Krooninen sairaus

tiivistelmä

GAIP vuorovaikutuksessa proteiini C-pää (GIPC) tiedetään tärkeä rooli erilaisissa fysiologinen ja tautitiloja. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden roolin GIPC master säätelijänä autophagy ja eksosytoottisen reittejä syövän. Osoitamme, että ehtyminen GIPC aiheuttaman autophagy haiman syöpäsoluissa, kuten käy ilmi ylössäätely autophagy markkerin LC3II. Olemme lisäksi ilmoittaa, että GIPC säätelee soluliikennöinti- reitit moduloimalla eritystä, biogeneesiä, ja molekyylitason koostumus eksosomeiksi. Havaitsimme myös osallistumista GIPC on metabolisen stressin reittejä säännellä autophagy ja microvesicular leviämistä, ja totesi, että GIPC asema määrittää lastaus solujen lastia eksosomi. Lisäksi olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen lääkeaineen resistenssigeenin ABCG2 sisään eksosomeiksi päässä GIPC-köyhdytettyä haimasyövän soluja. Olemme myös osoittaneet, että ehtyminen GIPC syöpäsolujen herkistetty ne gemsitabiinihoidon, Avenue, joka voidaan tutkia mahdollisena terapeuttinen strategia voittamiseksi lääkeresistenssin syöpään.

Citation: Bhattacharya S, Pal K, Sharma AK , Dutta SK, Lau JS, Yan IK, et ai. (2014) GAIP Vuorovaikutus proteiini C-pää säätelee Autophagy ja eksosomi biogeneesin haimasyövän kautta aineenvaihduntareittien. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10,1371 /journal.pone.0114409

Editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 07 marraskuu 2014; Julkaistu: 3. joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Bhattacharya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee National Institutes of Health myöntää CA78383 ja CA150190 (DM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Macroautophagy, yleisesti nimitystä kuten autophagy, on olennainen catabolic prosessin solut toteuttaa erilaisten biologisten ja fysiologisten toimintojen [1], [2]. Normaaleissa solun olosuhteissa, tämä prosessi ylläpitää solujen ja kudosten homeostaasin suojaavaan tavalla kierrätys- ja halventavan solukomponenttien solukuoleman aikana [2] – [5]. Aikaisemmin uskottiin, että autophagosome, kaksinkertaisen membraned rakkula, nielaisee soluelimiin sattumanvaraisesti [1], [2], [5]; kuitenkin, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että valinta soluelimiin on ohjannut lastin tekijät [6]. Lisäksi, autophagy on tärkeä rooli monissa tautiprosesseissa, mukaan lukien syöpä [7]. Useissa syöpätyyppejä, autophagy voivat vaikuttaa aloittamista ja sairauden etenemisen [8], [9] ja edistää kasvainten kehittymistä alla metabolisen stressin hypoksian. Koska mutaatiot autophagy liittyvien geenien on raportoitu ihmisen syövissä, [10], [11], tutkimukset ovat keskittyneet geneettisiin ja kemiallisia inhibitio autophagy kuin terapeuttinen strategia [12].

GAIP vuorovaikutuksessa proteiinin C- terminus (GIPC) oli alun perin identifioitiin vuorovaikutuksessa kumppani GTPaasia aktivoivan proteiinin RGS-GAIP G-proteiiniin kytketyn reseptorin alayksikköä GI alfa [13]. PDZ domeeni GIPC stabiloi monia transmembraaniproteiineja, kuten Glut1 transporter, semaforiini-F, neuropiliini-1, TAX virusproteiini, dopamiini D2 ja D3, ja IGF1 R [14] – [19]. Vaikka suurin osa PDZ domain-sitovia ligandeja GIPC ovat transmembraaniproteiineja, useat niistä ovat sytosolin proteiineja, kuten APPL1 ja RGS19 [13], [20]. Toiminnallisesti, N-terminaalisen alueen GIPC on mukana dimerisaation ja C-terminaalisen alueen GIPC vuorovaikutuksessa myosiinin VI (MYO6) [21], [22], korostaen sen asemaa sovittimen molekyyli loading PDZ domain-kohdennettuja lasteja päälle MYO6 moottori proteiinin kuljetusta varten. GIPC on mukana myös kaupan eri transmembraani- proteiineja endosyyttisiin rakkuloiden ja välttämättömiä kaupan internalized integriinien aikana solujen vaeltamiseen, angiogeneesi, ja sytokineesiin [23] – [25]. Kohonneita GIPC ilmentymisen on raportoitu useissa syövissä, mukaan lukien haima- ja rintasyöpä, edistää niiden solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä [19], [26] – [30]. Toisaalta ehtyminen GIPC syöpäsoluissa estää proliferaatiota ja edistää apoptoosia. Knockdovvn GIPC johtaa G

2 solusyklin pysähtymisen ja vähentää kuolleisuutta MDA-MB231-soluissa, tarkemmin viittaa roolia GIPC vuonna sytokineesin ja solumigraatio [23], [31].

