Krooninen sairaus

tiivistelmä

hankinta platinaa vastarintaa ensivaiheen platina /taksaani hoito on yleisesti havaittu munasarjasyöpää sairastavilla potilailla ja estää kliinisiä tehokkuutta. On olemassa muutamia vaihtoehtoja estää platinaa vastarintaa; kuitenkin, demetyloidaan aineiden on osoitettu resensitize potilaiden platina hoidon mikä osoittaa, että DNA: n metylaatio on kriittinen tekijä kehittymistä platinaa vastarintaa. Olemme aiemmin raportoineet epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on uusi säätelijä DNA metyylitransferaasin (DNMT) aktiivisuuden ja DNA: n metylaation. Toiset ovat osoittaneet, että EGFR aktivaatio liittyy sisplatiinihoitoon ja platinaa vastarintaa. Oletimme, että sisplatiini aiheuttama aktivointi EGFR välittää muutokset DNA: n metylaatio liittyy kehittymistä platinaa vastarintaa. Tämän tutkimiseksi arvioimme EGFR signalointi ja DNMT aktiivisuuden akuutin sisplatiinin altistuksen. Olemme myös kehittäneet

in vitro

malli platinaa vastus vaikutusten tutkimiseksi EGFR estoa hankkimisesta sisplatiinin vastarintaa. Akuutti sisplatiinihoitoon aktivoi EGFR ja alavirran signalointireittejä, ja indusoi EGFR välittämää lisääntyminen DNMT aktiivisuuden. Sisplatiini resistentit solut osoittivat myös lisääntynyt DNMT aktiivisuutta ja globaalin metylaatio. EGFR esto toistuvien sisplatiinin hoitoja syntyy soluja, jotka olivat herkempiä sisplatiinin ja eivät kehittyneet kasvaa DNA: n metylaatio tai DNMT aktiivisuus verrattuna kontrolleihin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että aktivointi EGFR aikana platinaa hoidon edistää kehittymistä platinaa vastarintaa. Lisäksi EGFR esto voi olla tehokas strategia heikentämään kehittymistä platinaa vastarintaa mikä parantaa tehokkuutta kemoterapeuttisen hoidon munasarjasyövän.

Citation: Granados ML, Hudson LG, Samudio-Ruiz SL (2015) vuosimaksut epidermaalisen kasvutekijän reseptorin hankinta Platinum Resistance in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 10 (9): e0136893. doi: 10,1371 /journal.pone.0136893

Toimittaja: J. Christopher States, University of Louisville, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 09 elokuu 2015; Julkaistu: 09 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Granados et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Tutkimus raportoitu tässä julkaisussa tukivat National Cancer Institute of National Institutes of Health alle Award Number K01CA172591. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy johtuvien gynekologisten syöpäsairauksia [1]. Advanced tauti, myöhään diagnoosi, vatsakalvon etäpesäke ja usein kehittämiseen chemoresistance estää parannuksia yleiseen eloonjäämisaste joka on edelleen alhainen noin 44% [1]. Ensisijaisena hoitona munasarjasyövän sisältää kirurgisen debulking ja platina (sisplatiini tai karboplatiini) -taxane (paklitakseli) kemoterapiaa [2]. Jopa 70-80% munasarjasyöpä potilaista kehittyy platinaa vastarintaa jälkeen ensimmäisen linjan hoito ja useimmat näistä potilaista lopulta periksi solunsalpaajaresistenttiin tautiin [3-5]. Siten platinaa vastus on edelleen merkittävää kliinistä haaste. Tähän mennessä on vain rajoitetusti toimenpiteitä, jotka estävät tai kääntää platinaa vastarintaa; kuitenkin, on ollut joitakin edistysaskeleita käytön demetyloiva agenttien resensitization potilaiden platinapohjaisen hoidon [6-10]. Erityisesti Matei ja kollegat osoittivat, että platina kestävät hoidettujen potilaiden pienellä annoksella demetyloivan agentti aiheuttama demetylaation geenien kasvainsolujen ja korreloi positiivisesti ilman taudin etenemistä [7]. Tämä korostaa DNA: n metylaatio kriittiseksi tukija hankintaan lääkeresistenssin munasarjasyöpä. Kuitenkin sääntelymekanismeissa DNA metylaatio ja hankinta platinaa vastarintaa seuraavista sisplatiinihoitoon ei ole täysin selvitetty. Olemme aiemmin raportoitu, että epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) säätelee DNA-metyylitransferaaseja (DNMT) ja DNA: n metylaatio [11]. Siksi EGFR voi edistää platinaa vastus.

