Krooninen sairaus

tiivistelmä

IGROVCDDP sisplatiini kestävä munasarjasyövän solulinja on myös resistentti paklitakselia ja malleja resistenssifenotyyppi uusiutuneen munasarjasyövän potilailla jälkeen ensilinjan platina /taksaania kemoterapiaa. TaqMan alhaisen tiheyden array (TLDA) käytettiin luonnehtimaan ilmaisua 380 liittyvien geenien kemoterapian resistenssin IGROVCDDP soluissa. Paklitakseli resistenssin IGROVCDDP välittää geenin ja proteiinin yli-ilmentyminen P-glykoproteiinin ja proteiini on toiminnallisesti aktiivinen. Sisplatiini vastus ei päinvastaiseksi elacridar, vahvistaa, että sisplatiini ei ole P-glykoproteiinin kautta. Sisplatiini resistanssi IGROVCDDP on monitekijäinen ja välittyy osittain glutationi polku ja laski kertymistä lääkkeen. Solun kokonais glutationi ei lisääntynyt. Kuitenkin entsyymiaktiivisuus GSR ja GGT1 olivat sääteli. Solun sijaintia kuparin kuljettajan CTR1 muuttunut kalvoon liittynyt IGROV-1 sytoplasmisen in IGROVCDDP. Tämä saattaa välittää aiemmin raportoitu kertymistä vika. Siellä oli vähentynyt ilmentyminen natrium kalium pumpun (ATP1A), MRP1 ja FBP jotka kaikki on aikaisemmin liittynyt platina kertymistä puutteita platina-resistenttejä solulinjoja. Sijainti solun MRP1 myös muutettu IGROVCDDP siirtää basolaterally verrattuna IGROV-1. BRCA1 oli myös ajan säädellään geenin ja proteiinin taso. Yli-ilmentyminen P-glykoproteiinin on kestävä malli kehitettiin sisplatiinin on epätavallinen. Tämä osoittaa, että P-glykoproteiini voi olla säädelty niin yleinen stressivaste sijaan erityisenä vastauksena alustaan. Mekanismit tunnettu IGROVCDDP solut voivat olla sovellettavissa uusiutunut munasarjasyöpä potilasta hoidettiin etulinjan platina /taksaani kemoterapiaa.

Citation: Stordal B, Hamon M, McEneaney V, Roche S, Gillet JP, O’Leary JJ, et al. (2012) Kestävyys Paklitakseli on Cisplatin hylkivät munasarjasyöpäsolulinja välittyy P-glykoproteiinin. PLoS ONE 7 (7): e40717. doi: 10,1371 /journal.pone.0040717

Editor: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center at San Antonio, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 helmikuu 2012; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 11 heinäkuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä Tutkimusta rahoittivat kansainvälisestä Marie Curie Incoming Fellowship Euroopan unionin PO7, ja irlantilainen Cancer Society Postdoctoral Fellowship (BS) . Välinen yhteistyö Britta Stordal ja National Cancer Institute tukivat Travel Fellowship Euroopan Association of Cancer Research. Tämä tutkimus tukee myös Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research (JPG, MG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja nalysis, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ennuste naisten munasarjasyövän on erittäin huono. Suurin osa potilaista on edennyt sairaus ja pitkäaikainen säilyminen näillä potilailla on 10-30% [1]. Nykyinen munasarjasyövän hoitoon on leikkaus seuraa platina /taksaani yhdistelmä kemoterapiaa [1]. Kemoterapeuttisten lääkkeiden sisplatiinin ja paklitakselin käytetään hoidettaessa monia kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien munasarja- syöpä. Sisplatiini sitoutuu DNA-säikeen, estää sekä DNA: n replikaatio ja RNA käännös ja lopulta liipaisu apoptoosin. Paklitakseli aiheuttaa sytotoksisuus sitoutumalla ja vakauttaa polymeroi- mikrotubulusten. Koska niiden erilaisia ​​toimintamekanismeja, platinat ja taksaanit ovat usein yhdistetty syövän hoidossa. Alkuperäinen vastata kemoterapiaan munasarjasyövän on korkea, mutta jopa 80%: lla potilaista lopulta relapsi ja tulla platina /taksaani kestävä.

