Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ensimmäinen Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa uusia seerumin diagnostisia markkereita ihmisen munasarjan solu kasvain (GCT), kasvain, joka edustaa jopa 5% kaikista munasarjojen syöpien. Kiertää vähäisyys ihmisen kudosten käytettävissä analyysejä, käytimme

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

PTEN

tm1Hwu /tmiHwu;

Amhr2

TM3 (cre) Bhr /+ siirtogeenisen hiiren mallia, jossa on konstitutiivinen aktivointi CTNNB1 signalointia yhdistettynä menetys

PTEN

vuonna granuloosasoluja ja kehittää sertifioidut opettajat, jotka jäljittelevät aggressiivinen muodot ihmisen sairauden. Proteomic profilointi massaspektrometrialla osoitti vinkuliini, enolaasi 1, useat lämpöshokkiproteiinit, ja valosin sisältävä proteiini (VCP) on runsaammin erittämän hiiren viljellyistä GCT soluja verrattuna ensisijaisen viljellyt GC. Näistä proteiineista, vain VCP oli läsnä merkitsevästi kohonneeseen ennen leikkausta seerumista GCT syöpäpotilaiden kuin terveillä henkilöillä. Voit selvittää spesifisyyden VCP, seerumin mitattiin myös munasarjasyövän non-Hodgkinin lymfooma ja rinta-, paksusuoli-, haima-, keuhko- ja eturauhassyövän potilailla. Seerumin VCP tasot havaittiin useimmissa syövän tapauksissa, lukuun ottamatta potilaita, joilla on keuhko- tai eturauhassyöpä. Lisäksi seerumin VCP kohoamiseen joissakin GCT, munasarja- syöpä, rintasyöpä, ja paksusuolen syöpä potilailla, jotka eivät muuten näy kohonneeseen laajalti käytetty seerumin kasvainmerkkiaineet niiden syövän tyyppi (esim inhibiini A, inhibiini B, CA125, CEA, tai CA15.3). Nämä tulokset osoittavat mahdollista käyttöä VCP kuten erittäin herkkä seerumimarkkerina GCT sekä useita muita ihmisen syövissä.

Citation: Laguën MN, Romieu-Mourez R, Bonneil É, Boyer A, Pouletty N, Vies- Masson AM, et ai. (2012) proteomiikan profilointi hiirimallissa varten munasarjan kasvain Tunnistaa VCP kuin erittäin herkkä Serum tuumorimarkkeri useissa ihmisen syövissä. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10,1371 /journal.pone.0042470

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2012; Julkaistu: 01 elokuu 2012

Copyright: © Laguën et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat -toimintatukea MOP-102508 Kanadan Institutes of Health Research ja Kanadan Research Chair munasarjojen molekyylibiologian ja Functional Genomics. University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core tukee National Institutes of Health NICHD (SCCPRR) Grant U54-HD28934. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Serum markkereita ovat suuri merkitys kliinisen seulontaan, diagnosointiin ja seurantaan syöpiä. Ihanteellinen merkki pitäisi olla korkea herkkyys ja /tai korkea spesifisyys, jotta syrjiä syöpäpotilaiden terveistä kohteista sekä potilailta, joilla hyvänlaatuisia kasvaimia tai jotka eivät liity ehtoja. Useimmat nykyisin käytetyt seerumimarkkereiden ovat hormoneja, glykoproteiineja, tai muiden proteiinien yli-ilmentää syöpäsoluja. Nämä markkerit eivät yleensä ole erityisiä ainutlaatuisen syöpätyypin ja joskus puuttuu herkkyys [1]. Useita strategioita on hiljattain ehdotettu tunnistaa uusia seerumin kasvainmerkkiaineet [2]. Differential proteomic analyysit seerumin yksilöitä syöpäpotilaista ja terveillä vapaaehtoisilla ovat lähestymistapoja valinta, mutta ongelmana ovat vähäisyys materiaalin harvinaisia ​​syöpiä sekä vaikeus havaita proteiineja, jotka ilmentyvät matalalla tasolla verrattuna runsas normaaliin seerumin proteiineihin. Vaihtoehtoisessa kaksivaiheinen lähestymistapa käsittää alkuperäisen proteiinien tunnistamiseksi, jotka ilmentyvät differentiaalisesti ja /tai erittää normaalien ja tuumorisolujen, minkä jälkeen tunnistaminen näiden proteiinien seerumissa syöpäpotilailla. Tämä lähestymistapa ihanteellisesti edellyttää eristämisen primaarikasvaimen solut ja vastaavat normaaleja soluja. Tässä yhteydessä käytetään asiaan eläinmalleissa kasvaimen kehitys voi antaa tärkeää lähtöaineita Proteomiikan tai genominen analyysi, ja johtaa tunnistamiseen kasvaimeen ehdokkaan proteiineja tai geenejä, joiden ilmentyminen voidaan sitten tutkia ihmisen näytteitä, kuten on osoitettu munasarjasyövän [3], [4], [5].

