Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Yksi tärkeimmistä mekanismeista, jotka voisivat tuottaa vastus että kasvainlääkkeiden syöpäsoluissa on ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) kuljettajat. ABC kuljettajat voivat merkittävästi pienentää pitoisuutta solun antineoplastisia lääkkeitä lisäämällä niiden ulosvirtausta, mikä alentaa sytotoksista aktiivisuutta antineoplastisia lääkkeitä. Yksi näistä kuljettajat, useita resistentti proteiinin 7 (MRP7, ABCC10), on äskettäin osoitettu tuottavan resistenssin antineoplastiset lääkkeet lisäämällä ulosvirtausta paklitakseli. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia BCR-Abl tyrosiinikinaasin estäjät imatinibi nilotinibia ja dasatinibi aktiivisuudesta ja ilmentymistä MRP7 HEK293-soluissa, jotka on transfektoitu MRP7, nimetyn HEK-MRP7-2.

Menetelmät ja /tai Principal havainnot

Me raportoimme ensimmäistä kertaa, että imatinibi ja nilotinib päinvastaiseksi MRP7 välittämän monilääkeresistenssin. Meidän MTT määrityksen tulokset osoittivat, että MRP7 ilmentymistä HEK-MRP7-2 soluja ei muuttunut merkittävästi inkuboimalla 5 uM imatinibin tai nilotinibin enintään 72 tuntia. Lisäksi imatinibi ja nilotinibi (1-5 uM) tuotti merkittävää konsentraatiosta riippuvaisen käänteinen MRP7 välittämää monilääkeaineresistenssin tehostamalla herkkyyttä HEK-MRP7-2 solujen paklitakselille ja vinkristiinin. Imatinibi ja nilotinibi, 5 uM, lisäsi merkittävästi kertyminen [

3H] -paclitaxel HEK-MRP7-2 soluissa. Inkubointi HEK-MRP7-2 solujen imatinibin tai nilotinib (5 uM) myös esti merkitsevästi ulosvirtausta paklitakseli.

Päätelmät

Imatinibi ja nilotinib kääntää MRP7-välitteisen paklitakselin vastus, kaikkein todennäköisesti johtuu niiden eston ulosvirtausta paklitakselin kautta MRP7. Nämä havainnot viittaavat siihen, että imatinibi tai nilotinib, yhdessä muiden antineoplastisten lääkkeiden, voivat olla käyttökelpoisia hoidettaessa tiettyjä resistenttien syöpien.

Citation: Shen T, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Y, Chen A, Zhou Y, et ai. (2009) Imatinibi ja Nilotinibia Reverse monilääkeaineresistenssin syöpäsoluissa estämällä effluksiaktiivisuus MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): E7520. doi: 10,1371 /journal.pone.0007520

Editor: Debbie Fox, The Research Institute for Children lastensairaalassa New Orleans, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 02 syyskuu 2009; Julkaistu: 20 lokakuu 2009

Copyright: © 2009 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja St. Johnin University Research Seed Grant No. 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) ja Primary Care Medicine Associates, PC (Flushing, NY) avustus nro 582-2082-7601 (Z. -S. Chen). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka kliinisen käytön leikkaus, säteily ja kemoterapia ovat vähentyneet uusiutuminen syöpä, solujen vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä on merkittävä este syövän hoidossa [1], [2]. Teho kemoterapian voidaan rajoittaa johtuen hankittu resistenssi aiemmista hoito. Näin ollen tutkimusstrategioihin kiertämään tällaista vastustuskykyä syöpäsoluissa on tullut nykyinen painopiste oli kehittää uusia monimuotoiset kemoterapeuttisen strategioita. Sekä sisäsyntyinen ja hankitun lääkeresistenssin voi tuottaa useita muutoksia solujen eri reittejä, mikä lasku sytotoksisuus, ja siten tehokkuutta, ja antineoplastiset lääkkeet [3]. Siksi syöpäpotilailla, jotka saavat useita hoidot voivat yhä herkkä kemoterapia-aineiden kanssa.

Yksi tärkeimmistä solun mekanismeja, jotka voivat tuottaa vastustuskyvyn antineoplastisen terapiassa ulosvirtausta lääkkeitä syöpäsolujen erityisillä transmembraaninen kuljettajat tai pumppujen [4]. Nämä kuljettaja proteiinit ovat peräisin superperheen ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajat, jotka jakavat yhteiset rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet [5]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jäsenten enemmistö C perheen ABC kuljettajat ovat monilääkeresistenssiin proteiineja (MRPs), joille on tunnusomaista ristiresistenssiä monelle rakenteellisesti eivät liity lääkkeiden [2], [4].