EGFR on reseptori tyrosiinikinaasin, joka on yli-ilmentynyt 30-98% munasarjan epiteelin syövän [4,5] ja yli-ilmentyminen EGFR (ja sen ligandit) munasarjasyöpää sairastavilla potilailla korreloi huonon ennusteen [12]. Aktivointi EGFR ovarioiden liittyy lisääntynyt pahanlaatuisuuteen ja köyhien potilaiden hoitotuloksiin [13,14]. Lisäksi aktivointi EGFR on osoitettu ~ 30% munasarjojen kasvaimia [15]. EGFR vastaa aktivointi useiden solunsisäisten signalointireittien lukien Ras /Raf /MAPK, Jak /Stat ja AKT /PI3K ja säätelee monia solun prosessit, kuten solujen selviytymistä, proliferaatiota ja muuttoliike (katso [14] tarkistettavaksi). Lisäksi EGFR aktivointi tapahtuu vastineena sisplatiini [16-19] ja hyperactivation reseptorin, ja sen loppupään signalointi polkuja, on sekaantunut platinaa vastarintaa [20,21]. Osoitimme aikaisemmin, että aktivointi EGFR munasarjasyöpäsoluja lisää DNMT aktiivisuutta ja pitkän aikavälin EGFR aktivointi voi johtaa lisääntyneeseen DNA metylaatio [11] sekä vähentynyt herkkyys Sisplatiinin [22].

Platinum tai sisplatiinia vastus korreloi lisääntynyt DNA: n metylaation ja myöhemmin hiljentäminen liittyvien geenien sopiva lääkevaste [23-28]. Geeniekspressioanalyysiä platina herkkiä versus platina kestävät potilaan näytteet osoittivat, että säädellään eri tavalla geenit ovat todennäköisemmin ali-ilmentynyt vastustuskykyisten verrattuna herkkien kasvainten [29]. Yhdessä me arveltu, että sisplatiini aiheuttama aktivointi EGFR edistää kehittymistä platinaa resistenssin munasarjasyöpäsoluja säätelemällä DNMT aktiivisuuden ja DNA: n metylaatio. Lisäksi ehdotamme, että pienimolekyylisiä inhibiittoreita EGFR saattaa auttaa ehkäisemään tai vähenemässä hankinnan sisplatiinin vastarintaa. Testata hypoteesia, arvioimme aktivointi EGFR, alavirran signalointireittejä ja DNA metyylitransferaasi aktiivisuutta munasarjasyöpäsoluja vastauksena fysiologisesti relevantti annoksia sisplatiinia. Tutkimme myös vaikutuksia pienmolekyylisalpaaja- Erlotinibi käytettäessä

in vitro

malli platinaa vastarintaa. Huomasimme, että esto EGFR vaimentaa sisplatiinin indusoimaa kasvua DNMT toimintaa, estää kohonnut DNA metylaatio ja myös vähentää platinaa vastarintaa munasarjasyöpäsoluja. Tämä työ korostaa mahdollisen mekanismi ja taipuisa tavoite vähentää kehittymistä platinaa vastarintaa perustuvan epigenetic mekanismeista.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

munasarjojen masolulinjassa OVCA 433 saatiin tohtori Robert Bast Jr., MD Anderson Cancer Center, Houston TX [30] ja kasvatettiin Minimum Essential Medium (MEME) (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) täydennettynä 10% ( v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 1 mM natriumpyruvaattia (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 yksikköä /ml penisilliini-0,5 ug /ml streptomysiiniä (Gibco, Life Technologies) myöhemmin kutsutaan MEME kasvualustojen. Kaikki Soluja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO2 /95% ilmaa. Akuutti 10pM sisplatiini (Sigma-Aldrich) käsittelyt tehtiin MEME kasvun median 0-6 tuntia. EGFR inhibitio suoritettiin tavalla esi-inkuboimalla soluja 2 uM AG1478 (LC Laboratories, Woburn, MA) 24 tuntia ennen sisplatiinia hoitoa. 10 nM EGF (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) hoidot 15 minuuttia tehtiin positiivisena kontrollina EGFR aktivointia.

Sisplatiini vastus paradigma

Kuten alun perin osoitettu [20], vastustuskyky sisplatiinin voidaan kasvattaa munasarjasyöpäsoluja toistuvilla peräkkäisten hoitojen sisplatiinin seurasi lääkkeettömän palautumisajat. Meidän sisplatiinia vastus paradigman mallinnettiin välillä [20]. Lyhyesti, OVCA 433 soluja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 48 tunnin ajan, sitten annettiin toipua vähintään 48 tuntia lääkekäsittelyn jälkeen. Solut kestänyt kolme sykliä kutakin pitoisuutta sisplatiinin seurasi lääkkeettömän elpyminen kertaa ennen altistuvat seuraavaksi suuremman annoksen. Annokset sisplatiinia käytettiin 3, 6 ja 9 pM. Solut suoritettuaan paradigman oli nimeltään Sisplatiini resistenttejä (CPR) soluja. Kulunvalvontajärjestelmä soluja (eivätkä saaneet sisplatiini hoidot) tehtiin rinnakkain. EGFR estyi käsittelemällä soluja 1 uM Erlotinibi (Cell Signaling, Danvers, MA) vähintään 1 tunti ennen lääkehoidot sisplatiinin kanssa. Erlotinibi säilyi elatusaineet 48 tuntia sisplatiinin hoitoja ja sitten solujen annettiin toipua kaikista huumehoidon MEME kasvualustojen aikana lääkkeettömän välein.

