Krooninen sairaus

tiivistelmä

XB130, uusi sovitin proteiinia, edistää solujen kasvua säätelemällä ilmentymistä monet liittyvät geenit. MikroRNA (miRNA), jotka ovat usein väärin ilmaistuna syöpäsoluissa, ekspression säätelemiseksi kohdennettuja geenejä. Tässä Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan kasvaimia synnyttävän mekanismin XB130 kautta miRNA asetuksella. Analysoimme miRNA ilmaisun XB130 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) pysyvästi transfektoitu WRO kilpirauhassyöpä soluissa miRNA array-kokeessa, ja 16 miRNA kasvoi säädelty ja 22 miRNA olivat alassäädetty merkittävästi näissä soluissa, verrattuna ei-transfek- tai negatiivinen kontrolli shRNA transfektoituja soluja. Valitsimme kolme sääteli miRNA (miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p) ja validoitu ne reaaliaikaisella qRT-PCR. Ektooppinen yliekspressio XB130 esti näiden 3 miRNA MRO-soluissa, solulinjassa, jolla on hyvin alhainen ilmentyminen XB130. Lisäksi olemme transfektoitiin miR jäljittelee näitä 3 miRNA osaksi WRO soluihin. Ne säätelee negatiivisesti ilmentymistä onkogeenien (miR-33a: MYC, miR-149: FOSL1, miR-193a-3p: SLC7A5), kohdistamalla 3’alueella, ja vähentää solujen kasvua. Tuloksemme viittaavat siihen, että XB130 voisi edistää syöpäsolujen kasvua säätelemällä ilmentyminen tuumoria tukahduttavan miRNA ja niiden kohdennettua geenit.

Citation: Takeshita H, Shiozaki A, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et al. (2013) XB130, New Adaptor Protein, Säätelee Expression of tuumoria tukahduttavan MikroRNA syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10,1371 /journal.pone.0059057

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 06 lokakuu 2012; Hyväksytty: 11 helmikuu 2013; Julkaistu: 19 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Takeshita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kanadan Institutes of Health Research (CIHR) toiminta-avustukset MOP-13270, MOP-42546 ja MOP-119514. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktiinifilamentin liittyvää proteiinia (AFAP) on pieni perhe sovittimen osallistuvien proteiinien solunsisäistä viestintää, solun tukirangan organisaatioon, soluliikkuvuus ja muita solutoiminnoille. Se sisältää AFAP [1], AFAP1L1 (aktiinifilamentin associate proteiini 1, kuten 1) [2], ja XB130 (tunnetaan myös nimellä aktiinifilamentin liittyvän proteiinin 1-, kuten 2, AFAP1L2) [3]. He ovat osoittaneet osallistumaan sääntelyn eri signalointireittien muodostamalla proteiini-proteiini ja /tai proteiini lipidikomplekseille [1], [4], ja tietyissä olosuhteissa nämä sovitin proteiineja voidaan kasvaimien syntyyn liittyvien [5], [ ,,,0],6].

XB130 on tyrosiinikinaasin substraatti, joka voi olla tyrosiinifosforyloituu Src ja muita tyrosiini- kinaasien [7] – [9], ja olla vuorovaikutuksessa Src kautta N-terminaalinen SH2 ja SH3-domeenin sitovat motiivit ja välittää Src liittyvät transaktivaatiota SRE ja AP-1 [7]. N-pään XB130 sisältää myös YxxM motiivi, joka voi sitoutua p85α alayksikköön-inositoli-3-kinaasi (PI3K) kautta SH2-domeenia, ja sen jälkeen aktivoida Akt [2], [8]. XB130 välittää solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä läpi useita signaaleja alas-virtaan Akt [9]. XB130 ihmisen kilpirauhasen syöpäsoluja säätelee kasvaimen kasvua, kuten esitetään eläinmallissa kanssa nude-hiirissä, edistämällä solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Lisäksi knockdovvn XB130 vähentää ilmentymistä Monien geenien, jotka liittyvät solun lisääntymisen ja /tai eloonjäämistä [10]. XB130 on myös mukana sääntelyn solumigraation [11]. Muuttaminen XB130 ilmentymisen on havaittu ihmisen kilpirauhassyöpä [10], ruokatorven syöpä [12], ja mahasyövän [13]. Siksi nämä tutkimukset vaativat lisätutkimusta yksityiskohtien toiminnasta XB130 kasvainten synnyssä.

