Krooninen sairaus

tiivistelmä

glykaation lopputuotteiden (AGE) tuotetaan peruuttamaton ei-entsymaattinen reaktio hiilihydraatteja ja proteiineja. Potilaat, joilla on diabetes mellitus (DM) tiedetään kohonneet AGE tasolle, jota pidetään riskitekijä diabetekseen liittyvien komplikaatioiden. Kliinisessä ympäristössä, on osoitettu, että potilailla, joilla suusyövän yhdessä DM on suurempi todennäköisyys syövän etäpesäkkeiden ja alemman syövän eloonjäämisaste. AGE-RAGE (reseptori AGE) on myös korreloi etäpesäke ja angiogeneesiä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että pahanlaatuisuuden syövän voidaan tehostaa glyseraldehydi-johdettu AGE; kuitenkin taustalla olevaa mekanismia jää epäselväksi. Tutkimuksessa selvitettiin ilmeisesti läheinen korrelaatio AGE-RAGE ja pahanlaatuisuuden SAS suun tasyöpäsolulinja. Tässä tutkimuksessa AGE lisääntynyt ERK-fosforylaation, parannettu solujen vaeltamiseen, ja edisti ilmaus RAGE, MMP2, ja MMP-9. Käyttäen PD98059, RAGE-vasta-aine, ja RAGE RNAi estää RAGE polku johti inhibition ERK-fosforylaation. Solujen vaeltamiseen, MMP2 ja MMP-9 ilmaisun vähensi myös tämä käsittely. Meidän havainnot osoittavat, kuinka tärkeää on AGE-RAGE osalta pahanlaatuisuuden suusyövän, ja auttaa selittämään huonon ennusteen DEM aiheista suun kautta syöpä.

Citation: Ko SY, Ko HA, Shieh TM, Chang WC, Chen HI, Chang SS, et ai. (2014) Cell Migration säätelee AGE-RAGE Vuorovaikutus ihmisen Oral Cancer Cells

In vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10,1371 /journal.pone.0110542

Editor: Barry I. Hudson, University of Miami, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2014; Hyväksytty: 16 syyskuu 2014; Julkaistu 16. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Ko et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Science Council, Taiwan (NSC 100-2314-B-309-002-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glykaation lopputuotteiden (AGE) ovat seurausta Maillard-reaktion välillä hiilihydraatteja ja proteiineja. Ikääntyminen ja vähentää metabolinen funktio on osoitettu lisäävän muodostumista AGE [1] – [5]. Lisääntynyt AGE kertymistä on havaittu myös potilailla, joilla on Alzheimerin tauti (AD) tai diabetes (DM) [6] – [8]. Lisäksi AGE on osoitettu olevan rooli patogeneesissä DM siten, että AGE kertyminen pidetään riskitekijä eri komplikaatioita [9] – [14].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että AGE ja raivoaa (reseptorit AGE) säätelevät solumigraation [15] – [17]. RAGE yli-ilmentyminen on yhdistetty paksusuolen, kurkunpään, kielen, vatsa, ja suu [18] – [20], kautta syövän syntymistä [21], solujen lisääntymistä, etäpesäkkeiden invaasio, ja angiogeneesi [22] – [25]. Kliinisessä tutkimuksessa, joka oli mukana potilaita, jotka kärsivät suun kautta syövän sekä DM, syöpä tuli yhä invasiivisia, mikä johtaa laskuun selviytymisasteet [26]. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin edelleen korrelaatio suusyövän ja DM [27]. RAGE on osoitettu olla tiiviisti mukana hyökkäyksen suun syöpä [15], ja pahanlaatuisuuden syöpä voidaan parantaa glyseraldehydi-johdettu AGE [17]. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia vastuussa näistä vaikutuksista on edelleen epäselvä.

