Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA), endogeeniset pienet ei-koodaavat RNA: t, ovat vakaasti havaitaan ihmisen plasmassa. Varhainen diagnoosi mahalaukun syövän (GC) on erittäin tärkeää parantaa hoidon vaikutusta ja pidentää potilaiden selviytymiseen. Meidän tavoitteena oli tunnistaa, onko neljä miRNA (miR-223, miR-21, miR-218 ja miR-25) tiiviisti kasvaimien syntyyn tai etäpesäkkeiden GC voivat toimia uusina mahdollisia biomarkkereita GC havaitsemiseen.

Menetelmät

alussa mitattu plasman neljästä miRNA 10 GC potilaalla ja 10 terveiden verrokkien kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR), ja sitten verrataan plasman miRNA tulosten kanssa ilmaisuja syövän kudoksissa kahdeksasta GC potilaista. Lopuksi läsnäolo miR-223, miR-21 ja miR-218 plasmassa oli validoitu 60 GC potilailla ja 60 terveiden verrokkien, ja alueilla vastaanotin toimii (ROC) käyrät näistä miRNA analysoitiin.

tulokset

Huomasimme, että plasman miR-223 (

P

0,001) ja miR-21 (

P

0,001) olivat merkittävästi suuremmat GC potilailla kuin terveillä verrokeilla, kun taas miR-218 (

P

0,001) oli huomattavasti pienempi. ROC-analyysit tuotti AUC-arvot 0,9089 Mir-223, 0,7944 Mir-21 ja 0,7432 Mir-218, ja yhdistetyt ROC-analyysi paljasti korkein AUC-arvo 0,9531 in erotteleva GC potilaiden terveiden verrokkien. Lisäksi plasman miR-223 (

P

0,001) ja miR-21 (

P

= 0,003) olivat merkittävästi korkeammat GC potilailla, joilla on vaiheen I kuin terveillä verrokeilla. Lisäksi plasman miR-223 olivat merkitsevästi korkeammat GC potilailla, joilla

Helicobacter pylori

(Hp) infektio kuin ilman (

P

= 0,014), ja huomattavasti korkeampi terveillä verrokeilla HP infektio kuin ilman (

P

= 0,016).

Johtopäätökset

Plasma miR-223, miR-21 ja miR-218 ovat uusia potentiaalisia biomarkkereita GC havaitsemiseen .

Citation: Li B, Zhao Yl, Guo G, Li W, Zhu Ed, Luo X, et al. (2012) Plasma MikroRNA, miR-223, miR-21 ja miR-218, koska Novel Mahdolliset biomarkkerit mahasyövän Detection. PLoS ONE 7 (7): e41629. doi: 10,1371 /journal.pone.0041629

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 joulukuu 2011; Hyväksytty: 27 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan Natural Science Foundation of China (NSFC, nro 81071412). Rahoittajat oli rooli tietojen keruu ja analysointi, mutta ei roolia tutkimuksen suunnittelu, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin maligniteetti maailmassa ja toiseksi suurin syy syövän kuolemaan molempien sukupuolten maailmanlaajuisesti. Kuolleisuus oli korkein arvioidaan Itä-Aasia [1]. 5 vuoden eloonjäämisaste mahasyövän on alle 20% -25% USA: ssa, Euroopassa ja Kiinassa [2]. Tällä hetkellä täydellinen kirurginen resektio on tehokkain hoito, joka tarjoaa erinomaisen (90%) mahdollisuus paranna Potilailla, joiden mahasyöpä [3]. Kehittyneen mahasyöpä huolimatta parantava leikkaus, noin 80% potilaista kuolee lyhyessä ajassa Paikallista toistuminen (87%) ja /tai kaukana etäpesäke (30%) [4]. Siksi parannus varhaisen diagnoosin voisi lisätä mahdollisuus parannuskeino aikaisin GC potilailla tai pidentää eloonjäämisen potilailla, joilla on varhaisvaiheen GC. Kuitenkin useimmat alkuvaiheen GC on vaikea havaita [5]. Tavanomainen seerumimarkkereiden GC, kuten hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9) ja syöpä -antigeeni (CEA), puute riittävä herkkyys ja helpottaa varhaista havaitsemista.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei ää koodaavien RNA: iden posttranscriptionally säädellä geeniekspressiota. Poikkeava ekspressio miRNA on korreloitu useiden sairauksien, mukaan lukien syöpien [6]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kudosten miRNA ekspressioprofiileja voidaan pitää diagnostisia biomarkkereita syövässä [7] – [9]. Kuitenkin tämä diagnostinen menetelmä on rajoitettu sen tehoa kuin kudosnäytteet eivät ole kätevää käyttää ja ovat invasiivisia saada. Yhä useampi papereita ovat ilmoittaneet, että kiertävä miRNA ovat vakaasti havaitaan eri kehon nesteiden, kuten seerumi ja plasma [10], [11]. Kiertävä miRNA uusina vakaa biomarkkereita olisi yksi lupaavimmista keino diagnoosin, koska plasma ja seerumi ovat helposti saatavilla ja noninvasive saamiseksi. Viime aikoina useita lupaavia seerumi tai plasma miRNA biomarkkereita GC havaitsemista on tunnistettu [12], [13].