MikroRNA (miRNA) ovat pienet ei-koodaavat RNA: t (noin 22 nukleotidin pituisia), joilla voidaan erityisesti vuorovaikutuksessa 3′-alue (3’UTR) kohdennetun mRNA estävät mRNA käännös, tai johtaa mRNA pilkkominen ja hajoaminen [14]. Ilmoitettujen ihmisen miRNA ylittää 2,000 (miRBase, Vapauta 18 Sanger Institute), ja miRNA tärkeitä rooleja valvoa biologisissa prosesseissa kuten kehitys-, erilaistuminen, metabolia ja lisääntymistä [15] – [18]. Jotkut miRNA ovat usein väärin ilmaistuna syöpäsoluissa, ja on äskettäin tunnistettu uusi liittyviä tekijöitä onkogeneesiin ja syövän etenemistä [19] – [22]. Useat viimeaikaiset tutkimukset keskittyvät säätelyyn miRNA ilmentymistä ja toimintaa syövässä [23] – [26], mukaan lukien kilpirauhasen syöpä [27] – [29].

Vaikka XB130 voi säädellä ilmentymistä monista liittyvistä geeneistä soluun leviämisen [10], ja edistää solujen lisääntymistä ja selviytymisen kautta PI3K /Akt-reitin [9], tiedetään vähän mekanismeista sen geenin ilmentymisen säätelyyn. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet onko XB130 voi säädellä ilmentymistä joitakin näistä geeneistä kautta alas-säätely tuumoria tukahduttavan miRNA. Tutkimme miRNA ilmentymisen tasolla käyttäen XB130 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) stabiilisti transfektoitu WRO kilpirauhasen syöpäsoluja, verrattuna ei-transfektoituja soluja tai soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu negatiivisen kontrollin shRNA. Toisaalta, transfektoimme MRO syöpäsolut, joilla on hyvin alhainen ilmentyminen XB130 kanssa XB130 plasmidin parantaa sen ilmentymistä. Kolme kasvaimen tukahduttava miRNA tunnistettiin ja edelleen tutkittu, mitattuna ilmentymisen kohdennetuissa geenien, solujen lisääntymistä, ja apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Human kilpirauhasen syöpä WRO solut ja MRO-soluja Dr. S. Asa (University of Toronto, Toronto, Kanada) [30], joka on saatu näiden solujen Dr. J. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA ). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 1 mmol /I pyruvaattia ja ei-välttämättömiä aminohappoja (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA), ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Olemme aiemmin perustettu WRO soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu shRNA plasmidiperhe XB130. (C3-1 ja C3-4 vakiinnutettiin vektori C3, C4-3 ja C4-11 vakiinnutettiin vektorin C4) ja negatiivinen kontrolli shRNA plasmidi (NC1, NC9 ja NC12) perustettiin aiemmin [10]. G418: aa (0,25 mg /ml) lisättiin elatusaineeseen transfektoitujen solujen ylläpitämiseksi valinnan. Soluja viljeltiin standardi kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Protein Studies ja Western-blottaus

Western blot suoritettiin menetelmien mukaisesti, kuten on kuvattu aiemmin [ ,,,0],31], [32]. Lyhyesti, solut hajotettiin modifioidulla radioimmuunisaostuspuskurissa määrityspuskurissa (50 mmol /L Tris-HCI, pH 7,5; 150 mmol /l NaCI: a, 2 mmol /L EGTA, 2 mmol /l EDTA: a, ja 1% Triton X-100) joka sisälsi 10 ug /ml kutakin aprotiniinia, leupeptiiniä, pepstatiinia, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mmol /l Na

3Vo

4 ja 10 mmol /l NaF. Proteiinipitoisuudet mitattiin Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL, USA).

Solulysaatit, jotka sisältävät yhtä suuret määrät yhteensä proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvoille. Sitten membraanit tutkittiin mainituilla vasta-aineilla. Proteiinit paljasti SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo). Intensiteetit proteiini kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Monoklonaalinen XB130 vasta-aine on tuotettu kuten aiemmin on kuvattu [7]. Vasta-aineita varten β-aktiini, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Anti-PCNA-vasta-aine tuli Abcam (Toronto, ON, Kanada). Anti-Ki-67 (klooni Ki-S5) tuli Cedarlane (Burlington, ON, Kanada).