Tämä tutkimus tutki ilmeisesti voimakas korrelaatio AGE ja pahanlaatuisuuden suun syöpä. Tuloksemme osoittavat, että AGE parantavat solujen vaeltamiseen ja myös lisätä ERK-fosforylaation ja ilmaisun RAGE, MMP2, ja MMP-9. Esikäsittely PD98059 (ERK-inhibiittori) havaittiin tukahduttaa vaikutuksia AGE; kuitenkin, RAGE ekspressiota ei estynyt. RAGE-vasta-aineita käytettiin myös estää konjugointi AGE, jotka vähensivät ERK-fosforylaation, ilmaus MMP2, MMP9 ja solujen vaeltamiseen. Lisäksi RAGE RNAi näyttää säännellä näitä vaikutuksia, mikä viittaa siihen, että AGE-RAGE järjestelmä muuttaa solujen vaeltamiseen kautta ERK-fosforylaation ja säätelyyn loppupään polkuja. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy lisätodiste AGE-RAGE on tärkeä rooli määritettäessä maligniteetti suusyövän.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

fenyylimetyyli- fluoridien (PMSF), naudan seerumin albumiini (BSA), DL-Glyseraldehydi, ja PD98059 hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). DMEM, naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä, streptomysiiniä, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), trypaanisinistä, ja Lipofectamine RNAiMAX ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). GAPDH (Cat nro .: MAB374) hankittiin Chemiconilta (Temecula, CA, USA). ERK (Cat No .: SC-94), p-ERK (Cat No .: SC-7383), RAGE (Cat No .: SC-94), ja raivoavat siRNA (Cat No .: SC-36374) hankittiin Santa Cruz bioteknologia (Santa Cruz, CA, USA). MMP2 (Cat No .: 2763-S) ja MMP-9 (Cat No .: 2551-S) ostettiin Epitomics (Burlingame, CA, USA). Nitroselluloosakalvoil- ostettiin PALL corp. (Ann Arbor, MI, USA). Enhanced kemiluminesenssin (ECL) hankittiin Millipore (Billerica, MA, USA). WST-1 sarja hankittiin Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, USA). Culture-Insert hankittiin ibidi (Verona, WI, USA).

valmistaminen AGE

AGE valmistettiin inkuboimalla BSA (pH = 7,4) PBS 20 mM DL-Glyseraldehydi at 37 ° C: ssa 1 viikko. Tuote dialysoitiin PBS: ssä 4 ° C: ssa 2 tuntia, ja tämä sykli toistettiin 5 kertaa. Tuote konsentroitiin sitten 4 ° C: ssa käyttäen Amicon Ultra-proteiinin pitoisuus putken (Millipore), ja sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 30 minuutin ajan, ennen kuin se varastoidaan -80 ° C: ssa [28].

Soluviljely ja käsittely

suullinen tasyöpäsolulinja SAS (Japani Collection of Research Bioresources Cell Bank [JCRB], Japani) kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Viljelmä pidettiin DMEM (Invitrogen) rutiininomaisesti täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 2 mM L-glutamiinia, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin seerumivapaassa 24 tuntia ennen käsittelyä.

trypaanisinisen väriaineen ekskluusiomääritystä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille konsentraationa 10

5 kohti ja viljeltiin 24 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritetään niiden kyky sulkea 0,5% trypaanisinisellä (Invitrogen), hoidon jälkeen 100-400 ug /ml AGE 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Yhtä suuri tilavuus trypaanisinivärin liuosta (0,1%, w /v), HBSS, ja solujen liete yhdistettiin ja pidettiin huoneenlämpötilassa viiden minuutin ajan. Näytteet ladattiin sitten hemosytometrillä luokitella solujen elävä tai kuollut mukaan ottoa väriainetta. Kaikki esitetyt luvut tässä tutkimuksessa ovat keskiarvoja rinnakkaisessa kokeessa.

