Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muuta geenien ilmentyminen liittyy haimasyöpä voisi johtua vaihtelu histoni posttranslational muutoksia, jotka johtavat myöhemmin remontin kromatiinin mallin transkription aikana. Kuitenkin yhdistetyn verkon molekyylien mukana säätelyssä tällaisissa prosesseissa on edelleen heikko. hPaf1 /PD2, alayksikkö ihmisen PAF-kompleksi, osallistuvat säätelyyn transkription pidentymisen on onkogeeninen. Tutkimuksemme tutkii mahdollisuutta, että sääntely histoni metylaation hPaf1 voi edistää muutosta geeniekspressiota nukleosomaalisten uudelleenjärjestelyn. Tässä osoitamme, että pudotus on hPaf1 /PD2 johtaa vähentyneeseen di- ja tri-metylaation histoni H3 lysiinin 4 tähteet haiman syöpäsoluissa. Mielenkiintoista, hPaf1 /PD2 colocalizes kanssa MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1), histoni metyylitransferaasin joka metyloi H3K4 jäämiä. Myös väheneminen hPaf1 tasolla vähensivät MLL1 ilmaisun ja vastaavan vähennyksen taso CHD1 (Chromohelicase DNA-sitovan proteiinin 1), ATPaasi riippuvainen chromatin remodeling entsyymi, joka sitoutuu spesifisesti H3K4 di ja trimetyyli markkaa. hPaf1 /PD2 havaittiin myös vuorovaikutuksessa ja colocalize kanssa CHD1 sekä sytoplasman ja tumaekstrakteilla haiman syöpäsoluja. Edelleen, alentunutta CHD1 sijoittuu tumaan in hPaf1 /PD2 Knockdown soluja voitaisiin pelastaa ektooppinen ilmentyminen hPaf1 /PD2. Micrococcal nukleaasidigestion osoitti muuttuneessa kromatiinirakenteeseen in hPaf1 /PD2-KD soluissa. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että hPaf1 /PD2 yhdessä MLL1 säätelee metyloinnin H3K4 jäämiä, sekä toimii vuorovaikutuksessa ja säätelee ydinvoiman sukkuloimisen chromatin remodeling proteiinin CHD1, helpottamaan sen toiminta haiman syöpäsoluja.

Citation: Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Human RNA Polymerase II-yhdistys Factor 1 (hPaf1 /PD2) Säätelee Histone metylointi ja Kromatiini Remodeling in Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10,1371 /journal.pone.0026926

Editor: Mary Bryk, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 syyskuu 2011; Hyväksytty: 05 lokakuu 2011; Julkaistu: 27 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Dey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tätä työtä tuetaan avustuksilla National Institutes of Health (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 ja CA131944) ja Department of Defense (BC073541). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Posttranslationaalinen muunnoksia perus- histoniproteiineista, kuten fosforylaatio, metylaatio, asetylaatio, ubiquitylation tai sumoylation, on tärkeä rooli säätelyssä geenin ilmentymisen. Yksi tapa, jolla tällaiset histonimodifikaation toiminto tapahtuu rekrytointi alavirtavaikuttajainhibiittorit proteiineja, jotka suorittavat tiettyjä itsenäisiä toimintoja chromatin malliin. Näitä ovat kromatiinin remodeling proteiineja, jotka ”lukea” modifioitu histonimerkkien ja käyttää ATP energiaa asento muuttuu nukleosomien DNA. Tämän seurauksena kromatiinin malli on joko tukossa tai saatava tutustua transkriptio koneita, joten säätelevät alavirtaan geenin ilmentymistä. Histone metylaatio, erityisesti histoni H3 lysiinin 4 jäännös mono-, di- ja trimethylation, on useimmiten liittyy 5 ’alueiden aktiivisesti puhtaaksi geenien [1]. Kuitenkin tuore tutkimus osoittaa, että alueilla DNA-vaurioita, ING proteiinit rekrytoida HDAC-kompleksien hiljentää transkriptio soluproliferaation geenien kautta tunnustetaan trimetyloidaan H3K4 jäämiä niiden PHD verkkotunnuksia [2]. Tämä on ensimmäinen raportti yhdistää K4 trimethylation aktiivisesti tukahdutettu geenejä samoin.