Useat tutkimukset viittaavat siihen, että syöpäsolut ilmentävät ABC C perhe transporter MRP7 /ABCC10 voivat kehittää resistenssin eri kemoterapeuttisten. Esimerkiksi ihmisen sylkirauhasen adenokarsinooma (SGA) soluja, jotka yli-ilmentävät MRP7 mRNA ja MRP7 proteiininäyttösirua merkittävää vastustuskykyä vinkristiinin [6]. MRP7 ilmentyminen on myös immunohistokemiallisesti havaittu tuumoria kantavien hiirten ksenosiirrettyjä ihmisen SGA-hoidon jälkeen vinkristiinin [6]. Lisäksi E

217βG, kilpaileva estäjä MRP7 liikenteen, merkittävästi vähentynyt dosetakseli kertymistä ihmisen SGA soluissa [6]. Kaiken yhdisteitä, jotka estävät MRP7 liikenne vaimentavat tai taaksepäin resistenssin syöpäsoluja, jotka ilmentävät MRP7 proteiinia.

MRP7 yli-ilmentäviä soluja resistenssiä useita syöpälääkkeet, kuten paklitakseli, vinkristiini ja vinblastiini [7]. Viimeaikaiset papereita kertoi myös, että MRP7-overexpresssing solujen resistenssiä nukleosidianalogin ja epithilone B [8]. Aiemmin laboratoriossamme, olemme osoittaneet, että cepharanthine, joka on biscoclaurine johdettu alkaloidi, käänteinen MRP7-välitteisen paklitakselin vastus [9].

tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) voidaan kääntää vastus syöpäsolujen antineoplastiset lääkkeet läpi useita mekanismeja. Esimerkiksi ihmisen SGA soluissa, MRP7, P-gp, ja MRP1 olivat kaikki havaitut altistuksen jälkeen vinkristiinin [6]. Viime aikoina olemme ja muut ovat ilmoittaneet, että jotkut TKI ovat voimakkaita modulaattoreita ABC kuljettajat, mukaan lukien P-gp: n ja BCRP /ABCG2 [10], [11]. Viimeaikaiset tulokset laboratoriossamme ehdotti, että nilotinib merkittävästi kumoaa P-gp- ja BCRP-välitteisen MDR [12].

Tässä tutkimuksessa yksi tärkeimmistä tavoitteista oli tunnistaa TKI yhdisteitä, jotka käänteinen MRP7 välittämän huume vastus. Näin ollen on mahdollista, että TKI, yhdessä muiden antineoplastisten lääkkeiden, voivat olla käyttökelpoisia hoidettaessa syöpiä, jotka ilmentävät MDR-proteiinien, mukaan lukien ABC kuljettajat. Tärkeä havainto siitä TKI oli, että tietyt niin sanotut ”pieni molekyyli” lääkitys saattaa estää TK aktiivisuutta kilpailemalla ATP sitoutumisesta solunsisäiseen katalyyttinen domeeni reseptorin TK, joka tuotti esto erilaisten alavirran signalointikaskadien by autofosforylaatio [13]. Mielenkiintoista, imatinibi, nilotinibia ja dasatinibi ovat estäjiä TK breakpoint klusterin alue- Abelson (BCR-Abl) ja KIT, luokan III reseptorin TK [14] – [18]. BCR-Abl-geeni liittyy häiriöstä TK-toiminto ja sen jälkeen johtaa pahanlaatuisiin krooninen myelooinen leukemia (CML) [19], [20]. Tunnustamista BCR-Abl-geeni ja sen vastaavan proteiinin on johtanut kehitystä pienimolekyylisiä lääkkeitä, joiden tarkoituksena on estää aktivoinnin BCR-Abl TKI läpi kilpailukykyinen sitova, ATP-sitoutumiskohta [19]. Kaiken kaikkiaan ensisijaisena tavoitteena oli selvittää, jos BCR-Abl TKI voisi kääntää MRP7 välittämän MDR.

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Solulinjat

HEK293 ja MRP7 cDNA jalomielinen lahjoitus tohtori Gary Kruh (University of Illinois at Chicago, Chicago, IL). Transfektoituja HEK-MRP7-2 solujen ja tyhjän vektorin transfektoitiin HEK293-pcDNA3.1-solut perustetaan HEK293 soluihin elektroporaatiolla [9]. Emo lääkettä herkkä ihmisen epidermoidikarsinooma solulinjaa KB-3-1 ja sen vastaava P-gp-yliekspressoivassa solulinjaa KB-C2 oli ystävällisesti Drs. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) ja Akiyama (Kagoshima yliopisto, Japani), tässä järjestyksessä. KB-C2-soluja perustetaan KB-3-1-solut altistamalla ne oli kasvavia määriä kolkisiinia asteittain vaiheittain tavalla (jopa 2 ug /ml) ja keräämällä solut, jotka olivat resistenttejä [20]. Kaikki nämä solulinjat kasvatettiin kiinnittynyt yksittäiskerroksina pulloissa Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan seerumia, 2 mM glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä normaaleissa solun viljely olosuhteissa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