Immunoblottausmääritys

Solut pestiin PBS: ssä ja korjataan solujen hajoamisen, joka sisälsi 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Na-

3Vo

4, leupeptiiniä 10 mg /ml, pepstatiini A: ta 10 mg /ml, 1 mM PMSF: ää PBS: ssä ja 1% SDS: ää . Kokonaisproteiinia pitoisuudet määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät kokosolulysaateille (30 ug) ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-polyakryyliamidi, siirrettiin 0,45 um nitroselluloosalle (Thermo Fisher Scientific) ja blokattiin 3% BSA: ta. Blotit kanin polyklonaalista anti-fosfo-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling) 1: 1000, kanin polyklonaalinen anti-yhteensä EGFR (Santa Cruz, Dallas, TX) 1: 500, kanin monoklonaalinen anti-fosfo-JAK2 ( Abcam, Cambridge, MA) 1: 1000, kanin monoklonaalista yhteensä JAK2 (Cell Signaling) 1: 1000, kaniini monoklonaalinen anti-fosfo AKT (Cell Signaling) 1: 1000, hiiren monoklonaalisella anti- yhteensä AKT (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) 1: 500, hiiren monoklonaalinen anti-fosfo-STAT3 (ser727) (Cell Signaling) 1: 1000, kanin monoklonaalista yhteensä STAT3 (Cell Signaling) 1: 1000, kanin polyklonaalinen anti-fosfo -ERK1 /2 (Cell Signaling) 1: 2000, kaniini polyklonaalinen anti-kokonais-ERK1 /2 (Cell Signaling) 1: 2000, kaniini polyklonaalinen anti-DNMT1 (New England Bio Labs, Ipswich, MA) 1: 750, kanin polyklonaalista anti-DNMT3A (Cell Signaling) 1: 1000, kanin polyklonaalinen anti-DNMT3B (Abcam) 1: 1000, kanin polyklonaalinen anti-DNMT3L (Abcam) 1: 1000, kanin polyklonaalinen pDNMT1 (Ser714) (Millipore, Billerica , MA) 1: 250, ja hiiren monoklonaalinen anti-GAPDH-vasta-aine (Millipore) 1: 1000, jota käytettiin latauskontrollina. Blotteja inkuboitiin sitten sopivan sekundaarisen vasta-aineen (Promega, Madison, WI), ja immunoreaktiiviset proteiinit havaittiin käyttäen SuperSignal West Pico tai Femto Kemiluminesenssi (Thermo Fisher Scientific). Kuvantaminen pyyhkii ja tiheysmittaus suoritettiin käyttäen Kodak Image Station 440 ja niihin liittyvien ohjelmistojen (NEN Life Science Products, Boston, MA).

Yksikerroksinen ja Monisoluista Aggregate (MCA) soluviljelmissä

Cells maljattiin 2000 solua per kuoppa 96-kuoppaisille tasapohjaisille soluviljelylevyissä (yksikerrosviljelmään) ja 96 hyvin Lipidure U pohjalevyt (NOF America Corporation, White Plains, NY) (MCA kulttuuri). Solut kasvoivat yön yli 37 ° C: ssa 5% CO2 /95% ilmaa. Kuvat otettiin käyttäen Olympus IX70 varustettu DP72 digitaalikamera ja kuvantamisen ohjelmistoja.

Solun elinkelpoisuus

kasvaneet solut yksikerrosviljelmässä ja MCAS käsiteltiin kasvavia annoksia sisplatiinia [0-300 uM] 48 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä PrestoBlue (Life Technologies) valmistajan protokollan. Lyhyesti, 10 ui PrestoBlue reagenssia lisättiin 100 ui elatusainetta ja inkuboitiin 1 tunti (yksikerroksinen) tai 24 tuntia (MCAS). Sen jälkeen kunkin inkubaatioaikojen, top-lukea fluoresenssi (RFU: t; eksitaatio 555 nm emissio 585 nm) mitattiin käyttäen SpectraMax M2 levy ja Softmax- Pro v5.4 ohjelmisto (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Laskelmat IC

50-arvot solujen elinkelpoisuuden määritykset määritettiin käyttäen GraphPad Prism Software 4,0 (San Diego, CA).

