Krooninen sairaus

tiivistelmä

Soluväliai- (ECM) remodeling on keskeinen osa solujen vaeltamiseen ja kasvaimen etäpesäke, ja on liittynyt syövän etenemiseen. Tärkeydestä huolimatta matriisin remodeling, järjestelmällinen ja kvantitatiivisia tutkimuksia prosessista on suurelta osin puuttunut. Lisäksi on edelleen epäselvää, jos häirinnyt jännitteellistä homeostaasin ominaista maligniteetin johtuu aluksi muuttunut ECM ja kudosten ominaisuuksia tai muuttaminen kudokseen syöpäsoluja. Tutkia näitä kysymyksiä, olemme tutkineet matriisi remodeling kahdella eri eturauhassyövän solulinjoissa in kolmiulotteinen kollageenin järjestelmä. Yli viikon, me seurataan rakenteelliset muutokset geelejä vaihtelevien Kollageenipitoisuuden konfokaali piassa ja kvantitatiivinen kuva-analyysi, seuranta mittarit fibrilliselluloosan fraktion, huokoskoko, ja kuidun pituus ja halkaisija. Geelit, jotka ympättiin ilman soluja (kontrolli), LNCaP ja DU-145-solut verrattiin kvantitatiivisesti. Geelit, joilla on korkeampi Kollageenipitoisuuden oli aluksi pienempi huokoskoko ja suurempi fibrilli- jakeet, odotetusti. Kuitenkin ajan mittaan, LNCaP- ja DU-145-asutuilla matriisit osoittivat erilaisten rakenteellisten ominaisuudet verrattuna sekä toisiinsa ja kontrolliin geelit, jossa LNCaP näyttäessään suosia mikroympäristöihin pienemmillä kollageenin kuitua jakeet ja enemmän huokosia kuin DU-145-soluja. Me posit että DU-145-solut suosivat tiiviimpiä matriisien johtuu niiden korkeampi invasiivisuus ja proteolyyttisen valmiuksia. Matriksin proteaasien johti pienentyneeseen fibrilli- jakeet suuren pitoisuuden geelit ympätty joko solutyypistä, joka tukee hypoteesia. Meidän uusi kvantitatiivisia tuloksia koetin dynamiikkaa geelin remodeling kolmiulotteisesti ja viittaavat siihen, että syöpäsolujen uudistaa niiden ECM synergistisesti tavalla, joka riippuu sekä alkuperäisestä matriisiin ominaisuuksista sekä niiden invasiivisuus.

Citation: Harjanto D , Maffei JS, Zaman MH (2011) kvantitatiivinen analyysi vaikutus syövän invasiivisuus ja Kollageeni keskittyminen 3D Matrix Remodeling. PLoS ONE 6 (9): e24891. doi: 10,1371 /journal.pone.0024891

Editor: Mário A. Barbosa, Instituto de Engenharia Biomedica, Porton yliopisto, Portugali

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 23 elokuu 2011; Julkaistu: 27 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Harjanto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa tuki National Institutes of Health (1R01CA132633). DH tukee National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat syövät, mukaan lukien eturauhassyöpä, vasta kohtalokas kun syöpäsolut ovat metastasized kaukaisiin kohtiin [1]. Syöpäsolujen leviämiseen liittyy solujen kulkeutumista alkuperäisestä syöpäkasvain tyvikalvon läpi ja löysä sidekudoksen vereen tai imujärjestelmään. Kasvainsolut sitten ekstravasoitumaan peräisin verenkiertoelimistön löytää tiensä uusiin kudoksiin. Etäpesäkkeen muodostumisen aikana, solut ovat vuorovaikutuksessa soluväliaineen (ECM), joka on monimutkaisen verkoston glykosaminoglykaanien, adheesioproteiinien, ja rakenteelliset kuidut, kuten kollageeni. Monet ominaisuudet ECM, mukaan lukien matriisin rakenne [2], mekaniikka [3], ja ulotteisuus [4], on osoitettu vaikuttavan solun käyttäytymistä. Soluihin in vivo ovat yleensä ympäröi joka puolelta ECM, joka osoittaa kudosspesifisiä mekaaniset ja rakenteelliset ominaisuudet. Tämän vuoksi on tärkeää tutkia solujen viritettävissä kolmiulotteisia (3D) järjestelmiä, jotka paremmin matkivat fysiologisia olosuhteita kuin tasainen, erittäin jäykät pohjat.