Mikroskopia ja Immunofluoresenssianalyysi

Immunofluoresenssivärjäystä varten soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille pre- käsiteltiin 50 ug /ml poly-L-lysiiniä. Seuraavat tarttuvuus, solut nopeasti vahvistetaan 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton-X-100: ssa 10 minuuttia ja blokattiin 1% BSA: ssa 1 tunnin ajan. Peitinlasit inkuboitiin sitten primaarisen vasta-aineen vasten XB130 2 h, mitä seurasi pesu ja inkubointi sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 tunnin ajan. Peitinlasit värjättiin myös F-aktiini Oregon Green 488 falloidiinia (Invitrogen) 1 h ja nucleus Hoechst 33342 (Invitrogen) 10 minuuttia. Peitelaseja pestiin PBS: llä ja asetettiin lasilevyille käyttäen Dako fluoresenssin kiinnitysväliaine (Dako, Mississauga, ON, Kanada). Värjäytyminen visualisoitiin käyttäen Olympus IX81 mikroskoopilla.

MicroRNA Array ja data-analyysin

neljä XB130 shRNA stabiilisti transfektoidut kloonit (C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11) käytettiin XB130 knockdown-soluja. WRO solut ja kolme negatiivinen kontrolli shRNA stabiilisti transfektoidut kloonit (NC1, NC9 ja NC12) käytettiin vertailun vuoksi. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA). RNA eheys määrä, joka määritetään Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) käytettiin mittana laadun RNA. MiRNA ilmaisun profilointi suoritettiin käyttäen Human Agilentin miRNA Microarray järjestelmä (Agilent Technologies) ja SurePrint G3 8 × 60 K v16 alustana 1205 ihmisen miRNA (miRBase release 16,0). Lyhyesti, 100 ng kokonais-RNA: leimattiin syaniini 3-pCp ja hybridisoitiin päälle paneelit 55 ° C: ssa 20 h. Objektilasit skannattiin Agilent Technologies Scanner G2505C, ja skannatut kuvat analysoitiin Agilent Feature Extraction versio 10.7.3. Differentiaalisen ekspression analyysi ja hierarkkinen klusterin analyysi suoritettiin käyttäen GeneSpring GX 11,5 (Agilent Technologies).

Target ennustaminen miRNA

TargetScan 6,0 (https://www.targetscan.org/), microRNA .org (https://www.microrna.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), ja Diana-MICROT v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) käytettiin etsimään ennustettu tavoitteita miRNA.

Real-Time Kvantitatiivinen RT-PCR XB130

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA), ja cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen High Capacity cDNA RT-kittiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitatiivinen RT-PCR XB130 suoritettiin käyttäen SYBR Green I Master PCR Kit LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) valmistajan protokollan. SDHA käytettiin sisäisenä viitteenä geeni analyysejä. PCR-alukkeet XB130 ja SDHA ovat: XB130_forward 5′-AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 ’, XB130_reverse 5′-GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3′, SDHA_forward 5’-CGGCATTCCCACCAACTAC-3 ’ja SDHA_reverse 5′-GGCCGGGCACAATCTG-3’. Expression of XB130 normalisoitiin käyttäen 2-ΔΔCT menetelmä suhteessa SDHA. ACt laskettiin vähentämällä Ct-arvot SDHA päässä Ct-arvot XB130. Kertainen muutos geenin laskettiin yhtälöllä 2-ACt [33]. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Keskimääräinen ilmentymisen XB130 /SDHA suhde WRO soluissa asetettiin 1 ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ja keskihajonta taitteeseen XB130 muutoksista.

Real-Time Kvantitatiivinen RT-PCR pri-miRNA ja Aikuinen miRNA

määrällisesti ilmentymisen pri-miRNA ja kypsä miRNA, kokonais-RNA uutettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion). Mitä kvantitatiivinen PRI-miRNA, cDNA syntetisoitiin käyttäen High Capacity cDNA RT Kit (Applied Biosystems). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen TaqMan® Universal Master Mix II ja TaqMan® pri-miRNA Analyysit spesifinen on-mir-33a, on-mir-149 ja on-mir-193a-3p on 7900 reaaliaikainen PCR -järjestelmää (Applied Biosystems).

Mitä kvantitatiivinen kypsä miRNA, joka on TaqMan® MicroRNA RT Kit ja TaqMan® MicroRNA määrityksissä spesifinen HSA-miR-33a, on-miR-149 ja on-asennuspalveli- 193a-3p (Applied Biosystems) käytettiin RT reaktiot. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen TaqMan® Universal Master Mix II ja TaqMan® MicroRNA määrityksissä on 7900 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). Molemmissa määrällisiä, RUN6B (U6) arvioitiin endogeeninen kontrolli, ja tulokset normalisoitiin käyttäen 2-ΔΔCT menetelmä sama kuin reaaliaikaisen qRT-PCR XB130.

