Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisäkilpirauhashormonin kaltainen proteiini (PTHrP) on hallussaan erilaisia ​​fysiologisia ja kehitykseen toimintoja ja tunnetaan myös helpottaa etenemistä monia yhteisiä syöpien, erityisesti niiden luuston hyökkäystä, ensisijaisesti lisäämällä luun resorptiota. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää FTHrP voisivat edistää epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), prosessi osallisina syövän kantasoluja, jotka on kriittisesti mukana syövän eteneminen ja metastaasit. EMT havaittiin DU 145 eturauhasen syöpäsolujen vakaasti yli-ilmentävät joko 1-141 tai 1-173 isoformin PTHrP, jossa oli säätelyä Etana ja vimentiinista ja downregulation E-kadheriinin suhteessa vanhempien DU 145. Sitä vastoin päinvastainen vaikutus havaittiin PC-3 syöpäsolujen joissa korkeita FTHrP tippuu alas kautta lentiviral siRNA transduktio. Lisääntynyt kasvaimen etenemistä havaittiin FTHrP yliekspressoivia DU 145 solua, kun taas vähentynyt etenemisen havaittiin FTHrP-pudotus PC-3-solut. PTHrP-yliekspressoivassa DU 145 muodostuu suurempia kasvaimia, kun istutettu orthoptopically nude-hiiriin, ja yhdessä tapauksessa johtanut selkärangan etäpesäkkeitä, vaikutusta ei havaittu joukossa hiiriä injektoitiin vanhempien DU 145 soluja. PTHrP-yli-ilmentävät DU 145 soluja myös aiheutti merkittävää luun tuhoutumisen kun ruiskutetaan sääriluiden nude-hiirten, kun taas vanhempien DU 145 solua aiheuttanut juurikaan mitään tuhoa luun. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että FTHrP voi työskennellä läpi EMT edistää aggressiivinen ja metastaattinen fenotyypin eturauhassyöpä, koulutusjakson merkitystä syövän kantasoluja. Siten jatkuva pyrkimys valottaa reittejä mukana FTHrP aiheuttama EMT sekä kehittää keinoja kohdistaa FTHrP signalointi voi johtaa tehokkaampia hoitomuotoja eturauhasen syöpä.

Citation: Ongkeko WM, Burton D, Kiang A, Abhold E, Kuo SZ, Rahimy E, et al. (2014) lisäkilpirauhashormonin kaltaisen-proteiini Edistää epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon eturauhassyövässä. PLoS ONE 9 (1): e85803. doi: 10,1371 /journal.pone.0085803

Editor: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2013 Hyväksytty: 02 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: Veterans Administration kunniapalkinnon (LJ Deftos) kannatti tätä hanketta (https://www.research.va.gov/services/csrd/merit_review.cfm # .UcI2KPY-UCG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat julistaa, että vaikka Robert M. Hoffman on sidoksissa AntiCancer, Inc., ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden ja kaikki kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja.

Johdanto

Lisäkilpirauhashormonin kaltainen proteiini (PTHrP) hallussaan erilaisia ​​fysiologisia ja kehitykseen toiminnot, mutta tunnetaan myös helpottaa etenemistä moniin syöpiin, mukaan lukien eturauhassyöpä. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että PTHrP stimuloi eturauhasen syöpäsolujen kasvua, invaasio ja metastaasi, jotka toimivat kautta sekä parakriininen /autokriinisen ja intracrine polkuja [1] – [3]. PTHrP tiedetään aktivoida erilaisia ​​mitogeenisen reittejä, mukaan lukien MAPK ja PI3K /Akt sekä polkuja, jotka lisäävät luuston etäpesäkkeet, yksi yleisimmistä hengenvaarallinen häiriöt, jotka liittyvät syöpään [4] – [6] .Secreted PTHrP tunnetaan välittävät sen soluvaikutuksensa kautta vuorovaikutuksessa G-proteiiniin kytkettyjen PTH /PTHrP reseptori [7]. Koekspressio PTHrP ja sen reseptori on aikaisemmin tunnistettu eturauhassyövän primaareja kasvaimia ja niiden vastaavat luun etäpesäkkeiden [8]. Lisäksi, Freemont et al aiemmin raportoitu kasvu ekspression PTHrP-reseptorin eturauhassyövän luuhun etäpesäkkeitä verrattuna primaaristen kasvainten, mikä viittaa mahdolliseen rooliin reseptorin välittämän reitin muodostumista luuston etäpesäkkeiden [9].