kriittinen vaihe aikana in vivo solujen vaeltamiseen, invaasiota ja etäpesäkkeiden on matrix remodeling. Matrix proteolyysi on erityisen tärkeää solujen kylvetään 3D, koska ne ovat todennäköisemmin steerisesti estynyt liikkumasta kuin soluista tasomaiseen alustoille. Näin ollen on osoitettu, että estämällä matriksimetalloproteaaseja (MMP) vähentää solujen nopeuden ja pysyvyys 3D matriiseja, mutta ehkä ei muuta merkittävästi tuumorisolujen liikettä 2D alustoille [5], [6]. MMP ilme myös lisää usein aikana syövän etenemisen [7], mikä viittaa siihen, että kehittyneet kasvainsolujen aktiivisemmin uudistaa ECM helpottamiseksi etäpesäkkeitä. MMP-2 ja MMP-9 on tunnistettu tärkeiksi MMP mukana metastaattisen eturauhassyövän [8]. Solut voivat myös käyttää actomyosin koneita vetää matriisin yhdenmukaistaa kuituja [9] – [11].

Vaikka matriisi remodeling on tärkeä prosessi, harvat tutkimukset ovat yrittäneet tutkia sitä suoraan. Erityisen kiinnostavaa on ymmärtää, miten remodeling dynaamisesti muuttaa ECM rakenne. Työkalu, joka on käytetty tutkimaan ECM rakenne on konfokaali piassa (CRM). CRM kerää valoa, joka heijastuu ECM kuituja, mikä mahdollistaa 3D rakenteellinen jälleenrakentamiseen matriisin. Vaikka viimeaikainen työ osoittaa, että CRM on sokea Kuidut suuntaan valon, jolloin liian suureksi verkon silmäkoko [12], CRM on edelleen laajalti käytössä tekniikka, joka tarjoaa informatiivisia tietoja, jotka voivat muodostaa perustan vertailevia tutkimuksia. CRM on aiemmin käytetty tutkimaan kollageenin rakenne [13] – [16], fibrillo- [17], ja miten solut vuorovaikutuksessa ECM [18], [19]. Valitettavasti monet tutkimukset soluväliaineen vuorovaikutuksia ovat olleet melko laadullisia, ja niiden on vielä tarjota suoran vertailun solun invasiivisuus, alustava kollageenipitoisuudesta, ja /tai muutoksia rakenteessa ajan mittaan.

tässä artikkelissa pyrimme vastaamaan kaikkiin näihin kysymyksiin kvantitatiivisesti. Tutkimme miten matriisi rakenteellisia ominaisuuksia, kuten määrällisesti kuva-analyysin CRM datan, muuttuvat ajan myötä arvioida ECM remodeling eturauhassyövän solut 3D kollageenin geeli järjestelmä, pitoisuus vaihtelee kollageenin määrittää vaikutus alkuperäisen ECM rakenne ja mekaniikka . Remodeling käyttäytyminen kaksi eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP ja DU-145, verrataan. LNCaP-solut ovat suhteellisen hitaasti kasvava, androgeeni-herkkä solulinja, joka on johdettu metastaattinen vaurio luun [20]. DU-145-soluja nopeammin kasvavat, androgeeni-tunteeton, ja johdettu metastaattinen vaurio aivoihin [21]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että DU-145-solut ovat aktiivisesti invasiivisia kuin LNCaP-solujen [22] – [25]. Tämän työn pystymme saamaan määrällisiä tietoja siitä, miten kaksi eri kasvainsolulinjoissa vaihtelemalla invasiivisuuden uudistaa matriisissa 3D-ympäristöissä. Tuloksemme aikaan uudenlainen käsitys dynamiikan soluväliaineen vuorovaikutuksia matriisista näkökulmasta.

Tulokset

geelit vaihtelevia kollageenipitoisuudesta esittävät erilaisia ​​mekaanisia ja rakenteellisia ominaisuuksia

saada Vertailukohtana, 3D-geelit vaihtelevia kollageenin pitoisuus (2, 3, tai 4 mg /ml), joita ei ole ympätty soluilla (merkitty nimellä ”ei solu” tila) tutkittiin. Rheometry suoritettiin arvioimaan ensimmäisen jäykkyys geelejä. Kuten odotettua, liukukerroin lisääntynyt kollageenin pitoisuus, joka vaihtelee välillä noin 200 550 Pa 2-4 mg /ml geelit (kuvio 1A), jolloin saatiin tulokset, jotka ovat verrattavissa raportoitu muiden ryhmien käyttäen samanlaista geeliytymisen tekniikkaa [26].