Solun transfektio

sukupolven plasmidi GFP-alone, GFP-leimatun XB130 (GFP-XB130) ja sen N-pään deleetiomutantin (GFP-XB130ΔN) on kuvattu aiemmin [11]. MRO-solut transfektoitiin ohimenevästi käyttäen 60 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen) on 100 mm: n malja, kuten on kuvattu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Väliaine, joka sisälsi plasmidi korvattiin tuoreella kasvualustalla, 24 h transfektion jälkeen, ja GFP-positiiviset solut eristettiin fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelu (FACS) Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA) 48 tuntia transfektion jälkeen. GFP-positiiviset solut käytettiin sitten western blotting ja soluproliferaatiomääritykset.

Mirvana ™ miRNA mimiikkapanelit Mir-33a, miR-149 ja miR-193a ja Mirvana ™ miRNA mimiikkapanelit Negative Control # 1 saatiin kaupallisesti (Ambion ). WRO-solut transfektoitiin 50 pmol miR jäljittele käyttäen 5 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen) on 6-kuoppalevyllä mukaan valmistajan protokollaa. Väliaine, joka sisälsi plasmidi korvattiin tuoreella kasvualustalla, 24 h transfektion jälkeen, ja kokonais-RNA ja proteiini uutettiin 48 h transfektion jälkeen.

Luciferase Reporter Assay

Seed sekvenssit miR-33a, miR -149 ja miR-193a-3p ja parikytkemällä 3’UTR sekvenssit MYC, FOSL1 ja SLC7A5 ennustettiin TargetScan. 3’UTR-sekvenssit kloonattiin alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector ja varmistettiin sekvensoimalla (Promega, Madison, WI, USA). PmirGLO rakentaa ja miR jäljittelevät tai valvontaa miR matkivat kotransfektoitiin osaksi WRO soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). Tulikärpäsen lusiferaasi normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Keskimääräinen lusiferaasin aktiivisuuden Monkey /Renilla-suhde WRO soluissa ko-transfektoitiin kunkin pmirGLO rakentaa ja hallita miR matkivat oli asetettu 1. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ja keskihajonta viidestä riippumattomasta kokeesta.

Cell Proliferation ja apoptoosi Analyysit

WRO solut maljattiin viisinkertainen kuoppiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (100 ul /kuoppa) solujen lisääntymisen määrityksessä, 12-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (1 ml /kuoppa) solujen lukumäärän määritys, ja 6-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (2 ml /kuoppa) apoptoosimäärityksessä, 5 x 10

4 solua /ml ja viljeltiin 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin miRNA matkivat kuten edellä on kuvattu.

Solujen proliferaatio arvioitiin käyttämällä CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) kullakin ajanhetkellä (0, 24, 48, ja 72 h) transfektion jälkeen. Sen jälkeen, kun korvattiin tuoreella kasvualustalla, 20 ui CellTiter 96® vesikerros Ratkaisu Reagent lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan kostutetussa, 5% CO

2-ilmakehässä. Absorbanssi Näytteiden luettiin 490 nm automaattisella levyn lukijaa (Thermo). Taustalla absorbanssi keskipitkän pelkästään vähennettiin. Lisääntyminen indeksi laskettiin keskiarvo absorbanssi solujen osoitettuna ajankohtana jaettuna absorbanssien keskiarvoa solujen 0 tuntia transfektion jälkeen ja ilmaistiin keskiarvon ja keskihajonnan. Vuonna solumäärämäärityksessä, solut irrotettiin pulloista trypsiini-EDTA-liuoksella ja laskettiin hemosytometrillä kunakin ajankohtana. Solujen lukumäärä ilmaistiin keskiarvo ja keskihajonta.

apoptoosimäärityksessä, transfektoidut solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoidulla anneksiini V: n ja fosfatidyyli-inositoli (PI), käyttäen anneksiini V: – FITC Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) valmistajan protokollien ja analysoitiin BD AccuriTM C6 -virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA).