epithelial-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on prosessi, jossa epiteelisolujen läpi solun tukirangan ja morfologiset muutokset hankkia mesenkymaaliset fenotyyppi, ja se on tärkeä normaaleissa prosesseissa, kuten fibroosi [10]. Koska sen vaikutukset solujen tarttumisen ja liikkuvuutta EMT on myös kriittisesti mukana syöpäsolujen leviämiseen ja invaasio [11], [12]. EMT voidaan luonnehtia menetys epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten proteiinien, mukaan lukien vimentiinista ja N-kadheriinin [13]. Transkriptiotekijöille Snail, Slug ja Twist tiedetään tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen ja aiheuttaa EMT [14] – [16]. Muut onkogeeniset reittejä, mukaan lukien Src, Ras, Wnt /β-kateniinin, PI3K /Akt, MAPK: n, ja TGF-β on kaikki liitetty EMT [17]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että syöpäsolut entistä invasiivisia ja metastaattinen kun niitä EMT. Lisäksi, EMT on osoitettu antavan kantasolujen ominaisuuksia rintasyöpäsoluissa [18].

Koska PTHrP on rooli ja metastaasit eturauhassyövässä ja EMT on yksi tärkeimmistä säätelijöitä nämä ominaisuudet syöpä, ratkaiseva kysymys esitettiin onko FTHrP pystyy edistämään EMT syöpäsoluissa. PTHrP: n on osoitettu indusoivan EMT muutaman yhteyksissä, mukaan lukien aikana päälaen endodermi muodostumista ja munuaisten fibrogenesis [19], [20], vaikka kyky PTHrP säädellä EMT syövän on pysynyt tutkimatta jääneissä. Rintasyövän, pro-metastaattinen vaikutus TGF-β, joka on voimakas indusoija EMT, on osoitettu välittyvän PTHrP [21]. Yhdessä nykyiset kirjallisuus viittaa siihen, että sääntely EMT mukaan FTHrP syövässä on erittäin todennäköistä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin määrittämään roolia FTHrP säätelyssä EMT eturauhasen syöpäsolujen ohella invaasio ja etäpesäkkeiden. Perustamisesta rooli FTHrP säätelyssä luuston etäpesäkkeiden syöpä ja EMT tarjoaa sekä perus- ja kliininen sovitusmenetelmät selvittämiseksi molekyylitason mekanismi FTHrP toimia monissa yleisissä syövissä, kuten eturauhasen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

VA IACUC hyväksyi tämän tutkimuksen. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals (NIH julkaisunumero 85-23) alle varmuus numero A3873-01. Eläimiä pidettiin isofluraanianestesiassa leikkauksen aikana, ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Näitä eläimiä seurataan tiiviisti, tarkistetaan päivittäin ja lopetettiin ensimmäisessä merkkejä epämukavuutta. Merkkejä epämukavuus sisällä epänormaaleja liikkeitä, epänormaali ruokinta tai juo käyttäytymistä, itsetunnon puute hoitotuotteita tai muita epänormaaleja käyttäytymismalleja.

Solut

DU 145 ja PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä kasvatetaan kerroksena RPMI 1640 media (Mediatech, Herndon, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gemini Bio Products, Woodland, CA) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 95% ilmaa, 5% CO

2. DU 145-solulinja valittiin, koska se on pieni konstitutiivinen PTHrP ilmaisun ja ei kasva tai etäpesäkkeitä hyvin hiiren kasvainmalleissa, toisin kuin PC-3-solujen [22] – [24]. PC-3-solulinjan, joka eristettiin alun perin eturauhasen adenokarsinooma, joka oli etäpesäkkeitä luuhun, on osteolyyttisiä fenotyyppi immuunipuutteisilla hiiren malleissa [22], [25].

Plasmidi rakentaminen

PTHrP ekspressioplasmideja käytetään tässä tutkimuksessa olivat ihmisen prepro PTHrP1-87, PTHrP1-141, ja PTHrP1-173; prepro lomakkeita käytettiin helpottamaan FTHrP eritystä. Konstruktit suunnatusti subkloonattiin pCI-neo-ekspressiovektorin (Promega, Madison, WI) ja fidelities kaikki plasmidit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla ja site-specific PTHrP immunomäärityksiä [23], [26].