IGROVCDDP sisplatiini kestävä munasarjasolulinja on epätavallinen sisplatiini kestävä malli, kuten se on myös rajat resistenttejä paklitakselia. Kun hankittu sisplatiinin vastus on tuotettu solulinjoja, vain 17% ovat myös resistenttejä paklitakselia [2]. 41% Sisplatiinin lääkeresistenttiä mallit eivät kestä paklitakselia ja 28% solumalleja tulla yliherkkiä paklitakselille [2]. Tämä viittaa siihen, että suurin osa syöpäpotilaiden hyötyisivät saavat kemoterapiaa, joka vuorottelee välillä sisplatiinin ja paklitakselin, kuten vastustuskyvyn kehittymistä yksi lääke on vähemmän todennäköisesti aiheuttaa resistenssin muille. Haasteena on, miten tunnistaa, mitkä potilaat reagoivat hyvin vuorotellen hoidon välillä sisplatiinin ja paklitakselin. Tämä johtuu siitä, kun taas suurin osa syöpäpotilaiden saattaa vastata hyvin tämän hoidon strategia, risti kestävä kohortin vastaisi huonosti ja on hoidettiin toinen hoito.

IGROVCDDP mallintaa resistenssifenotyyppi munasarjasyöpä potilaille, jotka ovat epäonnistuneet standardi etulinjan yhdistelmä platina /taksaania kemoterapiaa. Kemoterapeuttiset lääkkeet, jotka IGROVCDDP on herkkä voivat olla sopivia hoidettaessa platina /taksaanin kestävä munasarjasyöpä. Tutkiminen IGROVCDDP lääkkeille vastustuskykyisten mallin ansiosta voimme ymmärtää mekanismit rajat resistenssin välillä platinat ja taksaanit. Se on tavoitteemme kääntää molekyylimarkkereita tämän ristiresistenssiä fenotyyppejä kliinisen hoito uusiutuneen lääkeresistenttiä munasarjasyöpäpotilailla.

Methods

Soluviljely ja sytotoksisuusmääritykset

ihmisen IGROV-1 munasarjasyövän solulinjaa ja sen sisplatiini-variantin IGROVCDDP saatiin professori Jan Schellens [3], [4]. Soluja kasvatettiin antibiootti ja kemoterapia-RPMI (Sigma # R8758), jossa 10% FCS: ää (Lonza, Belgia). Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO 2 37 ° C: ssa, ja ne olivat

mycoplasma- ilmaiseksi. | Sytotoksisuuden toteamiseksi solut (1 x 10

4 solua /kuoppa) maljattiin tasapohjaisille 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Kuoppia käsiteltiin kolmena kappaleena sarjalaimennoksilla lääkkeen lopullisessa tilavuudessa 200 ui. Huumeettomat kontrollia sisällytettiin kuhunkin määritykseen. Levyjä inkuboitiin edelleen 5 päivää ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen happaman fosfataasin määritys [5].

TaqMan Low Density Array (TLDA) B

Solut (1,25 x 10

6 solua /10 cm malja) maljattiin ja annettiin kiinnittyä ja kasvaa 3 päivän päästä 70-80% konfluenssiin. Sitten solut trypsinoitiin, pestiin 10 ml: ssa PBS: ää, sentrifugoitiin ja supernatantti poistettiin. Solupelletit säilytettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä. Kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, UK). TLDA array suoritettiin biologisia triplikaattinäytteet kuvatulla Gillet

et al

. 2011 [6]. Mediaani ilmentyminen Kunkin näytteen vähennettiin kaikista geeniekspressioiden että näyte. Aineisto analysoitiin käyttämällä

BRB ArrayTools

, microarray-data tilastollisen analyysin työkalu (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Ekspressoidut geenit vähemmän kuin 50% näytteistä suodatetaan pois ja muuttujan kahden otoksen T-testi suoritettiin sen määrittämiseksi, geenejä, jotka olivat merkittävästi toisistaan ​​IGROV-1 ja IGROVCDDP perustuu p 0,01 sulku.

Epirubisiini arvosanojen Pitoisuus

Solut maljattiin tiheydellä 2,5 x 10

5 ei-tuuletettu T25 pulloon. Seuraavana päivänä väliaine poistettiin ja soluja käsiteltiin 1 uM epirubisiinia 2 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 0,25 uM elacridar, 0,67 uM, 3,33 uM tai 33,3 uM sisplatiinia. Solut pestiin 4 ml: lla kylmää PBS: ää ja trypsiinillä. Solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja solujen määrä suoritetaan (9 ui). Jäljelle jääneet solut sentrifugoitiin, supernatantti poistettiin ja pelletti säilytettiin -20 ° C: ssa ennen analyysiä. Yhteensä epirubisiinia kvantitoitiin sitten LC-MS jälkeen neste-neste-uutto näytteen valmistusta menetelmän mukaisesti Wall

et ai

. 2007 [8].

