Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman tähtisolut (PSCs) on keskeinen rooli aggressiivista käyttäytymistä haimasyöpä . Vaikka heterogeenisyys PSCs on tunnistettu, toiminnalliset erot ovat edelleen epäselviä. Olemme tunnettu CD271

+ PSCs ihmisen haimasyövän. Immunohistokemiaallisesti CD271 suoritettiin 31 normaalin haiman kudoksista ja 105 haimatiehyen adenokarsinoomat (PDACs). Suoritimme virtaussytometrillä ja kvantitatiivinen RT-PCR, ja arvioidaan CD271 ilmentyminen PSCs eristetty haiman kudoksista ja muutokset CD271 ilmentyminen PSCs viljellään kanssa syöpäsoluja. Tutkimme myös rakenteessa CD271 ilmentymistä SCID hiiren ksenograftimallissa. Vuonna immunohistokemiallista analyysejä, CD271 korkea värjäys hinnat haiman strooman normaaleissa haiman kudoksista ja PDACs olivat 2/31 (6,5%) ja 29/105 (27,6%), vastaavasti (p = 0,0069). Vuonna PDACs, CD271

+ stroomasolut havaittiin usein reunalla eikä keskellä kasvaimia. Stroomakasvaimet CD271 korkea ilmentyminen liittyi ennuste oli hyvä (p = 0,0040). Virtaussytometrinen analyysit osoittivat CD271-positiivisia hintojamme PSCs olivat 0-2,1%. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit paljastivat, että CD271-mRNA: n ekspressio lisääntyi PSCs jälkeen yhteisviljelmä haimasyöpä soluja. Kuitenkin taso CD271 mRNA ilmaisun jälkeen laskenut jälkeen ohimenevää. Lisäksi CD271-mRNA väheni PSCs vaeltavat kohti haimasyöpäsoluissa kautta Matrigel. Vuonna ksenograftimallia, CD271

+ PSCs olivat läsnä kasvain marginaalit /reuna ja olivat poissa kasvaimen ytimessä. Lopuksi, CD271 on ilmaistu PSCs noin haiman kasvaimia, mutta ei keskellä kasvaimia, ja ilmentyminen väheni sen jälkeen, kun pitkän yhteisviljelmä haimasyöpä solujen tai sen jälkeen, kun liike kohti haimasyövän soluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CD271

+ PSCs näkyvät alkuvaiheessa haiman syövän synnyn ja että CD271 ilmentyminen korreloi merkitsevästi parempi ennusteeseen potilailla, joilla PDAC.

Citation: Fujiwara K, Ohuchida K, Mizumoto K , Shindo K, Eguchi D, Kozono S, et ai. (2012) CD271

+ alipopulaatio Haiman tähtisolut korreloi prognoosi haimasyövän ja säätelee Vuorovaikutus syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (12): e52682. doi: 10,1371 /journal.pone.0052682

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 19 marraskuu 2012; Julkaistu: 27 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Fujiwara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat JSPS KAKENHI lupanumeroita 24-1237, 23390327, 24659613, 23659654, 24390319, 22591524, 23-11109, 23659655, 24390318. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavan syövät, ja sen 5-vuotta eloonjäämisaste on vain 4% [1]. Sille on ominaista liiallinen desmoplasia, jolla on keskeinen rooli sen aggressiivinen käytös [2], [3]. Viime aikoina tutkimus syöpäbiologian on keskittynyt syöpää stroomavuorovaikutuksiin. Vuorovaikutukset syöpäsolut ja strooman kudokset ovat välttämättömiä kehittymistä ja etenemistä kasvaimia [4]. Therapies kohdistaminen syöpä-stroomavuorovaikutuksiin voi edustaa uutta lähestymistapaa valvontaan haimasyövän.

Haiman tähtisolut (PSCs) on tunnistettu pääasiallisena lähteenä liiallinen soluväliaineen havaittu krooninen haimatulehdus ja haiman adenokarsinooma [ ,,,0],5], [6]. Samanlainen maksan tähtisolut tärkeä solutyypin soluväliaineen tuotantoa maksan fibroosi, PSCs varastoida rasvaa pisaroita vitamiinia sisältävien niiden solulimassa [7]. PSC: t aktivoituvat kun stimulaation eri autokriinisella tai paracrine tekijöistä. Ne ilmaisevat α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ja tuottaa erilaisia ​​soluväliaineen proteiinien [8], [9]. Liukoinen erittämiä tekijöitä aktivoitu PSCs edistää solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, ja selviytyminen haimasyöpäsoluissa vastaan ​​Gemsitabiinihoidon [10]. Siten PSCs tärkeä rooli syövän-stroomavuorovaikutuksiin haimasyövän.