DNMT aktiivisuuden määritys

Tumauutteet eristettiin käyttäen EpiQuik Nuclear Extraction Kit (Epigentek, Farmingdale, NY), mukaisesti valmistajan protokollaa. Proteiinikonsentraatiot tumauutteita määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Fisher Scientific). Yhteensä DNMT aktiivisuus määritettiin käyttäen 20 ug kokonais-proteiinin ja EpiQuik DNA metyylitransferaasi (DNMT) Aktiviteetti /Inhibition Assay Kit (Epigentek), kuten valmistajan suosittelemia. Jokainen levy luettiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa 450 nm: ssä. Määrä metyloitua substraatti-DNA: havaita kit on verrannollinen DNMT entsymaattisen aktiivisuuden meidän näytteitä. DNMT aktiivisuus lasketaan seuraavan yhtälön avulla: Näyte arvot normalisoitiin arvoihin, jotka saatiin ohjaus, käsittelemättömien OVCA 433 soluja samassa kokeessa ja ilmaistu suhteessa yhteen.

Global DNA: n metylaatio määrän

DNA eristettiin soluista käyttämällä DNeasy Blood and Tissue Kit mukaisesti valmistajan protokollan (Qiagen, Valencia, CA). Global DNA: n metylaatio arvioitiin käyttäen 250 ng DNA: ta ja MethylFlash Metyloitu DNA kvantifiointi Kit (Epigentek) mukaan valmistajan protokollaa. Määrä 5-metyylisytosiinin kussakin näytteessä määritetään kolorimetrisellä määrityksellä, joka on havaittu mikrolevylukijalla 450 nm: ssä. Kvantifiointi DNA: n metylaatio on laskettu seuraavalla kaavalla: näytteen arvot normalisoitiin arvoihin, jotka saatiin ohjaus, käsittelemättömien OVCA 433 soluja samassa kokeessa, ja ilmaistaan ​​prosentteina enemmän kuin 100% (kontrolli).

piirtäminen ja tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot arvioitiin kahtena vastaan ​​käsittelemättömät kulunvalvonta soluja ja kerätään vähintään 4 itsenäisen kokeen, ellei toisin mainita. Tiedot piirrettiin ja analysoitiin GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA) käyttäen yksisuuntaista ANOVA tai kaksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn, Dunnet post hoc-analyysissä tai Bonferronin korjausta tarvittaessa. Standard paritonta t-testiä käytetään myös tarvittaessa.

Tulokset

Välitön sisplatiinihoitoon aloittaa EGFR signalointi

Useat

in vitro

tutkimuksissa on käytetty high annoksia sisplatiinia (50-100 uM) osoittaa aktivoitunut EGFR lyhyillä hoitoajat [16-19]. Kuitenkin tutkimukset tarkastellaan farmakokinetiikkaa saaneilla potilailla 75-120 mg /m

2 Sisplatiinin osoitti huippu plasmassa välillä 0,2-14 uM [31,32], mikä viittaa siihen, että

in vitro

tutkimukset 50-100 uM ei voi olla kliinisesti merkittävä. Täällä varmistaneet, että sisplatiinihoitoon aiempaa fysiologisesti relevantti annos (10 uM) aktivoi EGFR. Merkittävä kasvu EGFR fosforylaatiota (pEGFR) havaittiin munasarjasyöpäsoluja (OVCA 433) seuraavan 30 min (0,5 h), 1 h ja 2 h hoito 10 uM sisplatiinin ilman muutoksia yhteensä EGFR (kuvio 1A ja 1 B). Tiedot ilmaistiin myös suhteena aktivoitua EGFR kokonaismäärään EGFR (kuvio 1 C) ja todettu merkittävästi kasvanut 2 tunnin kuluttua sisplatiinihoitoon. Erityisiä EGFR-tyrosiinikinaasin aktiivisuuden saatiin aikaan käyttämällä AG1478 määrittää rooli EGFR sisplatiinin indusoiman aktivaation alavirran signalointireittien. Kuten odotettua, AG1478 esti sekä perus- ja sisplatiinin aiheuttamaa tasoa pEFGR ilman merkittäviä muutoksia yhteensä EGFR (kuvio 2A). Toiminnallinen aktivointi EGFR jälkeen sisplatiinihoitoon arvioitiin arvioinnissa loppupään reseptorin tavoitteiden sisplatiinikäsittelyn jälkeen ja AG1478 (kuvio 2B). JAK2 ja AKT aktivointi lisättiin merkittävästi vuoden 4 tunnin käsittelyaika pisteen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Merkittävä kasvu ERK1 /2 tai STAT3 aktivointi ei havaittu näissä olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Kääntäen, aktivointi JAK2 ja AKT suuresti vähentynyt AG1478 kun koko proteiini-tasot pysyivät suhteellisen muuttumattomina riippumatta hoidon (kuvio 2B-2D). Siten akuutti, fysiologisesti relevantti annokset sisplatiinin aloittaa EGFR signalointi ja aktivointi JAK2 ja AKT.