munasarjan solu kasvain (GCT) on yleisin sukupuolen johto /strooman alaryhmä munasarjojen kasvaimia naisilla, ja sen uskotaan olla jopa 5% kaikista munasarjasyövistä. Viime vuosina, ryhmämme on keskittynyt selvittää sellaisten molekyyli- etiologiasta ihmisen GCT, sekä luomiseen asiaa eläin- GCT malleja. Huomasimme näyttöä siitä misregulation sekä WNT /CTNNB1 (ß-kateniinin) ja PI3K /AKT signalointireiteissä esiintyy ihmisen GCT [6], [7]. Siirtogeenisiä hiiriä konstitutiivisen aktivaation CTNNB1 vuonna granuloosasoluja (GC,

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

Amhr2

TM3 (cre) Bhr /+) kehittää syöpää edeltävät munasarjojen vaurioita, jotka usein edetä GCT myöhemmin elämässä [6]. Menetys PI3K /AKT signalointi antagonisti geeni

PTEN

GC aiheuttaa harvoin GCT, mutta samanaikainen aktivointi CTNNB1 ja menetys

PTEN

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

PTEN

tm1Hwu /tm1Hwu;

Amhr2

TM3 (cre) Bhr /+ (CPA) Mallitulosten kehittämiseen aggressiivinen, metastaattisen GCT 100 % penetrance [7]. Olemme ehdottaneet, että CPA hiiri on paras malli tällä hetkellä käytettävissä analysointia varten GCT biologian sekä prekliinisissä eläinkokeissa, joilla pyritään kehittämään uusia terapeuttisia interventioita ja /tai diagnostisia työkaluja.

arveltu, että CPA hiiri mallia voidaan käyttää tunnistamiseen differentiaalisesti ilmaistuna, GCT liittyvien proteiinien, ja että nämä johtaisi kliinisesti käyttökelpoisia uusia seerumin diagnostisina markkereina ihmisen taudin. Tässä esittelemme ero secretome analyysi vertailemalla ensisijaisesti viljellyt GC normaalista hiirten GCT soluja CPA hiirillä. Tämä lähestymistapa johti tunnistamiseen vasolin sisältävä proteiini (VCP) potentiaalisesti kliinisesti merkittävää seerumimarkkerina ihmisen GCT, sekä muita syövän muotoja.

Tulokset

tunnistaminen proteiinien erittyvien selektiivisesti hiiren GCT

proteomiikan profilointia käytettiin tavoitteena on tunnistaa erittyvien proteiinien, jotka voisivat edustaa uutta seerumin diagnostisia merkkiaineita spesifisiä GCT. Käytetyn elatusaineet saatiin viljellyistä GCT soluja CPA hiiristä tai normaalista GC EKG-stimuloitujen munasarjat. Proteiinit media erotettiin SDS-PAGE: lla ja neljätoista proteiinivyöhykkeet havaittiin GCT, mutta ei GC-väliaineessa alistettiin massaspektrometria-analyysi (kuvio 1). Tämä prosessi tunnistanut useita proteiineja, jotka runsaammin erittyy tai vuodattaa GCT solujen suhteessa normaaliin GC (taulukko 1). VCL, ENO1 useita lämpöshokkiproteiineiksi (HSPA8 /HSC70, konstitutiivinen ja indusoituva HSP90 alfa isoformit HSP90ab1 ja HSP90aa1, ja HSPA4), ja VCP olivat johdonmukaisesti tunnistettu proteiineja GCT secretome.

Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen hopeavärjäys. Nuolet osoittavat esimerkkejä proteiineista ilmaistaan ​​valikoidusti GCT soluviljelyalustoissa, sekä likimääräinen molekyylipaino. Yhteensä 3 geelien eri akryyliamidin sisältö tutkittiin ja 14 osaan (proteiinien kanssa 12-116 kDa) tehtiin massaspektrometria-analyysi. Vain yksi 3 geelien näkyy kuvassa.

VCP on seerumimarkkerina GCT ja muiden syöpätyyppeihin

tutkimme seuraavaksi erittämät proteiinit GCT soluja CPA hiiristä voisi toimia seerumimarkkereiden ihmisen GCT potilaalla. Ihmishomologit yhdeksän proteiinien tunnistettu secretome analyyseissä (B2M, CTSB, HSPA4 /HSP70, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCP, VCL, ja WIF-1) valittiin lisätutkimuksia perustuu tunnetun geenin toimintojen ja vasta saatavuus. Seeruminäytteet saatiin terveillä vapaaehtoisilla ja potilailla, joilla on GCT ennen hoitoa. Mitään merkittäviä eroja tasojen B2M, CTSB, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCL tai WIF-1 havaittiin immunoblottauksella analysoi seerumissa GCT potilaista verrattuna terveisiin henkilöihin (tuloksia ei ole esitetty). Marginaalisesti kohonnut HSP4A havaittiin seerumissa joidenkin GCT potilaista kuin terveillä henkilöillä, mutta erot eivät olleet tilastollisesti merkittäviä, ja katsotaan todennäköisesti ole kliinisesti käyttökelpoinen (kuvio 2A). VCP tasot olivat alhaiset immuunianalyyseilla seeruminäytteiden terveillä koehenkilöillä, mutta lisääntyivät merkitsevästi useimmissa seeruminäytteistä GCT potilaalla (

P

0,05). Kanssa viitearvo VCP tasolle asetettu keskiarvo immunoblot kaistan intensiteetin arvot terveillä verrokeilla plus kaksi kertaa keskihajonta, havaitsimme, että 8 ulos 9 naisten GCT näytetä seerumin VCP tasolla (kuvio 2B, taulukko 2). Voit selvittää spesifisyyden VCP kuin kasvaimen merkkiaine GCT, seerumin VCP tasot arvioitiin potilailla, joilla munasarjojen karsinoomat, sekä pienissä ikäluokat potilaita, joilla on merkittävästä munasarjasyöpiä tunnettujen histologian ja arvosana (taulukko 3). Yllättäen seerumin VCP tasot havaittiin kliinisesti merkittävä osuus munasarjasyöpäpotilaalla (8 8), rintasyöpä (5 12), paksusuolen syöpä (7 12), haimasyöpä (8 12) tai non-Hodgkin- lymfooma (5 12) (kuvio 2B ja taulukko 3). Kuitenkin seerumin VCP tasot eivät olleet merkitsevästi suurempi potilailla, joilla keuhko- tai eturauhassyövän.

(A) HSPA4 tasoja seerumissa naisten GCT tai munasarjasyöpäpotilailla. Yhtä suuret määrät seerumin proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblot-analyysi HSPA4 tasoilla (edustaja blotit on esitetty yläpaneelin jokaisessa kaistassa edustaa yksittäisen luovuttajan). Densitometria analyysit saatujen signaalien kanssa HSPA4 immunoblot analyysit on esitetty graafinen kuvaaja, jossa jokainen piste vastaa yhden luovuttajan (alhaalla, rekki = keskiarvo). Ei merkittävää eroa HSPA4 tasojen havaittiin ryhmissä yksisuuntaisella ANOVA. (B) VCP tasot ovat lisääntyneet seerumin syöpäpotilaita. Seerumit analysoitiin kuten (A): n läsnäolo VCP potilailla, joilla on rinta-, paksusuoli-, keuhko-, haima- tai eturauhassyöpä, munasarja- GCT tai non-Hodgkin-(NH) lymfooma. Tilastollisesti merkitseviä eroja (

P

0,05) välillä havaittiin ohjaus (normaali) ja GCT ja paksusuolensyöpä ryhmiä.