Tutkitaan että uusi plasma miRNA allekirjoituksia voidaan erottaa potilaalla on GC (erityisesti varhaisen vaiheen GC) terveistä tarkastuksia, valitsimme neljä miRNA (miR-223, miR-218, miR-25 ja miR-21), joka oli raportoitu usein väärin säädellystä GC kudosten ja läheisesti korreloi kasvaimen kehittymisen tai etäpesäke GC [14] – [21] . Me olettaa, että plasman kolmen miRNA (miR-223, miR-218 ja miR-25) oli poikkeava GC potilailla samoin kuin miR-21, joka ehdotti, että tätä allekirjoitusta voi toimia biomarkkeri GC havaitsemiseen [12]. Kuitenkin plasman miR-21 GC potilaille eri TNM vaiheissa ei ole tunnistettu. Tässä tutkimuksessa vertasimme plasmapitoisuudet neljän miRNA GC potilaita terveisiin kontrolleihin, ja arvioidaan mahdollisuutta neljän miRNA uusina noninvasive biomarkkereita GC havaitsemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Kaikki näytteet kerättiin suostumuksensa yksilöitä protokollien mukaisesti hyväksymän eettisen Review Board Third Military Medical University. Kaikkiaan 70 potilaalla on GC ennen mitään hoitoja ja 70 terveiden verrokkien välillä Southwest Hospital (Chongqing, Kiina) sisällytettiin tutkimuksessamme vuosien 2010 ja 2011. 70 GC potilaat, olemme analysoineet histologia GC kudosten, mukaan lukien 56 adenokarsinooma, 13 mucinous adenokarsinooma ja 1 Signet-rengas cell carcinoma, ja määritetään kasvain paikoissa, mukaan lukien 34 mahalaukun elin, 24 mahalaukkua, 8 mahalaukun cardia ja 4 toisissa (Upper vatsa, mahalaukun kulma, mahalaukun kanto). GC potilaat luokiteltiin kliinisen TNM vaiheita, mukaan lukien 12 vaiheessa I (mediaani-ikä, 53 vuotias [alue, 36-70 vuotta] 8 miestä, 4 naista), 11 vaiheen II (mediaani-ikä, 61 vuotias [alue, 36-77 vuotta], 7 miestä, 4 naista), 36 vaiheen III (mediaani-ikä, 55 vuotias [alue, 30-71 vuotta] 26 mies, 10 naista), ja 11 vaiheen IV (mediaani-ikä, 53 vuotias [alue , 46-66 vuotta] 9 uros, 2 naaras) kantavassa asema Hp infektio testattiin käyttämällä Anti-HP vasta-aineet ELISA diagnostiikkasarjoja (S20010005), (Peking BEIER biotekniikka CO., LTD), joka osoittaa 43 GC potilaalla on Hp infektio ja 27 ilman. Sillä 70 terveiden verrokkien, 44 mies- ja 26 naisen sisällytettiin, ja mediaani-ikä oli 51 vuotta [alue, 26-75 vuotta]. Tulokset Hp infektion testi osoitti 31 terveiden verrokkien kanssa Hp infektio ja 39 ilman. (Taulukko 1).