(

) Leikkausmoduuli funktiona kollageenin pitoisuuden geelejä ilman soluja. Virhepylväät: keskihajonta. CRM kuvia geelejä ilman solujen (

B

) 2 mg /ml; (

C

) 3 mg /ml; ja (

D

) 4 mg /ml. (

E

) CFM ja CRM päällekkäin DU-145-solut (vihreä) 3 mg /ml kollageenia (valkoinen) 5 päivän aikana kylvö. Mittakaava CRM kuvia: 30 pm.

rakenneanalyysi, CRM kuvapinot hankittiin vaihteleva kollageenigeelien 1, 3, 5, ja 7 päivän kuluttua kylvö. Edustaja CRM kuvia kolmesta geelit esitetään kuviossa 1B-D. Tässä tutkimuksessa, rakenteelliset parametrit kiinnostavia ovat osa-alueen kollageenisäikeiden miehittää (jäljempänä ”fibrillien osa”), huokoskoko ja kuidun halkaisija ja pituus. Nämä parametrit valittiin seurattavia, fysiologisesti relevantti mittarit matriisin remodeling. Laadullisesti, on ilmeistä, että korkeampi konsentraatio kollageeni aiheuttaa geelejä, jotka ovat tiheämmin asuttuja kuituja, jolloin pienempi huokoskoko. Kvantitatiivinen kuva-analyysi vahvistavat nämä havainnot, sillä korkeampi fibrillien murto (kuva 2A) ja pienempi huokoskoko (kuvio 2B) nähdään suuremmilla kollageenipitoisuuksilla. Kaiken kaikkiaan ei ole merkittävää muutosta ajan kuluessa fibrillirakennetta tiheyden ja huokoskoko (kuva S1) varten geelejä kunkin yksittäisen kollageenipitoisuudesta, kuten voisi odottaa ilman matriisin remodeling.

(

) Fibrillin fraktio; ja (

B

) huokoskoko, viikon kuluttua kylvö. Solujen kylvetään geelit, dataa matkapuhelinverkon alueita esittelyyn.

LNCaP ja DU-145-solujen uudistaa matriisi erillisissä tapojen riippuvainen alkuperäisestä kollageenipitoisuudesta

geelit vaihtelevia kollageenin pitoisuus (2, 3, 4 mg /ml), sitten ympättiin fluoresoivasti värjätty eturauhasen syöpäsoluja. Visualisoida värjätään solut, konfokaali- fluoresenssimikroskopiaa (CFM) suoritettiin yhdessä CRM. Edustava kuva on esitetty kuviossa 1 E, jotka osoittavat, että syöpäsolut ovat selvästi kiinni 3D-verkosto kollageenin kuituja.

Kuten ohjaus geelit, solu-kylvetään geelejä kuvaamisen 1, 3, 5, ja 7 päivää pinnoitus antaa käsityksen dynamiikkaa matriisin remodeling. Ymmärtää määrin, että matriisi remodeling esiintyy maailmanlaajuisesti verrattuna välittömästi paikallisia soluihin, alueiden geelin, että tietyllä ajanhetkellä sisälsivät soluja (tunnistettu ”solu alueet”), sekä alueita, jotka eivät ole käytössä soluja (tunnistettu ”soluton alueet ”) oli kuvattu. Eri alueilla otettiin näytteet välillä ajankohtina, joten sitä ei voida päätellä, että tietty alue oli (tai ei) käytössä solujen aikana kokeen koska solut ovat liikkuvia. On kuitenkin mielenkiintoista huomata, että vaikka ohjaus geelit osoittavat erilaisten rakenteellisten ominaisuuksien verrattuna ympätty geelit, ei ole merkittävää eroa fibrillien murto ja huokoskoko päässä acellular ja solujen alueiden geelit ympätty LNCaP soluja 2 mg /ml kollageenia kertymisen (kuva 3). Tämä pätee sekä solulinjat ja kaikki geelin pitoisuudet tahansa tiettynä ajankohtana (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että matriisi remodeling esiintyy maailmanlaajuisesti, varsinkin kun matriisi ympätään suhteellisen korkea tiheys solujen, kuten tässä tapauksessa.

(

) Fibrillin fraktio; ja (

B

) huokoskoko, ajan mittaan. Cellular alueilla kylvetään geelit sisältävät soluja; soluton alueet eivät.