tulokset

karakterisointi XB130 shRNA transfektoitu stabiilisti WRO Cells

tutkia roolit XB130 säätelyssä WRO solussa toimintaa, me pysyvästi transfektoitu solut shRNA kohdistaminen XB130. Expression of XB130 oli merkitsevästi pienempi näistä klooneista (C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11) kuin ei-transfektoiduissa WRO solut ja muut kolme kloonia transfektoitu stabiilisti negatiivinen kontrolli shRNA (NC1, NC9, NC12), kuten määritettiin Western blot (kuvio. 1A) ja reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR: llä (Fig. 1 B). Ilmentyminen SDHA mRNA käytettiin housekeeping-geenin qRT-PCR: llä (Fig. 1 B), koska sen ilmentyminen ei muutu erilaisissa koeolosuhteissa [10], [34], [35]. Mielenkiintoista, XB130 pudotus solut osoittivat pitkänomainen morfologia, kun tutkittiin faasikontrastimikroskopiaan. Lisäksi immunofluorecence värjäys paljasti, että ilmaus XB130 vuonna C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11-soluissa oli tuskin havaittavissa, ja F-aktiinivärjäyksen osoitti myös pitkänomainen morfologia yksittäisen solun tasolla (Fig. 1 C, kuva S1).

seuraavat solut tutkittiin: WRO solut (WRO), negatiivinen kontrolli shRNA transfektoidut WRO soluja (NC1, NC9 ja NC12) ja XB130 shRNA transfektoitiin WRO soluja (C3-1, C3-4 , C4-3 ja C4-11). (A) XB130 shRNA vähentää tehokkaasti XB130 proteiinin tasoja. (B) Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että ilmentyminen XB130 mRNA: XB130 shRNA transfektoiduissa WRO solut olivat merkittävästi alhaisemmat kuin WRO soluja (* P 0,05). (C) WRO, NC9 ja C3-1 oli immuuni-värjättiin XB130 vasta-aineella ja vastavärjättiin F-aktiini ja ytimet Oregon Green 488 falloidiinia ja Hoechst 33342. ilmentyminen XB130 proteiinin sytoplasmassa katosi XB130 shRNA transfektoiduista soluista.

MicroRNA Expression Profile XB130 shRNA transfektoiduissa soluissa

tunnistaa miRNA säätelee XB130, suoritimme miRNA ilmaisun profiilin määritys, vertaamalla XB130 shRNA siirretty stabiilisti WRO soluja (C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11) hallintalaitteet (WRO, NC1, NC9 ja NC12) käyttäen microRNA array määritystä. GeneSpring GX-analyysi osoitti, että 38 miRNA merkittävästi muuttanut vakaa knockdovvn XB130 vuonna WRO soluissa (p-arvo 0,05), joista 16 oli säädelty (taulukko 1) ja 22 alassäädetty (taulukko S1) in XB130 shRNA transfektoiduissa soluissa.

Voit selvittää mekanismeja, joilla XB130 säätelee solujen lisääntymistä, keskityimme miRNA tukahdutettu XB130 ja valittujen miR-33a, miR-193a-3p ja miR-149 lisäanalyysiä , joka on ilmoitettu osoittavan kasvaimia estävä toimintoja erilaisissa syövissä [36] – [38]. Voit tarkistaa vaikutukset XB130 Mir-33a, miR-149 ja miR-193a-3p, me määrällisesti määriä näitä 3 miRNA käyttäen reaaliaikaista qRT-PCR. Sekä kypsä miRNA (Fig. 2A) ja pri-miRNA (Fig. 2B) tasot näiden kolmen miRNA in XB130 shRNA pysyvästi transfektoitu WRO soluja (C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11) olivat merkittävästi korkeammat kuin ei-transfektoituja WRO soluja tai stabiilisti transfektoitu negatiivinen kontrolli shRNA (NC1, NC9 ja NC12).

kypsät muodot (A) ja ensisijaisen transkriptien (B) miR-33a, asennuspalveli- 149 ja miR-193a-3p ovat huomattavasti korkeammat XB130 shRNA transfektoiduissa WRO soluja (C3-1, C3-4, C4-3 ja C4-11) kuin WRO (* P 0,05).

Kohdunulkoinen XB130 Expression Tukahdetut Ensisijainen ja kypsät muodot miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p