spesifisyys ja herkkyys VCP suhteessa yleisesti käytetty seerumi diagnostisia markkereita

vieressä verrattuna osuvuudesta VCP kuin muiden yleisesti käytössä seerumin diagnostisia markkereita eri syöpätyyppeihin. Tällä hetkellä eniten hyötyä seerumimarkkereiden GCT postmenopausaalisille naisille ovat inhibiini A ja inhibiini B [8]. Meidän kohortti, inhibiini A ja inhibiini B seerumin korotettiin 5 out 9 ja 7 ulos 9 potilaalla on GCT (taulukko 2), tässä järjestyksessä. Ei ollut selvää korrelaatiota ennen leikkausta tasojen inhibiini A, inhibiini B ja VCP GCT potilaalla kuitenkin yksi potilas oli havaittavissa seerumin inhibiini A ja inhibiini B mutta erittäin kohonneeseen VCP (taulukko 2). Herkkyys VCP näyttäisi näin ollen verrata myönteisesti kuin inhibiinit, ja VCP saattaisi olla mahdollista tunnistaa harvinaisten inhibiini-negatiivinen GCT potilaalla. Seerumin CA125 on kasvanut noin 50% naisista, joilla on varhaisen munasarjasyöpäpotilailla ja yli 80% naisista, joilla on edennyt sairaus ja on hyödyllinen seuranta hoidon [9]. Meidän pieni munasarjasyöpäpotilailla kohortin, 4 8 potilasta positiivisiksi CA125, kun taas VCP mittaus havaittu syöpää kaikilla potilailla, mukaan lukien negatiivinen CA125 (kuva 3). CEA on yleisimmin käytetty seerumin tuumorimarkkeri paksusuolen syöpä. Seerumin CEA on kohonnut alle 25% varhaisessa vaiheessa paksusuolen syöpä ja 75% myöhäisen vaiheen syöpä ja sen avulla voidaan määrittää ennustetta, seurantaan hoito ja valvonta [10]. Vuonna 12 paksusuolen syöpäpotilaiden testasimme, 5 oli positiivisia CEA. VCP mittaus havaittu syövän kaikissa CEA-positiiviset potilaat, lisäksi kaksi, jotka olivat CEA-negatiivinen (kuva 3). CEA ja CA15.3 ovat yleisimmin käytetty seerumin markkereita rintasyövän. Tutkiessaan näitä markkereita ei suositella ennustetta vaan leikkauksen jälkeisen seuranta sekä seuranta kehittyneiden sairauksiin [10]. Kun 12-tapaus kohortti että selvitimme, 3 potilaalla positiivisen joko CEA tai CA15.3 ja loput negatiivinen molemmille. VCP tasot olivat koholla kaikilla kolmella potilaalla, jotka olivat CEA tai CA15.3-positiivisia, ja myös kolme potilasta, jotka olivat negatiivisia sekä markkereita (kuvio 3). Siten VCP seerumissa lisääntyivät merkitsevästi useimmissa testatun syöpäpotilaiden ja joissakin muuten negatiivisia perustettu seerumin tuumorimerkkiaineiden.

Seerumi potilaista testattiin VCP tasoilla immuunianalyyseilla ja pisteviiva osoittaa VCP sulku määritellyt arvot terveillä luovuttajilta. Lisäksi seerumit testattiin ELISA: lla, kun läsnä (+) tai puuttumista (-) on kohonnut CA125 on munasarjasyövän, CEA paksusuolen syöpä, tai CEA ja CA15.3 rintasyövän. Normaalirajoissa CA125, CEA, ja CA15.3 ovat alle 35 U /ml, 7 ug /l, ja 29 kU /l.