Cell-free plasma eristettiin kaikista verinäytteistä kuluessa 2 h keräämisen käyttämällä kaksivaiheista protokollaa (1500 rpm 10 min, 12000 rpm 2 min), jotta saastuminen solun nukleiinihapot. Plasma siirrettiin uuteen putkeen, jolloin kiinteä korkeus 0,5 cm plasman supernatantista pelletin yläpuolelta häiriinny pelletti [11]. Se varastoitiin -80 ° C: ssa 450 ul: n. Kahdeksan paria kudosnäytteitä kerättiin kahdeksan GC potilaalla on korkeampi plasman miR-223 ja miR-21, ja alemmat plasman miR-218 kuin terveillä verrokeilla jälkeen kirurgisen resektion, ja noin leikattiin 1 mm neliöitä ja jäädytettiin välittömästi nestemäistä typpeä.

RNA uuttaminen

Yhteensä-RNA: t uutettiin 400 ui plasmaa käyttämällä Mirvana PARIS Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan protokollan, ja eluoitiin 105 ul: esilämmitetty ( 95 ° C) Eluointi ratkaisu. Jotta normalisoituminen näytteen ja näytteen vaihtelu RNA: n eristämistä vaiheessa 10 ui 0,05 uM synteettisen

C. elegans

miR-39 (synteettinen RNA-oligo nukleotidin syntetisoitiin GenePharma) lisättiin kuhunkin denaturoituun näytteen yhdistämisen jälkeen plasman näytteen denaturointiliuos [11]. Pakasteiden kudoksia, kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan, ja suspendoidaan lopuksi uudelleen 60 ul: aan esilämmitetty (95 ° C) nukleaasitonta vettä.

Quantitative käännetyn transkriptaasi Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) B

Käänteiskopiointireaktio suoritettiin käyttäen Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). cDNA syntetisoitiin 5 mikrolitratilavuuksia joka sisälsi 1,67 ui RNA uutetta, 0,5 pl 10 x käänteiskopioinnin puskuria, 0,05 ui 100 mM dNTP, 0,063 ui RNaasia Inhibitor (20 U ul

-1), 0,33 ui Mutiscribe käänteistranskriptaasia (50 U ui

-1), 0,5 ui geenin-aluke ja 1,887 ui nukleaasitonta vettä. Reaktioita inkuboitiin 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen 42 ° C: ssa 30 min, sitten 85 ° C: ssa 5 minuutin ajan ennen kuin se pidetään 4 ° C: ssa. Syntetisoitu cDNA laimennettiin 2-kertaiseksi ydinaseettoman vettä. Kvantitatiivinen PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 2 ui cDNA-liuosta, 5 ui TaqMan 2 x Perfect Master Mix (Takara), 0,25 ui geenin-spesifisiä alukkeita /koetin (TaqMan® MicroRNA määritykset, Applied Biosystems. Taulukko S1) ja 2,75 ui nukleaasivapaata vettä lopputilavuuteen 10 ui, ja ajaa Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) lämpösyklilaitteella. Reaktio seoksia inkuboitiin 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Sykli kynnys (

C

t) arvot laskettiin Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition Optical System Software 2.1.94.0617.

plasmassa miRNA pitoisuudet laskettiin käyttäen standardia käyrä rakennettu synteettisten miRNA [22]. Standardi viite miRNA monistettiin jokaista reaktiota. Kuitenkin ilmaus miRNA kudosnäytteistä normalisoitiin käyttäen 2

-ΔΔ

C

t menetelmän

C

t arvot miRNA kiinnostava suhteessa RNU6B.

normalisointi Kokeellinen qRT-PCR tiedot Plasma käyttämällä Synteettinen C. elegans miR-39

C. elegans

miR-39, jossa ei ole sekvenssihomologia ihmisen miRNA, valittiin normalisoida kokeellisen qRT-PCR tietoja. Tunnetut määrät synteettisten

C. elegans

miR-39 laimennettiin tuottamaan

C

t-arvot sisällä

C

t arvoalueet on miRNA standardin käyriä. Olemme kokeellisesti lisättiin 10 ui 0,05 uM synteettisen

C. elegans

miR-39-400 ui plasmaa yhdistämisen jälkeen plasman näytteen denaturointiliuos.

C. elegans

miR-39 monistettiin sekä muita miRNA. Seuraava kaava käytettiin säätämiseen

C

t arvot miRNA (miR-223, miR-21, miR-218 ja miR-25) kaikissa plasmanäytteissä: Normalized_

C

t arvo miRNA näytteessä = Raw_

C

t-arvo – [(SpikeIn_ Average_

C

t arvosta annetun näytteen) – (Median_ SpikeIn_

C

t)] [11]. Normalized_

C

t arvoa käytettiin sitten pitoisuuden laskemiseksi kunkin miRNA.