PTHrP transfektio ja lentiviruksen-välitteisen hiljentäminen

DU 145 eturauhasen soluja ympättiin tiheydellä 2 x 10

4 solua /cm

2 12-kuoppaisille soluviljelymaljoille ja transfektoitiin 1 ug: lla plasmidia kohti. Yksittäiset G418 resistenttejä pesäkkeitä (800 ug G418 /ml) eristettiin 21-30 päivää myöhemmin. Esikäsitelty väliaine päässä poimitaan solun pesäkkeet arvioitiin FTHrP ilmentymisen paikkasidonnainen immunomäärityksiä ja FTHrP ilmentävien vakaa DU145 soluja lisättiin [23], [26]. Aikaisemmin on osoitettu, että villityypin ja vektori transfektoitiin DU 145 näytteille samanlaista fenotyyppi [27], [28]. Villityypin vanhempien DU 145 soluja siis käytettiin kontrollina RT-qPCR ja matrigeeliä invaasio kokeiluja, mutta rinnakkaisia ​​kokeita suoritettiin tyhjällä vektorilla transfektoidut ohjaus johdannainen. PC-3 eturauhasen soluissa tehtiin vakaa knockdovvn FTHrP kautta lentiviruksen siRNA. Ohjaus solut altistettiin lentiviruksen siRNA transduktion ei-kohdentavan sekvenssin konstrukti.

Quantitative Reverse-transkriptio-PCR

Solut kerättiin talteen kahden päivän kuluttua on siirrostettiin noin 70-80% konfluenssiin. Kokosolulysaattia kerättiin ja RNA uutettiin käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen). cDNA syntetisoitiin käyttäen Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR-reaktion seokset valmistettiin käyttämällä Virta SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja ajaa 7300 reaaliaikainen PCR System (Applied Biosystems) käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 95 ° C 10 minuuttia, 95 ° C 30 s, ja 60 ° C 1 min, 40 sykliä. Tulokset analysoitiin käyttäen Vertaileva ddCt menetelmä ja sulamiskäyriä suoritettiin varmistaa tuotteen spesifisyyttä. Kokeet tehtiin teknisiä kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kaksi kertaa itsenäisesti. GAPDH-geenin ilmentyminen mitattiin endogeeninen kontrolli. Alukkeet mukautettuja tilattu (Eurofinsille MWG Operon, Huntsville, AL) käyttäen seuraavat sekvenssit:

Snail Forward 5′- TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG-3 ’, Snail Reverse 5’CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC-3′, GAPDH Forward 5’-CTTCGCTCTCTGCTCCTCC -3 ’, GAPDH Reverse 5′-CAATACGACCAAATCCGTTG -3′, E-kadheriinin Forward 5’-GGCGGAGAAGAGGACCAGGACT-3 ’, E-kadheriinin Reverse 5′-TGGCAGGGCGGGGAAGATACC-3’, vimentiinistä Forward 5’GGAAATGGCTCGTCACCTTCGT-3 ’, vimentiinistä Reverse 5’-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3 ’.

Immunofluoresenssikoe

Solut trypsinoitiin ja viljeltiin peitinlaseja. Soluja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja estetty vuohen seerumia Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen huoneenlämmössä ennen inkubointia hiiren monoklonaalisella anti-ihmisen vimentiinista (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Soluja inkuboitiin sitten vuohen anti-hiiri-FITC-konjugoitu sekundaarinen vasta-aine (Chemicon, Temecula, CA) ja vastavärjättiin DAPI. Lopuksi SlowFade Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) käytettiin kiinnittää kansi liukuu päälle dioja. Fluoresenssikuvia saatiin 40X käyttämällä Leica DMIRE2 käänteinen fluoresenssimikroskooppiin ja tietokoneohjelma Yksinkertainen PCI käytettiin kuvan kaappaamiseen.

matrigeelin invaasiomääritys

Invasion of PC3 ja DU 145 solua mitattiin käyttämällä Matrigel invaasiomääritys (Becton Dickinson, Bedford, MA). Transwell-insertit 8 um huokoskoko päällystettiin lopullinen konsentraatio 1 mg /ml Matrigel kylmä seerumittomassa DMEM. Solut trypsinoitiin, ja 500 ml: lla solususpensiota (1 x 10

5 solua /ml) lisättiin kolmeen rinnakkaiseen kuoppaan. Alempaan kammioon Transvvell- täytettiin 750 ui viljelyalustaa, joka sisälsi 0,5% seerumia kemoattraktantti ja annettiin inkuboitua 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan. Tunkeutuvat soluihin alapinnalla että suodattimen läpi kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen kristalliviolettia glutaraldehydiä ja valokuvataan. Määrä värjättyä ytimien laskettiin ennalta määrätyllä ja johdonmukainen osa jokaisen hyvin.