Keskustelu

VCP proteiini on AAA + ATP liittyy erilaisia ​​solujen toimintaa. VCP on tarpeen ylläpitämiseksi solun homeostaasin ja säätelee proteiinien ilmentymisen mukana monia toimintoja, kuten DNA: n replikaatiota, mitoosia, proteiinien hajoaminen, endosytoosin, kalvofuusion, ja organelliin biogeneesin. Erityisesti VCP toimii ubikitinoitu alustoille molekyyleihin ja säätelee proteiini liikevaihto tasapainottamalla proteosomal hajoaminen liukoisen proteiinien tai väärin laskostuneen proteiinin aggregaattien lokalisoitu ER lumenia sytosoliin. Riippuen konformationaaliset hyödynnettävyys komplekseja VCP ja kohdeproteiinin alustoille, VCP joko edistää niiden hajoamista, erottelee heidät suurista proteiinikomplekseina tai moduloi niiden ubikinaa- kilpailevat ubikitiinipromoottori konjugaation ja dekonjugoituu koneiden (tarkistetaan [11]). VCP assosioituu lukuisia ubiquinated substraattien, ja toiminnot VCP eri solutyyppejä koskee osaksi erityiset kudosilmentämisen alustoissa ja co-tekijät. Neuronien ja lihassolujen VCP vuorovaikutus NF-1, UNC45b ja caveolin-3 säätelee synaptogenesis ja myofibrogenesis (tarkistetaan [12]). Jotkut autosomaalinen hallitseva mutaatioita VCP geenissä aiheuttavat Inkluusiokappale myopatian Pagetin luutauti ja frontotemporaalidementia (IBMPFD), joka on harvinainen, myöhäinen ikä ilmaantuvia perinnöllinen rappeuttava sairaus, joka voi vaikuttaa lihasten, luuston ja aivojen [13]. Lisäksi olennaisia ​​toimintoja homeostaasiin, VCP osoitettiin säännellä puoliintumisaika ja tasot useiden proteiinien syöpään moduloiva toimintoja. Esimerkiksi VCP yhteistyössä useiden ubikitiinipromoottori ligaaseilla säätelee vaihtuvuuden IkappaB [14], HIF-1 [15], p53 [16], tai ErbB3 [17]. Mutaatiot ja /tai misregulation VCP toimintojen syöpäsolut edelleen huonosti tunnettu, samoin kuin niiden mahdollisia aiheuttavia vaikutuksia kasvainten synnyssä. Kuitenkin yli-ilmentyminen VCP on äskettäin ilmi

in situ

in monenlaisia ​​ihmisen syövän tyyppejä, ja analyyseja suurten potilasaineistoihin osoittivat huomattavasti ekspressiotasot VCP kasvaimen solut usein korreloi taudin etenemiseen [18] , [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Käsiteltävänä oleva raportti on ensimmäinen tunnistaa lisääntynyt VCP tasoja seerumissa syöpäpotilaita.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että VCP edustaa erittäin herkkä, mahdollisesti kliinisesti käyttökelpoinen seerumin tuumorimarkkeri erilaisiin ihmisen syövät. Vaikka sen spesifisyyden puutteen yhden syövän tyyppi viittaa siihen, että on epätodennäköistä, että VCP seerumi mittausta voitaisiin käyttää seulontatyökaluna, sen herkkyys yhtäläinen tai parempi useita yleisesti käytettyjä merkkiaineita tarkoittaa, että sitä voidaan käyttää sovelluksissa, kuten seurantaa hoidon tehokkuuden tai tautien valvonta toistumisen. Lisäksi, VCP voitaisiin käyttää diagnoosin yhteydessä enemmän syöpätyypin-spesifisten lisätä yleistä herkkyyttä. Seulonta paljon suurempi kohortit vaaditaan määrittämään herkkyyden seerumin VCP mittauksen havaitsemiseksi eri vaiheissa syövän etenemistä, ja eri syövän alatyyppejä. Lisäksi spesifisyys VCP suhteen havaitsemiseen neoplastisten vs ei-neoplastisia tauti täytyy arvioida ennen käyttökelpoisuutensa tuumorimarkkeri voidaan lopullisesti vahvistettu. Kuten immunoblottauksella on rajoitettu olipa kyse kvantitatiivisuus ja teknisesti mahdollista, laajamittainen seulonta vaatii kehittämistä suurikapasiteettisten ELISA-analyysiä varten VCP.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että proteomic profilointi kasvain secretomes alkaen kliinisesti merkittäviä hiiri malleja voi johtaa tunnistamiseen ehdokas kiertävän liittyvien proteiinien tumorigeneesin ihmisillä. Me raportoimme että VCP on yli-ilmentynyt seerumissa syöpäpotilaiden ja että se voi olla uusi kliinisesti käyttökelpoinen merkkiaine syövän havaitsemiseen.