Nisäkkäillä metylaation H3K4 jäännös suorittaa histoni metyylitransferaasi MLL1, SET verkkotunnuksen sisältävän proteiinia, joka jää monimutkainen muut alayksikköproteiineja WDR5, RbBP5 ja ASH2 [3]. Hiiva homologi MLL1, Set1, on osa makromolekyylikompleksi kutsutaan COMPASS (kompleksi liittyvien proteiinien Set1), joka on vuorovaikutuksessa hiivan PAF monimutkainen histoni metylaation [4]. On väitetty, että jotkut konservoitunut geenejä, Drosophila ihmiseen, pitää tämä metylaatio merkki yksinomaan ja näiden geenien ilmentymistä säätelee Pol II yleinen venymään tekijät [1]. H3K4 histoni metylointi tavaramerkit voidaan edelleen tunnustettava erityisiä proteiineja, jolloin rekrytointi ja myöhemmin entsymaattiset tai fysiologisen aktiviteetin paikalle rekrytointi. CHD1 (Chromodomain helikaasin DNA: ta sitova proteiini 1) on proteiini, joka kuuluu perheeseen ATPaasi riippuvainen kromatiinin remodeling tekijöitä nimenomaan yhdistävät dimetyloidut ja trimetyloidaan H3K4 [5], [6]. Ihmisen CHD1 sitoutuu metyloitu histoni H3K4 jäännös kautta sekä sen tandem chromodomains, kun taas hiiva Chd1 ei sitoa metyloidut H3K4 jäämiä [7].

Cancer kehittymistä ja etenemistä johtuu säädeltyyn geenin ilmentymisen jotka voivat usein korreloivat joko viallinen epigeneettiset aktivointia tai vaiennettu geeni [8]. Altered histonimodifikaation kaavoja aiheuttaa mistargeting kromatiinin remodeling entsyymejä, jotka saattavat johtaa hallitsemattomaan geenin ilmentymisen ja siten aiheuttaa normaalien solujen muuntamiseksi syöpäsoluja. Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän erittäin huonon ennusteen ja viisi vuoden pysyvyys on alle 5%. Kuten muuta maligniteetin, haimasyöpä myös korreloi epigeneettisiä muutoksia, kuten DNA: n metylaation ja histonimodifikaation, mikä johtaa muunnetun geenin ilmentymisen [9].

PD2 on ihmisen homologi hiivan RNA-polymeraasin II liittyvä tekijä 1 (yPaf1), joka muodostaa ytimen alayksikön ihmisen RNA-polymeraasi II liittyvän tekijän (hPAF) kompleksi. Samanlainen kuin sen hiivan vastine, hPAF kompleksi koostuu neljästä muiden alayksiköiden, eli hLeo1, hCtr9, hSki8 ja parafibromin [10] – [12]. Tärkeimmät toiminnot hPAF kompleksi liittyy transkription venymä, mRNA: n prosessointi ja kypsyminen, samanlainen kuin hiivan PAF monimutkainen [12]. Kromatiinin muutoksia ja remodeling ovat myös joitakin ominaisuuksia transkriptiotekijöiden. Ilmeisesti joukko histonimodifikaation on liitetty PAF monimutkaisia ​​ja transkriptio pidentymistä sekä [4], [13]. Sekä hiivan ja ihmisen PAF kompleksin on todettu olevan välttämättömiä Rad6 /Bre1 riippuvainen ubiquitylation histoni H2B [14]. Monoubiquitylation of H2B jonka hPAF poistaa nukleosomaalisten este, joka on edellytys tehokkaalle transkriptio venyminen chromatin RNA Pol II [14]. Läsnäolo ubiquitylated H2B edelleen laukaisee H3K4 di ja tri-metylaatio. Hiivassa Paf1C toiminto H3K4-Me 3 muodostus Siirretään jonka RTF1 alayksikköä rekrytoimalla SET1 histoni metyylitransferaasi monimutkaisia ​​[15], joka on homologinen ihmisen MLL monimutkainen [16]. Hiiva tutkimukset osoittavat myös, että Paf1 monimutkainen tarvitaan rekrytointi COMPASS metyylitransferaasi monimutkainen RNA-polymeraasi II kautta alayksikköä vuorovaikutuksen. Ihmissoluissa, hCdc73 näyttää olevan vaaditaan täyden tasot H3K36-Me3 [17], mutta ei H3K4-Me3, kun taas hiivan Cdc73 vaaditaan sekä muutokset [18]. Siksi rooli PAF monimutkainen transkriptio venymä on ollut tiiviisti korreloi histonimodifikaation.

lisäksi sen rooli transkription säätelyyn, ihmisen PAF monimutkainen alayksikköä myös yhdistetty pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Parafibromin (hCdc73) on havaittu olevan mutatoitunut lisäkilpirauhasen kasvaimia ja monistettiin maksan ja rintasyöpä. Leo1, läsnä 15q21-lokuksen, monistetaan peräsuolen syövän ja pahanlaatuisten kuitu- histiosytoomaa luun, kun taas