Eläimet

Kuuden kuukauden ikäinen mies, sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä pidettiin esteenä suodatin huone ja ruokitaan Purina jyrsijämuonaa ad lib. Eläimistä otettiin verta lopussa tutkimuksen käyttäen silmäkuopan menetelmällä.

Orthotopic kasvaimen istutuksen

aliyhtyvät DU145 ja stabiilisti transfektoitu DU145-PTHrP (1-173) GFP-soluja tuoreeltaan trypsinoitiin, laskettiin ja pantiin jäihin välittömästi ennen injektiota. Hiiriin injektoitiin 10

6 solua ihon alle tilaan eläimen kylkeen kokonaistilavuudessa 0,25 ml seerumitonta RPMI 1640 media. Hiiret tapettiin sato kasvainkudoksen 4 viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion. Tuumorifragmentit (1 mm

3) on juuri valmistettu ihonalaiskudoksesta kasvaimista ja istutetaan eturauhanen sivusuunnassa koru toisen SCID hiiri (22-24). 1 mm

3 tuumorifragmentte- leikeltiin, mitattiin jarrusatulat, ja punnitaan vakuuttaa tarkka määrä alkaa kasvaimen käytettiin kunkin eläimen. Eturauhaskapselin on alttiina jälkeen alemman keskiviivan vatsan aukaisu ja kasvaimen fragmentti insertoitiin kapseliin. Eturauhaskapselin sitten suljettiin kanssa 8-0 haavanompeluaineet ja viillon vatsan suljettiin 6-0 haavanompeluaineet yhdessä kerroksessa [29].

Eläimiä isofluraanianestesiassa aikana leikkaus. Kaikki menettelyt edellä kuvattu toiminta suoritettiin 7 X suurennoksella mikroskoopilla. Hiiret arvioitiin 60 päivän kuluttua kasvaimen implantaation kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden fluorometrialla ja luuston epämuodostumia X-ray. Suurentavan kuvantaminen GFP-proteiinia ekspressoivien kasvainten suoritettiin Leica loisteputki stereomikroskooppi, malli LZ12, jossa on 50 W elohopealamppu ja koko kehon kuvantamisen suoritettiin valolaatikko valaistu sinisen valon kuituoptiikan (Lightools Research , Encinitas, CA) ja kuvattiin käyttäen thermoelectrically jäähdytetty CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ).

Luunsisäiseen pistettiin

vaikutuksen arvioimiseksi FTHrP eturauhassyövän kasvua luussa, käytimme sisäinen sääriluun malli eturauhassyövän luun etäpesäke (1, 24). Olemme tutkineet viisi eri stabiilisti transfektoitujen GFP ilmentävät DU145-soluja: (1) villityypin, (2) vektori (pCI-neo), (3) PTHrP (1-87), (4) PTHrP (1-141) ja ( 5) PTHrP (1-173) transformoitujen solujen. Hiiret injektoitiin 10

6 solua 15 ul: aan steriiliä PBS luuytimeen oikean sääriluun käyttäen 26 gaugen neulaa ja Hamilton lasiruisku. Vasen sääriluu toimi negatiivisena kontrollina. Hiiret arvioitiin 60 päivän kuluttua intraosseous injektioita luuston epämuodostumia röntgenkuvien [24]. Luuston röntgensäteilyä altistettiin 40 keV 20 sekunnin ajan Faxitron-yksikköön 5000-sarjan X-ray kaappi ja Kodak X-Omat TL kalvot käsitellään Kodak elokuva prosessori. Tarkempia kuvantaminen luustomuutoksia käytimme GE tutkia Micro CT (GE Healthcare).