Useat raportit viittaavat siihen, että stroomasolut, kuten myofibroblasteja ja mesenkymaalisten solujen, eristetty erilaisista ihmisen kudoksista osoittaa erilaisia ​​fenotyyppejä [11], [12 ]. Olemme aiemmin raportoitu, että CD10

+ PSC parantaa etenemistä haimasyövän soluja [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PSCs on käytännöllinen heterogeenisyys ja edelleen viittaavat siihen, että PSCs voi sisältää useita muita solualapopulaatioiden jotka yksin tai synergistisesti vaikuttavat etenemistä haimasyövän. Yksityiskohtaiseen kuvaukseen PSCs haimasyövän auttaisi selventämään taustalla oleva mekanismi vuorovaikutukset syöpäsolut ja stroomasolujen, ja ne voivat tarjota uusia kohteita stroma-hoitojen,.

CD271 (tunnetaan myös nimellä hermokasvutekijäreseptori NGFR tai p75NTR) on neurotrofiinireseptorin, joka on osallisena parakriiniseen kasvun säätelyssä useita hermosolujen ja ei-neuronaalisen kasvaintyypeissä [14], [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat keskittyneet CD271, koska se tunnistettiin markkerina ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen [16], ja se on arvioitu olevan tärkeä syövän kantasolujen markkerina melanooma [17]. CD271 voi olla merkki tietyn toiminnallisen alapopulaatio, kuten stemness. Haima, CD271 ilmentyminen PSCs on havaittu [18]. Kuitenkin CD271 ilmentyminen väheni nopeasti sen jälkeen, kun solu eristämisen haiman kudoksista [19]. Siksi rooli CD271 ilmaisun PSCs jää epäselväksi.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa erityisiä PSCs jotka vaikuttavat etenemistä syöpäsolujen keskittymällä ilmaus CD271. Olemme edelleen arvioitu merkitys CD271 ilmaisun PSCs.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Kyushu University (hyväksyntänumero, 23 -64) ja noudatetaan sovittuja eettisiä ohjeita Human Genome /Gene Research säätänyt Japanin hallituksen ja Helsingin julistuksen. Kaikki potilaat edellyttäen allekirjoitti tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin määrittelemättömistä tutkimustarkoituksiin. Kaikkien kokeista, joissa hiiret, eläimet asutettiin laminaarivirtaus- kaapit erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa laitoksissa hyväksymässä Kyushu University (hyväksymisnumero, A24-112-0).

Potilaille ja haiman kudoksista

haimasyöpä kudokset saatiin 105 potilasta joille tehtiin haiman resektio haimasyövän meidän laitokselle. Ennusteeseen viittaavia potilaiden ominaisuuksiin on kuvattu taulukossa S1. Survival mitattiin ajan haiman resektio kuolemaan asti. Ennuste määritettiin syyskuussa 2011. Keskimääräinen eloonjäämisaika aika oli 23,5 kuukautta (vaihteluväli, 1-114kuukausi). Kuusikymmentä-kaksi potilasta kuoli seuranta-aikana. Kaikki kudokset vieressä arvioitiin näytteet histologisesti kriteerien mukaan Maailman terveysjärjestön. Kasvain vaiheessa arvioitiin mukaan unionin International Cancer ohjaus (UICC). Olemme myös saaneet 31 normaali haima (NP) näytteet ehjä haima kudoksista resektoitiin varten sappitiehyen syöpä, hyvänlaatuinen kiinteän pseudopapillary kasvain tai neuroendokriinikasvain käytettäväksi kontrollisilkkipaperia. Olemme edelleen kerätään 10 haiman intraepiteliaalinen neoplasia (PANIN) ja 39 intraduktaalisissa papillaarinen mucinous kasvain (IPMN) näytteet.