edelleen varmistamiseksi sääntelyn vaikutuksia XB130 ekspressioon miR-33a, miR-149, ja miR-193a-3p, teimme ”pelastus” tutkimus MRO soluja, joilla on hyvin alhainen XB130 ilme määritettynä western blottauksella. Transfektoimme MRO solujen ilmentävien plasmidien GFP-alone, GFP-XB130, tai sen N-pään deleetiomutantin, GFP-XB130ΔN. GFP-positiiviset solut kerättiin FACS, ja GFP-XB130 ja GFP-XB130ΔN proteiinien transfektoiduissa MRO-soluissa osoitettiin western-blottauksella (Fig. 3A). Toisin kuin WRO soluihin, MRO solut osoittivat merkitsevästi korkeampi ekspressiotasot miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p, sekä kypsät ja alkumuodossa. XB130-GFP yliekspressio johti merkittävään alas-säätely sekä kehittyneitä miRNA ja pri-miRNA, kun taas yli-ilmentyminen GFP-XB130ΔN eivät aiheuttaneet tällaisia ​​vaikutuksia (Fig. 3B ja C). Koska N-pää XB130 sisältää funktionaalisia motiiveja, jotka voivat olla vuorovaikutuksessa Src [7] ja p85α alayksikön PI3K [8], ei ole vaikutusta tämän mutantti viittaa siihen, että ”pelastus” vaikutuksia GFP-XB130 voi liittyä Src ja /tai PI3K liittyviä mekanismeja. Se, että sekä kypsä ja pri-miRNA-tasot säädellään samalla tavalla sen XB130 ehdotti, että XB130 vaikuttaa näiden kolmen miRNA ainakin osittain transkriptionaalisella tasolla.

MRO-solut transfektoitiin GFP-vektorilla yksinään tai GFP-XB130 GFP-XB130ΔN (XB130 N-pään deleetiomutantin). GFP-positiiviset solut kerättiin FACS. (A) Western blottaus osoitti, että MRO ilmentävät hyvin alhainen XB130. Transfektio GFP-XB130 (MRO-XB130) tai GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) osoitti XB130 ilmentymistä MRO soluissa. Kypsät muodot (B) ja ensisijaisen selostukset (C) miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p tutkittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR. Nämä miRNA ja pri-miRNA MRO solut olivat huomattavasti korkeampi kuin WRO soluissa, ja merkittävästi vähentää yli-ilmentyminen GFP-XB130, mutta ei GFP-XB130ΔN. * P 0,05 verrattuna WRO soluihin.

yli-ilmentyminen miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p alennetulla Down-stream Kohdennettu proteiinit liittyvät Cell Proliferation

aiemmin raportoitu, että XB130 shRNA pysyvästi transfektoitu WRO soluja, 57 liittyvien geenien soluproliferaatiota tai eloonjäämistä merkittävästi muuttunut, ja useimmat näistä geeneistä oli alas-säädellä XB130 shRNA [10]. Me arveltu, että näihin geenit, jotkut ovat tavoitteita miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p. Käyttämällä TargetScan 6,0, microRNA.org, PicTar, ja Diana-MICROT v4 /TarBase 5.0 tunnistimme MYC ja CEBPG ehdokkaina kohdegeenien Mir-33a, CEBPG ja FOSL1 Mir-149, SLC7A5, DECR1 ja SETD8 varten asennuspalveli- 193a-3p. Sen arvioimiseksi, ovatko nämä miRNA todella säädellä ilmentymistä Ehdokaskohteiden, transfektoimme miR matkivat osaksi WRO soluihin. Transfektio näistä kolmesta miR jäljittelee merkittävästi kohonneeseen vastaavien miRNA (Fig. 4A), mutta ei vaikuta XB130 proteiinin tasot (Fig. 4B). Verrattuna WRO solut, proteiini tasot MYC, FOSL1 ja SLC7A5 oli pienempi XB130 shRNA stabiilisti transfektoidut solut (C3-1 kuin esimerkkejä) (Fig. 4C-E). Yli-ilmentymisen miR-33a pienensi MYC proteiinin tasot (Fig. 4C). Vastaavasti yli-ilmentyminen miR-149 alassäädetty FOSL1 proteiinin tasot (Fig. 4D), ja yliekspressio miR-193-3p alassäädetty SCL7A5 proteiinin tasot (kuvio. 4E). Negatiivinen kontrolli matkivat (Cont-m) ei vaikuttanut näiden kolmen proteiineja (Fig. 4C-E). Proteiini tasot CEBPG, DECR1 ja SETD8 eivät muuttuneet yli-ilmentyminen näiden miR jäljittelee (tuloksia ei ole esitetty).

(A): n transfektointi miR jäljittelee (33a-m, 149 m ja 193a-m) merkitsevästi lisääntynyt vastaavaan miRNA ilmentymisen, kun taas kontrolli miR matkivat (jatk-m) ei ollut tällaisia ​​vaikutuksia, kuten määrällisesti reaaliaikaisella kvantitatiivinen RT-PCR. (B) VVestern-blottaus osoittaa, että transfektio miR matkivat ei muuta XB130 proteiinin tasoja. (C-E) MYC, FOSL1 ja SCL7A5 ennustetaan tavoite miR-33a, miR-149 ja miR-193-3p, vastaavasti. Ylempi paneeli esittää esimerkkejä, että ilmaisu ennustetun kohdeproteiinin väheni vastaavien miR jäljittelevät transfektioiden määritettynä Western-blottauksella. Alempi paneeli esittää määrällisesti ekspressiotasoja densitometrisesti.