Ctr9

geenilokuksesta havaitaan poistettava haimasyöpä. HPaf1 alayksikkö ihmisen PAF monimutkainen, joka tunnetaan myös nimellä PD2, vahvistetaan ja yli-ilmennetään haimasyövän ja sen mahdollinen rooli tuumorigeneesissä on merkitty induktio transformoidun fenotyypin yliekspressio [19]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaa roolin hPaf1 /PD2 säätelyssä histoni metylaatio klo H3K4 jäännös haimasyöpäsoluissa vuorovaikutuksellaan histoni metyylitransferaasi MLL1. Todettiin myös säätelemään kromatiinin remontin tekijä, CHD1 joka sitoutuu spesifisesti di ja trimetyloidaan H3K4 ja helpottaa sen ydin- tuonti todennäköisesti suoraan vuorovaikutusta. Edelleen micrococcal nukleaasidigestion määritykset osoittavat, että knockdovvn PD2 johtaa muuttuneisiin nukleosomaalisten paikannuksen haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa Panc1 ja MiaPaca saatiin ATCC. Solut kulttuuri DMEM (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Sigma) ja 1% penisilliiniä-streptomysiiniä liuosta (Sigma). Viljelyväliaine vaihdettiin joka 2. päivä ja soluja aliviljeltiin trypsiinillä-EDTA hoitoon.

RNA: n eristäminen ja QRT-PCR

Yhteensä RNA uutettiin Panc1 soluista käyttämällä RNAeasy (Qiagen) ja käsitellään käänteisen transkription. Ensimmäinen PCR aktivointi vaihe oli 94 ° C: ssa neljän minuutin ajan, jonka jälkeen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa yhden minuutin ajan, alukkeen pariutumisvaiheen 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, pidennys 72 ° C ° C: ssa yhden minuutin ajan, ja lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa kymmenen minuuttia. PCR-reaktion tuotteet erotettiin sitten elektroforeesilla käyttämällä 2% agaroosigeelillä. Geelit värjättiin käyttäen 0,5 ug /ml etidiumbromidia, valaistu UV-valolla. Yhteensä solu-RNA: ta käänteistranskriboitiin ja määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä SYBR Green sisällyttämistä. Ilmaisu Kaikkien geenien normalisoitiin että sisäisen valvonnan β-aktiini ja ilmaistu suhteessa osoitettuun Vertailunäytteen (keskiarvo ± S.D. kolmoisnäytteiden reaktiot). Ilmaukset linjaa spesifisten geenien verrattiin välillä salattu ja PD2 pudotus Panc1 soluissa kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

RNA Häiriöitä

Alueella Paf1 /PD2 kohdennettiin erityisiä siRNA (sekvenssi 5’AACAGGUUCGUCCAGUACAAA-3) ’. Synteettiset sense- ja antisense-oligonukleotideja (Dharmacon, Lafayette, CO) liitettiin 100 mM kaliumasetaattia, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4), ja 2 mM magnesiumasetaattia yhden minuutin ajan 90 ° C: ssa ja yksi tunti 37 ° C: ssa, ja jäädytetty. Oligonukleotidit transfektoitiin soluihin

Trans

IT-TKO (Mirus, Madison, WI) mukaisesti toimittajan suositusten.

immunoblottaustesti

Panc1 ja MiaPaca solulinjoja jalostettu proteiinin uuttamalla ja Western blottaus käyttämällä standardimenetelmiä. Lyhyesti, solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja hajotettiin RIPA-puskuria (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40: tä, pH 8,0), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (1 mM fenyyli-metyyli sulfonyyli fluoridi, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä) ja pidettiin 4 ° C: ssa ja supernatantit kerättiin. Kaksikymmentä ug proteiinia lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE. Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF kalvo. Kun nopea pesu PBST (fosfaattipuskuroitu suolaliuos ja 0,1% Tween 20), kalvot estettiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssa vähintään 2 tuntia, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden (anti-Paf1 /PD2, anti-Leo1, anti-Cdc, anti-Ski8, anti- Oct3 /4, anti-Sox2, anti-β-aktiini) (laimennettu 3% BSA PBS: ssä) yli yön 4 ° C: ssa. Membraani pestiin sitten (3 x 10 min) PBST huoneenlämpötilassa ja tutkittiin 1:2000 laimennettiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani-vasta-aineita 1 tunti huoneenlämpötilassa ja pestiin 5 x 10 min PBST . Signaali havaittiin ECL chemiluminescence Kit (Amersham Bioscience, UK). Kaikki western blotit mittaamaan ChemiImager 4400 ohjelmisto. Käyrät syntyy Show virhepylväät edustavat keskivirheet laskettuna kolmesta itsenäisestä kokeellista rinnakkaista. Ero kullakin proteiinin tason välillä salattu ja PD2 knockdown solut analysoidaan Studentin t-testi p-arvo on alle 0,05 harkitaan tilastollisesti merkitsevä.