Tilastollinen analyysi

Mann-Whitneyn testiä käytettiin vertaamaan eroja plasman miRNA pitoisuudet ja miRNA väliset suhteet syövän ryhmä ja terve ryhmä. Kaksipuolisen χ

2 testiä käytettiin vertaamaan eroja sukupuolen, iän tai Hp tartuntatilanne välillä GC potilaiden ja terveiden verrokkien. ANOVA-testiä käytettiin analysoimaan suhde tasojen miR-223, miR-21, miR-218 ja TNM vaiheissa. Vastaanotin toimineiden (ROC) käyriä ja ala ROC-käyrän (AUC) käytettiin arvioimaan mahdollisuutta käyttää plasmapitoisuuksia miRNA diagnostisina työkaluina havaitsemiseksi GC. Youdenin indeksiä käytetään valitsemaan optimaalisen raja-arvot.

P

arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmisto ja kaaviot luotiin käyttäen GraphPad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, Caligornia).

Tulokset

luonnehtii Koehenkilöiden

Sata ja neljäkymmentä aiheita, mukaan lukien 70 GC potilasta ja 70 tervettä verrokeilla, rekrytoitiin tähän tutkimukseen. Mitään merkittäviä eroja sukupuolen tai iän välillä havaittiin GC potilaiden ja terveiden verrokkien (

P

= 0,371,

P

= 0,398, χ

2 testi, vastaavasti). Hp infektio oli merkitsevästi erilainen välillä GC potilaiden ja terveiden verrokkien (

P

= 0,042) (taulukko 1).

Evaluation of Quantitative RT-PCR mittaaminen miRNA Plasma

Jos haluat määrittää dynamiikan ja herkkyyden miRNA kvantifiointiin reaaliaikaisella PCR, synteettinen yksijuosteista miRNA sarjalaimennettiin 10-kertaisesti pitoisuudet 0,1-0,000001 fmol mir-223, miR-218, asennuspalveli- 25, ja miR-21 suosituksesta GenePharma miRNA Reference Panel. Lineaarisuus kvantitatiivinen RT-PCR välillä logaritmiarvot tulo miRNA ja

C

t-arvot vahvistettiin kunkin synteettisen miRNA, miR-223, miR-218, miR-25 ja miR -21 (R

2 = 0,997, R

2 = 0,998, R

2 = 0,993 ja R

2 = 0,999, vastaavasti) (kuvio 1).

Ten- kertainen sarjalaimennokselle synteettistä miRNA käytettiin tuottamaan standardikäyriä. Lineaarisuus vahvistettiin näiden pitoisuudet miR-21, miR-223, miR-218 ja miR-25 vaihtelee 0,1-+0,000001 fmol. (

miR-21

: y = -3.337x + 14,77 (R

2 = 0,999);

miR-223

: y = -3.121x + 17,37 (R

2 = 0,997);

miR-218

: y = -3.071x + 17,79 (R

2 = 0,998);

miR-25

: y = -3.114x + 17,47 ( R

2 = 0,993)).

Alustava seulonta Plasma miRNA joka voi Monitor GC

neljä miRNA, miR-223, miR-218, miR-25 ja miR -21, oli poikkeuksellisesti ilmaistuna GC kudoksissa. Sen tutkimiseksi, tasot neljän miRNA läsnä dysregulation plasmassa potilaiden GC, me aluksi mitattuna plasman neljästä miRNA 10 GC potilaalla ja 10 tervettä verrokkia. Kuten odotettua, plasman miR-223 ja miR-21 olivat merkitsevästi korkeammat GC potilailla kuin terveillä verrokeilla (

P

0,001), kun taas miR-218 oli merkittävästi pienempi (

P

0,001). Kuitenkin plasman miR-25 ei ollut merkitsevää eroa GC potilaiden ja terveiden verrokkien (