immunohistokemiallinen menettelyjä ja arviointi

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen Histofine SAB-PO Kit (Nichirei , Tokio, Japani). Kudokset leikattiin paksuuteen 4 um ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella anti-CD271-vasta-aineen (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai hiiren monoklonaalinen anti-α-SMA-vasta-ainetta (1:50; Dako, Glostrup , Tanska) yön yli 4 ° C: ssa. Solut katsotaan positiivisesti immuno- kun kalvo tai solulimassa värjättiin. Tunnistimme aktivoitu PSCs perustuu solumorfologiaan (kara-muotoinen solut) ja niiden identiteetit varmistettiin α-SMA värjäystä. Laskimme solujen määrä vähintään 10 kenttää per jakso 200 x suurennus. Selittämään heterogeenisyys CD271 ilmentyminen, jakelu CD271 immunovärjäyksellä arvioitiin prosentteina värjättyjen solujen ja pisteytettiin seuraavasti: 0, 0%; 1, 25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; tai 4, 76-100%. Vastaavasti, värjäytyminen intensiteetti pisteytettiin seuraavasti: 0, ei värjäytymistä; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; tai 3, voimakas värjäytyminen. Lopuksi lasketaan värjäytyminen pisteet kertomalla prosenttiluku, jonka intensiteetti pisteet. Haiman syöpäsoluja, jaoimme näytteet korkea värjäys 3 ja alhainen värjäys 2 ryhmää. Kaikki objektilasit arvioitiin erikseen kaksi tutkijaa ilman mitään tietoa kliiniset piirteet kunkin tapauksen.

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen PSCs eristettiin tuoreista haiman kirurgisista näytteistä käyttäen seuraus menetelmää meidän laboratorio [5], [20]. PTK solutyyppi varmistettiin morfologian (stellate kaltainen tai kara-muotoisia soluja) ja immunofluoresenssivärjäystä α-SMA ja vimentiinista [10], [13], [20]. PSC1 ja PSC3-9 eristettiin haimasyöpä. PSC2 ja PSC10 eristettiin hyvänlaatuinen haiman kysta. PSC11 ja PSC12 eristettiin normaalista haiman alueen haimasyövän kudoksiin. Lisäksi arvioimme kaksi haimasyöpä solulinjoissa, SUIT-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japani) ja Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). SK-N-MC, ihmisen neuroepithelioma solulinja (American Type Culture Collection), ostettiin positiivisena kontrollina CD271 ekspressiota. Solut kohdat 3-8 käytettiin määrityksiin. Soluja pidettiin aikaisemmin kuvatulla [21].

immunofluoresenssi ja Laser-skannaus konfokaalimikroskopia

PSCs (1 x 10

5) maljattiin lasipohjaisella astiat (Matsunami , Osaka, Japani), ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Viljelmissä supernatantin, solut inkuboitiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) /DMEM, jossa supernatantti peräisin haiman syöpäsoluissa 72 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin metanolilla, blokattiin 3% naudan seerumialbumiinia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella anti-α-SMA-vasta-ainetta (01:50; Dako), kanin monoklonaalista anti- vimentiinin vasta-ainetta (1:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ja hiiren monoklonaalinen anti-CD271-vasta-aineen (1:50; Santa Cruz Biotechnology), yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen soluja inkuboitiin Alexa 488-konjugoitua anti-hiiri-IgG- tai 546-konjugoitua anti-kani-IgG: llä (Molecular Probes, Eugene, OR) 1 tunnin ajan. Nuclear DNA vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (0,05 ug /ml). Laser-skannaus confocal fluoresenssimikroskoopilla (A1R; Nicon, Tokio, Japani) käytettiin, ja kuvien hoidettiin käyttämällä NIS-Elements (Nikon).

Virtaussytometrianalyysi

Viljellyt solut saatu subkonfluenteista yksikerrosviljelmiä ja inkuboitiin fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-CD271-vasta-aine (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Hiiren IgG1 K isotyyppikontrolli FITC (Miltenyi Biotec) käytettiin negatiivisena kontrollina. Leimatut solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS Calibur (Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista käyttäen High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja DNaasi I (Roche Diagnostics). Reaaliaikainen qRT-PCR suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen, Tokio, Japani) ja Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Alukkeet CD271 ja β-aktiini ostettiin Takara Bio Inc. (Tokio, Japani). Sekvenssit oligonukleotidialukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: CD271, 5′-TCAGTGGCATGGCTCCAGTC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GCAGTATCCAGTCTCAGCCCAAG-3′ (taaksepäin); p-aktiini, 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ (reverse). Kukin reaktioseos oli aluksi inkuboitiin 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan, jotta käänteistranskriptio. PCR-monistus aloitettiin sitten inkuboimalla 95 ° C: ssa 15 min aktivoida polymeraasi, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s, 60 ° C: ssa 20 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Ilmentymistasojen geenien laskettiin käyttämällä standardikäyrää konstruoida käyttämällä kokonais-RNA: SK-N-MC-soluja. Ilmaisu tasot olivat normalisoitu β-aktiinin ilmentymistä tasoilla sisäisenä kontrollina, ja ilmaistiin suhteena ilmentymisen kohdegeenin kuin β-aktiini. Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena. Ei havaittavaa PCR-tuotteet monistettiin ilman etukäteen käänteistranskriptio. Tarkkuus ja luotettavuus PCR-tuotteet varmistettiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Aito, CA).