Yhteensä Cellular Glutathione Assay

Solut maljattiin tiheydellä 1,25 x 10

6 solua 10 cm: n halkaisija astiaan ja annettiin kiinnittyä yön yli. Soluja lääke käsiteltiin 24 tunnin ajan, sitten trypsiinillä ja solujen määrä suorittaa. Solut pestiin 10 ml: aan PBS: ää, sentrifugoitiin ja supernatantti poistettiin. Solupelletit säilytettiin -20 ° C: ssa ennen analyysiä. Yhteensä glutationi määritettiin käyttäen modifikaatiota Suzakake

et ai

. [9]. Solupelletit hajotettiin 150 pl vettä ja sonikoitiin, 12,5 ui 30%: sulfosalicyclic happoa lisättiin ja näytteet vorteksoitiin. 30 minuutin jälkeen jäillä, proteiini-free supernatantit kerättiin sentrifugoimalla (12000

g

5 minuutin ajan 4 ° C: ssa). Glutationi konsentraatio määritettiin käyttäen reaktioseosta, joka sisälsi 20 ui lysaattia tai standardin, 90 ui trietanoliamiinipuskuria, pH 8,0 (0,2 M), 30 ui NADPH: ta (4 mM) ja 20 ui DTNB: tä (6 mM). 2 minuutin kuluttua 30 ° C: ssa, reaktio käynnistettiin lisäämällä 0,3 yksikköä glutationireduktaasin kuoppaa kohti. Levyt luettiin aallonpituudella 405 nM (esilämmitys 30 ° C), jossa kineettinen mittaus levylukijalla synergiaa HT, Bio-Tek® (MASON Technology). Muutosnopeus kineettisen määrityksen laskettiin sitten KC4 ohjelmisto.

glutationireduktaasi (GSR) ja gammaglutamyylitranspeptidaasi (GGT1) Entsyymimääritykset

Soluviljely – Cells (6,25 x 10

5 solua /10 cm malja) maljattiin ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin 0,67 uM sisplatiinia. Drug-käsitellyt solut ja niiden valvonta trypsinoitiin ja solujen määrä suorittaa. Sitten solut pestiin 10 ml PBS: ää, sentrifugoitiin ja supernatantti poistettiin. Pelletti suspendoitiin uudelleen 400 ui kylmää entsyymin systeemiä-puskuria (100 mM yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 100 mM EDTA, pH 7,5). 16 ui 25 x Complete proteaasinestäjä (Roche, UK) lisättiin, ja näyte sonikoitiin. Sentrifugoinnin jälkeen (13000 rpm 15 minuuttia 4 ° C: ssa), supernatantti otettiin talteen ja pakastettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä.

GSR – GSR (Sigma) standardeja tehtiin vuonna glutationireduktaasin laimennuspuskuriin ( 100 mM yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 100 mM EDTA, 1 mg /ml BSA: ta; pH 7,5), joka vaihtelee 0,3-0,0037 yksikköä /ml. 40 ui kutakin näytettä ja tavallinen testattiin kahtena kappaleena 96-kuoppaisille levyille. Reaktioseosta lisättiin sitten 160 ui kokonaistilavuudessa (2 mM hapetettua glutationia (100 ui), 3 mM DNTB (50 ui), 2 mM NADPH: ta (10 ui)).

GGT1- Tämä menetelmä on muokattu menetelmä Silber

et al

. [10]. GGT1 (Patricell, UK) standardit koostuu veteen vaihtelevat 1000-1,6 yksikköä /l. 30 ui kutakin näytettä ja tavallinen analysoitiin kahtena kappaleena 96-kuoppaisille levyille. 100 ui reaktioseosta lisättiin sitten (60 mM gamma-glutamyyli-p-nitroalinine (10 ui), 55,5 mM glyclglycine in 133,33 mM Tris Base, pH 8,5 (90 ui)).

Analyysi – Levyt luettiin 412 nM (esilämmitys 30 ° C) ja 405 nM (esilämmitys 37 ° C) GSR ​​ja GGT1 lla, kineettinen mittaus levynlukijalaitteella kuten kuvattiin glutationin määritystä.