Materiaalit ja Methods

Mice

Ctnnb1

tm1Mmt/+;

Pten

tm1Hwu/tm1Hwu;

Amhr2

tm3(cre)Bhr/+ (CPA) hiiret synnytettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7] ja ylläpidettiin C57BL /6-geneettinen tausta. Näissä hiirissä, konstitutiivinen aktivaatio CTNNB1 signalointi johtuu poistetaan kolmannen eksonin

Ctnnb1

, jolloin tuotanto määräävän stabiilin CTNNB1 mutantti proteiini, joka puuttuu fosforylaatiokohdat vaaditaan sen proteosomal hajoamista [ ,,,0],6]. CPA hiiret kehittävät GCT syntymää ja kuolla ennen 8 viikon ikäisille [7]. Kaikki eläinkokeiden hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttää komitea ja ne noudattavat USPHS valiokunnalle inhimillinen hoito ja käyttö Laboratory Animals.

Soluviljely

Normal GC eristettiin käyttäen menetelmää kuvanneet Zeleznik et al. [26]. Lyhyesti, epäkypsä (23-26 päivää vanhoja) C57BL /6-hiiriin injektoitiin i.p. 5 IU hevosen koriongonadotropiini (EKG, Folligon, Intervet, Schering-Plough) aiheuttavan follikkelien kasvun. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia myöhemmin eläimet lopetettiin ja munasarjat lävistää 25-gaugen neulan vapauttamiseksi GC väliaineeseen (0,9% NaCl). Solususpensio sentrifugoitiin nopeudella 1000

g

5 min ja suspendoitiin uudelleen GC maljattiin 24-kuoppalevyille 70% konfluenssiin DMEM /F12-väliaineessa (Sigma Aldrich), jota oli täydennetty 5% FBS: ää (Invitrogen), penisilliiniä ja streptomysiiniä (P /S). GCT 21-25 päivää vanha CPA hiiret leikattiin, jauhettu, joiden koko on 10 leikkausveitsellä terä ja hajotettiin 2 tuntia 0,1% kollagenaasia päässä

Clostridium histolyticum

(Sigma) seerumittomassa DMEM P /S . Sitten soluja sentrifugoitiin 1000

g

10 minuuttia ja suspendoitiin uudelleen DMEM: iin, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja P /S ennen pinnoitus tulee 100 mm soluviljelymaljoille (25 x 10

6 solua /malja) .

Differential secretome analysoi

Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, viljellään GC ja GCT solut pestiin HBSS: llä (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 24 h seerumittomassa DMEM. Supernatantit kerättiin ja väkevöitiin 80-kertaisesti käyttäen Amicon Ultra-4 keskipako- suodatin yksikköä (Millipore), jonka 3 kDa molekyylipainon cut-off. Proteiinikonsentraatiot kvantitoitiin käyttäen Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad proteiinimäärityksellä) ja 4-6 ug proteiinia näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla. Seuraavat hopeavärjäys, proteiinit bändejä löytyy GCT, mutta ei GC-näytteistä (n = 14), leikattiin irti geelistä. Geelipalat väri poistettiin 50%: lla metanolia pelkistetään sitten 10 mM DTT: ssa 1 tunnin ajan 56 ° C: ssa ja alkyloitiin 55 mM klooriasetamidia yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 50 mM ammoniumbikarbonaattia, geeli palat kutistunut 100% asetonitriili (ACN). Digestio suoritettiin käyttäen trypsiiniä 50 mM ammoniumbikarbonaattia 8 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Peptidit uutettiin lopuksi 90% ACN /0,5 M ureaa ja kuivattiin nopeus tyhjiössä. Näytteet liuotetaan uudestaan ​​5% ACN 2% muurahaishappoa (FA) ja erotettiin kotitekoinen C