In vitro yhteisviljelmä järjestelmässä

In vitro

keraviljelmiä suoritettiin käyttäen 6-hyvin soluviljelyinsertissä kumppani levyt ja 3,0-um soluviljelmässä insertit (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) kuten aiemmin on kuvattu [22]. SUIT-2 ja Capan-2-soluja (5 x 10

5) ympättiin erikseen ylempään kammioiden 24 tuntia ymppäyksen jälkeen kaksi PSCs (5 x 10

5) alempaan kammioihin.

Culture syöpään-soluista peräisin supernatantti

SUIT-2 ja Capan-2-soluja viljeltiin FBS-vapaa olosuhteissa 48 tunnin ajan. Sen jälkeen keräsimme supernatantit syöpäsolujen ja säätää niitä 10% FBS: ää. Syöpäsolun johdettu supernatantit lisättiin sitten aiemmin ympätty PSCs myöhemmin kulttuuriin.

toiminnallinen erottaminen Matrigel invaasiomääritys

Kuuden hyvin soluviljelyinsertissä kumppani levyt ja 8,0-um soluviljelmässä insertit (Becton Dickinson Labware) päällystettiin Matrigelillä (150 ug /kuoppa; BD Biosciences, Bedford, MA). PSC: t (5 x 10

5 solua /2 ml) ympättiin yläkammiot. Aikaisemmin syöpäsolujen (5 x 10

5) ympättiin alakammioissa. Sen jälkeen soluja viljeltiin 72 tunnin ajan. Tämän jälkeen poistimme solut molemmin puolin ylempien kammioiden käyttäen trypsiiniä. Kahden sentrifugoinnin, poimimamme mRNA soluista. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja riippumaton Kokeet toistettiin kolme kertaa.

In vivo -kokeet

SUIT-2 haimasyövän soluja ja kaksi PSCs käytettiin

vuonna vivo

kokeiluja. Solut jaettiin kolmeen ryhmään, joka käsittää SUIT-2-solut yksinään, SUIT-2-solujen PSC1 soluja, ja SUIT-2-solujen PSC2 soluja. SUIT-2-soluja (5 x 10

5) ja julkisia (5 x 10

5) suspendoitiin 100 ul: aan PBS: ää cotransplanted osaksi haiman hännän 6-viikkoisen naaras-SCID-hiiret (FOX CHASE SCID® , CB-17 /LCR-SCID /scidJcl; Clea Japan Inc., Tokio, Japani). Kuusi hiirtä käytettiin jokaiseen ryhmään. Kasvaimet resekoitiin päivinä 8, 15, ja 22 implantaation jälkeen. Kudokset kiinnitettiin 10% neutraaliksi puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Neljä um kudosleikkeet värjättiin hiiren monoklonaalisella anti-α-SMA-vasta-ainetta (Dako) ja kanin monoklonaalista anti-CD271-vasta-aineen (Millipore, Billerica, MA).

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Vertailut kahden ryhmän välillä suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. Tilastollinen merkittävyys määritettiin arvojen p 0,05. Χ

2 testiä käytettiin analysoimaan korrelaatioita CD271 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia havaittu immunohistokemiallinen analyysit. Survival analyysit tehtiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä, ja käyrät verrattiin käyttäen log-rank-testi. Arvioimaan riippumattomien ennustetekijöiden liittyy selviytymisen, Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysiä käytettiin, jossa CD271 ilme, pT luokka, imusolmuke etäpesäke, UICC vaiheessa perilymfaattinen invaasio, verisuonia invaasio, ja patologinen marginaali kovariantteja. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen JMP 8.0 ohjelmistoa (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