konfokaalimikroskopia

Solut päälle steriili pyöreä peitinlaseja (CIR 18-1 Fisher tuotemerkki 12-545-10) ja kasvatettiin 12-kuoppalevyillä 24 tuntia. Solut kiinnitettiin jääkylmässä metanoli (pre-jäähdytetty -20 ° C) ja tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä. Sitten solut pestiin PBS: ssä ja blokattiin käyttämällä 10% vuohen seerumi 30 min. Blokkauksen jälkeen, sitä inkuboitiin primääristen (PD2 hiiren monoklonaalinen, CHD1 kanin polyklonaalisia) vasta-aineiden yksi tunti ja fluoresoiva tagged sekundaarisia vasta-aineita (FITC vuohen anti-hiiri, Texas-punainen vuohen anti-kani) 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Vasta-aineet laimennettiin 5% vuohen seerumia. Lopuksi seuraava sekundaarinen vasta-inkuboinnin jälkeen solut pestiin TBST: llä kolme kertaa ja Pääliliuskat asennettu Vectashieldissä sisältävien DAPI (VECTOR).

eristäminen soluliman ja tumauutetta

Protokolla sytoplasman ja tumauutteesta valmistelu sovitettiin aiemmin julkaistuja menetelmiä. Solut huuhdeltiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja inkuboitiin jään päällä 30 minuuttia hypotoniseen sytoplasman uuttopuskuria (10 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM KCI, 0,2% NP-40, 0,1 mM EDTA, 10% glyseroli, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mM Na

3Vo

4, 5 mM NaF), täydennettynä täydellinen proteaasiestäjäseostabletit [Roche]. Solujen hajotus toteutettiin useita kohtia läpi 25G neula. Tumat kerättiin sentrifugoimalla 16000 g, ja supernatantti sentrifugoitiin edelleen 16000 g, jolloin saatiin lopullinen sytoplasmisen uute. Tumapelletit pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja sen jälkeen inkuboimalla hypertonisessa ydin- uuttopuskuria (20 mM Hepes, [pH 7,6], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glyseroli, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM DTT , 1 mM PMSF, 5 mM Na

3Vo

4, 5 mM NaF), täydennettynä täydellinen proteaasiestäjäseostabletit [Roche]. Liuos edelleen sonikoitiin 60% amplitudi kahdesti 10 sekuntia. Liukenemattomat aineet saostettiin sentrifugoimalla. Supernatantti kerättiin ja käytettiin tumauutteesta.

Immunosaostusanalyysi

Yhtä suuret määrät proteiini A + G-Sepharose-helmiä (Oncogene Research, Boston, MA), inkuboitiin yön yli anti-PD2 (kani polyklonaaliset) ja anti-CHD1 (kanin polyklonaalista) vasta-aineita 1 ml: n kokonaistilavuuteen. Se pestiin sitten kahdesti poistamiseksi sitoutumattoman vasta-aineen ja 1,5 mg proteiinia lysaattia lisättiin helmi-vasta-aine sekoitetaan ja inkuboitiin pyörivällä alustalla 5 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Tämän inkubointijakson jälkeen, seokset pestiin viisi kertaa hajotuspuskurilla. Immunosaostumat tai koko solulysaatit elektroforeettisesti eroteltiin SDS-PAGE (10%). Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF kalvo. Kun nopea pesu PBST (fosfaattipuskuroitu suolaliuos ja 0,1% Tween 20), kalvot estettiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssa vähintään 2 tuntia, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden (anti Paf1 /PD2, Oct3 /4, ja RNA Pol II). Immunoblot pestiin viisi kertaa (5 x 10 min), inkuboitiin 1 h piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, pestiin viisi kertaa (5 x 10 min), saatetaan reagoimaan parannetun kemiluminesenssi ECL-reagenssilla (Amarsham Bioscience, Buckinghamshire, UK), ja altistettiin röntgenfilmille signaalin ilmaisemiseksi.

micrococcal nukleaasimääritysreaktio

micrococcal nukleaasimääritystä suoritettiin kuten aiemmin [20] joitakin muutoksia. Viisikymmentä x 10

6 solut pelletoitiin nopeudella 2000 kierrosta minuutissa 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen se pestiin 10 ml: lla jääkylmää PBS: llä ja pelletoitiin uudestaan ​​kuin ennen. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan jääkylmää NP-40 hajotuspuskuria (10 mM tris-HCI (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