FTHrP Immunoassay

Solun tiivisteet ja median FTHrP mitattiin RIA perustuu PTHrP (1- 34), PTHrP (38-64), ja PTHrP (109-141), kuten aiemmin on kuvattu [30]. Kaikki näytteet määritettiin useita laimennoksia ja kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja virhepalkit edustavat keskihajonta. Tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttämällä kahden otoksen riippumatonta t-testiä (2-tailed test) kanssa raja-arvo

P

0,05.

Tulokset

PTHrP Yliekspressio Edistää Expression of mesenkyymikasvaimia Markers

tutkia sääntelyn EMT, FTHrP stabiilisti yli-ilmennetään DU 145, joka on eturauhassyöpäsolulinja alhainen pohjapinta FTHrP ilmaisun määritettynä immunomääritys (kuvio 1A). Kaksi kloonia luotu, yksi yli-ilmentävät 1-141 isoformin FTHrP ja toinen yli-ilmentävät 1-173 isoformin (kuvio 1 B). Molemmat klooneista merkkiaineita EMT, jotka ilmentävät erityisesti korkeimmilla tasoilla mesenkymaalisten proteiinien etana ja vimentiinista ja alhaiset E-kadheriinin suhteessa vanhempien DU 145, määritettynä qRT-PCR (kuvio 1 B). Kun vakaa yli-ilmentyminen täyspitkän PTHrP- (1-173) in DU 145, vimentiinistä ja etana mRNA: n ilmentymisen kohosivat 115 ja 6,82 kertaiseksi, kun taas E-kadheriinin ilmentymisen laski todistettavasti vuoteen 2080 mennessä kertaiseksi. Samoin vakaa yliekspressio PTHrP- (1-141) lisääntynyt vimentiinista ja etana mRNA ilmaisun 23,5 ja 3,88 kertaiseksi, ja laski E-kadheriinin ilmentymisen 12,3 kertaiseksi. Data on esitetty villityypin vanhempien johdannaisen kontrollina. Rinnakkaisessa kokeessa, PTHrP-yli-ilmentävät DU 145 soluja, osoitti 6,06-kertainen induktio etanat ja 9,68 väheneminen E-kadheriinin ilmentymisen verrattuna tyhjän vektorin-transfektoitujen DU 145 johdannaisen (tuloksia ei ole esitetty). Induktion EMT todennetaan immunofluoresenssianalyysia. Overexpressions sekä isoformien PTHrP osoittaa lasku E-kadheriinin kasvun kanssa vimentiinista proteiinin ilmentymisen (kuvio 1C).

A) kvantifiointi PTHrP-proteiinin tasot ohjaus ja PTHrP yli-ilmentäviä DU 145 soluja immunoassay. B) mRNA ilmentymä FTHrP ja EMT merkkiaineiden ohjaus ja FTHrP yliekspressoivia DU 145 soluja. C) Immunofluoresenssi kuvia vahvistetaan yliekspressio PTHrP, ylössäätelyyn vimentiinista, ja downregulation E-kadheriinin in FTHrP yliekspressoivia DU 145 soluja.

FTHrP Knockdown Vähentää ilmentäminen mesenkyymikasvaimia Markers

edelleen osoittamiseksi sääntelyä EMT mukaan FTHrP eturauhassyövässä, pysyvä FTHrP pudotus kautta retroviruksen transduktio suoritettiin PC-3, eturauhasen syöpäsolun linjassa korkealla pohjapinta FTHrP ilmaisun määritettynä immunomääritys (kuvio 2A). PC-3-KD soluissa, ilmentyminen FTHrP aleni 15% ohjaus-PC-3 (kuvio 2B), kun taas taso Etana ja vimentiinista olivat alas-säädellä 3,03 ja 3,73 kertaiseksi, ja E-kadheriinin ilmentymisen oli kohotetaan 2,30-kertaisesti (kuvio 2B). Muutos EMT proteiinin ilmentyminen on osoitettu immunofluoresenssianalyysia. Kaatamalla FTHrP downregulates vimentiinista ja ylössäätelee E-kadheriinin, joka vahvistaa qPCR data (kuvio 2C). Yhdessä kuvassa 1, nämä tiedot viittaavat siihen, että FTHrP aktiivisuutta tai ekspressiota edistää EMT eturauhassyövässä.