stroomakasvaimet ilmentävät CD271 haiman adenokarsinooma (PDAC) B

arvioimiseksi CD271 ilmentyminen haiman kudoksissa, suoritimme immunohistokemiaa CD271. Yhdenmukainen aiemman raportin [23], havaitsimme vahvaa värjäytymistä hermoja positiivisena kontrollina. Epiteelisolujen normaalin haiman kanavien ei osoittanut ekspressiota CD271, ja PDAC solut värjäämättä. Normaali haima (NP), stroomasoluista noin haiman kanava harvoin värjättiin (kuvio 1A-a). Olemme kuitenkin havaittu, että stromasoluja värjäytyivät voimakkaasti noin haiman intraepiteliaalisten neoplasia (Panin) (Kuva 1A-b) ja intraduktaalisissa papillaarisen mucinous kasvain (IPMN) (Kuva 1A-c). Vuonna PDAC kasvaimet, stroomasolut noin haimasyövän soluja osittain värjätään. Kuitenkin, CD271

+ stroomasolut eivät olleet vieressä syöpäsoluja PDAC, ja värjäytyivät voimakkaasti reunassa eikä keskellä kasvaimia (kuvio 1A-d). CD271 korkea värjäytyminen stroomasoluissa oli läsnä 6,5% (2/31) nonyylifenolin, 30,0% (3/10) ja Panin 27,6% (29/105) ja PDAC ja 84,6% (33/39) ja IPMN. CD271 korkea värjäys olivat merkitsevästi korkeampi stroomasoluissa ja IPMN (p 0,0001) ja PDAC (p = 0,0069) kuin stroomasoluissa NP (taulukko 1).

(A) immunohistokemiallinen värjäys CD271 haiman kudoksissa. (A-a) normaali haima (NP), stroomasolut harvoin värjäytyvät positiivisiksi CD271. (A-b, -c) stroomakasvaimet solut värjäytyivät voimakkaasti noin haiman intraepiteliaalinen neoplasia (PANIN) (b) ja intraduktaalisissa papillaarinen mucinous kasvain (IPMN) (c). (A-d) In haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC), stroomasolut osittain värjätään, ja CD271

+ stroomasolut eivät ole vierekkäin haimasyövän soluja. Musta nuolenkärkiä ja nuolet osoittavat CD271

+ solujen ja hermoja kuin positiivisena kontrollina leikesarjojen. (A-e) α-sileän lihaksen aktiini (SMA) ilmentyy useimmissa stromasoluja ympäri syöpäsoluja ja neoplastisia tubulukset. Valkoinen arrowheads osoittavat α-SMA solujen sarja kohdissa. Alkuperäinen suurennus: 200 ×, insets: 600 ×. (B) Kaplan-Meier selviytymisen analyysi CD271 voimakasta ilmentymistä stroomaan PDAC. Stroomakasvaimet CD271 korkea ilmentyminen liittyy ennuste oli hyvä (p = 0,0040).

stroomakasvaimet CD271 ilmentyminen itsenäisesti korreloi hyvä ennusteeseen

Kartoitimme korrelaatioita strooman CD271 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä PDAC. Vaikka erot eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä, pT1 /pT2, ei imusolmuke etäpesäke, UICC vaihe I, ei perilymfaattinen invaasio, ei verisuonia invaasio, ja patologinen marginaali /negatiivinen havaittiin useammin strooman CD271high värjäytymistä ryhmässä kuin strooman CD271 alhainen värjäys ryhmä (taulukko 2). Mielenkiintoista, strooman CD271 ilmentyminen liittyi hyvä ennusteeseen haimasyövän (p = 0,0040) (kuvio 1 B). Mediaani eloonjäämisajasta CD271 korkea värjäystä ja CD271 alhainen värjäys potilaat olivat 62 ja 18,5 kuukautta, vastaavasti. Seuraavaksi suoritimme Monimuuttuja selviytyminen analyysi perustuu Coxin suhteellisen riskin malliin kaikkien parametrien todettiin olevan merkittävä vuoteen univariate analyyseja, mukaan lukien strooman CD271 ilme, pT luokka, imusolmuke etäpesäke, UICC vaiheessa perilymfaattinen invaasio, verisuonia invaasio, ja patologinen marginaali positiivisuus (taulukko S2). Strooman CD271-ekspressiota havaittiin olevan riippumaton prognostinen markkeri haimasyövän potilailla, ja suhteellinen riski strooman CD271: n ilmentyminen oli 0,495 (taulukko 3).