Kun LNCaP ja DU-145-soluja ympätään kollageenia, on selvä muutos fibrillien murto ja huokoskoko verrattuna ei soluun ehto (kuva 2). Yksi viikko ymppäyksen jälkeen, verrattuna kontrolliin geelit, sekä solulinjat osoittavat korkeampia kollageeni fibrillien pitoisuus 2 mg /ml geelit ja pienempiä huokosia. (Vertailutiedot muutoksen matriisin ominaisuuksien kylvetään geelit ajan voidaan nähdä kuviosta S2.) DU-145-solut näyttävät tallettaa huomattavasti enemmän kollageenia kuin LNCaP 2 mg /ml geelejä. Asteen kollageenin pitoisuus geelit, käyttäytymistä kahdessa solulinjassa poikkeaa enemmän. Kontrolliin verrattuna geelit, DU-145-solut eivät näytä merkittävästi muuta niiden ympäristössä, kun taas LNCaP-seeded 3 mg /ml ja 4 mg /ml geelit merkittävästi pienemmät fibrillien jakeet ja vastaavasti suurempia huokosia. Kuidun pituus ja halkaisija profiileja molemmissa solulinjoissa ovat hyvin verrattavissa siihen, mitä havaitaan ei solussa ehdon (kuvio 4). On syytä huomata, että 2 mg /ml geelit, lisää eroa näissä kuidun ominaisuuksien havaittiin kuin korkeammilla kollageenia tiheydet, jossa LNCaP-kylvetään geelit osoittavat hieman kapeampi, lyhyempi fibrillien. LNCaP-solut näyttävät suosivan ympäristöissä noin -20% kollageenia käyttöaste, kun taas DU-145-solut suosivat tiheämpi mikroympäristöihin kanssa fibrilli- täyttöaste ~25-30% kun fibrillirakennetta jakeet kaikkien kolmen kollageenipitoisuuksilla testattu näyttävät lähentyä noin näitä arvoja yli aikana kokeiluja.

Fiber halkaisijat (

) 2 mg /ml; (

C

) 3 mg /ml; ja (

E

) 4 mg /ml. Fiber pituudet (

B

) 2 mg /ml; (

D

) 3 mg /ml; ja (

F

) 4 mg /ml. Y-akseli osoittaa desimaalin osa kuitujen tietyn läpimitta tai pituus, kuten on asianlaita muiden kuitujen profiilin kuvaajat (katso myös kuva S1C-F).

LNCaP-solujen ja DU- 145-solut osoittavat eri proteolyyttinen aktiivisuus, ja estämällä tämän toiminnan muuttaa matriisin remodeling joka havaittiin

suoraan arvioida proteolyyttinen aktiivisuus ja invasiivisuus kahden eri solulinjojen suoremmin, geelitsymografiaa suoritettiin. Kuten odotettavissa aikaisemmista tutkimuksista [22] – [25], DU-145-solut näyttävät olevan paljon invasiivisia, jotka osoittavat korkeampaa proteolyysin aktiivisen MMP-2 ja aktiivisen MMP-9 kuin LNCaP-soluja (kuvio 5). Lisääntynyt invasiivisuus on DU-145 solut voivat selittää niiden toleranssi tiheämmin kollageenisäieverkosta mikroympäristöihin.

(

) Gelatiini Tsymogrammi; ja (

B

) määrällisesti tietojen kanssa pikselimäärä alueen proteolyyttisen aktiivisuuden geelillä normalisoidaan solutiheyden kokeessa käytetty. Virhe palkit kuvaavat keskivirhettä.

Voit testata tätä hypoteesia, laajakirjoinen MMP-estäjä, Marimastat, joka estää MMP-1, 2, 3, 7, 9, ja 12 [27 ], käytettiin hoitoon soluja ympättiin kollageenigeeleissä vaihtelevan pitoisuuden. Kun MMP-aktiivisuus inhiboitui sekä solulinjoissa, fibrillirakennetta fraktiot 4 mg /ml geelejä paljon pienempi kuin mitä nähtiin geelit ympättiin käsittelemättömien solujen (kuvio 6), jopa alittaa mitä nähtiin ohjaus geelit. Tämä tulos tukee hypoteesia, että lisääntynyt MMP toiminta voi sallia solujen jatkaa kasvuaan ja menestyä erittäin kuitu- mikroympäristöihin. Koska tällaisen toiminnan, solujen uudistaa matriisin paremmin majoittaa muutettu tarpeisiin.

Fibrillin jakeet solu- alueilta geelien mitataan 3 vuorokauden kuluttua kylvö geeleille ympätty (

) LNCaP solut; ja (

B

) DU-145-soluja.

Keskustelu

Matrix remodeling on keskeinen vaihe solumigraatioon, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Kvantitatiivinen ymmärtäminen miten kasvainsolujen eri vaiheissa taudin etenemiseen muuttamaan mikroympäristöihin on kriittinen kokonaisvaltainen käsitys taudin etenemisen ja terapeuttisen intervention. Tässä olemme tutkineet, miten matriisin rakenne kehittyy ajan myötä käyttäen kvantitatiivista CRM, tutkimalla 3D kollageenimatriiseihin vaihtelevan pitoisuuden ympätään kahta eturauhassyöpäsolulinjoissa vaihtelevan invasiivisuus.