18 pylväs (150 um x 10 cm) käyttäen Eksigent nanoLC-2D-järjestelmä. 56-min gradientti 5-60% ACN (0,2% FA) eluoimiseksi käytettiin peptidien kotitekoinen käänteisfaasi-kolonnia (150 um sisähalkaisija x 100 mm) virtausnopeudella asetettu 600 nanoliter /min. Pylväs liitetty suoraan nanoprobe rajapinnan avulla LTQ-Orbitrap Velos massaspektrometri (Thermo Fisher). Jokainen täysi MS-spektri seurasi kaksitoista MS /MS-spektri (kolmetoista scan tapahtumat), kun kaksitoista runsain moninkertaisesti varautuneita ioneja valittiin MS /MS sekvensoinnin. Tandem MS kokeet suoritettiin käyttäen törmäyksen aiheuttama dissosiaatiota lineaarisessa ioni ansa. Aineisto käsiteltiin käyttäen 2,1 Mascot (Matrix Science) hakukoneen sietävän parametrit asetettu 15 ppm ja 0,5 Da esiasteen ja fragmentti-ioneja. Valittua muuttuvan muutokset olivat karbamidometyyli (C), deamidaatiota (NQ), hapetus (M) ja fosforylaatio (STY). Valittuun tietokantaan oli ihmisen IPI tietokanta v.3.54 kanssa 150858 sekvenssit.

seeruminäytteitä

seeruminäytteitä potilaista, joilla on rinta-, paksusuoli-, keuhko-, haima- tai eturauhasen syöpä, tai non-Hodgkin-lymfooman ( n = 12 kullekin syövän tyyppi) saatiin Ontario Tumour Bank. Seeruminäytteistä terveillä vapaaehtoisilla (n = 7), ja potilailla, joilla on GCT (n = 9) tai munasarjasyövän (n = 8; 2 selvä solu, 2 vakavien, 2 mucinous ja 2 endomet- munasarjasyövät) saatiin Réseau de Recherche du syöpä du Fonds de recherche Québec – Santé. Menettelyjä hyväksynyt FRQS-RRCancer tutkimuskomitea ja Ontario Cancer Research Ethics Board, sekä Comité d’éthique de la Recherche sur les sujets humains keskuksen hospitalier de l’Université de Montréal. Inhibiini A ja inhibiini B-tasot määritettiin ELISA yliopistossa Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay ja analyysi Core. Arvot inhibiini A ja B alapuolella havaitsemisraja (13 ng /l ja 20 ng /l, vastaavasti) määritettiin normaalisti. CA15.3 ja CEA-tasot määritettiin les Laboratoires du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. Arvot alle 7 g /l ja 29 kU /l CEA ja CA 15,3, vastaavasti, pidetään normaalina. CA125-tasot määritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa ELISA-määritystä kit ja tasot pidetään normaalia, kun alle 35 U /ml (Abnova).

immunoblot-analyysit

seeruminäytteitä (4 ui eli noin 200 ug ) erotettiin SDS-PAGE: lla 10% akryyliamidigeeleillä. Geelit siirrettiin polyvinylideenifluoridia kalvoja (GE Amersham /VWR). Immunodetektio suoritettiin HSPA4- tai VCP-spesifisten vasta-aineiden (kloonit ab75977 tai ab11433 vastaavasti Abcam) ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (GE Amersham /VWR) ja paljastettiin käyttäen ECL Detection Reagents (GE Amersham /VWR). Kvantifiointi proteiinivyöhykkeet suoritettiin densitometrialla analyysejä käyttämällä Kodak Image Station 440CF ja Kodak 1D v.3.6.5 ohjelmisto (Eastman Kodak, Rochester, NY). Normalisoimiseksi VCP tai HSPA4 proteiini tasoilla immunobloteilla, kukin geeli sisälsi kaksi tai kolme yhteistä seeruminäytteitä viitteinä. Viitearvo VCP asetettiin keskimääräinen terveiden Säätökaista enimmäisosuuksina immuunianalyyseilla + 2 SD.

Tilastolliset analyysit

Yksisuuntainen ANOVA Dunnettin post-testiä käytettiin vertaamaan VCP tasolle terveillä naisilla ja syöpäpotilailla.

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Meggie Girard, Kathleen Theroux, Jennifer Kendall-Dupont, ja Manon de Ladurantaye niiden teknistä apua ja Ontario Kasvain Bank (Jeanette Joanes ) ja Réseau de Recherche du syöpä du Fonds de la Recherche en Santé Québec tarjota seerumeista syöpäpotilaista ja normaalilta henkilöltä.