2, 0,5% Nonidet P-40, 0,15 mM spermiini ja 0,5 mM spermidiiniä), inkuboitiin 5 min jäällä ja tumat pelletoitiin. Ytimet pestiin 2,5 ml: lla MNase hajotuspuskuria (10 mM Tris-HCI, 15 mM NaCl, 60 mM KCI, 0,15 mM spermiini ja 0,5 mM spermidiiniä) ja sentrifugoinnin jälkeen edelleen suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan MNase hajotuspuskuria, joka sisälsi 2 mM CaCl

2. Alkaen uudelleen suspendoitua ratkaisuja, 100 ul: n eriä otettiin ja inkuboitiin lisääntyvien määrien kanssa ja Micrococcal nukleaasi-entsyymin (0, 80 ja 100 yksikköä) ja 5 ja 10 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 80 ui MNase hajotuspuskuria, 20 ui MNase stop-puskuria (100 mM EDTA, 10 mM EGTA), 3 ui proteinaasi K (25 mg /ml) ja 10 ui 20% SDS: ää ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Seuraavana päivänä näytteet uutettiin 200 ui fenoli-kloroformia ratkaisu. Näytteet sentrifugoitiin ja vesipitoinen kerros kerättiin. Kaksi ui RNAasi A: ta (10 mg /ml) lisättiin liuokseen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia ja taas fenoli-kloroformilla uutto suoritettiin. Edelleen, DNA saostettiin lisäämällä 100% etanolia ja sentrifugoinnin jälkeen, DNA-pelletti suspendoitiin uudelleen DNA nesteytys puskurin tai vettä. Viisi ug eristettyä DNA: ta ratkaista 1,4% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. ImagJ ohjelmistoa käytettiin densitometrian analyysiin DNA vyöhykekuvia hallinnassa, salatut ja PD2 KD PC soluja.

Tulokset

hPaf1 /PD2 vaikuttaa muihin PAF monimutkainen alayksiköiden PC soluissa

ihmisen PAF kompleksi koostuu viidestä alayksiköistä, samanlainen kuin sen hiivan vastine, eli hPaf1, parafibromin (hCdc73), hCtr9, hLeo1 ja hSki8 alayksikkö, joka on myös osa ihmisen SKI monimutkainen. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että alayksiköt ihmisen PAF kompleksi osoittaa koordinoitu ilmentymisen, jossa pudotus joko hCtr9 tai hSki8 alayksikön johti vähentämättä muiden alayksiköiden kuten hPaf1 ja hLeo1 [12]. Tämä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, hiivassa, jossa poistetaan yksittäisten alayksiköiden johtaa eriasteista vähentäminen proteiinin tasot muiden alayksiköiden [21]. Mielenkiintoista, tuoreet tiedot meidän lab on osoittanut, että PAF monimutkainen alayksiköt toimivat itsenäisesti hiiren alkion kantasoluja, niin että Knockdown on Paf1 alayksikköä ei vaikuta tasoon muiden alayksiköiden [22]. Analysoida toiminnallista merkitystä hPaf1, suuret alayksikköä hPAF monimutkainen, haimasyövän, me ohimenevästi pudotti hPaf1 /PD2 että haimasyövän solulinjoissa Panc1 ja MiaPaca. Vuonna vahvistus aikaisempien tutkimusten kanssa, huomasimme, että hPaf1 /PD2 on koordinoitu ilme muiden alayksiköt hPAF monimutkainen. Western Blot-analyysi hCdc73 (parafibromin), hLeo1, hSki8 ja hCtr9 proteiineja ja myöhemmin kvantifiointi osoitti vähentynyttä ilmentymistä tasoilla hLeo1, hCdc73 ja hCtr9 alayksikkö on hPaf1 pudotus Panc1 ja MiaPaca soluja verrattuna salattu siRNA käsiteltyjen solujen (kuvio. 1) vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä. (P 0,05) ei kuitenkaan ollut havaittavissa muutosta proteiinin taso hSki8 alayksikköä kun vaimennussäätely hPaf1 alayksikön. Olemme edelleen vahvistaneet tuloksia käyttämällä eri altaan siRNA: iden (Santa Cruz, CA) vastaan ​​suunnattu PD2 ja havaittu vastaavia vaikutuksia (Fig. S3). Nämä tulokset osoittavat, että pudotus yhden alayksikön hPAF kompleksin vaikuttaa ilmentymisen muiden jäsenten säilyttämiseksi yleinen stoikiometrinen suhde kompleksin haiman syöpäsoluissa. Lisäksi se korostaa myös ero ilmentymistä ja toimintaa yksittäisten alayksiköiden PAF kompleksin eri karsinoomissa.