Western blotit

solut (1,25 x 10

6 solua /10 cm malja) maljattiin ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten solut lääkkeen sisplatiinia ja kasvatettiin 3 päivää. Solut suspendoitiin uudelleen 100 ui lyysipuskuria (0,01 M Tris /HCl, pH 7,4) ja sonikoitiin. 20 ug proteiinia laimennettiin Laemmli-näytepuskuriin, keitettiin 3 minuuttia, jäähdytettiin jäillä ja ladattiin 12% Tris /glysiini-geeleissä, joissa on 4% pinoaminen geeli. Näytteet ja molekyylipainomarkkerit sitten elektroforeesi 90 minuutin ajan 100 V: n geelit siirrettiin sähköllä 0,45 um nitroselluloosakalvoille (Biorad) 90 minuutin ajan 100 V: n käyttäen märkää siirtojärjestelmän (Biorad). Membraanit blokattiin 5% rasvattomalla rasvaton maito (Biorad) PBS: ssä 2 tunnin ajan, sitten niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen valmistettu 3% kuorittu maito /0,1% Tween /PBS: ssä (taulukko 1) yön yli 4 ° C: ssa [11 ]. Membraanit pestiin 0,3% Tween /PBS: llä 3 x 10 minuuttia ja inkuboitiin sitten 1 tunti, jossa on HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (taulukko 1). Kalvot pestiin jälleen ja altistettiin luminoliin reagenssia (Santa Cruz) tai ECL kehittynyt western blotting reagenssia (GE Healthcare). Sitten kalvot altistettiin autoradiografisten elokuva. β-aktiinin blotit kehitettiin käyttäen alkalista fosfataasi-vasta-ainetta (taulukko 1) ja Sigma Fast BICP reagenssia. Densitometria on vähintään n = 3 biologinen rinnakkaista tehtiin käyttämällä Määrä Yksi ohjelmisto (Biorad), paikallisten taustakorjauksen. Runsaasti proteiinia normalisoitiin Ponceau kullekin näytteelle ja sitten kunkin biologisen sarja normalisoitiin IGROV-1.

konfokaalimikroskopia

Solut (1,5 x 10

5 solua /kuoppa) maljattiin 8-kaivokammio dioja ja annettiin kiinnittyä yön yli. Kaikki pesut PBS: lla, ja kaikki inkuboinnit huoneenlämpötilassa, ellei toisin mainita. Solut pestiin kahdesti, ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä (Sigma) PBS: ssä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut permabilised 0,5% Triton-X-100 (Sigma), 10 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solut värjättiin 50 ug /ml fluoresoivaa TRITC liuoksena PBS: ssä 40 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti. Sitten soluja inkuboitiin estopuskurilla (0,02% BSA: ta PBS: ssä) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (taulukko 1) 2 tunnin ajan kostutetussa atmosfäärissä. Sitten solut pestiin 3 kertaa 5 minuuttia ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (taulukko 1) 1 tunnin ajan. Sitten solut pestiin 3 kertaa 5 minuuttia. Solut peitettiin sitten asennusainetta sisältävät DAPI (Sigma) ja niitä säilytettiin 4 ° C: ssa ennen mikroskoopilla. Kuvat otettiin klo x63 suurennus ja × 1 zoom. Skannaukset suoritettiin 1 um välein syvyyksissä kautta kiinteän soluja, ja yhden tai sulautuneen kuvat esitetään joko XY single kautta kulkevien keskiosassa solujen tai ortogonaalisen näkymän.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolminkertaisina. Kahden otoksen kaksisuuntaisia ​​opiskelijan t-testejä käytettiin määrittämään merkittäviä eroja käyttämällä p 0,05 kuin katkaista.

Tulokset

Taksaania Resistance in IGROVCDDP välittyy P-glykoproteiinin

IGROV-1 ja IGROVCDDP solut analysoitiin 380 liittyviä geenejä chemoresistance mukaan TLDA array jotta luonnehtimaan mekanismeja platinaa ja taksaanin vastarintaa. 145 geenejä havaittiin olevan huomattavasti toisistaan ​​IGROV-1 ja IGROVCDDP perustuu p 0,01 sulku. Geenit valittiin jatkotutkimuksiin perustuivat merkittävin p-arvo sekä ne reitit aiemmin liittyvät platinaa ja taksaania vastus (taulukko 2). Kaikki geenit luetellaan taulukossa kaksi validoitiin proteiinitasolla Western blot.

geeniekspressiota P-glykoproteiinin (P-gp) on lisääntynyt IGROVCDDP (taulukko 2), ja siellä on vastaava lisäys proteiinin ekspressio (kuvio 1A). 3 päivän hoito pieniannoksisen sisplatiinin taipumus lisätä P-gp: n ilmentyminen sekä IGROV-1 ja IGROVCDDP mutta tämä ei ollut merkitsevä (kuvio 1A). P-gp Lisäksi vahvistettiin olevan toiminnallisesti aktiivisia IGROVCDDP kanssa epirubisiinia kertymistä määrityksessä (kuvio 1 B). IGROVCDDP solut ovat merkittävästi alhaisemmat P-gp-substraatti epirubisiinin jälkeen 2 tunnin altistus verrattuna IGROV-1. Kun IGROVCDDP käsiteltiin 0,25 uM P-gp-salpaajaa elacridar, joka estää lääkkeen vaikutusta pumpun [12] akkumuloidun epirubisiinin kasvoi ja oli merkittävästi korkeampi kuin vanhemman IGROV-1-soluissa. Kasvu yläpuolelle IGROV-1 on mielenkiintoinen havainto, ja se voi johtua siitä, että IGROVCDDP soluihin on niin riippuvainen P-glykoproteiinin varten lääkevuoto-; he kärsivät enemmän kertyminen lääkettä kun se on estetty.