A) edustaja western blotit aktivoitua tai fosforyloidun EGFR (pEGFR, tyr1068) in OVCA 433 soluissa annettu 10 uM sisplatiinia 0,5 , 1, 2, 4 ja 6 tuntia käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin. 10 nM EGF annetaan soluihin 15 minuuttia positiivisena kontrollina osoittaa reseptorin aktivoitumista. Yhteensä EGFR blot ja GAPDH edustava blotit myös esitetty. B) Kuvio EGFR aktivoinnin jälkeen, 10 uM sisplatiinihoitoon 0,5, 1, 2, 4 ja 6 tuntia, n = 6. EGF tiedot esitetään positiivisena kontrollina. C) Kaavio suhde pEGFR kokonaismäärään EGFR (pEGFR /yhteensä EGFR-suhde), kun 10 uM sisplatiinihoitoon 0,5, 1, 2, 4 ja 6 tuntia, n = 6. Yksisuuntainen ANOVA paljastivat merkittävää vaikutusta sisplatiinin käsittely ja merkittäviä eroja valvontaa määritettynä Dunnet post hoc-analyysissä merkitty * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

A) edustaja western blotit pEGFR, Yhteensä EGFR ja GAPDH on OVCA 433-soluja – /+ 10 uM sisplatiinin 1 tunnin ajan, kun läsnä ja poissa ollessa EGFR spesifisen inhibiittorin AG1478 (2 uM, 24 tunnin esi-inkubaatio). B) edustaja western blotit pJAK2 (tyr1007 /1008), yhteensä JAK2, Pakt (Ser473), yhteensä AKT ja GAPDH. OVCA 433 solua – /+ 10 uM sisplatiini 1-4 tuntia ja läsnäollessa AG1478. Tiedot syntyy seuraavista kuvaajat edustavat vähintään 4 itsenäisen kokeen eli ~ 4 erilaista kohtelua /kokoelma ryhmiä ja ~ 4 eri immunobloteista. C) suhde JAK2 aktivointi (pJAK2 /yhteensä JAK2) arvoja, jotka saadaan 10 uM sisplatiinin hoito 1-4 tuntia, ja kun läsnä on AG1478, n = 4-6. Merkittävä nousu kontrollinäytteistä tarkkailtiin 4 tunnin sisplatiinihoitoon. AG1478 esi-inkuboitu 24 tunnin ajan pyöristettyjä-tasojen aktivoitua JAK2 sekä sisplatiinin indusoimaa kasvua JAK2 aktivointi 4 tuntia (AG + 4). D) suhde AKT aktivointi (Pakt /yhteensä AKT) arvoja, jotka saadaan 10 uM sisplatiinin hoito 1-4 tuntia, ja kun läsnä on AG1478, n = 4-7. Merkittävä nousu kontrollinäytteistä tarkkailtiin 4 tunnin sisplatiinihoitoon. AG1478 esi-inkuboitu 24 tunnin ajan pyöristettyjä sisplatiinin indusoimaa kasvua AKT aktivointi 4 tuntia (AG + 4). Yksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävää vaikutusta lääkehoidon ja seuraava Dunnet post hoc testi merkittäviä eroja valvontaa osoitetaan * p 0,05, ** p 0,01.

In vitro

hankinta sisplatiinin vastuksen

arvioimiseksi rooli EGFR aktivoinnin kehittämisessä platinaa vastarintaa, suunnittelimme

in vitro

paradigma platinaa vastarintaa perustuu aiemmin julkaistu työ [20] ( kuvio 3A). Sisplatiini resistenttejä (CPR) soluja kasvatettiin kiinni (yksikerroksinen) olosuhteissa näytteillä morfologisia muutoksia verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 3B). Kirjallisuudessa ehdottaa, että 3D-malleja, kuten monisoluisista aggregaatit (MCAS), paremmin vastaamaan munasarjasyöpäsolu

in vivo

vastausten [33] ja se voi olla tärkeä ymmärtää lääkeresistenssin [34]. CPR MCAS olivat selvästi tasaisempi verrattuna kulunvalvonta MCAS (kuvio 3B). Tämä on johdonmukaista aikaisempien havaintojemme kanssa, jotka osoittavat kompakti MCAS ovat vastustuskykyisempiä sisplatiinin [22]. Yksikerroksinen sisplatiinia luelinkykymäärityksillä muotoutuneet 5 kertainen lisäys IC