P

= 0,970) (kuvio 2 (A-D)). On raportoitu, että tasot miR-21 GC plasmassa saattaa heijastaa niille ensisijainen GC kudoksessa [12]. Sen tutkimiseksi, tasot kolmen miRNA (miR-223, miR-218 ja miR-21) in GC plasmassa voi heijastaa niille ensisijainen GC kudoksessa, testasimme tasot kolmen miRNA kahdeksan paria GC kudosten ja viereisen normaali kudos näytteitä 8 GC potilaat, joiden plasmapitoisuudet miR-223, miR-21 olivat huomattavasti korkeampia, ja miR-218 oli huomattavasti pienempi. Kuten kuviossa 2E, ilmentymisen tasot miR-223 olivat korkeampia ensisijainen GC kudoksissa kuin verrokeilla seitsemässä kahdeksasta potilaista analysoitiin (87,5%) ja miR-21 kahdeksalla potilaalla (100%), kun taas miR-218 oli alempi seitsemässä potilaalla (87,5%), mikä viittaa siihen, että määriä näitä kolmea miRNA GC plasman vastanneet näitä perus GC kudoksessa.

Scatter dot ploteista plasman neljä miRNA mahalaukun syöpäpotilailla (GC, n = 10) ja terveiden verrokkien (NC, n = 10). Scatter pistekuvioita osoittavat plasman

miR-223

(A),

miR-21

(B),

miR-218

(C) ja

miR-25

(D). Rivit scatter pistekuvioita tarkoittavat medians. (E) Bars ilmentymisen tasojen miR-223, miR-21 ja miR-218 ensisijainen GC kudoksissa ja pariksi normaaleissa kudoksissa. Ilmaisu tasot miR-223 olivat korkeampia ensisijainen GC kudoksissa seitsemän kahdeksasta potilaista analysoitiin (87,5%) ja miR-21 kahdeksalla potilaalla (100%), kun taas miR-218 oli pienempi seitsemässä potilaalla (87,5%) kuin pariksi normaaleissa kudoksissa. Kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa kaksoiskappaleet.

pitoisuutta plasmassa miR-223, miR-21, miR-218 ja miR-25 oli validoitu Large Scale

arvioimiseksi plasman edellä neljä miRNA diagnostisina markkereina GC havaitsemiseen, toinen 60 GC potilasta ja 60 tervettä verrokeilla lisättiin tässä validointi määrityksessä. Kuten kuviossa 3 on esitetty, tasot miR-223 ja miR-21 olivat merkitsevästi korkeammat GC plasmassa kuin verrokeilla (

P

0,001), kun taas miR-218 oli merkittävästi vähäisempää (

P

0,001). Kuitenkin plasman miR-25 ei ollut merkitsevää eroa GC potilaiden ja terveiden verrokkien (

P

= 0,082) (Kuva S1). Konsentraatio-arvot neljän miRNA mitattu koehenkilöiden plasmasta on esitetty taulukossa S2. ROC-käyrä analyysit suoritettiin arvioimaan diagnostinen arvo kolmen plasma miRNA ja kävi ilmi, että kolme plasma miRNA olivat arvokkaita biomarkkereita erottaa GC normaalista säätimet AUC (alueilla ROC käyrä) ja 0,9089 (95% CI: 0,8598-0,9580 ) mir-223, 0,7944 (95% CI: 0,7211-0,8677) mir-21 ja 0,7432 (95% CI: 0,6628-0,8236) mir-218. Tällä optimaalinen raja-arvo 0,7286 kanssa arvosta herkkyys + spesifisyyden-1 pidetään maksimaalinen Mir-223, herkkyys ja spesifisyys olivat 84,29% ja 88,57%; katkaisuaallonpituuden arvoon 0,5000 Mir-21, herkkyys ja spesifisyys olivat 74,29% ja 75,71%, ja cutoff on 0,3858 Mir-218, herkkyys ja spesifisyys olivat 94,29% ja 44,29%. Nostaa diagnoosin arvoon, yhdistelmä ROC käyrä analyysit suoritettiin (miR-223 kerrottuna miR-21) jaettuna miR-218. Suhde (miR-223 x miR-21) /miR-218 tuotti korkeimman AUC-arvo 0,9531 (95% CI: 0,9222-0,9839) ja optimaalista raja-arvo 0,7715, herkkyys ja spesifisyys olivat 84,29% ja 92,86% , joka osoitti, että yhdistelmä allekirjoitus on vahva potentiaali diagnoosi vastinetta GC havaitsemiseen.