Huomasimme, että kollageenigeelien ilman soluilla on suurempi leikkausmodulisuutta ja näytteillä pienempi huokoskoko ja suurempi fibrilli- jae yhä kollageenipitoisuudesta odotetusti. Fibrillirakennetta jae ja huokoskoko näiden valvonnan geelien ei muuttunut merkittävästi ajan myötä. Olemme myös pystyivät osoittamaan, että LNCaP ja DU-145-soluja aktiivisesti remontin ympäristöään. Viikon kuluttua, molemmat solutyypit lisäsi fibrillin osa ja vähentää huokoskoko 2 mg /ml geelit kontrolliin verrattuna. Samaan aikaan, 4 mg /ml geelit, solujen muunnettu matriisit vähentää fibrillien osa ja lisätä huokoskoko. Havaitut rakenteelliset muutokset olivat havaittavissa yli aikataulusta useita päiviä ja havaittiin esiintyvän suhteellisen tasaisesti koko matriiseja, koska ei ollut eroa acellular ja solutason alueet LNCaP- tai DU-145-kylvetään geelejä.

se oli myös osoittanut, että LNCaP ja DU-145-solujen uudistaa matriisin eri tavalla, mikä tarkoittaa, että eri solutyyppejä suosivat erilaisia ​​mikroympäristöihin ja uudistaa niitä vastaavasti vastaamaan heidän tarpeisiinsa. Keskimäärin LNCaP näyttivät suosivan pienempi kollageenin pitoisuus ja suurempi huokoskoko kuin DU-145-soluja. 2 mg /ml kollageenigeelien ympätty LNCaP näyttää lyhyempi, kapeampi kuidut keskimäärin kuin niiden ohjaus ja DU-145 kollegansa. Korkeammilla pitoisuuksilla, kuitu profiileja kunkin kollageenipitoisuudesta kolmen olosuhteissa (kontrolli, LNCaP ja DU-145) olivat vähemmän erotettavissa, mikä viittaa siihen, että se on organisaatio matriisin sijasta rakenteen yksittäisten kollageenisäikeitä ovat itse eri eri geelin olosuhteissa.

voimistunut matriisi remodeling on keskeinen piirre kasvaimia. Remodeling sisältää laskeuma uusia ECM, hajoamista nykyisten matriisin komponenttien ja kuitu linjaus. Laskeuma uusia ECM ei voida odottaa kasvaimen mikroympäristöihin kuin voisi olettaa, että solut 3D matriiseja mieluummin käsitellä vähemmän steric esteitä hyökkäystä. Kuitenkin väli sijaan hyvin alhainen ECM ligandipitoisuuksia on osoitettu olevan optimaalinen solujen liikkumisen vuoksi tarvetta tasapainottaa pitoa ja adheesiovoimat [28]. Histologinen tutkimukset ovat osoittaneet, että pahanlaatuinen kudosten osoittavat myös lisääntynyt kollageenin kerrostumista [29]. Äskettäin on osoitettu, että kohdunkaulan syöpä solulinjoja, kuten LNCaP-solut, tuottavat tyypin I kollageeni, joka on vastustuskykyinen MMP-heikkenemisen ja helpottaa proliferaatio ja migraatio [30]. Kun 2 mg /ml kollageenia geelit erityisesti silloin, ECM laskeuma voi olla tärkeää solujen adheesiota ja liikkeen, selitetään lisääntynyt kollageenin pitoisuus havaittiin solujen läsnäolon.

Käänteisesti, kun syövän solut kohtaavat tiheä verkkojen ECM kuten tyvikalvon, lisääntynyt matriisi proteolyysi ja kuitu linjaus tulee kriittinen solujen liikkumista. Eturauhassyöpä koepaloja esiintyy enemmän MMP tasolla kuin normaaleissa kudoksissa [29]. On mahdollista, että DU-145-solut eivät uudistaa melko tiheä 3 ja 4 mg /ml kollageenia matriiseja niin suuressa määrin kuin LNCaP-solut, koska DU-145-solut ovat invasiivisia [22] – [24] ja ilmaista korkeampi MMP: iden, kuten MT1-MMP [23], ja ovat näin ollen enemmän kykenee liikkumaan läpi tällaisen tiheän ympäristöissä. LNCaP-solut täytyy järjestää matriisiin valikoivasti hajottavien tai kohdistaa kuituihin käyttämällä actomyosin koneita saavuttaa suurempia huokosten kokoja. Koska kollageeni voi sen lisäksi, että este muuttoliikettä, helpottaa invaasion ja leviämisen [30], DU-145, koska sitä enemmän invasiivisia solulinja, soveltuu paremmin entistä raskaasti kuitu- geeliä.