2,2. Materiaalit

DMEM, naudan seerumin ja penisilliini /streptomysiinillä ostettiin Hyclone (Logan, UT). Nilotinibi (Tasigna®) (Fig. 1 B) saatiin lahjana Novartis Pharmaceuticals (Basel, Sveitsi). Imatinibi (Fig. 1A) ja dasatinib (Fig. 1 C) ostettiin ChemieTeck Inc. (Indianapolis, IN). Paklitakseli, vinkristiini, doksorubisiini, kolkisiinin, p-aminophenylmethylsulfonyl fluoridi, naudan seerumialbumiinia, dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja 1- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -3,5-diphenylformazan (MTT), polyklonaalinen vuohen vasta-aine vastaan ​​MRP7 (C-19), monoklonaalinen hiiren vasta-aine P-gp: (P7965), toissijainen piparjuuriperoksidaasi-leimattua anti-vuohi tai anti-hiiri-IgG hankittiin Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) . Polyklonaalinen vasta-aine ihmisen MRP1 /ABCC1 sen toimitti ystävällisesti Dr. Akiyama (Kagoshima yliopisto, Japani). [21] Monoklonaalinen vasta-aine BXP-34 vastaan ​​BCRP hankittiin Signet Laboratories Inc. (Dedham, MA). [

3H] -paclitaxel (45 pCi /mmol) ostettiin Moravek Biochemicals (Brea, CA).

2.3. Valmistaminen solulysaateista

Confluent yksikerrossoluissa T-25 pulloon otettiin talteen ja huuhdeltiin kahdesti kylmällä PBS: llä. Solu-uutteet valmistettiin käyttäen Radioimmunosaostus määrityspuskurissa [1 x PBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää, 100 uM p-APMSF, 10 uM leupeptiiniä, 10 uM aprotiniinin] 30 min jäätä satunnaisesti keinumisesta seurasi sentrifugointi 12000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Proteiinipitoisuudet solulysaateista määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä [22]. Supernatantti, joka sisälsi koko solulysaatit kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

2,4. Immunoblottaus

tasa määrä kokosoluliuotteista (40 ug) erotettiin 4-12% natriumdodekyylisulfaattia polycrylamide geelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvoille [23]. Solulysaatit denaturoitiin 100 ° C: ssa vettä dekantterilasissa 5 min ennen lastattu 4-12% SDS-PAGE. Geeli ajettiin SDS-elektroforeesin puskurissa (25 mM Tris-emästä, 0,192 M glysiiniä, 1% SDS), 170 V: ssa 2 tuntia. Siirto suoritettiin siirto-puskurissa (25 mM Tris-emästä, 0,192 M glysiiniä, pH 8,3) 30 V: ssa 2 tuntia. Nitroselluloosakalvolle upotettiin sitten 5% rasvatonta maitoa estää ei-spesifinen sitoutuminen 1 h huoneen lämpötilassa. Sitten membraania immunoblotat- yön primaarisilla vasta-aineilla (polyklonaalisia MRP7 tai monoklonaalisia P-gp: n ja BCRP vasta-aineiden 1:500 ja polyklonaalisten MRP1 on 1:3,000) 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä, membraani pestiin kolme kertaa TBST-puskurilla (0,3% Tris, 0,8% NaCl, 0,02% KCI, 0,05% Tween 20), jota seuraa kolmen tunnin inkubaation johdetun vasta-aineiden polyklonaalista anti-MRP7 tai monoklonaalisia anti- P-gp: 1:1000. Proteiini-vasta-aine kompleksin mitattiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, NJ). Kalvo altistettiin sitten kalvon kehittämiseen. Tavanomaisesti käytettyjä latauskontrollina aktiini havaitsemiseen käytettiin yhtä suuri lastaus kussakin kaista valmistettujen näytteiden solulysaateista.

2.5. Analyysi huumeiden herkkyys

Drug herkkyys analysoitiin käyttämällä hieman muutettu MTT kolorimetristä [23]. Tyhjä vektori transfektoitiin HEK293-pcDNA3.1-solujen ja MRP7-transfektoitujen HEK293-MRP7-2 solut ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena 5000 solua /kuoppa. Inkuboinnin jälkeen DMEM täydennettynä 10% naudan seerumia 37 ° C: ssa 24 tuntia, antineoplastiset lääkkeet laimennettiin eri konsentraatioissa ja inkuboitiin solujen kanssa jatkuvasti 72 tuntia. Mahdolliset inhibiittorit lisättiin 1 h ennen lisäystä syöpälääkkeiden.