A) Western blot P-glykoproteiinin, IGROV-1 (avoimet pylväät) ja IGROVCDDP (harmaat pylväät) ja ilman hoitoa 0,67 uM sisplatiinin 72 tuntia (viivoitetut pylväät). Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 6 biologinen toistoja normalisoidaan P-aktiini. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 p 0,05 opiskelijan t-testiä. B) kertyminen epirubisiinin määritettiin LC-MS: llä. IGROV-1 (avoimet pylväät) ja IGROVCDDP (varjostetut pylväät). Soluja käsiteltiin 1 uM epirubisiinia 2 tunnin ajan, 0,25 uM elacridar, 0,67 uM, 3,33 uM tai 33,3 uM sisplatiinia tutkittiin modulaattoreina epirubisiinin kertymistä. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 3 biologisia mallikertaa normalisoitu solujen määrä. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 ja IGROV-CDDP, # todetaan merkittävä ero lisäämällä modulaattorin (p 0,05 opiskelijoiden t-testi). C) sytotoksisuus IGROV-1 ja IGROVCDDP P-glykoproteiinin ja muiden P-glykoproteiinin substraatteja.

IGROVCDDP soluja seulottiin niiden vaste eri kemoterapeuttisten aineiden (kuvio 1C). IGROVCDDP solut ovat merkittävästi resistenttejä ei-P-gp-substraatteja sisplatiinin ja karboplatiinin [13]. IGROVCDDP on myös merkittävästi resistenttejä P-gp-substraatteja [14]; taksaanit, paklitakseli ja taksoteeri, antrasykliini epirubisiini ja alkaloidi vinblastiini. Sen sijaan, IGROVCDDP on yliherkkä hoitoon ei-P-gp-substraatti 5-FU: [15]. IGROVCDDP kestää MRP1 alustaan ​​metotreksaatin [14], mutta ei kestä BCRP alustaan ​​SN-38 (kuvio 1C) [16]. Hoidon 0,25 uM elacridar merkittävästi kääntää vastus IGROVCDDP solujen kaikki P-gp-substraatteja, mutta ei vastus sisplatiini, karboplatiini ja metotreksaatti. IGROVCDDP solut ovat myös herkempiä elacridar kohtelun kuin IGROV-1 (taulukko 3). IGROVCDDP solut ovat vähentyneet mRNA: n ilmentymisen on BCRP (taulukko 2), ja se ei ole havaittavissa Western blot (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, että kääntyminen, joita on esiintynyt elacridar hoito ovat ominaisia ​​P-gp: n eikä BCRP, mikä elacridar myös estää.

vaikutus yhteis- tai ennalta sisplatiinihoidolle paklitakselia sytotoksisuuteen tutkittiin ja mitään merkittävää muutosta ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty). Samoin yhteis- tai esikäsittely paklitakselilla eivät muuttaneet sisplatiinin vastus (tuloksia ei ole esitetty).

Platinum vastus liittyy solunsisäinen siirtyminen platinasta sisäänoton kuljettajan CTR1 ei vastus välittämä MRP2.

A) sytotoksisuus IGROV-1 ja IGROVCDDP ja CuSO

4. B) ATP7A western blot. Avoin palkit ovat IGROV-1, varjostetut pylväät ovat IGROVCDDP ja raidalliset palkit ilmaisevat käsittelyä 0.67 uM sisplatiinin 72 tuntia. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 4 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. C) CTR1 western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 3 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 p 0,05 opiskelijan t-testiä. CTR1 konfokaalimikroskopia D) IGROV-1 ja E) IGROVCDDP soluja. XY lentokoneet näkyvät DAPI (sininen), Golgi (punainen) ja CTR1 (vihreä), joka on yhdistetyn kuvan on myös esitetty.