CD271 stroomasolut ovat alapopulaatio aktivoitu PSCs

luonnehtia CD271

+ stroomasolut, suoritimme immunohistokemiallisesti varten α-SMA, merkkiaine aktivoitu PSCs, sarjavalmistukseen PDAC osissa. Huomasimme, että α-SMA ilmaistiin useimmissa stroomasoluissa ympäri syöpäsoluja ja neoplastisten tubulukset (kuvio 1A-e). CD271

+ stromasoluja rajoittui alueilla vahva α-SMA ilme. Nämä havainnot osoittavat, että CD271

+ stromasoluja ovat alapopulaation aktivoitua PSCs.

CD271 ilmentyminen ihmisen PSCs

eristetty viisi primääriviljelmien PSCs tuoreesta ihmisen haiman kudoksista, ja niiden identiteetti varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksen. PSC: t olivat stellate kaltainen tai kara-muotoinen ja ilmaisi α-SMA ja vimentiinista (kuvio 2A). Näiden immunofluoresenssilla analyysit meidän ei havaittu CD271 ilmentymistä PSCs (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavaksi arvioidaan CD271 ilmentymisen 12 ensisijainen Ihmisen PSCs virtaussytometriaa käyttämällä, ja sen on todettu CD271-positiivisia hinnat +0,0-+2,1% vuonna PSCs (kuvio 2B).

(A) edustaja mikrovalokuva immunofluoresenssivärjäystä a-sileän lihaksen aktiini (SMA) (vihreä) ja vimentiinista (punainen) in PSCs. Tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (sininen). PSC: t osoittavat stellate kaltainen tai kara-muotoinen morfologia ja ilmaista α-SMA. Alkuperäinen suurennus: 200 ×. (B) positiivinen hinnat CD271 ilmentymisen PSCs ovat 0,0-2,1% virtaussytometrisella analyysejä. Edustavia virtaussytometrinen kuvia CD271 aktivoidussa PSCs on myös esitetty (oikealla).

CD271

+ PSCs kasvavat kautta syövän stroomavuorovaikutuksiin

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia PSCs fenotyyppiin syöpäsolujen käyttäen yhteisviljelmä järjestelmää. Käytimme kaksi haimasyöpä solulinjoissa, SUIT-2 ja Capan-2, ja kaksi ensisijaista Ihmisen PSCs eristettyjen PDAC ja hyvänlaatuisia haiman kystat. Sen jälkeen, kun yksipuolinen tai yhteisviljelmä haimasyöpä soluja 72 tunnin ajan, voimme arvioida CD271 ilmentyminen PSCs käyttäen virtaussytometrialla ja reaaliaikaisen qRT-PCR: llä. Virtaussytometrillä analyysit, havaitsimme prosenttiosuus CD271

+ soluja oli korkeampi yhteisviljelmä kuin yksipuolinen (0,7% vs. 0,1%) (kuvio 3A). Reaaliaikaisella qRT-PCR-analyysit, taso CD271 mRNA ilmaisun kahdessa kulttuureissa PSCs oli huomattavasti korkeampi yhteisviljelmä kanssa haiman syöpäsoluja kuin yksipuolinen (p 0,001) (kuvio 3B). Seuraavaksi keräsimme supernatanttia SUIT-2 haimasyöpäsoluissa, ja lisännyt sen kaksi ensisijaista kulttuureissa PSCs. Vertasimme tasot CD271 mRNA: n ekspression joukosta monokulttuureja, viljelmiä syöpäsolun johdettu supernatantti, ja keraviljelmiä haimasyöpä soluja 72 tunnin ajan. Taso CD271 mRNA ilmaisun oli korkein keraviljelmistä kanssa haiman syöpäsoluja. Lisäksi taso CD271-mRNA: n ilmentyminen oli korkeampi viljelmissä syöpäsolujen johdettu supernatantti kuin monokulttuurien (p = 0,0053) (kuvio 3C). Immunofluoresenssilla analyysit, olemme havainneet CD271 ilmentyminen PSCs oli hieman suurempi viljelmässä syöpäsolujen johdettu supernatantti toisin monokulttuurien (kuvio 3D).