50 (valvonta IC

50 = 12,7 uM vs. CPR IC

50 = 72,9 uM) (kuvio 3C). Kaksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävää vaikutusta sisplatiinin, merkittävä vaikutus solutyypin (kontrolli vs. CPR) ja merkittävä vuorovaikutus. Elinkelpoisuus määritykset MCAS osoitti, että CPR MCAS oli kasvanut IC

50 verrattuna kulunvalvonta MCAS (ohjata MCA IC

50 = 44,0 uM vs. CPR MCA IC

50 = 79,5 uM) (kuvio 3D) . Jälleen, kaksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävää vaikutusta sisplatiinin, solu- tyyppi ja vuorovaikutusta. Siten meidän

in vitro

malli platinaa vastus osoittautui arvokkaaksi välineeksi tarkasteltaessa molekyylitason muutokset mukana kehittämässä sisplatiinin resistenssin.

A) Kaavamainen esitys sisplatiinin vastuksen paradigman kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. B) edustaja 10X kuvia OVCA 433 ohjaus ja sisplatiinin kestävä (CPR) soluja yksikerroksinen ja monisoluisina aggregaatit (MCA). Asteikko bar = 100 pm. C) Solujen elinkelpoisuus yksikerroksisen ohjaus (musta viiva), IC

50 = 12,7 uM, ja CPR (harmaa viiva) IC

50 = 72,9 uM, vastauksena sisplatiinihoitoon annoksilla [5, 10, 20, 50, 100 uM] 48 tuntia. Data ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien kontrollisolujen, n = 8. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti merkittävää yleistä pääasiallinen vaikutus solutyypin (kontrolli vs CPR) [F (1,84) = 88,10, p 0,001], on merkittävä vaikutus sisplatiinin altistus [F (5,84) = 61,87, p 0,001] sekä merkittävä vuorovaikutus [F (5,84) = 4,353, p 0,01]. Merkittäviä eroja kannattavuuden havaittiin 5, 10, 20, 50, 100 uM sisplatiinin ohjaus soluissa, ** p 0,01, *** p 0,001. D) Solujen elinkelpoisuus MCAS ohjaus (musta viiva), IC

50 = 44,0 uM, ja CPR (harmaa viiva), IC

50 = 79,5 uM, vastauksena sisplatiinihoitoon annoksilla [5, 10, 20 , 50, 100 uM] 48 tuntia. Data ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien kontrollisolujen, n = 7. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti merkittävää yleistä pääasiallinen vaikutus solutyypin (kontrolli vs CPR) [F (1,72) = 30,41, p 0,001], on merkittävä vaikutus sisplatiinin altistus [F (5,72) = 128,3, p 0,001] sekä merkittävä vuorovaikutus [F (5,72) = 3,946, p 0,01]. Merkittäviä eroja kannattavuuden havaittiin 50, 100 uM sisplatiinin ohjaus soluissa, *** p 0,001.

karakterisointi signalointireiteissä CPR soluissa

CPR solut pysyivät resistenttejä edelleen sisplatiinihoitoon jopa ilman ylimääräisiä saaneet sisplatiinia osoittavat jatkuvasti muutoksen CPR soluissa verrattuna niiden kulkua valvontaa. Kun taas toiset raportoitu, että yliaktiivisuus EGFR liittyy platinaa vastus [20], emme havainneet eroa pohjapinta tasoilla pEGFR CPR-soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4A). Lisäksi olemme havainneet, että CPR solut eivät näy merkittäviä lisäyksiä pohjapinta tasoilla EGFR alavirran signalointireittien kuten JAK2, AKT, STAT3, ERK1 /2 (S1 Kuva). Kuitenkin CPR solut pysyivät alttiita sisplatiinin indusoimaa aktivoitumista EGFR kun uudelleen altistuminen lääkkeelle 1 tunnin ajan, ilman samanaikaista muutokset yhteensä EGFR tasoilla (kuvio 4A). CPR solut osoittivat merkittävää kasvua EGFR aktivointi (suhde pEGFR /yhteensä EGFR), kun solut altistetaan uudelleen sisplatiinin (kuvio 4B). Yhdenmukainen havaintomme kuvassa 1, me osoittavat merkittävää kasvua EGFR aktivointi, kun ohjaus soluja sisplatiinia, mutta ei ollut merkittäviä eroja havaittu ohjaus ja CPR solujen puuttuessa sisplatiinin.