WST-1 määritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille pitoisuudella 5 x 10

3 per syvennys ja viljeltiin 24 tuntia. Soluproliferaatiota havaittiin, WST-1 (Clontech) kunnostetussa alustassa. Näytteet valmistettiin esitettyä protokollaa valmistajan. Lyhyesti, hoidon jälkeen AGE (0-400 ug /ml), elatusaine sentrifugoitiin 2000 rpm 10 minuuttia. Supernatantti siirrettiin sitten 96-kuoppaisille levyille (100 ul /kuoppa). Reaktioseos (100 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan, minkä jälkeen inkuboitiin 30 minuutin ajan. Itämisaikana, näytteitä pidettiin huoneenlämmössä (RT) ja valolta suojattuna. Absorbanssi näytteistä mitattiin 490 nm: ssä. Viite aallonpituuden tulisi olla suurempi kuin 600 nm. Kaikki esitetyt luvut tässä tutkimuksessa ovat keskiarvoja kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

RNA-interferenssi Kokeet

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille pitoisuutena 2 x 10

5 solua per kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin RAGE siRNA (pooli 3 kohdespesifisen 19-25 nt siRNA, Santa Cruz) tai sense-juosteen sekvenssi RNAi negatiivisena kontrollina (5′-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 ’) [29]. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) valmistajan protokollan. Erityisesti laimenna 40 pmol RNAi Duplex 250 pl Opti-MEM I vähensi seerumiväliaineessa ilman seerumia. Sitten sekoita varovasti Lipofectamine RNAiMAX ja laimennetaan 4 ui seos 50 ui Opti-MEM I vähensi seerumiväliaineessa. Laimennetun RNAi duplex yhdistettiin laimean Lipofectamine RNAiMAX ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi, RNAi kääntöyksikkö Lipofectamine RNAiMAX kompleksit lisättiin kuhunkin kuoppaan. Tämä johti lopulliseen tilavuuteen 600 ui ja lopullinen siRNA pitoisuus oli 20 nM. Soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan ennen niiden käyttöä kokeissa.

Western blot

Proteiinit (30 ug) erotettiin käyttämällä 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvoille (PALL Corp .). Membraanit blokattiin käyttämällä rasvattoman maidon ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: anti-p-ERK (laimennus 1:1,000); anti-ERK (laimennus 1:1,000); anti-MMP2 (laimennus 1:1,000); anti-MMP-9 (laimennus 1:1,000); anti-RAGE (laimennus 1:1,000, anti-GAPDH (laimennus 1:40,000). Ensisijainen vasta-aineet poistettiin sitten ja kalvot pestiin PBST: llä puskurissa 30 minuutin ajan. Kalvoja jälkeen inkuboitiin 45 minuutin ajan RT: ssä seuraavasti sekundäärisiä vasta-aineita: piparjuuriperoksidaasi konjugoitu anti-hiiri (laimennus 1:4,000) ja anti-kani (laimennus 1:4,000) (Chemicon). Lopuksi, sekundaariset vasta-aineet poistettiin ja kalvot pestiin PBST: llä puskuria kahdesti 30 minuutin ajan. signaalit havaittiin käyttäen Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus -kittiä (Millipore). tiheydet signaalit mitattiin käyttäen kuvantamisjärjestelmä, ja signaalit kvantitoitiin sen jälkeen kun normalisoitu niitä vastaan ​​GAPDH. Kaikki luvut esitetään tässä paperissa ovat keskiarvoja kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Cell migraatiokokeessa

solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille käyttäen Culture-Insert (ibidi) pitoisuutena 6 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja sitten viljeltiin 24 tuntia. Kauden jälkeen 24 tuntia seerumittomassa olosuhteissa kulttuuri-insertit poistettiin ja solut pestiin käyttäen HBSS, ennen kuin hoidetaan AGE analysointiin solumigraation.

Zymorgraphy määritys

hoidon jälkeen 200-400 ug /ml AGE 4 tai 24 tunnin ajan, solut ympättiin 7 cm: n maljoihin pitoisuudella 1 x 10

6 solua. Tsymografialla käytettiin havaitsemaan toiminta MMP2 ja MMP9 ehdolliseen väliaineessa. Tämän saavuttamiseksi käytimme 7,5% SDS-PAGE-geelillä, joka sisälsi 0,1% gelatiinia (J.T.Baker, Center Valley, PA, USA). Sitten geeli pestiin 2,5% Triton X 100: ssa 30 minuutin ajan RT: ssä. Triton X 100 poistettiin ja geeli pestiin RO H

2O. Sitten lisättiin renaturoimalla-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7.2,20% glyserolia) 30 minuuttia RT: ssä. Renaturoimalla puskuri poistettiin ja geeli pestiin RO H

2O. Lisäsimme sitten kehittää puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 8,8, 5 mM CaCI2, 1 mM ZnCI 2) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kehittäminen puskuri poistettiin ja geeli pestiin RO H

2O. Geelivärjäys tehtiin 1 tunnin ajan RT: ssä käyttäen PageBlue Protein Värjäys (Fermentas, Lafayette, CO, USA). Gel värinpoistoliuos suoritettiin käyttäen RO H

2O huoneenlämpötilassa. (Kuva S1).