Eksosomit ovat solunsisäinen rakkulat (40-100 nm) tarvitaan solujen välisen viestinnän monisoluisten organismien [23]. Molekyyli koneet mukana eksosomi biogeneesissä kuuluu neljä Multiproteiinikompleksit tunnetaan endosomaaliseen lajittelu monimutkainen liikenteestä vastaava (ESCRT) -0, -I, -II, ja -III, ja tarvike proteiinit kuten Alix ja VPS4. ESCRT-0, -I ja -II komplekseja tunnistavat ja sitovat ubikitinoituja kalvon proteiineja endosomaaliseen rajoittava kalvo, kun taas ESCRT-III kompleksi on vastuussa kalvon orastava ja varsinaisen poistamisen intraluminaalisen rakkulat (ILVs) [32]. Äskettäin Alix (tunnetaan myös nimellä PDCD6IP) on toiminnallisesti liitetty eksosomi biogeneesin kautta vuorovaikutuksessa TSG101 ja CHMP4 proteiinit [33] – [35]. Tuoreen tutkimuksen mukaan muodostumista ja vapautumista arrestin domain sisältävä proteiini 1-välitteisen mikrovesikkeleille (ARMMs) on solukalvon riippuu rekrytointi TSG101 proteiini [36].

On kertynyt näyttöä siitä GIPC näytelmiä tärkeä rooli soluliikennöinti-. Erityisesti, GIPC toimii tukirakenteena ohjata reseptorivälitteisen kaupan [20], [22], [37] ja sen jälkeen reseptori sisäistämisen, GIPC ohimenevästi on yhteydessä altaan endosyyttisissä rakkuloiden lähellä solukalvon [15]. Eksosomi biogeneesissä sekä muodostumista autophagosome liittyy endosytoottiselle rakkulat. Kuitenkin, ei ole selkeää näyttöä siitä, että nämä kaksi mekanismia rakkuloiden muodostumisesta ylikuulumisen keskenään [38]. Tässä Esillä olevassa tutkimuksessa paljastaa ainutlaatuinen säätelevän roolin GIPC on autophagy aineenvaihdunnan reittejä ja modulaatioon eksosomi eritystä. Osoitamme myös, että ehtyminen GIPC syöpäsoluista herkistää ne kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten gemsitabiini, avenue joka voidaan tutkia edelleen mahdollisena terapeuttinen strategia huumeiden vastarintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely GIPC pudotus solulinjat

haimasyöpä solulinjoja AsPC-1 ja PANC-1 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 median (AsPC-1) tai korkean glukoosin DMEM (ja PANC-1), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 5% L-glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 95% ilmaa-5% CO

2 (v /v). Vakaa GIPC pudotus solulinjoja käyttäen lentiviruksen shRNA. Lentivirus partikkelit valmistettiin käyttämällä 293T-soluja ko-transfektoitiin gag-pol-ekspressioplasmidin pCMVΔ8.91, The VSVG kirjekuoren ekspressioplasmidin PMD-G, ja vektori plasmidi pLKO.1 koodaa cDNA: n ilmentämiseen GIPC /Synectin shRNA (5 ”-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3 ’). GIPC /Synectin shRNA sisään pLKO.1 ostettiin Open Biosystems. Supernatantti kerättiin 48 h transfektion jälkeen ja jäädytettiin -80 ° C: ssa. PANC-1 tai AsPC-1-soluja infektoitiin sitten yön yli 37 ° C: ssa ja stabiili pesäkkeet eristettiin sen jälkeen, kun puromysiiniselektion (1 ug /ml). Tehokkuuden varmistamiseksi, että GIPC /Synectin pudotus, proteiini lysaatit analysoitiin immunoblot varten GIPC /Synectin. Ohjaus solut transdusoitiin tyhjällä proteiinivektorin. Retrovirus- pBabe-puro mCherry-EGFP-LC3B plasmidi Addgene (Addgene plasmidi 22418) käytettiin valmistamaan retroviruspartikkeleita käyttämällä 293T seuraavan standardin mukaisesti. AsPC-1 tai PANC-1-solut infektoitiin retroviruspartikkeleita ja vakaa pesäkkeet eristettiin sen jälkeen, kun puromysiiniselektion (1 ug /ml). Kokeet suoritettiin 70-80% solun konfluenssiin ja vahvistettu vähintään kolmen erillisen kokeen.