Kun MMP olivat esti molemmissa solulinjoissa, huomaamme, että solut suosivat tiheämpi matriisien samanaikainen vähennettävä, kuten fibrillirakennetta jakeiden 4 mg /ml geelit ympätty Marimastat käsiteltyjä soluja oli paljon alhaisempi kuin geelit siirrostettu käsittelemättömät solut. Lasku oli erityisen dramaattinen geelit ympätty DU-145-soluissa, sitä enemmän invasiivisia solulinjassa. Tämä viittaa siihen, että aktiivinen MMP ovat merkittävä tekijä määriteltäessä miten solut remontoida matriisi, ja että lisääntynyt MMP toiminta ei saa johtaa pelkästään alentunut ECM sisältöä kuin voisi odottaa. Pikemminkin, meidän tiedot osoittavat, että MMP: t voivat itse asiassa johtaa enemmän kuitu- mikroympäristöihin. Tämä viittaa siihen, että MMP: t voivat vaikuttaa matriisin remontin kautta vaihtoehtoisia väyliä lisäksi vain hajottavia matriisin. Itse asiassa MMP ovat sekaantuneet geeli supistuminen [31], jossa MMP inhibition seurauksena vähentää kollageenin geelin supistuminen [32]. Lisäksi on osoitettu, että MMP esto johtaa laski kollageenisynteesiä [33], [34], mikä voi myös selittää vähentämiseen fibrillien jakeet nähty meidän Marimastat Hoitokokeissa.

etusija käsittelemättömän DU-145 solujen enemmän kollageenia-rikas ympäristöissä on myös yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että kudokset jäykistää aikana syövän etenemisen [35], [36]. Tässä tutkimuksessa ilmeni, että kollageenin pitoisuus korreloi hyvin leikkausmodulisuutta. Siksi merkille, että DU-145-modifioitu ympäristöissä, mikä osoitti korkeampi keskimääräinen fibrillien jakeet, ovat jäykempiä keskimäärin kuin LNCaP-modifioitu matriisit. On kuitenkin yhä epäselvää, lisääntynyt jäykkyys on syy syövän kehityksen tai on sen sijaan vaikutusta syövän etenemisen. Tuloksemme tässä osoittaa kohti jälkimmäistä. Tämä työ tukee vallitsevan teorian häiriön jännitteellistä homeostaasin merkittävänä ominaisuus pahanlaatuisten fenotyypin [35], [37]. On syytä huomauttaa kuitenkin, että tutkimuksessamme, vertasimme remontin vaikutuksia vain kahden eri solulinjoissa. Paljon työtä vertaamalla remontin vaikutuksia laaja kirjo syövän solulinjoissa on välttämätöntä pystyä tekemään yleisesti, että korkeasti invasiivisia syöpiä mieluummin suurempi tiheys mikroympäristöihin. Olisi myös mielenkiintoista nähdä, jos ja miten ei-syöpäsolujen (eli kantasoluja tai fibroblastien kudosteknologisiin) osoittavat eri remontin aktiivisuutta.

Kaiken tuloksemme aikaan uudenlainen määrällisen kuvan matriisi remodeling evoluution ja dynamiikka ja tarjoavat suoran vertailun matriisin remodeling kahdesta eri eturauhassyövän solulinjoissa. Toivomme, että tulokset johtavat uusiin riviä tutkimuksen dynamiikkaa matriisin remontin ja tulevaisuuden kokeilut jatkuvat vertailla sekä miten rakenne- ja mekaaniset ominaisuudet solu-ympätty kollageenigeelien kehittyy ajan käyttäen syöpä- ja ei-syöpä solutyyppejä. Tällainen tutkinta saadaan tarkempia ja kipeästi tietoa ymmärtämiseen, hallintaan ja torjumiseen etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kaksi eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP ja DU-145 (molemmat ATCC, Manassas, VA), tutkittiin. LNCaP-soluja viljeltiin RPMI-1640-median ja DU-145-soluja viljeltiin F12K media. Molemmat media oli täydennetty 10% v /v naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% tilavuus /tilavuus penisilliini-streptomysiiniä (10000 IU /ml penisilliiniä, 10000 ug /ml streptomysiiniä) (kaikki soluviljelyreagenssit ATCC: ltä). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa inkubaattorissa. Solut värjättiin 5 pm CellTracker ™ Orange CMRA (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden soluja suspensiossa ennen kollageenin kylvö. Kun ympätty kollageenia, soluja pidettiin antibioottivapaa alusta täydennettynä 10% FBS.