Panc1 ja MiaPaca haimasyövän soluja transfektoitiin salattu ja PD2 erityisiä siRNA oligoja ja proteiinin lysaatit kerättiin 72 tuntia transfektion. Western blot-analyysi solulysaateista käyttäen vastaavia vasta-aineita, osoitti, että ilmentyminen hPaf1 /PD2 ja muut PAF monimutkaisia ​​molekyylejä (parafibromin, hLeo1, hSki8 ja hCtr9) on salattu ja Paf1 /PD2 RNAi käsiteltiin Panc1 ja MiaPaca soluja. Ilmaisu histonien 3 lysiini 4 jäännös mono-, di- ja tri-metylointi tavaramerkit osoitti alennettu taso hPaf1 /PD2 Knockdown Panc1 ja MiaPaca soluja verrattuna salattu RNAi käsiteltyihin soluihin. Yhteenlaskettu Histoni H3 taso on sama sekä salattu ja PD2 pudotti soluja. β-aktiini toimi latauskontrollina. Kvantifiointi western blotit kunkin solulinjan alapuolella on immunoblot-luvut vastaavat virhepalkit. * Edustaa merkittävää muutosta (p 0,05) proteiinin tason välillä salattu ja PD2 knockdown soluja.

hPaf1 /PD2 vaikuttaa histoni metylaation PC soluissa

Hiiva PAF Monimutkainen on hyvin vakiintunut asema histonimodifikaation kuten ubiquitylation ja metylointi [4], [23] – [25]. On tunnettua välittävän vuorovaikutusta Rad6-Bre1 monimutkainen, kompassi histoni metyylitransferaasin, ja RNA Pol II, joka johtaa ubikitinaation histonien H2B lysiinin 123 tähteen, joka on myöhemmin laukaista metylaation lysiini 4 jäännös histoni H3 [24]. Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että RNAi vastaan ​​hCtr9 tai hSki8 johti vähenemiseen solutasolla histonien H3K4 mono- ja trimethylation merkkejä, mutta ei dimetyloimalla tavaramerkkejä HeLa-soluissa, mikä viittaa mahdolliseen rooliin ihmisen PAF monimutkainen histoni metylaation samoin [12 ]. Huomasimme, että ohimenevää knockdovvn hPaf1 /PD2 käyttämällä erityisiä RNAi haiman syöpäsoluissa vaikuttaa histoni metylaatio klo H3K4 jäännöksen (Fig. 1). Western Blot-analyysi mono-, di- ja trimethylation tavaramerkkien histoni H3 lysine4 jäännös osoittivat merkittävää vähenemistä (* p 0,05) di- ja trimetyloidaan H3K4 tasoilla PD2 pudotus Panc1 ja MiaPaca soluja verrattuna salattu RNAi käsiteltyjen solujen. Kuitenkin, ei ollut paljon vaihtelua H3K4 monomethylation taso johtuu PD2 ehtyminen haiman syöpäsoluja. Kokeet toistettiin erilaisella allas PD2 erityisiä siRNA: iden molemmissa solulinjoissa (kuvio. S3). Olemme jälleen havaittu downregulation histoni di- ja trimethylation markkaa ennen vähän tai ei lainkaan vaihtelua histoni monometyylitriatsenoimidatsolikarboksamidiksi tasoilla.

hPaf1 /PD2 säätelee histoni metyylitransferaasi MLL1 proteiinin taso

Perustuen havaintoon, että hPaf1 /PD2 säätelee histoni di ja tri-metylaatio klo H3K4 jäännöksen, halusimme tutkia vaikutusta hPaf1 knockdown on histoni metyylitransferaasit. MLL1 proteiini kuuluvat SET1 perheen lysiiniä metyylitransferaasit tiedetään nimenomaan säännellä di-ja trimethylation at histoni H3 lysiinin 4 jäämiä. Siksi olemme analysoineet vaikutus hPaf1 /PD2 Knockdown annetun MLL1 proteiinin ilmentymisen käyttäen kahta erilaista PD2 siRNA: iden in Panc1 ja MiaPaca haimasyövän solulinjoissa. Western blot-analyysi osoitti, että lasku hPaf1 /PD2 tasolla haimasyöpäsoluissa johtaa merkittävään laskuun (* p 0,05) MLL1 proteiinin taso (Fig. 2A, S3). Käyrät alla immunoblottaus tulokset edustavat kvantifiointiin western blotit kunkin solulinjan. Olemme edelleen katsoi PD2 ja MLL1 proteiinien haimasyöpäsoluissa konfokaalimikroskopiaa ja totesi, että kaksi proteiinia colocalize tumassa, mikä viittaa mahdolliseen välistä vuorovaikutusta (Fig. 2B). Kuitenkin, määrä rinnakkaispaikantumisen kahden proteiinin, oli suhteellisen pieni, mikä osoittaa mahdollisesti heikko ja /tai vaihtuvissa vuorovaikutusta. Nämä tulokset olivat vahvistusta aiempien tutkimusten jotka osoittivat, että sekä hiiva ja ihmisen PAF komplekseja vuorovaikutuksessa vastaavan homologin MLL tai Set1 proteiini [4], [26], [27]. Näin ollen tulokset viittaavat siihen, että hPaf1 /PD2 säätelee, ja mahdollisesti vuorovaikutuksessa MLL1, ohjata H3K4 metylaatio haiman syöpäsoluissa.