RNA-interferenssi, transfektio

jälkeen 24 tunnin inkubointi antibiootti-elatusaineella, solut transfektoitiin anti-GIPC sirna (siRNA) käyttäen DharmaFECT 2 transfektioreagenssin (Dharmacon, Lafayette, CO). Seitsemänkymmentä kaksi 96 h transfektion jälkeen, GIPC pudotus vahvistettiin Western blot -analyysillä. Samanlainen siRNA lähestymistapa hyväksyttiin anti-Atg7 ja anti-Beclin1 knockdown. Glukoosi nälkään kokeissa, sekä ohjaus siRNA ja GIPC siRNA käsiteltiin AsPC-1-soluja pidettiin glukoosin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää lopulliseen 16 h 96 h kokeen. Sillä autophagic siuminvirtauskokeista, sekä ohjaus siRNA ja GIPC siRNA käsiteltiin AsPC-1 ja PANC-1-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla Pepstatin A ja E-64d lopullisen 24 h 96 h kokeen.

Vasta-aineet ja immunoblot-analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin NP-40 hajotuspuskuria, jota oli täydennetty proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma, St. Louis, MO) ja Pysäytetään fosfataasinestäjällä cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Supernatantti kerättiin sentrifugoinnin jälkeen 13.000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja erotettiin SDS-PAGE: lla. Anti-GIPC, anti-PLCγ, ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineet ABCG2, mTOR, fosfo-mTOR, p70S6K, fosfo-p70S6K, Atg7, Beclin1, AMPK-α, ja fosfori-AMPK-α ostettiin Cell Signaling Technologies. Anti-CHMP4b ja anti-TSG101 hankittiin Abcam; anti-β-aktiini hankittiin Sigma; ja Alix vasta-aine hankittiin Thermo Scientific. Western blotit kehitettiin käyttäen SuperSignal West Pico alustan (Thermo Scientific) ja immunosaostukset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19].

Immunofluoresenssi

Soluja (2 x 10

4) ympättiin on peitelasi antibioottia väliaineessa 24 tunnin ajan. Sitten solut transfektoitiin GIPC siRNA tai salattu siRNA (Dharmacon) ja väliaine vaihdettiin 48 h post transfektiota. Jälkeen 96 h, solut pestiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Kun oli salvattu 10% vuohen seerumissa 15 minuuttia, solut tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan. Objektilasit värjättiin sitten ensisijaisesti vasta-aineiden LC3 2 tuntia 1% vuohen seerumia. Inkuboinnin jälkeen diat sekundääriset vasta-aineet on konjugoitu AlexaFluor 488 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY), 1 h, objektilasit asennettu Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), joka sisältää 4 ’, 6-diamino-2 -phenylindole (DAPI) ja konfokaalimikroskopialla tehtiin. Eräässä toisessa koesarjassa, solut, jotka ilmentävät mCherry-EGFP-LC3B ympättiin peitinlaseilla ja transfektoitiin GIPC siRNA tai salattu siRNA. Jälkeen 96 h, solut pestiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Objektilasit asennettu Vectashield sisältävät DAPI kuten aiemmin on kuvattu.