jälkeen lääkeaineen inkubaation 72 h, 20 ui MTT: tä (4 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboitiin vielä 4 h, jolloin eläviä soluja kehittyä keltaisen värinen MTT osaksi tummansinistä formatsaanikiteet. Tämän jälkeen väliaine poistettiin varovasti ilman sekoittamalla liima yksikerroksista solujen, ja 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Levyjä hyvin ravisteltiin 5 minuuttia, ja OPSYS mikrolevylukijaa luetaan absorbanssi 570 nm DYNEX Technologies Inc. (Chantilly, VA). Kestävyysaste laskettiin jakamalla IC

50 MDR-soluissa kuin vanhempien solujen, kun taas aste MDR kääntyminen laskettiin jakamalla IC

50 solujen kanssa syövän huumeiden vuonna Koska inhibiittorin, joka saatiin, kun läsnä on estäjää. Pitoisuudet tarvitaan inhiboimaan kasvua 50% kontrolli solut laskettiin eloonjäämisen käyrät käyttäen Bliss menetelmällä [23].

antineoplastiset lääkkeet käytetään mukana paklitakselin, vinkristiini ja doksorubisiini vaihtelevilla konsentraatioilla loppukonsentraatioon 10, 1, ja 1 uM. BCR-Abl TKI kuten nilotinibi ja imatinibi myöhemmin käytettiin myrkyttömiä pitoisuuksina 1, 2,5 ja 5 uM seuloa vastaan ​​vinkristiinin ja doksorubisiinin. Tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen valittu yhtenä myrkytöntä annosta (5 uM) tutkia vaikutuksia TKI on MRP7 välittämän resistenssin paklitakseli. Kun olemme ratkaista, mikä TKI oli merkittävin kääntyminen vaikutus, kuten imatinibi ja nilotinibi, me myöhemmin valittujen kolme keskittymää (1, 2,5 tai 5 uM) kullekin TKI onko niiden kääntyminen vaikutukset olivat pitoisuudesta riippuvainen paklitakselille, vinkristiinin ja doksorubisiinin .

2.6. Drug keskittymisen ja ulosvirtaus

HEK293-pcDNA3.1 emosoluista ja HEK-MRP7-2 transfektoituja soluja siirrostettiin kaksi T75-pulloihin ja inkuboitiin DMEM täydennettynä 10% naudan seerumia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun solut olivat 60-95% konfluentteja, kukin inhibiittori lisättiin erillisiin pulloihin, ja soluja inkuboitiin 1 h ajan. Sitten solut trypsinoitiin ja kahdessa erässä (48 x 10

6 solua) kunkin solulinjan suspendoitiin väliaineessa. Sen jälkeen solut suspendoitiin väliaineeseen, joka sisälsi [

3H] -paclitaxel pitoisuutena 0,1 uM kanssa tai ilman TKI nilotinibi ja imatinibi (5 uM) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tunnin kuluttua inkuboinnin alusta korvattiin sisältävä väliaine TKI ilman paklitakseli. Alikvootit (1 x 10

6 solua) kerättiin eri aikapisteissä (0, 20, 60, ja 120 min). Sitten solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kukin näyte laitettiin tuikenestettä mitata radioaktiivisuus Packard TRI-CARB 1900CA nestetuikelaskurilla Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).

2.7. Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja erot määritettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. A priori tilastollinen merkitsevyys asetettiin

P

0,05.

Tulokset

3.1. Expression of MRP7 HEK293-pcDNA3.1 ja HEK-MRP7-2 solujen

Tässä tutkimuksessa, kahdessa solulinjassa käytettiin, olivat HEK293-solut transfektoitiin joko MRP7 ekspressiovektori tai tyhjän vektorin ohjaus (pcDNA3.1 ). Immunoblot-analyysi suoritettiin ekspression havaitsemiseksi tason MRP7 proteiinin edellä mainitussa linjat. MRP7 proteiinia (MW 171 kD) ilmennettiin HEK-MRP7-2 soluja, mutta ei HEK293-pcDNA3.1-solut (Fig. 2A). P-gp, jonka molekyylipaino on 170 kD, havaittiin positiivinen kontrolli KB-C2 solulinjoissa, mutta ei negatiivisen kontrollin KB-3-1, HEK293-pcDNA3.1 tai HEK-MRP7-2 solulinjoja ( kuva 2B). Meillä on myös suoritettu Western blot -kokeita sen määrittämiseksi MRP1 ja BCRP ilmennettiin HEK293-pcDNA3.1 ja HEK-MRP7-2 soluja. Tasot MRP1 ja BCRP sekä HEK-MRP7-2 solut ja HEK293-pcDNA3.1 solut huomaamaton. Nämä havainnot ovat tärkeitä, koska kaikki havaitut vaikutukset kanssa inhibiittorit ovat todennäköisesti johtua niiden vuorovaikutusta P-gp, MRP1 ja /tai BCRP.