Koska yli-ilmentäminen GFP-XB130 in MRO soluissa tukahdutti ilmentyminen miR-33a, miR-149, ja miR-193a-3p ( Fig. 3A-3B), testasimme myös se voi myöhemmin vaikuttaa niiden alavirran kohdennettuja proteiineja. Western blotit osoittivat, että verrattuna GFP-alone transfektoitujen MRO soluja, GFP-XB130 transfektoidut solut osoittivat korkeampia MYC, FOSL1 ja SLC7A5. Verrattuna GFP-XB130ΔN transfektoitujen solujen FOSL1 ja SLC7A5 tasot olivat selvästi korkeampia GFP-XB130 transfektoiduissa soluissa (kuvio. S2). Nämä tulokset tukivat miRNA matkivat tiedot WRO soluissa.

MiR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p Suoraan Kohdennettu Binding Site 3’UTR MYC, FOSL1 ja SLC7A5, Vastaavasti

sitten käytetään pmirGLO Dual-lusiferaasireporttiterilla järjestelmä määrittää, onko väheneminen MYC, FOSL1 ja SLC7A5 tasoilla yli-ilmentymisen miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p miR jäljitellä oli kautta 3’UTR tavoitellun mRNA: t. Huomattava täydentävät tunnistettiin käyttämällä algoritmeja TargetScan välillä sekvenssien sisällä siemen alueilla miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p ja sekvenssit 3’UTR MYC, FOSL1 ja SLC7A5, vastaavasti (Fig. 5A ). PmirGLO konstruktit, jotka sisältävät lusiferaasireportteri- ja 3’UTR kunkin näistä 3 geenit syntyy. WRO solut kotransfektoitiin kanssa pmirGLO rakentaa ja kunkin miR jäljittelee tai negatiivinen kontrolli miR. Yli-ilmentymisen miR-33a vähensi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuuden pmirGLO rakentaa kloonattuja 3’UTR sekvenssit MYC (Fig. 5B). Samoin, yliekspressio miR-149 ja miR-193-3p vähensi merkittävästi lusiferaasiaktiivisuudet, kun solut transfektoitiin lusiferaasin konstruktilla, joka sisältää 3’UTRs on FOSL1 ja SCL7A5 (Fig. 5C ja D). Nämä tulokset osoittivat, että nämä 3 miRNA saattavat vaikuttaa ilmaus liittyvien kohdegeenien sitoutumalla niiden 3’UTRs.

(A) Seed sekvenssit miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p ja pariksi 3’UTRs sekvenssi MYC, FOSL1 ja SLC7A5 kuten ennustaa TargetScan on esitetty. PmirGLO rakentaa kloonatun 3’UTR sekvenssit (luc-MYC, luc-FOSL1 ja luc-SLC7A5) ja miR matkia (33a-m, 149 m ja 193a-m) tai ohjaamaan miR matkivat (jatk-m) olivat kotransfektoitiin WRO soluihin. (B) yli-ilmentyminen miR-33a vähensi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuuden pmirGLO rakentaa kanssa kloonattujen 3’UTR sekvenssit MYC (luc-MYC). Samoin, yliekspressio miR-149 ja miR-193-3p vähensi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuus luc-FOSL1 (C) ja luc-SCL7A5 (D), tässä järjestyksessä.

alennetulla Cell Proliferation by yliekspressio Mir-33a, miR-149 ja miR-193a-3p

MYC, FOSL1 ja SLC7A5 tiedetään osallistua solujen jakautumisen. Koska transfektoimalla kukin näistä miR jäljittelee alassäädetty kunkin kohdennettuja proteiini, me tutki näiden vaikutukset miR jäljittelee soluproliferaatioon. Leviämisen WRO solujen väheni transfektio miR matkivat Mir-33a, miR-149 tai miR-193a-3p, määritettynä MTT: llä (Fig. 6A), tai solu laskenta (Fig. 6B), verrattuna ohjaus- miR jäljittele transfektoitujen solujen 72 tunnin kuluttua solujen kylvö. Lisäksi, ekspressio solun proliferaation markkerit, Ki-67 ja PCNA, vähennettiin kustakin kolmesta miR jäljittelee verrattuna ei-transfektoitujen WRO soluja tai transfektoitu ohjaus matkivat (Fig. 6C). Toisaalta, yliekspressio GFP-XB130, ja vähemmän laajentaa GFP-XB130ΔN kasvoi Ki67 ilmentymistä MRO-soluissa (kuvio. S2).