glukoosin soluunottoa ja Solunsisäiset glukoosin mittaus määrityksessä

Stable soluja, joko transfektoitu GIPC shRNA tai kontrollivektorilla, ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 48 tuntia. Glukoosin oton mitattiin käyttämällä glukoosin imeytymisen Cell-Based Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) käyttäen fluoresoivasti leimattua deoksiglukoosi analoginen. Saat solunsisäinen glukoosipitoisuus mittauksessa Amplex Red glukoosi Assay Kit (Life Technologies) käytettiin pienin muutoksin valmistajan protokollan kuten aiemmin on kuvattu [39]. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja saatu solupelletti pestiin kahdesti PBS: ssä ja dispergoidaan 1X reaktiopuskuria sarjasta. Solut hajotettiin sauvasonikoinnilla kolme sykliä 10 sekunnin, 30 sekuntia pois 20% teholla samalla jatkuvasti yllä jäällä. Viisikymmentä ui reaktioliuosta (10 mM Amplex Red, 10 U /ml HRP, 100 U /ml glukoosioksidaasia, 50 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4) lisättiin 50 ui solu- lysaattia 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin pimeässä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Fluoresenssi (eksitaatio: 544, Emissio: 590) mitattiin sitten käyttäen SpectraMax-levylukijaa ja arvot ilmaistiin Suhteellinen fluoresenssi-yksikköä (RFU) /mg proteiinia.

eksosomi eristäminen

Eksosomit oli eristetty kunnostettua alustaa ja PANC-1 ja AsPC-1-soluissa differentiaalisentrifugaatiolla. Soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin ja elatusaine korvattiin media sisälsi 10% naudan sikiön seerumia vailla mikropartikkeleita sentrifugoimalla (60 min 100000 x

g

). 72 tunnin kuluttua inkubaation supernatantit kerättiin ja poistettu solujätteiden ja kuolleita soluja, jossa on kaksi peräkkäistä pyörii 4 ° C: ssa, 3000 x

g

10 min. Tyhjennetään Sitten supernatantit sentrifugoitiin edelleen 4 ° C: ssa, 60000 x

g

70 min. Saatu eksosomi pelletit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten sentrifugoitiin uudelleen 4 ° C: ssa, 100000 x

g

70 min. Lopulliset eksosomi pelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään tai vettä riippuen kokeessa.

elektronimikroskopialla

Vasta valmistettu eksosomeiksi suspensoitiin uudelleen vettä edelleen dispergoitiin Trump fiksatiiviliuosta, joka koostuu 4 % (v) formaldehydiä ja 1% (v) glutaraldehydiä 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,2. Eksosomeiksi pestiin sitten 0,1 M fosfaattipuskurilla, 1%: isella osmiumtetroksidilla 0,1 M fosfaattipuskuria, tislattua vettä, 2% (v) uranyyliasetaatilla, tislattua vettä, etanolia, ja absoluuttinen asetonilla peräkkäin. Lopuksi eksosomeiksi sijoitettiin TEM verkkoon tutkittavaksi käyttämällä

Philips Technai

T12.

Proteomiikka analyysi

Proteiini tunnistus suoritettiin kautta geelissä trypsiinihajotuksen käyttäen nanoLC- MS /MS hybridi orbitrap /lineaarinen ioni ansa massaspektrometrialla. Lyhyesti, proteiini eksosomeiksi on GIPC puutteesta stabiilien solulinjojen erotettiin 4-12% NuPage geelillä (MOPS-puskurissa) ja 20 ui SDS-PAGE-näytepuskuria, joka sisälsi 50 mM DTT: tä. Geelit värjättiin BioSafe kolloidinen sinistä väriainetta (BioRad) ja halutut juovat leikattiin irti geelistä ja massaspektrometria-analyysi käyttäen seuraavia menettelyjä. Kolloidinen sinistynyt geeli vyöhykettä väri poistettiin 50% asetonitriili /50 mM Tris pH 8,1, kunnes selvä. Vyöhykkeet pelkistetään sitten 50 mM TCEP: tä /50 mM Tris, pH 8,1 55 ° C: ssa 40 min ja alkyloitiin 20 mM jodiasetamidilla /50 mM Tris, pH 8,1 huoneen lämpötilassa 60 minuutin ajan pimeässä. Proteiinit pilkottiin