MRP2, kuljetusyritystä joka voi pumpata sisplatiinia konjugaatteja, oli vähentynyt geenin ilmentyminen in IGROVCDDP (taulukko 2), mutta ei ollut havaittavissa western blot joko solulinjassa (määritystuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, ettei asema platinan effluksitransportteri MRP2 platinan vastus IGROVCDDP. Kupari kuljettajat voivat myös olla rooli platina oton (CTR1) ja ulosvirtaus (ATP7A ja ATP7B) [17]. Väheneminen CTR1 ilmentymisen tai lisääntyminen ATP7A tai ATP7B voisi mahdollisesti välittää platinaa vastarintaa. IGROVCDDP solut ovat 2,26-kertaisesti kestävä CuSO

4 (kuvio 2A) viittaa siihen, että kupari aineenvaihdunta voi jotain roolia mekanismi vastarintaa. Ei ollut merkittävää muutosta mRNA: n ekspression CTR1, ATP7A ja ATP7B on TLDA array (tuloksia ei ole esitetty). ATP7A proteiinin ekspressio oli taipumus kasvaa IGROVCDDP vasteena sisplatiinin, mutta tämä muutos ei ole merkittävä (kuvio 2B). Oli kuitenkin merkittävä lasku CTR1 ilmaisun vastauksena sisplatiinin huumehoitoon vuonna IGROVCDDP soluissa (kuvio 2C). CTR1 on läsnä solukalvossa IGROV-1 ja siirtyy solun sytoplasmaan in IGROVCDDP (kuvio 2D, E). On olemassa jonkin verran yhdistys CTR1 kanssa Golgin in IGROVCDDP mutta värjäytyminen on johdonmukainen koko solulimaan.

Kuljetusyritysten biomarkkereina Platinum arvosanojen vika

Yksi merkittävimmistä ilmentyvät eri geenien IGROVCDDP oli lasku ilmaus Na

+ /K

+ pumppu (ATP1A1) (taulukko 2), joka on aiemmin liittynyt platinan kerääntyminen vikoja [18]. Sisplatiini ei kuljeta ATP1A1 ja muuttaa kalvojännite voi olla rooli passiivinen kertyminen lääkkeen. Oli vastaava lasku proteiinin ilmentymisen ATP1A1 (kuvio 3A) ja myös herkkyys hoidon ATP1A1 inhibiittorin ouabaiinin [19] (taulukko 3). Kuitenkin, kun 0,01 nM ouabain oli co-inkuboitiin sisplatiinin sytotoksisuusmäärityksessä sijaan käännetään vastus IGROVCDDP se laski IC

50 sekä IGROV-1 ja IGROVCDDP soluja yhtä, kannen välinen vastus kahdessa solulinjassa pysyi vakio (taulukko 3). IGROVCDDP ei ollut resistentti NaCl tai KCI yksittäisinä aineina ja lisäksi 40 mM näiden suolojen ei muuttanut merkitsevästi sisplatiinin sytotoksi- (tuloksia ei ole esitetty).

Avoimet pylväät ovat IGROV-1, varjostetut pylväät ovat IGROVCDDP ja raidallinen palkit ilmaisevat käsittelyä 0.67 uM sisplatiinin 72 tuntia. A) ATP1A1 western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 4 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. B) MRP1 western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 3 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 p 0,05 opiskelijan t-testiä. MRP1 konfokaalimikroskopia C) IGROV-1 ja D) IGROVCDDP soluja. Orthogonal kuvat näkyvät yhdistetyn kuvan DAPI (sininen) ja MRP1 (vihreä), nuolet sivussa palkit osoittavat apikaalisella (IGROV-1) ja basolateraalisessa sijainti MRP1 (IGROVCDDP). FBP konfokaalimikroskopia E) IGROV-1 ja F) IGROVCDDP soluja. XY lentokoneet näkyvät DAPI (sininen), aktiini (punainen) ja FBP (vihreä), joka on yhdistetyn kuvan on myös esitetty.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet heikompaa ilmentymistä ja solunsisäinen siirtyminen kalvoproteiinien MRP1 ja FBP liittyvän vian platina kerääntymisen sisplatiini-resistenttejä solulinjoja [20]. Siksi tutkimme MRP1 ja FBP mahdollisina biomarkkerit vika platina kertymisestä IGROVCDDP. IGROVCDDP solut ovat väheneminen mRNA: n ilmentymisen on MRP1 (taulukko 2), sekä pieni lasku MRP1 proteiinin ekspressio vasteena sisplatiinin hoitoon (kuvio 3B). MRP1 jakelu tutkittiin konfokaalimikroskopiaa (kuvio 3C, D). Värjäystä sekä IGROV-1 ja IGROVCDDP solulinjoissa näkyy sytoplasmassa ja perinuclear alue joidenkin keskittymistä MRP1 ilmeinen. In IGROV-1 on enemmän MRP1 yläpuolella ja koko sininen viiva kohtisuoraa näkymä osoittaa se on apikaalisella ja keskiosan soluissa. Suurin osa värjäyksen IGROVCDDP on alle sininen viiva on basolaterally sijaitsee. FBP on lokalisoitu pääasiassa vieressä tumaan kuluessa diskreetti solukomponenttien rakkuloiden; pikku sytoplasminen värjäytyminen on ilmeinen (kuvio 3E, F). Ei ole mitään muutosta solun jakautuminen FBP välillä IGROV-1 ja IGROVCDDP, mutta laskua ilmaus FBP in IGROVCDDP ilmenee konfokaali kuvia.