(A) ilmentyminen MRP7 HEK293-pcDNA3.1 ( kaista 1) ja MRP7-transfektoiduissa soluissa (kaista 2). (B) ilmentäminen P-gp HEK293-pcDNA3.1 (kaista 1), HEK-MRP7-2 (kaista 2), KB-3-1 (kaista 3) ja KB-C2-solujen (kaista 4). (C) vaikutus 5 uM imatinibin on ilmentymistason MRP7 (HEK-MRP7-2) 36 ja 72 tuntia, vastaavasti. (D) vaikutus 5 uM nilotinibin on ilmentymistason MRP7 (HEK-MRP7-2) 36 ja 72 tuntia, vastaavasti. Yhtä suuret määrät (40 ug proteiinia) kokosolulysaattia käytettiin kullekin näytteelle. Nitroselluloosakalvoja immunoblotattiin primaarisen vasta-aineen vasten MRP7 tai aktiini on 1:500 laimentamiseen tai P-gp 1:500 laimennuksen 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1:1000 laimennoksilla huoneenlämpötilassa 3 h.

vaikutuksen arvioimiseksi imatinibin /nilotinibin ilmentymistä koskevat MRP7, HEK-MRP7-2 soluja inkuboitiin 5 uM imatinibin tai nilotinibin 36 ja 72 tuntia, vastaavasti . Inkubointi HEK-MRP7-2 solujen imatinibin tai nilotinib ei merkittävästi muuta proteiinin ekspression tasojen MRP7 eri ajankohtina (Fig. 2C ja D). Tämä viittaa siihen, että vaikutus estäjien vastetta solujen syöpälääkkeitä ei johdu sääntelyyn MRP7 ilmaisun.

3.2. Analyysi lääkeaineen herkkyys MRP7-transfektoitujen HEK293-solujen

määrittämiseksi lääkeresistenssin profiili MRP7, herkkyys HEK-MRP7-2 transfektoitujen solujen erityisiin antineoplastiset lääkkeet verrattiin vektorin vain ohjaus solut, HEK293-pcDNA3.1. HEK-MRP7-2 solut osoittivat merkittävää korkeampi resistenssi paklitakseliin ja vinkristiinin (9.5- ja 6.7-kertainen resistenssi verrattuna kontrollisoluihin, vastaavasti) (taulukko 1). Nämä tulokset osoittivat, että HEK-MRP7-2 solulinjaa pystyi resistenssin eri antineoplastisia lääkkeitä, joka on yhdenmukainen edellisessä raportissa [9].

3.3. Vaikutus TKI siitä herkkyydestä MRP7-transfektoitujen HEK293 solujen syöpälääkkeiden

Testasimme useita BCR-Abl TKI selvittää, jos he voisivat kääntää vastus HEK293 solujen yli-ilmentävät MRP7 on antineoplastinen lääkeaine paklitakseli ja vinkristiini. Suuruus kääntyminen tuottaman TKI paklitakselille oli vaihteleva (taulukko 1, Fig. 3). Esi-inkubointi solujen kanssa imatinibin tai nilotinib, 2,5 uM, merkittävästi käänteinen vastus HEK-MRP7-2 solujen paklitakseli (taulukko 1, Fig. 3A ja 3B). Imatinibin ja nilotinib tuotti 6.9- ja 13,0-kertainen kääntyminen vastaavasti vastuksen paklitakseliin. IC

50 Paklitakselin HEK-MRP7-2 soluja viljeltiin yhdessä 2,5 uM nilotinibin oli merkittävästi vähentynyt 207,0 ± 19,7 nM 15,9 ± 0,9 nM, ja tämä oli huomattavasti alhaisempi kuin paklitakseli kontrolliryhmässä (21,9 ± 1,9 nM). Vastus Paklitakseliin täysin päinvastainen, kun imatinibi yhteistyössä inkuboitiin paklitakselin HEK-MRP7-2 soluissa. Merkittävästi suurempi kääntyminen saatiin klo 5 uM (12,4-kertainen) verrattuna 1 uM (4,7-kertainen) pitoisuus. Imatinibi, 5 uM, myös lisääntynyt solujen herkkyys paklitakseliin HEK293-pcDNA3.1 solujen 2,2-kertaiseksi, vaikka tämä vaikutus HEK293-pcDNA3.1 oli merkittävästi alhaisempi kuin että MRP7 transfektoiduissa soluissa (12,5-kertainen) (Pöytä 1). Nämä tulokset osoittivat, että BCR-Abl-TKI imatinibin ja nilotinib vaimensi merkittävästi vastustuskyky paklitakselin välittämä MRP7. Vaikka koinkubaation HEK293-pcDNA3.1 (kontrolli solut) nilotinibin ja paklitakselilla myös parannettu herkkyys paklitakselille (2,5-kertainen muutos HEK293-pcDNA3.1 solut), tämä parannettu herkkyys oli huomattavasti pienempi kuin määritetyt MRP7 transfektoiduissa soluissa (taulukko 1, Fig. 3C). Sen sijaan toinen BCR-Abl-TKI dasatinib 2,5 uM, ei merkittävästi parantaa paklitakseli herkkyyttä joko HEK293-pcDNA3.1 tai HEK-MRP7-2 soluja (taulukko 1, Fig. 3C).