A) kvantifiointi FTHrP proteiinin tasot ohjaus ja FTHrP-knockdown PC-3-soluista immunoassay. B) mRNA ilmentymä FTHrP ja EMT merkkiaineiden ohjaus ja FTHrP-knockdown PC-3-solut. C) Immunofluoresenssi kuvia vahvistetaan yliekspressio FTHrP ylössäätelyyn vimentiinista, ja downregulation E-kadheriinin hallinnassa ja FTHrP-knockdown PC-3-solut.

FTHrP säätelee Invasion ja lisääntymisen merkkejä MMP-9

jotta voidaan vahvistaa, että aktivointi FTHrP tai EMT johtaa lisääntyneeseen invasiivisuus meidän koejärjestelmässä, Matrigel invaasiomääritys suoritettiin määrittää suhteellinen invasiivisuus DU 145-PTHrP (1-141), DU 145-PTHrP (1-173), ja PC-3-KD-soluissa verrattuna niiden valvontaa. DU 145-PTHrP (1-141) ja DU 145-PTHrP (1-173) solujen havaittiin olevan 3,0 (p 0,01) ja 2,9 (p 0,05) kertaa enemmän invasiivisia kuin vanhempien DU 145 soluja, tässä järjestyksessä ( Kuva 3A). Samaan aikaan, PC-3-KD-soluja havaittiin olevan vain 0,5-kertainen (p 0,01), kuten invasiivisia kuin vanhempien PC-3-soluja (kuvio 3B). Rinnakkaisessa kokeessa, PTHrP- (1-141) ja – (1-173) DU 145 solua osoitti 2,0 (p 0,5) ja 2,1-kertainen (p 0,05) kasvaa matrigeeliä invaasio verrattuna tyhjän vektorivälitteisten transfektoitu DU 145 johdannainen, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi, PTHrP yliekspressio DU 145 havaittiin upregulate MMP-9 17,1 ja 7,10-kertaisesti PTHrP- (1-141) ja PTHrP- (1-173), joka ilmaisee johdannaiset, vastaavasti, kun taas pudotus PC-3 vaimentua MMP-9 25,1-kertaisesti (kuvio 3C).

A) Matrigel invaasiomääritys osoittaa nousu hyökkäyksen DU145 solujen kun yli-ilmentyminen joko FTHrP 1-141 tai 1-173. B) Matrigel invaasiomääritys osoittavat laskua hyökkäystä PC3-solujen päälle knockdovvn FTHrP. C) mRNA-MMP-9: n PTHrP yli-ilmentäviä DU145-solujen ja PTHrP-pudotus PC3-soluissa verrattuna niiden valvontaa. * Osoittaa p 0,05, ** osoittaa p 0,01.

FTHrP Edistää Tumor Growth and Bone Destruction käytettäessä Orthotopic /Luunsisäiseen Mouse Model

DU 145 ja DU 145- PTHrP (1-173) solut transfektoitiin stabiilisti GFP-ekspressioplasmidin ja istutetaan ortotooppisesti eturauhasen sängyn nude-hiirten tai suoraan luuhun, kuten aiemmin on kuvattu (1). Vaikka kaikki hiiret muodostivat kasvaimia, ne istutettu DU 145-PTHrP (1-173) solut muodostivat merkittävästi suurempi kasvaimia verrattuna ruiskutetaan normaalin DU 145 soluja. Edustavia kuvat osoittavat laajaa syöpäkasvain hiirillä ruiskutetaan DU 145-PTHrP (1-173) soluja verrattuna hiiriin ruiskutettiin vanhempien DU 145 (kuvio 4A). Lisäksi, etäpesäke selkärangan havaittiin yksi hiiriä, joihin injektoitiin DU 145-PTHrP (1-173), kun taas mitään hiiriä, joihin injektoitiin DU 145 on muodostettu etäpesäkkeitä (kuvio 4B). DU 145 tai DU 145-vektori solut muodostivat ole kasvainta, kun injektoidaan hiiriin sääriluut taas DU 145-PTHrP (1-141) tai DU 145-PTHrP (1-173) soluja injektoidaan hiiriin sääriluut johti kasvaimen muodostumisen, invaasio ja tuhoaminen luu (kuva 5), ​​jossa vahvistetaan vakiintunut asema FTHrP luun resorptiota. Lopuksi ilmentyminen PTHrP kasvaimissa vahvistettiin immunohistokemialla (kuvio 5B).