(A) In virtaussytometria-analyysit, prosenttiosuus CD271

+ solut on suurempi yhteisviljelmä kuin yksipuolinen (0,7-0,8% vs. 0,1%). (B) tasot CD271 mRNA: n ilmentymisen kahdessa kulttuureissa PSCs ovat huomattavasti korkeammat keraviljelmistä kanssa haiman syöpäsoluja kuin monokulttuurien (p 0,001). (C) taso CD271 mRNA ilmaisu on suurempi viljelmissä syöpäsolu johdettu supernatantti kuin monokulttuurien (p = 0,0053). (D) edustaja mikrovalokuva immunofluoresenssivärjäystä CD271 (vihreä) ja α-sileän lihaksen aktiini (SMA) (punainen) in PSCs. Tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (sininen). CD271 in PSC oli hieman ilmaistu kulttuureissa syövän soluperäisissä supernatantti, vaikka se oli vaikea havaita CD271 ilmentyminen monokulttuurien. Alkuperäinen suurennus: 200 ×. * P 0,01; ** P 0,001.

CD271 ilmentyminen vähenee jälkeen ohimenevää ilme, kun viljellään haimasyöpä solujen

Käytimme yhteisviljelmä, joka koostuu kahdesta haimasyövän solulinjoissa, SUIT -2 ja Capan-2, ja kaksi ensisijaista ihmisen PSCs arvioida ajasta riippuvia muutoksia CD271 mRNA: n ilmentymisen. Sen jälkeen monokulttuuria tai yhteisviljelmä PSCs haimasyöpä solujen 1-5 päivää, arvioimme taso CD271 mRNA ilmaisun PSCs. Monokulttuurien ekspressio CD271-mRNA: n PSC-koodia ei muutu. Kuitenkin keraviljelmistä Haimasyöpä solujen taso CD271 mRNA ilmaisun lisääntyi päivänä 3 (p = 0,0249) ja saavutti päivänä 4 (p 0,0001). Mielenkiintoista on, että tasot CD271 mRNA: n ilmentymisen laski päivän jälkeen piikin ilmaisu (p 0,0001) (kuvio 4A). Seuraavaksi kerättiin supernatantti Capan-2 haimasyövän soluja, se on lisätty kaksi ensisijaista viljelmiä PSCs ja arvioitiin ajasta riippuvia muutoksia CD271 mRNA: n ilmentymisen. Viljelmissä supernatantin, taso CD271 mRNA ilmaisun kasvoi päivänä 2 (p 0,0001) ja sitten laski päivänä 4 (p 0,0001) (kuvio 4B). Samanlainen yhteisviljelmä haimasyöpä solujen CD271 ilmentyminen väheni jälkeen ohimenevää ilme, kun viljellään kanssa supernatanttia.

(A) Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysit osoittivat, että tasot CD271 mRNA: n ekspression PSCs in yhteisviljelmä haimasyöpä solut alkavat lisääntyä päivänä 3 (p = 0,0249), ovat korkeimmat päivänä 4 (p 0,0001), ja sitten lasku seuraavana päivänä sen jälkeen, kun piikin ilmaisu (p 0,0001). (B) Kulttuureissa lisäten syöpäsolujen johdettu supernatantti, taso CD271 mRNA ilmaisun alkoi kasvaa päivänä 2 (p 0,0001) ja sitten laski päivänä 4 (p 0,0001). (C) arviointi erojen CD271 ilmentyminen toiminnosta riippuen PSCs reaaliaikaisella qRT-PCR. Taso CD271 mRNA: n ekspression yläpuoli johdettuja PSCs, joka ei liikkunut kohti syöpäsolujen kautta matrigeelin ja pysyi yläkammiot, on alhaisempi kuin alapuoli johdettuja PSCs, joka ei liiku kohti haimasyöpäsoluissa kautta matrigeelin (p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää.

CD271 ilmentyminen vähenee PSCs vaeltavat läpi matrigeelin kohti haimasyöpäsoluissa

Seuraavaksi arvioimme CD271 ilmentyminen PSCs jälkeen toimintojen eriyttäminen käyttäen Matrigel invaasiomääritys. Tässä viljelyjärjestelmästä johon ylempi kammiot päällystetään matrigeelin, arvioimme SUIT-2 haimasyöpäsoluissa ja kaksi ensisijaista Ihmisen PSCs. PSCs ylemmässä kammioissa inkuboitiin 72 tunnin viljelyn kanssa haimasyöpäsoluissa alakammioissa, tai valvonta ilman haimasyöpäsoluissa alakammioissa. PSC: t kerättiin ylä- ja alapuolelta ylemmän kammioiden erikseen. Yläpuoli johdettuja PSCs olivat soluja, jotka eivät muuttaneet kohti syöpäsolujen kautta matrigeelin ja jäi ylähuoneissa. Alapuolelta johdettu PSCs oli soluja, jotka vaelsivat kohti haimasyöpäsoluissa kautta Matrigel ja kerätään pohjalle puolella yläkammiot. Sitten analysoitiin CD271 mRNA ekspressiotasot ylä- tai alapuolen johdettujen PSCs arvioimaan toiminnallisia eroja CD271