Kaksi solulinjat, HEK293-pcDNA3.1 ja HEK-MRP7-2, ovat edustettuina HEK293 ja MRP7, vastaavasti. Ymppäyksen jälkeen ja viljelemällä soluja 24 h, yhtä suuret määrät PBS: ää tai käänteisen aineita lisättiin HEK293-pcDNA3.1-soluja (esitetty ja, vastaavasti) ja HEK-MRP7-2 soluja (esitetty ja, vastaavasti) 1 tunnin ajan ennen lisäämällä paklitakseli. Eri pitoisuuksia Paklitakselin esitetty kuviossa. Lopullinen pitoisuus imatinibi nilotinibi tai dasatinibi oli 2,5 uM. Oheinen kuva on edustava tulos imatinibi nilotinibi tai dasatinibi.

Lisäksi paklitakseli, tutkimme myös vaikutusta valitun TKI herkistää soluja toiseen syöpälääke, vinkristiini. Samanlainen havainnoista paklitakselin, nilotinibia ja imatinibi (1, 2,5 ja 5 uM) merkitsevästi päinvastaiseksi MRP7 välittämää vinkristiini vastus (2.1-, 6.8- ja 9.0-kertaiseksi, sillä nilotinibi, 2.4-, 6.9- ja 8.2-kertainen vastaavasti imatinibilla) pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (taulukko 1). Tutkimme myös vastetta MRP7-transfektoitujen solujen toiseen syöpälääke, doksorubisiini, on läsnä imatinibin, kuten doksorubisiini ei ole substraatti MRP7 [23]. Tuloksemme osoittivat, että imatinibi (1, 2,5 ja 5 uM) ei merkittävästi herkistää vaste ohjaus vanhempien HEK293-pcDNA3.1-solut, tai taaksepäin vastus HEK-MRP7-2 transfektoiduissa soluissa, (taulukko 1) ja doksorubisiini. Tämä osoittaa, että vastaus näihin TKI oli spesifinen MRP7, kuten doksorubisiini ei ole substraatti MRP7 eikä näin ollen välittää doksorubisiini ulosvirtausta. Doksorubisiini on substraatti P-gp, MRP1 ja BCRP, mutta kumpikaan imatinibi eikä nilotinibin huomattavasti doksorubisiinin herkkyyttä HEK-MRP7-2 soluissa, mikä viittaa siihen, että P-gp: n, MRP ja BCRP eivät merkittävästi edistää lääkeresistenssin HEK- MRP7-2.

Kaiken imatinibin ja nilotinibi merkittävästi käänteinen MRP7 välittämää vastus paklitakseli ja vinkristiini, mutta ei doksorubisiini. Lisäksi tämä kääntyminen oli pitoisuudesta riippuvainen (taulukko 1, Fig. 3). Vaikka kasvu herkistämisen HEK293-pcDNA3.1 kontrollisoluja tapahtui, kun nilotinibialtistusta tai imatinibi, tämä vaikutus oli merkittävästi pienempi kuin määritetty HEK-MRP7-2 transfektoiduissa soluissa (taulukko 1, Fig. 3).

3.4. Vaikutukset imatinibin ja nilotinibia solusisäiseen keskittymisen ja ulosvirtaus [

3H] -paclitaxel

Sen määrittämiseksi mekanismia, jolla imatinibin ja nilotinibi selviytymään tai taaksepäin MRP7 välittämä paklitakseli kestävyys, niiden vaikutus kertyminen [

3H] -paclitaxel in MRP7-transfektoiduissa soluissa tutkittiin. Pitoisuutta solun [

3H] -paclitaxel HEK-MRP7-2-soluissa oli 30% siitä kertyneet HEK293-pcDNA3.1-soluissa (kuvio. 4). Kertyminen paklitakselia merkittävästi parannettu (1,9-kertainen) HEK-MRP7-2 solujen (P 0,05) inkuboinnin jälkeen soluja joko imatinibin tai nilotinib pitoisuutena 5 uM. HEK293-pcDNA3.1 soluja, imatinibi mutta ei nilotinibi, oli johtanut lievästä kasvusta pitoisuutta solun [

3H] -paclitaxel, mutta tämä herkistyminen oli vähäistä verrattuna vaikutus imatinibin HEK-MRP7- 2-soluilla.