elinkykyisten solujen arvioitiin MTS-määritys (A) ja solujen laskenta (B) 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen ohjaus matkivat (jatkoa-m) ja erityisiä miR jäljittelevät (33a-m, 149 m ja 193a-m). Yli-ilmentyminen miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p johti vähenemiseen solujen lisääntymisen. (C) Solulisääntyminen markkereita, Ki-67 ja PCNA tasot, vähensi myös vuonna miR matkivat käsitellyissä soluissa (33a-m, 149 m ja 193a-3p). (D) Apoptoosi määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä PI /anneksiini V: kaksinkertainen värjäys. Yli-ilmentymisen miR-193a-3a merkittävästi indusoi sekä varhaisen apoptoosin (anneksiini V positiivinen /PI negatiivinen) ja myöhäinen apoptoosin (anneksiini V /PI kaksinkertainen positiivinen) in WRO soluissa. *: P 0,05.

onko solujen määrän väheneminen johtui apoptoosin, suoritimme virtaussytometria PI /anneksiini V kaksinkertainen värjäys. Anneksiini V: positiiviset solut edustavat aikaisin apoptoosin, kun taas anneksiini V: ja PI kaksinkertainen positiivisten solujen osuus myöhään apoptoosin [10]. Yliekspressio miR-193a-3a (mutta eivät muut kaksi miRNA) indusoituu merkittävästi sekä varhaisen ja myöhäisen apoptoosin WRO soluissa (Fig. 6D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että alennettu solumäärät miR-33a ja miR-149 matkii johtuvat pääasiassa Solujen proliferaation estyminen, kun taas miR-193a-3p voi vähentää solujen lisääntymisen ja apoptoosin.

Keskustelu

meidän edellisessä tutkimuksessa mikrosiruanalyysi tunnistettu 246 geenien merkittävästi muuttaa pysyvästi kaataa of XB130 vuonna WRO kilpirauhasen syöpäsoluja. Varsinkin, 57 pois 246 geenit liittyvät soluproliferaatioon tai elinkelpoisuudesta, mukaan lukien monet transkriptio sääntelyviranomaiset [10]. On arvioitu, että noin 30% kaikista ihmisen geenejä voidaan säädellä miRNA [39]. Muutoksilla on miRNA käsittely myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn [40]. Siksi me arveltu, että XB130 voi säädellä ilmentymistä kasvuun liittyviä miRNA ja myöhemmin hallitsemaan liittyvistä geeneistä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Arvioida tämän hypoteesin, analysoimme miRNA ilmaisun XB130 pudotus WRO soluja. MicroRNA erilaisia ​​analyysi osoittivat, että 38 miRNA olivat eri ilmaistu XB130 pudotus soluissa. Niistä keskityimme miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p, jotka on ilmoitettu tuumoria tukahduttavan miRNA erilaisissa syövissä. MiR-33a hidastaa solujen lisääntymistä toimii estämällä esikasvaintekijän Pim-1 in lymfooma ja koolonkarsinoomasoluissa [36]. miR-149 ilmaisu on suora korrelaatio KCNMA1 ja LOX onkogeenien kirkas cell munuaissolusyövässä [37]. Samoin miR-193-3p tavoitteet JNK1 ja estää solusyklin etenemisen ja lisääntymistä rintasyövässä [38]. Me validoitu säätely ylöspäin miR-33a, miR-149 ja miR-193a-3p in XB130 pudotus soluissa reaaliaikaisella qRT-PCR.

microRNA ilmaisun prosesseissa, RNA-polymeraasi II tuottaa pitkä ensisijainen miRNA selostukset kutsutaan pri-miRNA, jotka leikataan ja pilkotaan multi-proteiini-kompleksin mukaan lukien DROSHA ja DICER1 tuottamaan kypsiä funktionaalisia miRNA [41]. Miten miRNA ilmentymistä säädellään on vielä epäselvä, mutta eri mekanismeja on ehdotettu. On osoitettu, että p53 oli vastuussa transkription jälkeisen kypsymisen miR-16-1, miR-143 ja miR-145, kun taas ilmaus liittyvien pri-miRNA ei vaikuttanut p53 [25]. Kuten raportoitu kuvassa.