Tilastolliset analyysit

teimme opiskelija t-testejä, yksisuuntainen ANOVA, ja p-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vaikutus AGE suullinen syöpäsolujen

ensin arvioitiin vaikutuksen AGE solujen elinkykyä. SAS-soluja käsiteltiin AGE (0-400 ug /ml) tai BSA: ta (0-400 ug /ml), 24 tai 48 tuntia, minkä jälkeen solujen lukumäärä ja leviämisen määrä määritettiin mukainen trypaanisinivärin syrjäytymisen (Fig. 1A ) ja WST-1 määrityksissä (Fig. 1 B). Verrattuna kontrolli soluihin, AGE käsitellyt solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen määrä (24 tuntia AGEs 100: 2,88 ± 0,16,

P

= 0,006; AGEs 200: 2.6 ± 0,25,

P

= 0,008; AGEs 400: 1,85 ± 0,05,

P

0,0001; 48 tuntia AGEs 100: 3,1 ± 0,18,

P

= 0,05; AGEs 200: 2,57 ± 0,17,

P

= 0,01; AGEs 400: 2,03 ± 0,08,

P

= 0,003). Sen sijaan, BSA havaittiin lisäävän solujen määrä (negatiivisena kontrollina, 24 tuntia: 4,77 ± 0,32, NS, 48 tuntia: 9,25 ± 0,35,

P

= 0,0004) (Fig. 1A). Lisäksi, solujen lisääntyminen osoitettiin estää AGE (Fig. 1 B). Lopuksi, käsittelemällä soluja AGE (400 ug /ml; 0-4 tuntia) lisätä maastamuuttoa; kuitenkin, BSA ei ollut mitään vaikutusta, siirtymisestä (Fig. 1 C).

SAS-soluja käsiteltiin AGE (0-400 ug /ml) tai BSA: ta (0-400 ug /ml) 24-48 tuntia. Solujen lukumäärä ja proliferaatiota havaittiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen (A) ja WST-1-määritys (B). AGE vähensi merkittävästi solujen; BSA: ta (negatiivisena kontrollina) kasvoi elinkelpoisuus (A). AGE esti myös solujen proliferaatiota (B). Käsittely AGE (400 ug /ml; 0-4 tuntia) tehostettu solumigraation, kun taas käsittely BSA ei (C).

AGE sääntelyn RAGE, MMP2, ja MMP-9

Soluja käsiteltiin AGE (200 ja 400 ug /ml) tai BSA: ta (400 ug /ml) 24 tuntia. Sitten käytetään western blot-analyysi havaitsemiseksi RAGE, MMP2, ja MMP-9. Verrattuna kontrolli solujen, tulos osoitti, että AGE käsitellyistä soluista esitti merkittävän kasvun RAGE (AGE 400: 1,3 ± 0,03,

P

= 0,0007), MMP2 (AGE 200: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,002; AGEs 400: 1,47 ± 0,04,

P

= 0,004), ja MMP-9 (AGE 400: 1,24 ± 0,03,

P

= 0,0008) (Fig. 2). Lisäksi toiminnallisuus MMP2 ja MMP9 kasvoi hoidon jälkeen AGE 4 tai 24 tunnin ajan (kuvio S2).

jälkeen käsittelemällä soluja AGE (200 ja 400 ug /ml) tai BSA: ta (400 ug /ml ) 24 tuntia, RAGE, MMP2, ja MMP-9 havaittiin western blot -analyysillä (A). AGE huomattavasti ilmaisun RAGE, MMP2, ja MMP-9 (B).