solunsisäinen paklitakselin kertymistä HEK293-pcDNA3.1 ja HEK-MRP7-2 solut mitattiin inkuboinnin jälkeen 0,1 uM paklitakselin. Kertymiseen solun paklitakselin HEK293-pcDNA3.1 solujen puuttuessa imatinibin ja nilotinibin näytetään vasemmanpuoleisessa baareissa (▪). Kertymiseen solun paklitakselin läsnäollessa 5 uM imatinibin HEK293-pcDNA3.1 soluissa näkyy oikealla (□). Solunsisäinen kerääntyminen paklitakselin HEK-MRP7-2 soluja kun läsnä oli 5 uM nilotinibin on esitetty oikealla (). Kukin pylväs edustaa välineet (± SD). Kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena. * P 0,05, Studentin t-testillä.

Edellä esitetyn perusteella tulokset, on mahdollista, että solunsisäisten paklitakselia tuotetaan imatinibin ja nilotinib voi johtua: (1) lasku ulosvirtausta paklitakselia ja /tai, (2) lisääntyminen oton paklitakseli. Siksi seuraava koe suoritettiin sen määrittämiseksi, onko lisäys paklitakselin kertymistä tuottaman imatinibin ja nilotinibi johtui esto paklitakselin ulosvirtausta. HEK-MRP7-2 solut ja HEK293-pcDNA3.1-soluja inkuboitiin paklitakselin ja ajankulku solunsisäisen lääkkeen kerääntyminen määritettiin (Fig. 5). Kuten odotettua, HEK-MRP7-2 solujen julkaissut huomattavasti suurempi prosenttimäärä kertynyt paklitakselin verrattuna HEK293-pcDNA3.1-solut, ja paklitakselin määrä, joka on effluksoidaan lisääntyi ajan. Paklitakseli kerääntyminen 0 min lääkevuoto- asetettiin 1. 60 min, soluissa inkuboitiin huumeeton väliaineessa, -60% kertyneestä paklitakselin vietiin HEK-MRP7-2 solujen puuttuessa imatinibin tai nilotinibin . Sen sijaan, lähes kaikki paklitakseli oli läsnä sisällä HEK-MRP7-2 soluja inkuboitiin imatinibin tai nilotinib lopullisessa pitoisuudessa 5 uM eri ajanjaksoina. Valvontaa solujen Paklitakselin pitoisuus suoritettiin ulosvirtausta kasvoi myös ajan kanssa, mutta taso ulosvirtaus oli vain hieman pienempi kuin havaittu soluissa, jotka on transfektoitu MRP7. Sen sijaan, että HE293-pcDNA3.1-solut, -30% paklitakseli vapautui 60 minuutin kuluttua ilman testiyhdisteitä. Inkuboinnin HEK293-pcDNA3.1 solujen imatinibin tai nilotinib (5 uM) esti myös ulosvirtausta paklitakselin, vaikka on vaikutus oli merkittävästi pienempi kuin mitä havaitaan HEK-MRP7-2 soluissa.

prosenttiosuus vapautuneen paklitakselin piirrettiin ajan funktiona. 1 tunnin inkubaation TKI, [

3H] -paclitaxel oli co-inkuboitiin HEK293-pcDNA3.1 kanssa TKI () tai ilman TKI (), ja sillä välin HEK-MRP7-2 solujen TKI () tai ilman TKI (). Solut pestiin ja uudelleen inkuboitiin paklitakselin väliaineessa. Ajanhetkellä 0 min, 20 min, 60 min ja 120 min, solut kerättiin ja tasot [

3H] -paclitaxel määritettiin tuikelaskennalla. Arvot 0 min lääkevuoto- asetettiin 1 verrataan mitattuja arvoja muilta ajankohtina. Jokainen piste edustaa välineet (± SD) kolmesta erillisestä kokeet tehdään käyttäen triplikaattinäytteet.

Keskustelu

Tämä tutkimus oli ensimmäinen tunnistaa, että BCR-Abl TKI imatinibi ja nilotinib , mutta ei dasatinibihoidon, voi kääntyä MRP7-välitteisen MDR pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