valmistaminen kollageenigeelien

Solut suspendoitiin 3D tyypin I kollageenin (BD Biosciences, San Jose, CA) lopulliseen tiheyteen 200000 solua /ml. Geelien soluja, kollageenimatriksin liuos koostui LNCaP tai DU-145-solut suspendoidaan sopivaan johon oli lisätty 10% v /v FBS, ja yhtä suuri tilavuus kollageenin ja neutraloivat liuosta (100 mM HEPES-puskuria (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) 2 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,3), kuten aiemmin on kuvattu [38]. Geelit ilman soluja valmistettiin samalla tavalla, paitsi että solususpension tilavuus korvattiin media. Lopullinen kollageenipitoisuus oli vaihteli 2, 3, ja 4 mg /ml. Kokonaismäärä kutakin geeliä liuoksessa oli 1 ml. Matriisi Liuoksen annettiin geeli 35 mm: n lasi-bottom astia (MatTek, Ashland, MA) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa inkubaattorissa 2 tunnin ajan ennen 2 ml 10% v /v FBS -supplemented media lisättiin. Media korvattiin joka toinen tai kolmas päivä. Geelit valmistettiin kolmena rinnakkaisena kullekin tilalle.

rheometry

mekaaniset ominaisuudet geelien vaihtelevia kollageenin pitoisuus (2, 3, 4 mg /ml) arvioitiin käyttämällä rheometry. Lyhyesti, kollageeni ratkaisuja ilman soluja (koostumus kuten aiemmin on kuvattu) on geeliytynyt suoraan reometrillä (TA Instruments AR2000 Rheometer) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Välittömästi sen jälkeen geeliytymistä, mittaukset tehtiin käyttäen kartion muotoinen geometria, värähtelevän 0,1-10 Hz vääntömomentti 0,1 μN * m. Kolme näytettä kutakin kunnossa mitattiin. Tehon laki kunnossa sovellettiin tietojen saamiseksi arvo varastoidaan pakkaamattomana ja kimmokerroin 10 Hz.

Konfokaalimikroskopia

arvioimiseksi mikrorakenne geelien, CRM suoritettiin käyttäen skannauksen -konfokaalimikroskoopilla (Olympus FV1000), jossa on 60 x 1,2 NA vesiupotukseen linssi. Kollageeni pinnoitettu lasi-bottom astiat olivat innoissaan matalan intensiteetin 488 nm laser ja kevyt välillä 485-495 nm valoa kerättiin. Kuvat otettiin vähintään 100 um geeliin välttää reunaan vaikutuksia. Valvontaa varten geelejä, joita ei ole ympätty soluja, kolme 30 um pinot 0,5 um: n paksuisiksi viipaleiksi saatiin satunnaisesti valituilla alueilla geelissä 1, 3, 5, ja 7 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus. Kunakin ajankohtana kunkin geeli, joka ympättiin soluilla kolme pinoa tehtiin alueilla, jotka sisältävät soluja ja kolme pinot tehtiin alueilla, jotka eivät sisällä soluja (ts ei ollut soluja 10 um yläpuolella, alapuolella tai sivusuunnassa). Alueet kanssa ja ilman solut tunnistettiin suorittamalla konfokaali- fluoresenssimikroskopialla (CFM) samanaikaisesti CRM. CFM, joka on 543 nm laseria käytettiin asetukset eksitaatio /emissio spektrit Alexa Fluor 546 solun alueilla, CFM kuva solujen saatiin rinnakkain CRM kuvan kollageenin rakenteen. Samat mikroskooppi asetuksia käytettiin kunkin hankintaan, jotta tulokset olivat vertailukelpoisia.

Kuva-analyysi

Raaka CRM analysoitiin saamiseksi kollageenin rakenteellisia parametreja. Samat käsittely asetuksia käytettiin kuvasta toiseen johdonmukaisuuden varmistamiseksi. Fibrillien osa ja huokoskoko saatiin ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Lyhyesti, 2D-kuvia kustakin pinosta oli binarized, kollageeni kuidut merkitty mustalla pikseliä. Binaarisoidussa kuvia käytettiin sitten laskettaessa osa käytössä kollageeni, joka on samanlainen, mitä on aiemmin raportoitu [39]. Huokoskoko mitattiin piirtämällä kolme riviä (vaaka-, pysty- ja diagonaalinen välttäen soluihin, kun he olivat läsnä) poikki binaarisoidun kuvan keskellä kunkin pinon, ja käyttämällä tontin profiilin toiminto ImageJ. Skripti oli kirjoitettu Matlab (MathWorks, Natick, MA) ja laskea etäisyys kollageenin kuituja tästä profiilitietoja. Tämä taas on samanlainen kuin mitä on tehty ennen [40].

Fiber halkaisija ja pituus määritettiin käyttäen Imaris (Bitplane, St. Paul, MN). Karhea pinta maski oli alun perin valmistettu raaka CRM tiedot, joista sileä pinta luotiin. Esineet luotu tuloksena sileä pinta kukin edustaa kollageenin fibril ja tilastoja säde ja puoli pituus kunkin fibrillien olivat lähdön.