A) Orthotopic-hiirimallissa, joka esittää hiiren injektoitu DU145-GFP-soluja. B) Hiiren pistetään DU 145-PTHrP (1-173) soluja. C) Todisteet luutuhon hiiren injektoitu DU 145-PTHrP (1-173) soluja. D) Spine etäpesäke on hiiri injektoitu DU 145-PTHrP (1-173) soluja.

A) röntgen- ja teen kuvat osoittavat vaikutuksen FTHrP ilmentymisen vaikutus luutuhon luun sisäisen hiiren malli. Hiirten sääriluun vastaanottamisesta FTHrP yliekspressoivia DU 145 näkyvissä merkittävää tuhoa luun verrattuna kontrolliin. B) DU-145-GFP-PTHrP1-173 eturauhasen kasvain poistettiin hiirestä, kiinteä ja immunohistokemiallisesti värjättynä PTHrP käyttäen biotiini-streptavidiini- piparjuuri-peroksidaasi-järjestelmä (ruskea reaktiotuote osoittaa PTHrP lauseke).

keskustelu

Olemme tunnistaneet FTHrP paitsi kriittinen välittäjänä syövän etenemisen eturauhassyöpä, mutta myös edistäjänä EMT. Vaikka PTHrP on osoitettu aiheuttavan EMT kehittämiseen [10], [31], havaintomme että se edistää EMT syövän sekä edelleen uudenlainen havainto. Tämä havainto merkitsee sitä, että PTHrP voi olla vieläkin merkittävä rooli syövän etenemistä kuin aiemmin uskottiin, koska kyky säädellä EMT merkitsee mahdollista säädellä erilaisia ​​ominaisuuksia, jotka liittyvät syövän etenemisessä, mukaan lukien invaasio, metastaasi, solun liikkuvuus, solu-adheesion , angiogeneesi, ja stemness /tuumorigeenisyystesti [11], [18], [32] – [34]. Ennusteeseen edenneen eturauhassyövän edelleen heikko johtuu usein luumetastaasipotilailla invaasio [35], [36]. Siten kohdentaminen FTHrP voi johtaa tehokkaampia hoitomuotoja eturauhasen syöpä.

Tuloksemme osoittivat, että FTHrP yliekspressio DU 145 soluissa indusoi EMT ja edistettävä invaasio, tuumorigeenisyyteen, ja etäpesäkkeitä, kun taas FTHrP knockdown PC-3-solujen aiheuttama päinvastoin vaikutuksia. Lisäksi havaitsimme, että PC-3 solulinja on korkea perusilmennystä FTHrP määritettynä FTHrP immunomääritys ja on luonnostaan ​​metastasoitunut ja invasiivisia verrattuna DU 145, joka on huonosti pohjapinta FTHrP ilme. Nämä havainnot posit että FTHrP voi paitsi helpottaa etäpesäke edistämällä luun resorptiota, mutta voi myös olla tärkeä säätelijä aggressiivinen fenotyypin eturauhassyöpä. Sekä 1-141 ja 1-173 isoformeja PTHrP havaittiin edistää EMT, yhdenmukainen sen kanssa, että klassisen aktiivisen sijaitsee lähellä aminopäässä, kuten on esitetty aikaisempien tutkimusten [37]; kuitenkin muita jalostettuja peptidejä FTHrP voi myös olla tärkeä välittäjiä kanteen. Kohdistaminen kaikki isoformit FTHrP anti-syövän hoitoon voi tarvittaessa vaikka kohdistus on 1-141 isomuodon voi olla ensiarvoisen tärkeää, koska se muodostaa suurimman osan FTHrP ilmaisun ihmisillä.