asetukseen ERK fosforylaation AGE

Jotta voitaisiin tunnistaa polun AGE, SAS solut käsiteltiin joissa AGE tai BSA 24 tuntia. ERK-fosforylaation havaittiin sitten Western blot -analyysiä käyttämällä. Tuloksemme osoittavat, että hoito AGE huomattavasti ERK-fosforylaation (AGE 400: 1,26 ± 0,06,

P

= 0,01) (Fig. 3A). ERK-fosforylaatio parannettu seuraavat 4 tuntia AGE hoito (kuvio S2); kuitenkin, esikäsittelemällä solut PD98059 1 tunnin ajan vähensi ilmaus MMP2 ja MMP9 (Fig. 3B ja C). Näyttää siltä, ​​että PD98059 esikäsittely esti vaikutuksia AGE solumigraation (Fig. 3d); kuitenkin, RAGE ilmentyminen ei ollut vaikutusta (AGE 400: 1.27 ± 0.04,

P

= 0,003) (Kuva. 3E).

Western blot-analyysi osoittaa, että hoitoon SAS soluja AGE 24 tuntia lisännyt ERK fosforylaatio (A). Esikäsittely PD98059 1 tunti vähennetään ERK-fosforylaation, MMP2 ja MMP-9 (B ja C) sekä solujen vaeltamiseen (D); kuitenkin RAGE tasot yhä lisääntynyt (E).

asetukseen ERK mukaan AGE kautta RAGE

RAGE-aineet (10 ng /ml esikäsittely 1 tunti) käytettiin estämään AGE konjugaatio. Hoito AGE johti merkittävään kasvuun ERK-fosforylaation ja ilmaisun MMP2, ja MMP-9 (ERK: 1,31 ± 0,03,

P

= 0,0008; MMP2: 1,38 ± 0,04,

P

= 0,0005; MMP-9: 1.32 ± 0.09,

P

= 0,02). Verrattuna soluihin käsitelty AGEs yksin, solut, joita käsiteltiin sekä AGE ja RAGE-vasta osoittivat merkitsevästi esti ERK-fosforylaation (

P

= 0,009) sekä vähensi ilmaus MMP2 (

P

= 0,05) ja MMP-9 (

P

= 0,0003) (Fig. 4 A ja B). RAGE vasta-aineet osoitettiin myös tukahduttaa solujen vaeltamiseen (Fig. 4C).

käyttö RAGE vasta-ainetta (10 ng /ml esikäsittely 1 tunti) estää AGE konjugaatio johti merkittävään kasvuun ERK fosforylaatio, MMP2, ja MMP-9 vuoksi AGEs. Verrattuna AGE hoito (#), RAGE-vasta tukossa ERK-fosforylaation, MMP2, ja MMP-9 (A ja B) sekä solujen vaeltamiseen (C).

RAGE RNAi (20 nM 48 tuntia) sitten käytettiin hiljentää proteiinin ilmentymisen. Verrattuna RNAi negatiivisen kontrollin (N), RAGE RNAi osoitettiin olevan merkittävästi tukahduttaa RAGE lauseke (0,64 ± 0,07,

P

= 0,006) (Kuva. 5A). Tukahduttaminen solumigraation mukaan RAGE RNAi havaittiin tapahtuvan itsenäisesti vaikutuksilta AGE (Fig. 5B). Lisäksi RAGE RNAi esti ERK fosforylaatio (RNAi: 0,64 ± 0,08,

P

= 0,01; N + AGE: 1,26 ± 0,03,

P

= 0,001) MMP2 (N + AGE: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,003), ja eritystä MMP-9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,

P

= 0,002; N + AGE: 1,36 ± 0,05,

P

= 0,003). Verrattuna N + AGEs hoito RNAi + AGEshad merkittävä vaikutus kaikkiin kolmeen näistä prosesseista (ERK:

P

= 0.02; MMP2:

P

0,003; MMP-9:

P

= 0,04) (kuvio. 5C ja D). Negatiivinen kontrolli ei osoittanut merkittäviä vaikutuksia.

