää ylimääräisen 5 CpG: t analysoitiin edelleen käyttämällä transkription Elements haku System (TESS, https://www.cbil.upenn.edu/tess), joka perustuu Transfac V6.0-tietokannan useiden transkriptiotekijän sitoutumiskohdat tunnistettiin, mukaan lukien sitovat sivustoja E2F1-p107: n ja NF-E2 (tuloksia ei ole esitetty).