(A) Panc1 ja MiaPaca haimasyövän soluja transfektoitiin salattu ja PD2 RNAi oligoja ja lysaatit kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Western Blot-analyysi käyttäen spesifisiä vasta-aineita on vähentynyt in MLL1 histoni metyylitransferaasin proteiinin ilmentymistä Knockdown soluissa verrattuna salattu soluihin. β-aktiini toimi latauskontrollina. Kvantifiointi data western blot alapuolella on vastaavat immunoblot tulokset vastaavat solulinjat. Virhepalkit Esitetyt luvut ovat keskivirhettä lasketaan kolmen erillisen kokeen. * Edustaa merkittävää muutosta (p 0,05) proteiinin tason välillä salattu ja PD2 pudotus soluja. (B) -konfokaalimikroskoopilla kuvia havainnollistaen PD2 ja MLL1 sijoittuu tumaan ja Panc1 soluja. MLL1 colocalizes kanssa PD2 erillisissä alueiden tumassa (värjättiin DAPI) on Panc1 soluja. Insertti esittää suurennettua kuvaa rinnakkaispaikantumisen paikoista PD2 ja MLL1.

knockdovvn hPaf1 /PD2 pienenee CHD1 tasolla haimasyöpäsoluissa

sääntely histoni metylaation jonka hPaf1 /PD2 alayksikköä hPAF kompleksin nostaa esiin mahdollisuuden, että se voisi vaikuttaa monien muiden proteiinien, kuten kromatiinin remodeling tekijöitä, jotka ovat vuorovaikutuksessa modifioitu histonien paikoissa transkription. Oletettu kromatiinin remodeling monimutkainen, CHD-1 (Chromodomain helikaasi DNA-sitovan proteiinin 1), tunnistettiin adventitiously kuin nisäkkäiden DNA-sitovan proteiinin, joka sisältää kolme allekirjoitus jaksoryhmittymät: 52-aminohapon chromodomain löytyy heterochromatin proteiinin HP- 1 ja homeotic repressori Polycomb-, The SnF2 /SWI2 ATPaasi domain, ja motiiveja ominaisuus pieniä-uran DNA: han sitoutuvat proteiinit [28], [29]. Mielenkiintoista on, että CHD1 kromatiinin remodeling proteiinin tiedetään sitoutuvan spesifisesti metyloitu lysiini 4 Jäännös histoni H3, joka on tunnusomaista aktiivisen transkription. Oletetaan, että ihmisen CHD1 chromodomains vastaavat tunnustamista ja vuorovaikutus histoni metylointi tavaramerkit [30]. Koska hPaf1 /PD2 säännelty histoni metylaatio klo H3K4 jäännöksen, tutkimme CHD1 sääntelyä hPaf1 väliaikaisella knockdovvn hPaf1 /PD2 haiman syöpäsoluissa ja analysoi vaihtelua tasojen CHD1 proteiinia. Western blot-analyysi yhdessä vastaavan määrän tietojen alapuolella immunoblottaus luvut (Fig. 3A) osoittaa, että pudotus on hPaf1 /PD2 haiman syöpäsoluissa johtaa lasku tason CHD1 verrattuna sekoitetun kontrollisoluihin. Downregulation CHD1 kuin vaikutus PD2 Knockdown edelleen vahvistaa samassa solulinjoissa käyttämällä eri siRNA-allas vastaan ​​PD2 (Fig. S3). Voidakseen vahvistaa tätä, immunofluoresenssimikroskoopilla käytettiin. Yhdenmukaisia ​​biokemiallisten tietojen immunofluoresenssi analyysi osoitti, että CHD1 taso on vähentynyt hPaf1 /PD2 pudotus Panc1 ja MiaPaca soluja verrattuna salattu MiaPaca tai Panc1 solut (Fig. 3B). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi edelleen osoittaa, että yhdessä PD2 mRNA, on myös lasku CHD1 mRNA tasolla PD2 siRNA käsiteltiin Panc1 solut, mikä osoittaa, että hPaf1 säätelee CHD1 ilmentymistä sekä transkription ja translaation tasolla (Fig. S1A). Samalla yliekspressio PD2 in HPAF /CD18 haimasyöpäsoluissa myös ylössäätelee CHD1 lauseke (Fig. S1B). Nämä tulokset osoittavat, että hPaf1 /PD2 säätelee ilmentymistä kromatiinin remodeling proteiinin CHD1, viittaa sen mahdolliseen rooliin uudelleenjärjestelyn kromatiinin rakenteen transkription aikana venymä haiman syöpäsoluissa.