Quantitative gelatiinitsymografialla

gelatiinitsymografialla käytettiin vertaamaan MMP toimintaa solujen välillä linjat. Sekä LNCaP ja DU-145-solut maljattiin ja kasvatettiin lähes konfluenssiin ennen inkubointia seerumittomassa alustassa 24 tuntia. Media uutettiin viljelmistä, ja konsentroidaan ultrasentrifugointi 30 min (10 kDa sulku). Näytteet sekoitettiin sitten Laemmli-latauspuskuriin ilman pelkistintä ja altistettiin gelatiinitsymografialla kuten aikaisemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, näytteet ladattiin polyakryyliamidigeelillä kopolymeroitu jossa oli 0,1% gelatiinia, ja suoritettiin elektroforeesi. Geelit siirrettiin sitten vesiliuosta, joka sisälsi 2,5% Triton-X100 ja renaturoida proteiineja, jonka jälkeen tasapainotuspuskurilla kehittyvässä puskurissa (50 mM Tris, pH 7,8, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl

2, 0,02% Brij- 35) ja sen jälkeen inkuboimalla 37 ° C: ssa 20 tunnin ajan. Geelit lopulta värjättiin ja väri poistettiin Coomassie-sinisellä. Värin poistamisen jälkeen geelejä kuivattiin yön yli käyttäen geelin kuivaus kit (Promega, Madison, WI). Alueet proteolyyttisen aktiivisuuden ilmaistaan ​​selvä bändejä vasten värjätään taustaa. Gel kuvat prosessoitiin ImageJ ja kynnysarvo hankkia sopiva pikselien arvot sekä MMP-2 ja MMP-9 seurannut normalisointia alkuperäisen solun pitoisuuksia. Koe suoritettiin kolmena kappaleena.

MMP Inhibitiotutkimuksissa

Solut ympättiin geelejä vaihtelevien kollageenin sisällön (2, 3, ja 4 mg /ml) 12 hyvin lasi-pohjalevyt ( MatTek). Kokonaismäärä kunkin näistä pienemmistä geelien oli 0,5 ml. Kukin geeli käsiteltiin 50pM Marimastat (Tocris, Ellisville, MO) 1 ml: ssa 10% FBS-täydennetty media 2 tunnin kuluttua ensimmäisestä gelation ja ne on sijoitettu inkubaattoriin. Sen jälkeen elatusaine korvattiin 100 uM Marimastat 10% FBS-täydennettyä elatusainetta 24 tunnin välein. Geelit valmistettiin kolmena kappaleena. CFM ja CRM suoritettiin 1 ja 3 päivää ymppäyksen jälkeen. Kuvankäsittely suoritettiin aiemmin kuvatulla.

Tilastollinen

Koska yksikään CRM rakenteellisten tietojen seurasi normaalijakaumat arvioimana QQ tontteja, 95% luottamusvälit konstruoitiin käyttäen bootstrap vähintään 5000 simulaatioita. Bias-korjattu, nopeutettu algoritmia käytettiin. Analyysi suoritettiin Matlab. Virhe palkit kaikki graafit ovat 95%: n luottamusväli, ellei toisin mainita.

tukeminen Information

Kuva S1.

Rakenteelliset parametrit geelejä ilman soluja. (

) Fibrillin jae ja (

B

) huokoskoko ajan kaikissa kolmessa geeliä pitoisuuksia. (

C

) Fiber halkaisijat ja (

D

) kuitujen pituudet 2 mg /ml kollageenia ajan. (

E

) Fiber halkaisijat ja (

F

) kuitujen pituudet päivänä 7 kaikille geelin pitoisuuksilla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0024891.s001

(TIF )

Kuva S2.

Rakenteelliset parametrit solun alueille DU-145-solut ja LNCaP verrattuna ei solun kunnossa ajan mittaan. Fibrillien kelpaavan (

) 2 mg /ml; (

C

) 3 mg /ml; ja (

E

) 4 mg /ml. Huokosten (

B

) 2 mg /ml; (

D

) 3 mg /ml; ja (

F

) 4 mg /ml.

doi: 10,1371 /journal.pone.0024891.s002

(TIF) B

Kiitokset

Kirjoittajat haluaisi tunnustaa apua Phil Allen, FT, mikroskopiaan asiantuntemusta, ja Kaethe Beck, jossa kehitystä Imaris kuvankäsittelyn rutiinia. Olemme myös kiitollisia jäsenet ovat laboratoriossa oivaltavia kommentteja ja ehdotuksia koko tämän tutkimuksen.