HEK293-solut, jotka on transfektoitu MRP7 rekombinantti-geeni-HEK-MRP7-2, ja HEK293-pcDNA3.1-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla, käytettiin testeissä MRP7 ulosvirtausta toiminto. Nämä transfektoidut solulinjat on aiemmin käytetty tutkimuksissa suunniteltu määrittämään vaikutukset cepharanthine on käänteinen MRP7-välitteisen resistenssi paklitakseliin [9]. Tässä tutkimuksessa, Western blot-analyysi vahvisti, että solujen transfektio MRP7 oli onnistunut, sillä MRP7 proteiinit ilmennettiin vain HEK-MRP7-2 soluja, eikä HEK293-pcDNA3.1-solut (Fig. 2). Solulinjat altistettiin täsmälleen samoissa koeolosuhteissa ja menettelyjä, ja viljeltiin samalla antineoplastisia lääkkeitä samaan inkubaatioajan. Voidaan väittää, että MRP7-transfektoidut solut ilmensivät muita proteiineja, lisäksi MRP7, kuten P-gp, joka on saattanut vaikuttaa MDR. Kuitenkin Western blot-analyysi osoitti, ettei HEK293-pcDNA3.1 ohjaus solulinja, eikä HEK-MRP7-2 transfektoitu solulinja, ilmaistuna havaittavia P-gp (Fig. 2), joka voi myös välittää MDR. Lisäksi, MRP1 ja BCRP oli havaittavissa sekä ohjaus HEK293-pcDNA3.1 ja transfektoitiin HEK-MRP7-2 soluihin Western blot-analyysi (tietoja ei esitetty). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että HEK-MRP7-2 transfektoitu solulinja ilmentää spesifisesti MRP7, mutta ei P-gp, MRP, tai BCRP.

Aiemmin on raportoitu, että cepharanthine ja nilotinib merkittävästi käänteinen P- gp-välitteisen MDR HEK-MRP7-2 soluihin [9] ja BCRP yli-ilmentyvä solulinjat [24], vastaavasti. Koska MRP7 ja P-gp ovat rakenteeltaan samanlaisia ​​ja toiminnallinen aktiivisuus, suunnittelimme kokeita sen määrittämiseksi, nilotinibille voisi kääntää MRP7-välitteisen lääkeresistenssin paklitakseli. Koska rakenteellinen samankaltaisuus MRP7 ja P-gp, aikaisempi tutkimus osoitti, että jotkut P-gp: n estäjien pystyivät merkittävästi kääntämään paklitakselia vastus HEK-MRP7-2 solut yli-ilmentävät MRP7 [9]. Olemme havainneet, että nilotinib (2,5 uM) merkittävästi herkistyneet MRP7-transfektoitujen HEK293-solujen paklitakselia, koska se laskee merkittävästi IC

50 paklitakselin MRP7-trasnfected solujen, verrattuna kontrollisoluihin. Vaikka nilotinib on estäjä P-gp: n [24], tämä ei ole sekoittava tekijä kokeissa, koska P-gp-proteiinia ei ekspressoida joko HEK293-pcDNA3.1 tai HEK-MRP7-2 solut (Fig. 2) .

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että tietyt TKI: 1) merkittävästi heikentynyt vastustuskyky paklitakselin MRP7 yli-ilmentäviä soluja (taulukko 1, Fig. 3), 2) ei merkittävästi herkistää reaktiota paklitakselille tyhjän vektori transfektoituja soluja, mutta vaikutus oli huomattavasti pienempi kuin että MRP7 transfektoiduissa soluissa (Fig. 3), ja 3) ei merkittävästi estä tai indusoi MRP7 ilmentymistä (Fig. 2C ja D). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot alustavasti viittaavat siihen, että on TKI: tässä tutkimuksessa käytetyt, imatinibi ja nilotinibi kykenevät kääntämään MRP7-välitteisen vastus toiminnan estäminen MRP7. Niistä TKI että testattiin paklitakselia, BCR-Abl-TKI imatinibin ja nilotinib 5 uM täysin päinvastainen MRP7-välitteisen paklitakselia vastus, jonka suuruus 12.5- ja 21.0-kertaisesti, vastaavasti (taulukko 1). Sen sijaan toinen BCR-Abl TKI dasatinibi, ei tuottanut merkittävää käänteinen MRP7 välittämää paklitakseli vastus (taulukko 1; Fig. 3C). Tällä hetkellä selitys erotuksen dasatinib verrattuna nilotinibille tai imatinibi on vielä määrittämättä. Yksi mahdollinen lähestymistapa, joka voi tuottaa käsityksen tästä asiasta olisi, että rakenne–aktiivisuussuhde (SAR). Perustuen niiden kemiallisten rakenteiden (Fig. 1), dasatinibi puuttuu 2-phenylaminopyrimidine rengas, joka on läsnä rakenteiden nilotinibin ja imatinibi. On mahdollista, että ilman tätä renkaan dasatinibia voisi olla tärkeä tekijä, joka erottaa dasatinib aktiivisuutta että joko Nilotinibin tai imatinibi. Yksityiskohtainen rakenne-toiminto tutkimuksia tarvitaan rajaamiseksi SAR vuorovaikutus näiden TKI kanssa MRP7 yli-ilmentäviä soluja. Lisäksi ehdotettiin, että HEK293-pcDNA3.1 solut myös herkistettiin annettaessa samanaikaisesti nilotinib tai imatinibia (taulukko 1; kuvio. 5).