RAGE RNAi (20 nM 48 tuntia) käytettiin hiljentää proteiinin ilmentymisen. Verrattuna RNAi negatiivinen kontrolli (N), RAGE RNAi vähensi merkitsevästi RAGE ilmentymistä (A). Tukahduttamista solun muuttoliikkeen RAGE RNAi tapahtui riippumatta hoidon AGE (B). RAGE RNAi esti myös ERK-fosforylaation, MMP2, ja MMP-9. Verrattuna N + AGE (#), RNAi + AGE esitti merkittävä väheneminen (C ja D) ja negatiivinen kontrolli ei ollut vaikutusta.

Keskustelu

suhdetta suusyövän ja DM on osoitettu edellisessä tutkijat [30] – [32]. Potilaat kärsivät suusyövän yhdessä DM ovat kasvot erittäin invasiivisen syöpäsoluja, ja alhainen eloonjäämisluvut [26]. Kuitenkin taustalla oleva mekanismi suhde suun syövän ja DM ei ole selvitetty. Tämä on ensimmäinen tutkimus, tutkia mahdollista yhteyttä vuotiaille ja suun syöpä. Teimme tätä tutkimusta tunnistaa roolia AGE-RAGE järjestelmän suusyövän, ja selvittämään suhdetta suusyövän ja DM.

Tutkijat ovat aiemmin raportoitu, että AGE ja RAGE säätelevät solujen vaeltaminen [15] – [17], [33]. Tuloksemme vahvistavat, että AGE parantavat solujen vaeltamiseen ja osoittavat myös, että AGE vähentää solujen elinkykyä. Takino et ai. saatu vastaavia tuloksia käyttäen glyseraldehydi-johdettuja AGE [17]. Lisäksi Bhawal et ai. kertoi, että RAGE on läheisessä yhteydessä invasiivisuus suusyövän [15], ja meidän tulokset osoittavat, että AGE säätelevät solujen vaeltamiseen kautta ilmaus RAGE. Kliinisessä ympäristössä, ilmaus MMP2 ja MMP-9 on ilmestynyt liittyy läheisesti etäpesäke suusyövän [34], [35]. AGE on edelleen osoitettu lisäävän eritystä MMP2 [17] ja säätelevät MMP-9 ilmaisun [36], [37] kautta, ERK-reitin [23], [38]. Tuloksemme tukevat näitä aikaisemmin havainto; Erityisesti, että ERK fosforylaatio ja ilmaus MMP2 ja MMP-9 säätelee AGEs. Lisäksi CD44 on muuttoliike tekijä liittyvä raivota [39]. Emme kuitenkaan ole havaittu merkittävää eroa CD44 ekspression jälkeen, AGE hoitoon (tietoja ei esitetty). Vastaava raportti vahvisti, että ilmaus CD44 ei vaikuta AGE [40]. Tämä viittaa siihen, että AGE-RAGE säätelevät solumigraatio kautta reittiä, joka ei ole CD44 riippuvainen.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että RAGE on moninkertainen reseptori, joka säätelee solujen lisääntymistä kautta ligandin (S100 tai HMGB1) [41] – [43]. Xu et ai. ja Meghnani et ai. viittaavat myös siihen, että RAGE lisää solujen lisääntymistä ja siihen liittyviä reittejä [44], [45]. Lisäksi HMGB1 on todettu säätelemään solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden kautta RAGE ja melanoomaa estoaktiivisuus (MIA) väylän suusyövän [46]. Tutkimuksessamme AGE ja BSA näyttävät eroavat vaikutukset SAS soluihin. AGE oli osoitettu vähentävän solujen määrä; kuitenkin, BSA lisääntynyt sitä. Tarkemmin sanottuna, tässä tutkimuksessa soluja inkuboitiin seerumittomassa 24 tuntia ennen hoitoa; Näin BSA saattanut toimia kasvutekijänä. Meidän havainto, että AGE vähensi solujen lisäten samalla ERK-fosforylaation osoittaa selvästi, että AGE eroavat vaikutuksia soluihin. Valencia et al. osoittivat myös, että erilaiset reitit geeniekspression aktivoidaan RAGE ligandin S100 ja AGE: [47]. Näin ollen vaikutukset AGE-RAGE järjestelmä poikkeavat muut ligandit.