Rasiakuvaajat esittävät plasman miR-223 (A), miR-21 (B), miR-218 (C) ja (miR-223 × miR-21) /miR-218 (D) GC potilailla (GC, n = 70) ja terveillä verrokeilla (NC, n = 70). Viivat sisällä laatikot merkitsevät medians. Viikset of rasiakuvaajien: Min Max. Kuvaajat vastaanottimen toiminta-ominaisuudet (ROC) käyrä näyttää ala käyrien (AUC) on miR-223 (E), miR-21 (F), miR-218 (G) ja (miR-223 × miR-21) /miR-218 (H) erottamiseksi GC potilaiden terveillä verrokeilla. Väli 5

th ja 95

th persentiilit merkitsee luottamustasolla ja raportin tulokset osoittavat fraktioksi. Kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa kaksoiskappaleet.

pitoisuutta plasmassa miR-223, miR-218 ja miR-21 GC Potilaat, joilla on erilainen kliininen tila

plasmatasot nämä kolme miRNA GC potilaille eri TNM vaiheissa (12 I, 11 II, 36 kanssa III tai 11 IV) analysoitiin sen määrittämiseksi, kolme plasma miRNA voi havaita alkuvaiheen GC. Kuten kuviossa 4A, plasman kolmesta miRNA eivät olleet merkittävästi erilaiset neljässä vaiheessa (miR-223,

P

= 0,244; miR-218,

P

= 0,664; miR -21,

P

= 0,596), mutta kukin neljä vaihetta, kuten vaiheessa I potilaista oli merkittävästi kohonnut plasman miR-223 ja miR-21 verrattuna terveisiin kontrolleihin (P 0,01), ja miR -218 pieneni merkitsevästi vaiheessa II, III ja IV (

P

0,01), kun taas miR-218 eivät olleet merkittävästi erilaiset välinen vaihe I potilaille ja terveillä verrokeilla (

P

= 0,071). Lisäksi vertasimme tasoilla kolmen miRNA plasmassa GC potilailla, joilla on etäpesäkkeitä ilman. Kuten kuviossa 4B, plasman kolmen miRNA ei ollut merkittäviä eroja GC potilaalla on etäpesäkkeitä ja ilman (miR-223,

P

= 0,320; miR-218,

P

= 0,979; miR-21,

P

= 0,310).

(A) Rasiakuvaajat n plasman miR-223 (vasen paneeli), miR-21 (keskimmäinen paneeli ) ja miR-218 (oikea paneeli) myös terveiden (NC, n = 70) ja mahasyövän (GC, n = 70) potilasta eri TNM vaiheissa (12 I, 11 II, 36 kanssa III ja 11 kanssa IV ). (B) Rasiakuvaajat n plasman miR-223 (vasen paneeli), miR-21 (keskimmäinen paneeli) ja miR-218 (oikea paneeli) GC potilaalla ei etäpesäkkeitä. Viivat sisällä laatikot merkitsevät medians. Viikset of rasiakuvaajien: Min Max.

Suhde plasmatasoien miR-223, miR-21, miR-218 ja Hp Infektio tila aiheet

Lisäksi testasimme asemaa Hp infektion 140 aiheita kuten edellä on kuvattu, ja analysoitiin plasman kolmen miRNA 70 GC potilasta (43 HP infektio ja 27 ilman) ja 70 terveiden verrokkien (31 HP infektio ja 39 ilman) arvioida suhdetta plasman kolmen miRNA ja Hp infektiotilanteesta aiheista. Kuten kuvassa 5, plasman miR-21 (

P

= 0,875,

P

= 0,527) ja miR-218 (

P

= 0,097,

P

= 0,539) eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä GC sairastavien potilaiden Hp infektio ja ilman, ja välillä terveillä verrokeilla HP infektio ja ilman, vastaavasti. Kuitenkin miR-223 oli merkitsevästi suurempi GC potilailla, joilla Hp infektio kuin ilman (

P

= 0,014), ja huomattavasti korkeampi terveillä verrokeilla HP infektio kuin ilman (

P

= 0,016). Plasman miR-223 (

P

0,001) ja miR-21 (

P

0,001) olivat merkittävästi koholla GC potilailla, joilla Hp infektio tai joiden ilman verrattuna jossa terveiden verrokkien kanssa Hp infektio tai joiden ilman, kun taas miR-218 oli huomattavasti pienempi (

P

0,05). Nämä tiedot tarjoavat vahvoja todisteita siitä, että kolme miRNA allekirjoituksia voidaan erottaa GC potilaalla ei Hp tartunnan terveillä verrokeilla.