in situ

30 ui (0,005 ug /ul) trypsiinillä (Promega Corporation, Madison WI) 20 mM Tris pH 8,1 /0,0002% Zwittergent 3-16, 55 ° C: ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen peptidi uutetaan 10 ui 2% trifluorietikkahappoa, ja sitten 60 ui asetonitriiliä. Yhteen kerätyt uutteet konsentroitiin alle 5 ui on Speed-Vac keskitin (Savant Instruments, Holbrook, NY) ja sitten kasvatettiin 0,2% trifluorietikkahapossa proteiinin tunnistamiseen nano-flow nestekromatografia sähkösumutus tandem-massaspektrometrialla (nanoLC-ESI -MS /MS) käyttäen ThermoFinnigan Orbitrap Elite Hybrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksa), joka on kytketty Eksigent nanoLC-2D HPLC-järjestelmää (Eksigent, Dublin, CA). Sulanut peptidi Seos ladattiin 250 nl OPTI-PAK trap (optimointi Technologies, Oregon City, OR), mittatilaustyönä täynnä Michrom magic C8 kiinteän faasin (Michrom Bioresources, Auburn, CA). Kromatografia suoritettiin käyttäen 0,2% muurahaishappoa sekä liuotinta (98% vettä /2% asetonitriiliä) ja B liuotinta (80% asetonitriili /10% isopropanoli /10% vettä), ja 2% B: tä 45%: iin B gradientti 70 min 300 nl /min läpi käsi-pakattu PicoFrit (Uusi tavoite, Woburn, MA) 75 pm x 200 mm pylväs (Michrom magic C18, 3 um). Orbitrap Elite massaspektrometri koe asetettiin suorittamaan FT täyden skannauksen 340-1500 m /z resoluutiolla asetettu 120000 (400 m /z), jota seurasi lineaarinen ioniloukku CID MS /MS skannaa päällä viisitoista ioneja. Dynaaminen syrjäytyminen asetettiin 1 ja valitut ionit asetettiin ulkopuolelle jätettävien listalle 30 sekuntia.

Tietokanta etsimällä

Tandem massaspektrit uutettiin msconvert (versio 3.0.4019, ProteoWizard) ja kaikki MS /MS analysoitiin käyttämällä Mascot (Matrix Science, London, UK, versio 2.4.0), Sequest (Thermo Fisher Scientific, versio 27, rev. 12) ja X1 Tandem (gpm, thegpm.org; versio CYCLONE (2010.12 .01.1)). Mascot, Sequest, ja X1 Tandem perustettiin etsiä helmikuu 2012 Svvissprot tietokanta, rajoittuu ihmisen kanssa syötti käänteinen tietokantaan, ja olettaen pilkkovan entsyymin trypsiinin. Maskotti ja X1 Tandem etsittiin kanssa ioniosan massa toleranssi 0,60 Da ja emäioni toleranssi 10,0 PPM. Sequest haettiin kanssa ioniosan massa toleranssi 0,60 ja emäioni toleranssi 0,01 Da. Metioniinin hapetuksen ja jodiasetamidia johdannainen kysteiini tarkennettiin Mascot, Sequest, ja X1 Tandem kuin muuttuja muutoksia.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen PCR-analyysi

Yhteensä RNA eristettiin solulinjoista ja eksosomeiksi käyttämällä miRCURY RNA Isolation Kit – Cell Plant (Exiqon, Woburn, MA) seurasi spektrofotometrisesti (NanoDrop, Thermo Scientific) kvantifiointiin ja laadullinen analyysi. Yhtä suuret määrät kokonais-RNA käänteistranskriboitiin oligo (dT) pohjustus käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) seuraten valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), kuten aiemmin on kuvattu [40]. Glut1 ja β-aktiini-alukkeet ostettiin SABiosciences (Frederick, MD).

Drug herkkyyden määritys

Lyhyesti, 5 x 10

3 solua siirrostettiin hyvin kolmena kappaleena, 96 -No tasapohjaisille levyille 100 ul: lla väliainetta. 24 tunnin kuluttua, eri pitoisuuksina gemsitabiinia (ug /ml) lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 72 tuntia. Lopussa hoitojakson ajan, lisättiin 20 ui MTS liuosta, joka sisälsi PMS (MTS: PMS = 20:1 til. Suhde) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1-2 h. Absorbanssi 490 nm: ssä rekisteröitiin käyttäen Spektrafluor PLUS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ja puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) arvot laskettiin konsentraatiot vastaavat 50%: n vähennys solujen kasvua. Ennen lääkkeen herkkyyden testaus, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määritys (Promega, Madison, WI).

Tilastollinen

tiedot Pylväiden edustavat keskiarvoa ± keskihajonta vähintään kolmen erillisen kokeen, jokainen suoritetaan triplikaattinäytteet. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Studentin t-testiä, jossa on kaksisuuntaista arvo P 0,05 katsotaan olevan merkittäviä.