(A) Western blot-analyysi osoittaa vähentynyt taso CHD1 proteiinin PC soluissa upon RNAi välittämä hPaf1 /PD2 esto. β-aktiini toimi latauskontrollina. Alla oleva kaavio kunkin western blot luku vastaa vastaavan määrällisesti tulokset yksittäisiä solulinjoja. (B) Immunofluoresenssianalyysi osoittaa alennettua hPaf1 /PD2 taso (vihreä) yhdessä vastaavan alennuksen CHD1 taso (punainen) in PD2 siRNA käsitelty PC soluja verrattuna salattu siRNA käsiteltyihin soluihin.

hPaf1 /PD2 on vuorovaikutuksessa CHD1 sekä sytoplasmassa ja tumassa haimasyöpäsoluissa

Kromatiini remodeling proteiinin CHD1 tiedetään olevan vuorovaikutuksessa transkription venymä tekijöitä ja paikallistaa aktiivisesti puhtaaksi geenejä [31]. Hiivassa CHD1 toiminnot transkription aikana pidentymisen kautta vuorovaikutus venymä tekijöiden Spt4-Spt5 ja Spt16-Pob3. Mielenkiintoista on, CHD1 on myös todettu vuorovaikutuksessa RTF1 alayksikköä hiivan PAF kompleksi, joka liittää RNA-polymeraasilla II ja säätelee transkriptiota venymä [31]. Vaikka RTF1 on läsnä ihmisessä, se ei ole niin osa hPAF monimutkainen. Siksi testasimme mahdollisuutta, että hPaf1 /PD2 alayksikön ihmisen PAF kompleksi on vuorovaikutuksessa CHD1 käyttäen samanaikainen immunosaostus tutkimuksissa. Western blot analyysi yhteistyössä immunosaostumat osoittaa PD2 vuorovaikutuksessa CHD1 molemmissa sytoplasmassa sekä ydin- otteita haiman syöpäsoluja, Panc1 ja MiaPaca (Fig. 4). Olemme edelleen analysoi vuorovaikutusta PD2 ja CHD1 co-localization tutkimukset käyttäen konfokaalimikroskopialla (Kuva. 5A). CHD1 värjäytyminen (punainen) havaittiin päällekkäisiä PD2 värjäys (vihreä) sekä sytoplasmassa sekä tumassa haimasyövän soluja vahvistuksen kanssa biokemiallisia tietoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PD2 ja CHD1 vuorovaikutuksessa ja edelleen osallistua kromatiinirakenteeseen remodeling haimasyövän.

(A) Sytoplastiset ja tumauutteesta fraktiointi suoritettiin Panc1 ja MiaPaca haimasyöpäsoluissa seuraa vastavuoroinen samanaikainen immunosaostus endogeenisen proteiinit solufraktioista. Western blot-analyysi osoittaa, että hPaf1 /PD2 vuorovaikutuksessa CHD1 sekä sytoplasman ja ydinvoiman otteita Panc1 ja MiaPaca haiman syöpäsoluja. Anti-PD2 immunosaostumissa uutteista Panc1 ja MiaPaca solut immunoblotattiin anti-CHD1 vasta-aine. Samoin anti-CHD1 sakat blotattiin anti-PD2-vasta-ainetta. Kanin IgG: tä käytettiin kontrollina.

(A) Panc1 ja MiaPaca solut transfektoitiin salattu ja PD2 RNAi oligoja ja 48 tuntia transfektion jälkeen immunofluoresenssilla analyysi suoritettiin. Konfokaaliset kuvat osoittavat, että on vähentynyt lokalisaation CHD1 tumassa (sininen, värjättiin DAPI) Pd2 KD haimasyöpäsoluissa (keskimmäinen paneeli) verrattuna salattu soluihin (yläpaneeli). Solut edelleen transfektoida uudelleen pBabe-hygro PD2 rakentaa ektooppisten ilmentymä PD2, 72 tuntia intital transfektion. Konfokaaliset kuvat havainnollistavat lisäämättä eksogeenistä PD2 reshuttles CHD1 takaisin tumaan (alapaneeli). Insertti edustaa PD2 ja CHD1 sijoittuu tumaan (värjätään DAPI).