+ ja CD271

– PSCs. Taso CD271 mRNA ilmaisun oli suurin yläpuoli johdetun PSCs jälkeen kulttuurin haimasyöpäsoluissa (p 0,001). Mielenkiintoista on, että taso CD271 mRNA: n ekspression alapuolelta johdettu PSC siirryttäessä kohti haimasyövän soluja oli alhaisempi kuin ylä- puolella johdettuja PSC, joka ei liiku kohti syöpäsolujen (p 0,01). Kontrolleissa ei ollut eroja CD271 mRNA: n ekspression tasojen ylä- ja alapuolen johdettu PSC-koodien, ja nämä tasot olivat alhaiset verrattuna tasot CD271 mRNA: n ilmentymisen viljelmissä haimasyövän soluja (kuvio 4C).

CD271

+ PSCs ovat läsnä kasvain marginaalien /reuna ja ovat poissa kasvaimen ytimessä

arvioimiseksi lokalisoinnin CD271

+ PSCs

in vivo

, me istutetut SUIT -2 haimasyövän soluja haiman hännän SCID-hiirten tai cotransplanted ne kaksi ensisijaista ihmisen PSCs. Me lopetettiin hiiriä päivinä 8, 15 tai 22, ja arvioidaan lokalisoinnin CD271

+ PSCs että ksenograftikasvaimissa. Stroomakasvaimet CD271 ilmentyminen havaittiin lainkaan päivää elinsiirron jälkeen, riippumatta elinsiirtoon tai cotransplantation. Stroomakasvaimet CD271 korkea värjäys hinnat olivat 50% (3/6), 60% (3/5), ja 67% (4/6) päivinä 8, 15, ja 22, vastaavasti. Joka tapauksessa olemme havainneet CD271 ilme hermokimppuja positiivisena kontrollina, ja totesi, että haiman syöpäsoluja koskaan ilmaissut CD271. Olemme varmisti aktivoitua PSCs jonka kara-muotoinen morfologia ja α-SMA värjäystä. Aktivoidut PSCs ollut olemassa ksenograftikasvaimissa ja normaalin haiman alueilla ympäri kasvaimet (kuva 5A). Kuitenkin CD271

+ PSCs olemassa vain normaalin haiman alueilla ympäri ksenograftikasvaimissa, ja olivat poissa kasvaimen ytimessä (kuvio 5B).

(A) α-SMA

+ stroomasoluissa kuten aktivoitu PSCs, olemassa ksenograftissa kasvain ja normaali haima (NP) alueet (vasen puoli) ympärille kasvain (oikealla puolella). (B) Harva CD271

+ stromasoluja oli läsnä NP-alueella (vasen puoli) ympärille vierassiirrettä kasvain, ja olivat poissa kasvaimen ytimessä (oikea puoli). Alkuperäinen suurennus: 200 ×.

Keskustelu

Aiemmin Trim ym., [18] ilmoitti, että CD271 ilmaistiin PSCs. Haas et ai., [19] myös, että CD271 oli hieman ilmaistu PSCs ja että taso CD271 mRNA ilmaisun nopeasti vähentynyt ensisijainen rotan PSCs viljelyn aikana. Huomasimme, että CD271

+ PSCs olemassa kirurgiset haiman kudoksista käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Kuitenkin qRT-PCR ja virtaussytometria analyysit paljastivat, että CD271 ilmentyminen PSCs eristettyjen haiman kudoksista oli hyvin heikko. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CD271 ilmentyminen ensisijainen ihmisen PSCs myös nopeasti vähentynyt viljelyn aikana.

Huomasimme, että CD271-mRNA ohimenevästi lisääntynyt PSCs viljellään haiman syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että haiman syöpäsoluja parantaa CD271 ilmentymistä PSCs. Kuitenkin esillä immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että CD271

+ PSCs myös olemassa ympäri Panin ja IPMN, syövän esiasteita. Lisäksi Trim ym., [18] kertoi, että CD271

+ PSCs löytyivät kudoksissa krooninen haimatulehdus potilaita. Nämä havainnot viittaavat siihen, ulkonäkö CD271

+ PSCs ei ole spesifinen pahanlaatuisia sairauksia, ja se liittyy desmoplasia.