Tulokset

GIPC ehtyminen indusoi autophagy haiman syöpäsoluissa

Hyödyntämällä GIPC-köyhdytettyä AsPC-1 ja PANC-1 haiman solu- linjat, me tutkimme, GIPC moduloidaan autophagy arvioimalla autophagy liittyviä mikrohaaroihin liittyvä proteiini kevyt ketju 3 (LC3) tuloksia (LC3-I LC3-II) kautta Western blot-analyysi. On hyvin tunnettua, että konversio kevyen ketjun 3-I (LC3-I), kun konjugointi fosfatidyylietanoliamiini (PE), muodostaa konjugaatin kevyen ketjun 3-II (LC3-II), joka sitten rekrytoidaan membraanit autophagosomes [13], [20]. LC3 ilmentyminen on laajalti käytetty seurata ja luoda tila autophagy määränä LC3II korreloi määrä autophagosomes [41]. Kun perusteellinen tutkimus LC3-II tason haiman Pysyvien solulinjojen havaitsimme kohonnut LC3-II tason soluissa puutteellinen varten GIPC, mikä osoittaa aktivoinnin autophagy (kuvio 1A). Havaitsimme myös kasvua LC3-II (vihreä) puncta muodostumista GIPC vaje solujen immunofluoresenssilla tutkimuksessa (kuvio 1 B). GIPC pudotus läsnä ollessa lysosomaalisen proteaasin estäjät, pepstatiini-A: n ja E-64d, entisestään LC3-II: n tasot annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna GIPC pudotus yksinään, mikä osoittaa, lisääminen autophagic virtauksessa (kuvio S1A). Lisäksi käytimme tandem fuusioproteiini mCherry-EGFP-LC3B sisältävät happo-herkkä mCherry ja happoherkän EGFP kuin autophagic flux reportteri-järjestelmän [42], [43]. Aikana autophagosome muodostumista, sekä EGFP ja mCherry havaitaan autophagosomes jotka näkyvät keltaisina puncta. Kuitenkin, kun autophagosomes sulake kanssa lysosomeihin, vihreä fluoresenssi on menetetty, koska hajoamista EGFP happo lysosomaalisen proteaasien tuloksena vain punainen puncta. Siksi läsnäolo sekä keltainen ja punainen puncta osoittaa toiminnallinen autophagic vuon prosessissa. Tässä on käytetty sekä AsPC-1 ja PANC-1 solulinjat ilmensivät stabiilisti mCherry-EGFP-LC3B näyttämään lisää sekä keltainen ja punainen puncta päälle GIPC Knockdown mikä myös osoitti kasvua autophagic virtauksessa (kuvio S1B). Nämä havainnot ehdottivat, että GIPC pudotus aiheuttaa muodostumista autophagosomes haiman syöpäsoluissa.

A) AsPC-1 ja PANC-1-solut infektoitiin lentivirukset ekspressoivat shRNAs on GIPC ja salattu valvontaa. Yhtä suuri määrä kokosolulysaateista päässä AsPC-1 ja PANC-1 GIPC köyhdytettyä solut analysoitiin immunoblottauksella (IB) kanssa vasta-aineiden GIPC ja LC3II. β-Actin käytetään latauskontrollina. B) edustaja immunofluoresenssianalyysillä ja PANC-1-soluissa ekspressiota varten LC3 II (vihreä) in GIPC köyhdytettyä PANC-1-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Solut vastavärjättiin DAPI (sininen).

tutki tarkemmin vaikutusta kahden autophagy liittyviä geenejä, Atg7 ja Beclin1 puolesta GIPC välittämän autophagic sääntelyä. Arvioimaan vuorovaikutusta Atg7 ja Beclin1 vähensimme taso Atg7 ja Beclin1 RNA interferenssi (RNAi) sekä PANC-1 ja AsPC-1-soluissa. Kuten kuvioissa 2A ja 2B, emme noudata mitään merkittävää muutosta Atg7 tai Beclin1 ilmaisun jälkeen GIPC ehtyminen sekä haiman syöpäsoluja. Kuten Atg7 ja Beclin1 kaksi avainkomponenttien autophagosome biogeneesin, myös havaittu laskua LC3 II muuntaminen LC3 I yhteydessä knockdovvn Atg7 ja Beclin1 sekä haiman syöpäsoluja. In AsPC-1-soluissa, huomasimme, että induktio autophagy kanssa ehtyminen GIPC merkittävästi haitannut vähentäminen Atg7 ja Beclin1. Päinvastoin in PANC-1-soluissa, Atg7 ja Beclin1 voinut vaikuttaa LC3II muuntaminen kohteena GIPC ehtyminen. Olemme edelleen pohdittava yhdistys GIPC kanssa Atg7 ja Beclin1 co-immuunisaostuskokeissa ja todettu Beclin1 olevan samassa monimutkainen GIPC (kuviot 2C), mutta ei saanut vakuuttavia tulos Atg7 (tuloksia ei ole esitetty).