Rasiakuvaajat n plasman miR-223, miR-21 ja miR-218 GC potilailla jossa

H. pylori

infektio (With, n = 43) ja ilman (ilman, n = 27), ja terveillä verrokeilla kanssa

H. pylori

infektio (With, n = 31) ja ilman (ilman, n = 39). Huom: *,

P

0,05; **,

P

0,01. Rasiakuvaajien osoittavat plasman miR-223 (A), miR-21 (B) ja miR-218 (C). Viivat sisällä laatikot merkitsevät medians. Viikset of rasiakuvaajien: Min Max.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tasot neljän miRNA (miR-223, miR-218, miR-21 ja asennuspalveli- 25) plasmassa 70 GC potilaista ja 70 tervettä verrokkia analysoitiin. Yhdenmukainen aiempien tutkimusten mukaan Tsujiura et al [12], meidän määritys osoitti myös, että merkittävästi korkeammat plasmapitoisuudet miR-21 GC potilailla. Huomasimme, että tasot miR-223 olivat merkitsevästi korkeammat GC plasmassa kuin verrokeilla, kun taas miR-218 oli huomattavasti pienempi. Yhdistetty ROC-analyysit paljastivat korkeimman AUC 0,9531 kanssa 84.29% herkkyys ja 92,86% spesifisyyttä suhde (miR-223 × miR-21) /miR-218 erotteleva GC kontrolleihin. Analysoimme myös plasman miR-223, miR-21, miR-218 GC potilailla eri kliininen tila (TNM-luokitus tai etäpesäke) ja suhde plasman kolmen miRNA ja Hp infektiotilanteesta aiheista.

Vaikka miR-223 on raportoitu lähes yksinomaan ilmaistaan ​​luuytimen [23], sen yliekspressio on havaittu monissa syöpätyypeissä, kuten ruokatorven syöpä [16], maksasyövän [24], ja GC [14], [15]. Äskettäin Xiaohua Li kertoi, että miR-223 oli vain yli-ilmentynyt metastaattisessa mahasyövässä soluja ja stimuloitiin ei-metastasoituneen mahalaukun syöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [25]. Miksi plasman miR-223 olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla alkuvaiheen GC? GC mikroympäristössä, monet kasvaimeen liittyvät solut, kuten makrofagit, myeloidisoluissa, dendriittisolujen ja T-solujen, on kyky vapauttaa eksosomeiksi, joka sukkula sekä mRNA: ta ja microRNA muiden solujen tai liikkeeseen [26]. Alkuvaiheen GC, miR-223 saattaa olla säädelty joissakin kasvaimeen liittyvien solujen ja joutuvan ääreisverenkierron kautta exosmes. Viimeaikaiset todisteet osoittivat, että miR-223 vapautuu makrofagien edestakaisin osaksi rintasyövän soluja ja säädellä invasiivisuus rintasyövän solujen [27]. On osoitettu, että palauttaminen miR-218 estää ROBO1 ilmaisun ja estää mahalaukun syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden

in vitro

ja

in vivo

[17]. Yli-ilmentymisen miR-218 johti merkittävästi vähentynyt solukasvuaktiivisuus ja solujen invaasion AGS soluja verrattiin valvonta [20]. Gao C et al [21] ilmoitetaan, että ekspressiotasot miR-218 vähenivät merkittävästi GC kudoksissa, in helikobakteeri-infektio mahalaukun limakalvon ja helikobakteeri-infektio AGS soluissa. Tutkimuksessamme plasman miR-218 eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä GC potilaalla on Hp infektio ja ilman välillä tai terveiden verrokkien kanssa Hp infektio ja ilman. Tasot miRNA saattavat olla erilaiset GC plasman ja mahan limakalvoa. MiR-21 yli-ilmentyy erilaisten syöpien, mukaan lukien rintasyövän [28], keuhkosyöpä [29], paksusuolen syöpä [30], ja GC [18], [19]. Vaikka Tsujiura ym [12] ilmoitti, että plasman miR-21 olivat merkittävästi koholla GC potilailla, sen tasot plasmassa GC potilaiden eri TNM stags ei ole tunnistettu.