A) edustavia western blotit pEGFR, Total EGFR ja GAPDH valvontaa ja CPR solua – /+ 10 uM sisplatiini (uudelleen altistus) 1 tunnin ajan. B) graafisesti tiedot suhde EGFR aktivaation (pEGFR /yhteensä EGFR) valvonta ja CPR soluja sisplatiinin jälkeen uudelleen altistuksen. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey post hoc paljastanut merkittäviä lisäyksiä EGFR aktivaation ohjaus soluissa sisplatiinia ja CPR soluissa sisplatiinia verrattuna niiden käsittelemättömän kollegansa, mutta CPR solut eivät olleet merkittävästi erilaiset kuin kontrolli solujen puuttuessa sisplatiinia. * P 0,05, ** p, 0,01.

Akuutti sisplatiinihoitoon lisää DNMT aktiivisuutta ja tämä vaikutus on riippuvainen EGFR aktivointi

Koska EGFR aktivointi lisää DNMT aktiivisuutta ja DNA: n metylaation ja on vakiintunut yhteys DNA: n metylaation ja platinaa vastus (27-32), arvioimme akuutin sisplatiinin altistumisen DNMT toimintaa. OVCA 433 solua sisplatiinia osoitti merkittävästi lisääntynyt DNMT aktiivisuus 1 tunti verrattuna kontrolleihin (Kuva 5A). EGF hoito käytettiin positiivisena kontrollina näissä tutkimuksissa kuten aikaisemmin osoittivat lisääntynyttä DNMT aktiivisuutta näissä olosuhteissa, [11]. Lisäksi, estämällä EGFR: ään, AG1478 esti sisplatiinin indusoimaa DNMT aktiivisuus 1 tunti (kuvio 5B), mikä osoittaa, että tämä lisäys DNMT toiminta riippuu sisplatiinin aktivointi EGFR. Ei ollut merkittäviä eroja havaittu kontrollinäytteiden ja AG1478 yksin käsiteltyjen näytteiden, ei myöskään ollut merkittävää eroa AG1478 yksin ja AG1478 + sisplatiini ryhmille.

A) Normalized DNMT aktiivisuus hoidon jälkeen 10 uM sisplatiinin 0- 4 tuntia, n = 4. 10 nM EGF hoitoa 15 minuuttia, käytettiin positiivisena kontrollina. Yksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävän vaikutuksen sisplatiinihoitoon ja merkittäviä eroja valvontaa määritettynä Dunnet post hoc-analyysissä merkitty * p 0,05. B) Normalisoitu DNMT aktiivisuus käsittelyn jälkeen 10 uM sisplatiinin 1 tunnin ajan, kun läsnä ja poissa ollessa 2 uM AG1478 (24 tunnin esi-inkubaatio), n = 5. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn post hoc-analyysi paljasti, että EGFR erityiset estäjä AG1478 vaimensi merkittävästi sisplatiinin aiheuttamaa vaikutuksia DNMT toimintaan. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

DNMT aktiivisuutta ja maailmanlaajuinen DNA: n metylaation ovat lisääntyneet CPR soluissa, mutta EGFR estäminen vähentää tämä muutos

CPR solut osoittivat merkittävää kasvua DNMT aktiivisuus verrattuna kulunvalvonta-soluissa (kuvio 6A). Niinpä olemme hyödyntäneet EGFR estäjä, Erlotinibi, tutkia DNMT toiminta voitaisiin ehkäistä aikana sisplatiinihoitoon. Erlotinibi hoidot yksinään ei vaikuttanut DNMT toimintaa kuitenkin erotinib yhteistyössä sisplatiinihoidolle aikana platinaa vastus paradigma (erlotinibi CPR) heikensi sisplatiinin aiheuttama lisäys DNMT aktiivisuuden. Seurausten arvioimiseksi lisääntyneen DNMT toimintaa, voimme mitattiin sitten globaali DNA: n metylaatio (yhteensä 5-metyyli-sytosiini sisältö) koeryhmissä (kuvio 6B). Data normalisoitiin arvoihin, jotka saatiin kontrollisoluja ja piirretään prosentteina kontrolliin. Yhteensä 5-metyyli-sytosiini pitoisuus oli lisääntynyt CPR soluissa, mutta tämä kasvu oli vaimentunut soluissa alle EGFR esto aikana platinaa vastarintaa paradigma. Nämä tutkimukset vahvistavat, että sisplatiini indusoi muutoksia DNMT toimintaa ja DNA: n metylaatio ovat riippuvaisia ​​EGFR aktivointia. Tämä kasvu DNMT aktiivisuuden ja DNA: n metylaation CPR soluissa ei voitu selittää kohonneeseen DNMTs läsnä näissä soluissa. Itse analyysi DNMT tasojen hallinnassa ja CPR solut osoittivat, että DNMT1 ja fosforyloitu muoto DNMT1 seriinin 714 (pDNMT1) aiemmin liitetty EGFR aktivointi [35] ovat molemmat merkittävästi vähentynyt CPR soluissa (S2 Kuva). DNMT3A, DNMT3B ja DNMT3L kaikki osoittanut mitään merkittäviä eroja CPR soluissa kontrolleihin verrattuna.