Avoimet pylväät ovat IGROV-1, varjostetut pylväät ovat IGROVCDDP ja raidallinen palkit ilmaisevat käsittelyä 0.67 uM sisplatiinia. A) Yhteensä solunsisäisen glutationin. Kaavio osoittaa n = 3 biologisia mallikertaa normalisoitu solujen määrä. B) γGCS western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 4 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. C) GSR ​​western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 3 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. D) GSR ​​entsyymimääritystä. Kaavio osoittaa n = 4 biologisia mallikertaa normalisoitu solujen määrä. E) GGT1 western blot. Edustavia kuva näkyy kaavio osoittaa kvantitoimiseksi n = 3 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. E) GGT1 entsyymimääritystä. Kaavio osoittaa n = 4 biologisia mallikertaa normalisoitu solujen määrä. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 p 0,05 opiskelijan t-testiä. # Osoittaa merkittävä ero IGROVCDDP lisättäessä sisplatiinia. G) modulaatio sisplatiinin sytotoksisuuden IGROV-1 ja IGROVCDDP BSO.

Platinum Resistance in IGROVCDDP liittyy lisääntymiseen Glutathione Kierrätys ei Lisääntynyt de novo synteesi

mRNA ilmaisun glutationireduktaasin (GSR) ja gammaglutamyylitranspeptidaasi (GGT1) olivat molemmat merkittävästi lisääntynyt IGROVCDDP (taulukko 2). GSR toiminnot kierrättää hapetetut glutationin solussa [21], [22] ja GGT1 kierrättää glutationin ulkopuolelta solukalvon [21], [22]. Proteiini ilmaus GSR ja GGT1 ei kasvanut IGROVCDDP soluissa, GSR oli merkittävästi vähentynyt IGROVCDDP ja ei ollut muutosta GGT1. (Kuvio 4A ja 4B). Kuitenkin entsyymin aktiivisuus sekä GSR ja GGT1 olivat merkittävästi (kuvio 4C ja kuvio 4D); viittaa siihen, että glutationin on kierrätetään enemmän sisä- ja ulkopuolelta solun.

Avoimet pylväät ovat IGROV-1, varjostetut pylväät ovat IGROVCDDP ja raidalliset palkit ilmaisevat käsittelyä 0.67 uM sisplatiinin 72 tuntia. A) BRCA1 western blot. Edustavia kuva näytetään. Kuvaaja osoittaa kvantitoimiseksi n = 4 biologisia mallikertaa normalisoidaan P-aktiini. * Osoittaa merkittävä ero IGROV-1 p 0,05 opiskelijan t-testissä.

IGROVCDDP solut eivät ole korkeampi glutationi, ja tasot eivät ole lisääntyneet matalan tason sisplatiinihoitoon (kuvio 4E) . Tasot glutationi olivat myös muuttuja IGROVCDDP soluissa. Hoidon 12,5 uM butathione sulfoksimiini (BSO), joka on inhibiittori γGCS [23] väheni merkittävästi solujen glutationi sekä IGROV-1 ja IGROVCDDP soluja (tietoja ei esitetty). IGROV-1 ja IGROVCDDP myös samanlaisia ​​proteiinin ilmentymistä γGCS, ja se ei ole säädelty vasteena matalan tason sisplatiinihoitoon (kuvio 4F). BSO hoito myös huomattavasti herkistynyt molemmissa solulinjoissa sisplatiiniin (Kuva 4G). Kuitenkin vaikutus oli vastaava ja sisplatiinin kertainen resistenssi pysyi vakiona (18,76 kertainen). IGROVCDDP solut näyttivät olevan herkempiä BSO hoitoon yksin sytotoksisuusmäärityksessä, mutta tämä ei ollut merkittävä (kuvio 4G).

IGROVCDDP on lisääntynyt BRCA1 Expression

Lisääntynyt ilmentyminen DNA korjaus geeni BRCA1 on aiemmin liittynyt sisplatiinin vastus [24]. IGROVCDDP solut ovat kasvaneet mRNA (taulukko 2) ja proteiinien ilmentyminen BRCA1 (kuvio 5A).