A) immunoblottianalyysi analyysi Atg7 ilmaisun AsPC-1 ja PANC-1 solulysaateista transfektoitu siRNA on GIPC, Atg7 ja salattu valvontaa. β-Actin käytetään latauskontrollina. B) immunoblottianalyysi on Beclin1 ilmaisun AsPC-1 ja PANC-1 solulysaateista transfektoitu siRNA on GIPC, Beclin1, ja salattu valvontaa. β-Actin käytetään latauskontrollina. C) Co-immunosaostuksella (IP) ja PANC-1 solulysaateista transfektoitu siRNA on GIPC, ja salattu hallinnan käyttämällä GIPC vasta-ainetta. Immunokompleksit analysoitiin immunoblottauksella (IB) kanssa vasta Beclin1 ja GIPC.

GIPC sovittelee autophagy kautta metabolisen stressin reittien

Glut1 liittyy glukoosin sisäänottoa syöpäsoluihin ja GIPC on tiedossa vakauttaa Glut1 solukalvon kuin PDZ verkkotunnuksen sisältävän vuorovaikutus kumppanin [14]. Tässä suhteessa olemme tutki kaatamalla GIPC haiman syöpäsoluissa horjuttaisi Glut1 ja häiritä glukoosin ottoa näihin soluihin. Kuten odotettua, löysimme merkittävä lasku Glut1 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tason päälle GIPC Knockdown in AsPC-1 ja PANC-1-soluissa (kuvio 3A 0,01). D) Solunsisäiset glukoositasot myös merkittävästi vähentynyt GIPC köyhdytetyn AsPC-1 ja PANC-1 solulinjat vahvistaa roolia GIPC glukoosiaineenvaihdunnan (** tarkoittaa p 0,01).

A) Immunoblot solun lysaatit GIPC köyhdytettyä ja hallita AsPC-1 ja PANC-1-solut ovat koetettiin p-AMPK-α, yhteensä AMPK-α. β-Actin käytetään latauskontrollina. B) Edelleen immunoblottia solulysaateista ylhäältä kunto olivat koetettiin p-mTOR yhteensä mTOR, p-p70S6K ja yhteensä p70S6K. β-Actin käytetään latauskontrollina.

Tutkimme lisäksi molekyylitason mekanismi autophagy tutkimalla alavirtaan molekyylit AMPK-α-reitin. Havaitsimme alentuneet mTOR fosforylaation jälkeen GIPC Knockdown in AsPC-1 ja PANC-1-solut; kuitenkin yhteensä mTOR ilme ei muuttunut. Lisäksi havaitsimme lasku tunnettu alavirtavaikuttajainhibiittorit mTOR, fosfo-p70S6K ja p70S6K-suhde, on GIPC-köyhdytettyä solulysaateista kontrolliin verrattuna emo-soluja (kuvio 4B). Poistaminen ekstrasellulaarisen glukoosin entisestään AMPK-α fosforylaatiossa ja vähentää mTOR fosforylaatio sekä p70S6K fosforylaatiota (kuvio S2). Kuitenkin LC3 tasot laskivat poistettaessa solunulkoinen glukoosin mikä tukee aiempien raporttien kanssa [46] viittaa solunulkoisen glukoosin poisto tappaa soluja joko apoptoosin tai nekroosin sijasta asiakkuutta autophagy kuin prosurvival vaikutus. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että GIPC ohjaa autophagy kautta sääntelyn metaboliareitit haiman adenokarsinoomasolua.