A) Normalized DNMT aktiivisuutta ohjaus, CPR solut sekä solut, jotka saivat EGFR estäjän Erlotinibi ainoastaan ​​tai Erlotinibi + sisplatiini aikana sisplatiini vastus paradigma, n = 4. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Dunnet n post hoc osoitti, että Erlotinibi yhteistyössä sisplatiinihoidolle että sisplatiinin vastus paradigma heikennetty kasvu DNMT aktiivisuuden havaittiin CPR soluissa. B) Normalized prosenttia 5-metyylisytosiinin (5mC) tai DNA globaali metylaatio valvontaa, CPR solut sekä solut, jotka saivat EGFR estäjän Erlotinibi ainoastaan ​​tai Erlotinibi + sisplatiini aikana sisplatiinin vastus paradigma, n = 4-6. Yksi tapa ANOVA seurasi Tukey post hoc paljasti merkittävän kasvun maailmanlaajuinen DNA-metylaation CPR soluissa, mutta ei soluissa, jotka saivat Erlotinibi * p 0,05.

EGFR esto vähentää laajuus vastuksen havaittiin in vitro mallissa platinaa vastarintaa

koska todisteita siitä, että käyttämällä DNMT estäjät kääntää platinaa vastus [6-10] sekä havaintomme että EGFR esto vaimennettu DNMT aktiivisuuden ja DNA: n metylaation CPR soluissa, testasimme onko tämä johti muutokseen platina herkkyyttä. Alun perin osoitettu kuviossa 3, löysimme erillisessä kokeiden sarjasta CPR solut ovat merkittävästi vastustuskykyisempi kuin niiden kulunvalvonta kollegansa kasvanut yksikerroksista (valvonta IC

50 = 15,8 uM vs. CPR IC

50 yli 100 uM) (kuvio 7B) ja MCAS (valvonta IC

50 = 28 uM vs. CPR IC

50 yli 100 uM) (kuvio 7C). Inhibitio Erlotinibi ei yksin vaikuta herkkyys sisplatiinin; yksikerroksista (Erlotinibi IC

50 = 12 uM) ja MCAS (Erlotinibi IC

50 = 32 uM). EGFR esto kanssa Erlotinibi aikana platinaa vastarintaa paradigma vähentää kestävyysaste havaittu CPR soluissa sekä yksikerroksista (CPR IC

50 yli 100 mikroM vs. Erlotinibi CPR IC

50 = 59 uM) ja MCAS (CPR IC

50 yli 100 mikroM vs. Erlotinibi CPR IC

50 = 86 uM). Kaksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävän vaikutuksen solutyypin (ohjaus vs. Erlotinibi vs. CPR vs Erlotinibi CPR), merkittävä vaikutus sisplatiinihoitoon ja merkittävä vuorovaikutus. Post hoc analyysi paljasti merkitseviä eroja CPR ja Erlotinibi 50 uM ja 100 uM. Yhdessä tämä viittaa siihen, että EGFR on rooli kehittämisessä platinaa vastarintaa EGFR esto vähentynyt määrä vastarintaa, joka saavutettiin mallimme platinaa vastarintaa.

A) edustaja 10X kuvia OVCA 433 ohjaus , Erlotinibi käsitelty, sisplatiini resistentti (CPR) ja solut, jotka saivat Erlotinibi ja sisplatiinin platinan kestävä paradigma (Erlotinibi CPR) yhtenä kerroksena ja monisoluisina aggregaatit (MCA). Asteikko bar = 100 pm. B) Solujen elinkelpoisuus yksikerroksisen ohjaus (musta viiva), IC

50 = 15,8 uM, CPR (harmaa viiva) IC

50 100 uM, Erlotinibi yksin (pilkullinen musta viiva), IC

50 = 12 uM, ja Erlotinibi CPR (pilkullinen harmaa viiva) IC

50 = 59 uM, vastauksena sisplatiinihoitoon annoksilla [5, 10, 20, 50, 100 uM] 48 tuntia. Data ilmaistaan ​​prosenttiosuutena hoitamattomien soluja, n = 4. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti huomattavaan pääasiallinen vaikutus solutyypin (ohjaus vs. Erlotinibi vs. CPR vs Erlotinibi CPR) [F (3,72) = 65,88, p 0,001] sekä merkittävä vuorovaikutus [F (15,72) = 3,468, p 0,001].