Loppupään tavoitteet, jotka aktivoituvat PTHrP sisältävät Snail, AP-1, CREB, ERK1 /2, VEGF, PI3K /Akt ja sykliini D1 [20], [38] – [45]. Snail edistää EMT suoraan transkription tukahduttaminen E-kadheriinin [15]. CREB ylössäätelee VEGF mikä puolestaan ​​edistää EMT, invaasio ja angiogeneesi [46], [47]. PI3K /Akt-reitillä on tärkeä säätelijä solujen lisääntymistä ja on myös osoitettu indusoivan EMT erilaisia ​​syöpiä [48]. AP-1 on osoitettu olevan osallisena TGF-β-indusoidun EMT [49]. Yliekspressio sykliini D1 on osoitettu aiheuttavan gliooma hyökkäystä lisäämällä metalloproteinaasiaktiivisuus ja soluliikkuvuus [50]. Vallitsevat tutkimukset osoittavat, että PTHrP, TGF-β, EGF, ja VEGF yhteistyötä aktivoimalla ERK1 /2 aiheuttavan EMT aikana munuaisten fibrogenesis [19], ja että Snail on välitön varhainen kohde FTHrP hiiren päälaen Endodermi muodostumisen [20]. Yksi tai yhdistelmä näistä reiteistä on todennäköisesti selittää induktion EMT ja invaasio, jotka havaittiin kokeissa, joissa olemme vahvistaneet induktion Snail mukaan PTHrP. Vaikka se on aiemmin osoitettu, että FTHrP pystyy upregulaatioon Snail transkriptio puuttuessa de novo proteiinisynteesiä [20], on epäselvää, onko tämä vaikutus on suoraan sitoutumalla Snail promoottori tai aktivoimalla signalointipolkujen kuten Akt että tiedetään säännellä Snail. Joko niin, lisätutkimuksia tarvittaisiin vahvistamaan mekanismin FTHrP aiheuttaman EMT eturauhassyövässä.

On mahdollista, että useat muut reitit luottavat FTHrP edistämään EMT, invaasio ja metastaasi. TGF-β, indusoi tehokkaasti EMT, on esitetty rintasyövän edistää FTHrP ilmentymisen johtaen luun tuhoutumisen [21]. Eri onkoproteiineja lukien Ras, TPR-Met, Src ovat kaikki osoitettu kohdistaa FTHrP ja myös ovat osoittautuneet rooleja EMT, invaasiota ja etäpesäkkeiden [51] – [53]. Erityisen kiinnostavia olisi Indian hedgehog, joka on tunnettua säätää PTHrP alkupuolella luun ja ruston kasvua [54], [55]. Jäsenet Hedgehog perheen poikkeavasti aktivoidaan erilaisia ​​syöpiä, kuten eturauhassyöpää, on osoitettu epäsuorasti edistää EMT, ja ovat teorian, että on roolinsa muutosta aikuisten kantasolujen syövän kantasolut [56] – [59] . Olisi mielenkiintoista selvittää Ihh vetoaa FTHrP induktiolle EMT ja muut pahanlaatuiset ominaisuuksia syöpää.

Käynnissä oleva tutkimus vahvistaa edelleen teoria, että syöpä kantasolut ovat pääasialliset syövän etenemisen ja avaintekijöitä hoitovaste [60]. Siten tärkeä kysymys harkita, onko FTHrP voi säädellä eturauhassyövän kantasolujen avulla EMT-välitteisen reitin. Kuten EMT on aiemmin osoitettu aiheuttavan syöpää kantasolujen ominaisuuksia [18], tästä seuraa, että FTHrP pitäisi mahdollisesti pystyä säätelemään kantasolujen ominaisuuksia eturauhassyövän ja voi siten olla arvokas terapeuttinen kohde uusiutumisen ehkäisemiseksi ja etäpesäke. Eturauhassyöpä kantasoluja on aiemmin eristetty ja tunnusomaista CD44

+ /CD133

+ /α2β1

hi fenotyyppi [61]. Tuleva työ on keskityttävä kykyyn FTHrP säädellä tähän lokeroon eturauhassyövän.

Havainto, että FTHrP indusoi EMT samalla edistää invaasio ja kasvaimen kasvu viittaa siihen, että hoitoja, jotka kohdistuvat FTHrP voidaan käyttää yhdessä tavanomaisten hoitomuotojen estämällä invaasio ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän, varsinkin toistuvat kasvaimia. Olemme aiemmin seulottu kirjasto yhdisteitä ja havaittiin useita, jotka kykenevät inhiboimaan PTHrP ilmentymisen ja solujen kasvua keuhkosyövän [62]. Se olisi suuri kliininen edun mukaista laajentaa näiden tulosten eturauhassyöpä ja onko tällaisia ​​lääkkeitä ovat myös omiaan estämään FTHrP aiheuttaman EMT ja hyökkäystä. Samalla lisätoimia luonnehtia reittejä mukana FTHrP aiheuttama EMT voi johtaa selventämiseen rooli FTHrP syövän kantasolujen kehittämistä ja uusia hoitoja, jotka voivat merkittävästi parantaa ennustetta metastaattisen eturauhassyövän (1, 57).