GIPC vaikuttaa eksosomi eritystä ja biogeneesin

Kun eksosomeiksi kerätty vakaa transfektanteista, suoritimme entsymaattiset analyysit asetyylikoliiniesteraasin aktiivisuuden kuten aiemmin on kuvattu [14]. Tämä määritys osoitti suurempaa runsaasti eksosomeiksi että väliaine on GIPC-puutteellinen solulinjat. 3,5 tai suurempi kertainen lisäys eksosomi tuotannon havaittiin väliaine kerätään GIPC-köyhdytettyä AsPC-1-soluissa verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 5A). Saimme samanlaisen tuloksen kanssa GIPC-köyhdytettyä PANC-1-soluja sekä (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös päättäneet pitoisuus kokonais-RNA näissä eksosomeiksi kuin toinen mittari eksosomi runsautta ja löysi samankaltaisia ​​tuloksia (kuviot 5B 5C). Nanohiukkasten seuranta-analyysi käyttäen NanoSight LM10 vahvisti kokojakauma meidän eksosomi valmisteet. Jossa tila on noin 100 nm, niiden koko oli yhdenmukainen nykyisen eksosomi määritelmän (kuvio 5D).

Eksosomit eristettiin viljelyväliaineessa AsPC-1 ja PANC-1 GIPC loppuun ja valvontaa soluviljelmässä. Laadullista mittausta sama määrä soluja siirrostettiin viljelylevyillä. A) vertailu aktiivisuus asetyylikoliiniesteraasin kuvataan varten eksosomeiksi kerätty GIPC köyhdytettyä ja hallita AsPC-1-solulinjassa. B & C) vertailu kokonais-RNA sisällön eksosomi valmisteen AsPC-1 ja PANC-1 soluviljelmä näytetään. D) Edustava kokojakauma profiilia eksosomi valmiste saadaan käyttämällä Nanosight. E) Edustava siirto elektronin micrograph (TEM) on eksosomeiksi on esitetty tässä kuviossa. Mittakaava on 500 nm. F) Korkeampi suurennos TEM kuva eksosomeiksi esitetään. Mittakaavapalkki on 200 nm. G) Immunoblot suoritettu solujen lysaatit kerättiin GIPC Knockdown soluista sekä säätökennoja olivat koetettiin TSG 101, Alix, ja CHMP 4B. PLC γ käytetään latauskontrollina.

jälkeen suoritettiin morfologinen luonnehdinta eksosomi valmisteen ultra-rakenteellinen analyysi eksosomi pelletteihin raskasmetallien negatiivisesti värjätty ja siirto (TEM). Analyysi TEM kuvia vahvisti eksosomi mitat meidän näytteitä. Kuva 5E edustaa tyypillistä morfologiaa yleistä eksosomi väestön alemmassa TEM suurennus. Edelleen analyysi TEM kuvia suuremmalla suurennuksella vahvistivat tyypillinen cupped muoto rakenne eksosomeiksi (kuvio 5F). Nämä analyysit vahvistivat, että läsnä tai poissa GIPC ei vaikuttanut eksosomi morfologiaan.

Vahvista onko kasvatettu eksosomeiksi in GIPC-köyhdytettyä soluissa korreloi aktivoitumisen eksosomi biosynteesin koneet, tarkastetaan ilmentymistä avaimen geenien ( Alix, TSG101, CHMP4B) osallistuu eksosomi biogeneesissä immunoblottauksella. Havaitsimme lisääntynyt ilmentyminen Alix, TSG101, ja CHMP4B in GIPC pudotus soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 5G).

GIPC vaikuttaa eksosomi sisältöä ja herkistää haimasyövän solulinjoissa kemoterapeuttisia lääkkeitä

Jos haluat vertailla eksosomi sisällön GIPC knockdown ja villityypin solujen, suoritimme proteomiikka analyysejä eksosomeiksi kerätty PANC-1 stabiileja solulinjoja. Sillä proteomianalyysi, proteiini uutettiin erittyy eksosomeiksi ja olemme havainneet, että sisältö eksosomeiksi suuresti vaihdella riippuen GIPC tilasta. Tukemiseksi luotettavuutta ja herkkyys myös analyysimenetelmiä, proteomiikka tiedot on vahvistettu, ettei GIPC proteiinin eksosomeiksi eristää GIPC vajaiden solujen, mutta ei kontrollinäytteissä. Tämä osoitettiin myös ensimmäistä kertaa läsnäolo GIPC in eksosomeiksi. Lisäksi proteomiikka analyysi eksosomeiksi eristetty PANC-1 stabiili soluissa paljasti merkittävän rikastamisen liittyvien geenien lääkeresistenssin (tuloksia ei ole esitetty).