Yhä useampi papereita raportoitu että kiertävä miRNA voivat toimia noninvasive biomarkkereita GC havaitsemiseen. Äskettäin Hanshao Liu kertoi, että seerumin miR-378 oli merkittävästi koholla GC potilaalla on TNM I, mikä viittaa siihen, että tämä miRNA allekirjoitus voi toimia uutena noninvasive biomarkkeri varhaiseen toteamiseen GC [31]. Mutta Hp tartuntatilanne GC potilaiden ja terveiden verrokkien ei mainittu. On hyvin tunnettua, että HP-infektio on yksi tärkeimmistä syistä GC, mukaan lukien mahalaukun adenokarsinooma, mahalaukun MALT-lymfooma. Jos plasman /seerumin erityisen kiertävän miRNA vasta väärin säädellystä GC potilailla, joilla Hp infektio mutta ei niitä ilman, miRNA voisi toimia biomarkkereita havaitsemista potilailla, joilla Hp infektio sijasta havaitsemiseen potilaiden GC.

tässä tutkimuksessa, vaikka olemme analysoineet plasmapitoisuudet miR-223, miR-21 ja miR-218 GC potilaille eri TNM vaiheissa määrä alkuvaiheen GC näytteiden oli vaatimatonta. Määrä plasman miRNA testattiin harjoitussarjassa oli rajallinen. Tulevaisuudessa tutkimuksen voimme saada enemmän määrä alkuvaiheen GC näytteiden arvioida roolia plasma miR-223, miR-21, miR-218 tai muu plasma miRNA liittyy GC varhaisen havaitsemisen GC.

varten etsivät tehokasta veripohjaisten biomarkkereita GC havaitsemiseen pidentämään eloonjäämistä potilailla, joilla on varhainen GC, monet tutkijat ovat keskittyneet verenkierrossa miRNA, joita on viime aikoina raportoitu toimivat tehokkaana ja ei-invasiivisia biomarkkereiden havaitsemiseksi erilaisten syöpien tai muiden sairauksien, [32] – [35]. Vaikka herkkyys ja kiertävän miRNA biomarkkereita GC havaitsemiseksi ovat paljon korkeammat kuin seerumin biomarkkerit (CA19-9 ja CEA) käytetään tällä hetkellä, se on pitkä tie ennen kiertävän miRNA kuin kliininen diagnoosi käytetään havaitsemiseksi GC , koska tasoja verenkierrossa miRNA voi olla huomattavasti suurempi tai pienempi eri sairauksia. Jatkotutkimuksissa verenkierrossa miRNA biomarkkerit voivat keskittyä yhdistämällä ilmentymisen profiilit kiertävän miRNA kaikista yleisistä sairauksista saada erityinen biomarkkereita ainutlaatuinen taudin havaitsemiseen. Vaikka Jianning Song [36] suositellaan miR-16 ja miR-93 sopivina viitteenä geenit seerumin miRNA analyysi GC potilaiden ja terveiden kontrollien otoskoko on vaatimaton. Normalisoituminen menetelmiä käytetään määrittämään pitoisuudet kiertävässä miRNA olisi yhdistettävä.

Yhteenvetona tunnistimme, että kolme plasma miRNA (miR-223, miR-21 ja miR-218) voi mahdollisesti olla uusi noninvasive biomarkkereita GC havaitsemiseen. Olipa miR-223 ja miR-21 on kyky havaita aikaisen vaiheen GC tunnistetaan tulevissa tutkimuksissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

validointi plasman miR-25 GC potilaiden ja terveiden verrokkien. Rasiakuvaajien n plasman miR-25 GC potilailla (GC, n = 70) ja terveillä verrokeilla (NC, n = 70). Viivat sisällä laatikot merkitsevät medians. Viikset of rasiakuvaajien: Min Max. Mitään merkittävää eroa ei havaittu GC potilaiden ja terveiden verrokkien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0041629.s001

(TIF) B Taulukko S1.

kypsä MikroRNA ja niiden yhteensovitettujen pohjamaali /koetin AB määritys tunnus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041629.s002

(DOCX) B Taulukko S2.

pitoisuusarvot neljän miRNA mitattu koehenkilöiden plasmasta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041629.s003

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitämme Yun Zhao teknistä tukea.