käyttö PD98059 estää ERK-reitin johti tukahduttaminen solujen vaeltamiseen ja vähensi myös ilmaus MMP2 ja MMP-9; kuitenkaan mitään eroa ei havaittu osalta vaikutuksen AGE lisäämisessä RAGE ilme. Käyttö RAGE-vasta-aineen ja RNAi estää AGE-RAGE polku johti esti ERK-fosforylaation ja solujen vaeltaminen ja vähensi myös ilmaus MMP2 ja MMP-9. Nämä havainnot osoittavat, että vaikutukset AGE solumigraation tapahtua ERK-fosforylaation. Mielenkiintoista, aiemman kliininen tutkimus ehdotti, että kasvu RAGE tasot syövän korreloivat etäpesäkkeitä [15], [33]. Muissa solumalleja, RAGE ilmestyi säätelemään solujen vaeltamiseen [15], [48], [49]. Tuloksemme osoittavat, että vaikutukset RAGE RNAi vaikuttaa solujen vaeltamiseen, ERK fosforylaatio, ja MMP-9 ilmaisun itsenäisesti. Tämä havainto antaa lisää tukea väitettä RAGE välittää etäpesäke ilmaisun kautta MMP-9 kautta ERK-reitin.

Tässä raportissa AGE vähentynyt solujen elinkelpoisuuden ja parannettu solujen vaeltaminen, edistäen samalla ERK-fosforylaation ja parantaa ilmaus MMP2 ja MMP-9. PD98059, RAGE-vasta, ja RNAi osoitettiin välittävän AGE sääntelyä. Tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että RAGE säätelee ilmentymistä MMP-9 kautta ERK-reitin. Vielä tärkeämpää on, osoitimme roolia, joka AGE-RAGE pelaa maligniteetti suusyövän kautta sääntelyn ERK ja loppupään polkuja, lopulta vaikuttaa solujen vaeltamiseen suun syöpä. Mekanismi, jolla AGE-RAGE järjestelmä toimii meidän

in vitro

malli suusyövän on esitetty kuvassa. 6. AGE lisätä RAGE ilmaisua, joka stimuloi alavirran polun ERK-fosforylaation ja johtaa jopa sääntelyn MMP2 ja MMP-9. Tämä puolestaan ​​parantaa solujen vaeltamiseen, joka ilmenee siinä maligniteetti syövän. Nämä havainnot selittävät, miksi tapauksia suusyövän samanaikaisten DM läsnä lisääntynyt syövän invaasio ja vähentää eloonjäämisaste. Tulokset osoittavat myös, että kertyminen AGE vanhenemiseen tai DM nostaa todennäköisyys kehittää pahanlaatuinen syöpä.

AGE lisätä RAGE ilmaisun ja edistää alavirtaan koulutusjakson ERK-fosforylaation. Tämä vaikuttaa jopa säätelevien MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja parantaa solujen vaeltaminen, joka ilmenee maligniteetti.

tukeminen Information

Kuva S1.

sulkeminen solumigraation alueella. Muuttoaluetta mitattiin ImageJ ja kvantifioidaan tallennus muutoksia haava-alueen. AGE merkittävästi vähentynyt koko haavan alueen, kun taas PD98059, RAGE-vasta, ja RAGE RNAi vaimentaa siirtymästä 4 tuntia. Analyysi oli harjoittamiseen yksisuuntainen ANOVA, ja tulos oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,0001).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110542.s001

(TIF) B Kuva S2.

Toiminnallisesti MMP 2: n ja MMP 9 hoidon jälkeen SAS-solujen AGE (400 ug /ml) ja 0,5-4 tuntia, ilmentyminen ERK-fosforylaation havaittiin. Toiminnallisesti MMP 2 ja MMP 9 havaittiin zymorgraphy seuraavat AGE hoitoa 4 tai 24 tuntia. Tulokset osoittavat, että AGE lisääntynyt ERK-fosforylaation (A). MMP 2: n ja MMP 9 korotettiin AGE 4 tuntia, mutta vain MMP 2 lisättiin 24 tunnin kuluttua (B).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110542.s002

(TIF)