Keskustelu

P-gp: n yli-ilmentyminen on epätavallinen malli Hankitut Cisplatin Resistance

sieto paklitakselin IGROVCDDP solujen välittämä yli-ilmentyminen P-gp: n geeni (taulukko 2) ja proteiinien taso (kuvio 1A). P-gp: n on osoitettu olevan funktionaalisesti aktiivinen sytotoksisuuden määritykset (kuvio 1C) ja epirubisiini kertyminen määrityksissä (kuvio 1 B). Toisin kuin muissa tutkimuksissa [25], lyhyen aikavälin sisplatiinihoitoon ei moduloida P-gp-proteiinin ilmentymistä, aktiivisuutta tai taksaani sytotoksisuuden IGROVCDDP soluissa (kuvio 1A, 1B, tuloksia ei ole esitetty). On harvinaista, mutta ei ennennäkemätön nähdä mallin hankitun sisplatiinin vastuksen yli-ilmentävät P-gp (taulukko 4) [26] – [30]. Tämä todennäköisesti edustaa yleinen stressin vastaus pitkäaikaista sisplatiinihoitoon kuten sisplatiini ei ole P-gp-substraatti [13]. P-gp voi olla säädelty osana vastauksena lisääntyneeseen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) solussa [31]. Tämä voi olla miksi P-gp ilmentyminen indusoitiin IGROVCDDP kun ROS valmistetaan myös vastauksena sisplatiini [32]. Koska IGROVCDDP soluja kasvatetaan ilman sisplatiinia media, näyttää olevan joko toinen ärsyke suositaan ilmaus P-gp tai P-gp tarjoaa valikoivan edun IGROVCDDP soluihin.

Monet mallit hankittu lääkeresistenssi on yliekspressio sellaisen kuljettajan joka effluxes lääke, jota käytettiin kehittää mallia. Kolkisiini, P-gp-substraatti [33] valittiin P-gp yli-ilmentymisen in KB-8.5.11-solujen [34] ja epirubisiini, joka on MRP1 alustan [35] aiheuttama MRP1 ilmentymistä CCRF-CEM /E1000 [36]. Kuitenkin, metotreksaatti, fluorourasiili, klorambusiili, sisplatiini, ja hydroksiurean on kaikki osoitettu ohimenevästi indusoida P-gp K562 leukemia soluihin, kun nämä lääkkeet eivät ole P-glykoproteiinin substraatteja [15]. Se on sitten luonnollinen valinta, jos solut, jotka lyhytaikaisesti ilmentävät P-gp: n on muita selviytymisen etu ja osaksi lääkeaineille solulinjassa. Joissakin sisplatiinin kestävä malleja, jotka yli-ilmentävät P-gp, P-gp ei selviytyminen etu, koska ei ole toiminnallisesti aktiivinen (SNU-601 /Cis10 – taulukko 4) [29]. Sisällä sisplatiini kestävä P-gp: n yli-ilmentäviä solulinjoja voi myös olla heterogeenisyys; in SKOV3 /CIS P-gp: n positiivisia ja negatiivisia populaatiot pidettiin hoidon jälkeen sisplatiinilla, mikä osoittaa, että P-gp ei ole eloonjäämisen etua sisplatiinihoitoon [27]. Kuitenkin P-gp voi olla anti-apoptoottiset vaikutukset eroavat liittyvät kuljetukseen sytotoksisten lääkkeiden, ja jotkut saattavat olla välittyvän ulosvirtaus proapoptootti- glukosyylikeramidi [37], [38]. On myös mahdollista, että jotkut xenobiotic läsnä FCS, jota käytetään solujen viljelemiseksi voi auttaa ylläpitämään P-gp ilmentymisen IGROVCDDP.

IGROVCDDP on ainoa sisplatiini kestävä malli kehitettiin IGROV-1 tiedetään yli-ilmentää P-gp: n ja näin ollen on platina /taksaani kestävä fenotyypin. Sisplatiini kestävät mallit IGROV-1 /Pt0.5 ja IGROV-1 /Pt1 [39] on käänteinen platina /taksaani kestävä fenotyypin. Muut sisplatiini kestävä IGROV-1 on kehitetty (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), mutta ne eivät näytä on tutkittu resistenssi P-gp: n substraatit tai P-gp ilme. Kuitenkin P-gp ei ole tunnistettu ilmentyvät eri Genomin tai proteomic profilointi [40] – [44].

Platinum Resistance on Monitekijäinen

Platinum vastarintaa IGROVCDDP soluissa on monitekijäinen ja liittyy glutationin polku ja laski kertymistä lääkkeen. Tämä voi johtaa joko monimutkainen sääntely polun, joka ohjaa monia erilaisia ​​mekanismeja resistenssin sisplatiini, tai voisi heijastaa sitä, että solut valittiin useita vaiheita ja voi näin ollen on kertynyt eri mekanismeja jokaisessa vaiheessa.

IGROVCDDP solut ovat matalan tason resistenttejä CuSO

4 viittaa merkitykseen kuparin liikenteen platinaa vastus (kuvio 2A).