Krooninen sairaus

tiivistelmä

RABEX-5, guaniini-nukleotidin vaihto tekijä (GEF) ja RAB-5, on tuumorigeneesiin ja kehittämisessä tiettyjen ihmisen syövissä. Täällä me raportoimme että RABEX-5 edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kyky mahasyövän solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Expression of RABEX-5 on merkittävästi suurempi maha- syöpä kudosten ja liittyy kasvaimen koon ja imusolmuke etäpesäke. Lisäksi, kohdennettua vaimentaminen RABEX-5 vähensi mahasyövän solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostuminen

in vitro

kautta induktio G0 /G1 vaiheeseen pysäyttävästi, ja stimuloitiin mahasyövän apoptoosia. Knockdovvn RABEX-5 esti myös haavan paranemista, muuttoliike ja invasiivisia kyvyt mahalaukun syöpäsoluja. Tulokset

in vivo

eläinkokeissa olivat myös yhdenmukaisia ​​näiden

in vitro

havaintoja. Hiljentäminen RABEX-5 vähensivät VEGF: n ilmentymistä. Nämä tulokset osoittavat, että RABEX-5 ylössäädellään ja sillä onkogeenisessä merkitys mahalaukun syövän kehittymisen aktivoimalla VEGF-signalointireitin.

Citation: Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) RABEX-5 ylössäädellään ja Toistot onkogeenisessä rooli mahasyövän kehitys aktivointi VEGF Signaling Pathway. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10,1371 /journal.pone.0113891

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 03 syyskuu 2014; Hyväksytty: 31 lokakuu 2014; Julkaistu: 26 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

huolimatta lasku maailmanlaajuisen ilmaantuvuuden tietyillä alueilla maailmassa, mahasyövän jää neljänneksi korkein esiintyvyys ja toinen kuolleisuus kaikista syövistä maailmanlaajuisesti [1]. Tutkimukset osoittavat, että ympäristötekijät, kuten

Helicobacter pylori

infektio, tupakointi ja ruokavalio, voi olla tärkeä rooli mahasyövässä kehittämiseen [2]. Varhaisen vaiheen mahasyövän on yleensä oireeton tai liittyy epäspesifinen oireita, kuten dyspepsia, ja kun oireita ilmenee, se on usein edennyt pitkälle. Huolimatta yhteisestä käytöstä multimodaalisten hoito (kemoterapia, säteily ja leikkaus), 5 vuoden pysyvyys potilaiden on pieni, 20-40% [3]. Vaikka tutkimus mahasyövässä on edistynyt suuresti, molekyylitason mekanismit kehittämiseen mahasyövän edelleen puutteellisesti.

Eksosytoosi ja endosytoosin ovat keskeisiä prosesseja käyttävät solut ylläpitämään normaalia fysiologista toimintaa, ja rakkula liikenne on keskeinen osana tätä prosessia. Pieni GTPaasit olla kytkimen toiminto solunsisäisessä molekyylejä ja erittäin tärkeä rooli endosytoosin ja rakkula liikenne, mukaan lukien solukasvun säätelyssä, signaalitransduktion, erilaistumista ja aktiinisytoskeletonin rakentaminen ja monia näkökohtia toisen solun prosesseja [4]. Ras-superperheen, on enemmän kuin 50 eri GTPaasit, mukaan lukien Rab, joka kuuluu suurimman alaperheen [5]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että suurin osa Rab proteiinien muassa määrätty kohdistaminen liikenteen, fagosytoosia ja rakkulan telakka erityisiä kalvoja, kun taas pieni määrä Rab proteiinien säädellä rakkula orastava [6], [7]. Pieni GTPaasi RAB-5, joka on jaettu solukalvon ja varhainen endosomeihin, on päällikön säätelijä varhaisen endosyyttisissä kaupan [8]. Kuten muutkin pienet GTPaasit, RAB-5 aktivoidaan vaihtamalla sidottu BKT GTP, jota katalysoi perheen guaniinin nukleotidin vaihto tekijät [9]. RABEX-5 otettiin esimerkiksi Interactor of Rabaptin-5 ja hänellä GEF aktiivisuutta RAB-5 ja liittyvää GTPaaseja. Samoin molemmat RABEX-5 ja Rabaptin-5 tarvitaan RAB-5-ajettu endosomissa fuusio

in vitro

[10].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että RABEX-5 ilme on huomattavasti suurempi useissa syövissä, mukaan lukien rintasyöpä [11], eturauhassyöpä [12] ja peräsuolen syövän [13]. Epänormaali RABEX-5 ilmentyminen kasvaimissa viittaa siihen, että RABEX-5 on merkittävä syövän synnyssä ja etenemisessä, ja voi vaikuttaa kasvaimen biologista käyttäytymistä. Kuitenkin rooli ja vaikutusmekanismi RABEX-5 mahasyövän syövän synnyn ja etenemisen ei ole vielä määritelty. Tässä tutkimuksessa, ensin analysoidaan ilmentymisen RABEX-5 mahasyövän kudoksissa käyttämällä kvantitatiivista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) ja immunohistokemia. Seuraavaksi tutkimme vaikutuksia RABEX-5 kasvaimen biologinen toiminta

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että RABEX-5 on yli-ilmentynyt ja sillä onkogeenisessä rooli mahasyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet on kuvattu tässä tutkimuksessa hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) at Taishan Medical University ja kaikki eläimet pidettiin mukaisesti IACUC ohjeita. Kerääminen ja käyttö ihmisen näytteitä hyväksynyt Institutional Review Board of Taishan Medical University ja sidoksissa Taian Central Hospital Medical Center, seuraavat ilmoitti kirjallinen suostumus kaikilta potilailta.

Potilaille ja kudosnäytteiden

yhteensä 110 erilaista mahalaukun kasvaimet ja viereisen ei-kasvain kudosten (vähintään 5 cm kasvaimen raja) saatiin potilailta, joille tehtiin parantava leikkaus Taian keskussairaalassa välillä tammikuussa 2010 ja joulukuuta 2013. Näihin sisältyy 27 naista ja 83 miestä, joiden keski-ikä 59,3 vuotta (vaihteluväli 32-80 vuotta). Kukaan potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Kliinis kerättiin ja patologinen tuumorin luokitus määritettiin mukaan American sekakomitean Cancer (AJCC) mahasyöpä TNM lavastus järjestelmä. Histologinen tyypitys suoritettiin vähintään kaksi asiantuntija patologia, työskentelee itsenäisesti kaksinkertaisen sokkona. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Boards Taishan Medical University ja sidoksissa Taian Central Hospital Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen tutkimusta tutkimuksessa.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen mahasyövässä solulinjat ja kuolemattomaksi mahan limakalvojen epiteelisolujen linja, GES-1 , ostettiin Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. Solulinjoja ylläpidettiin rutiinisti RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% vasikan seerumia, penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 IU /ml), 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa.

Yhteensä RNA: n eristys ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin kudosnäytteistä tai solulinjoja käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega, Madison, WI, USA). PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green-reagenssia (Applied Biosystems, CA, USA) ja seuraavat PCR-alukkeet;

RABEX-5

(forward) 5′-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 ’ja (reverse) 5′-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3’;

VEGF

(forward) 5′-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ’ja (reverse) 5′-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3’ ja

GAPDH

(forward) 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ’ja (reverse) 5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ’. PCR-reaktiot suoritettiin ensimmäisen denaturaatio 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina ja kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen ekspressio suhteet

RABEX-5

kunkin pariksi kasvaimen kasvaimen ulkopuolista kudosta näytettä laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä.

immunohistokemia

Parafiini -Embedded kudosleikkeiden potilailta tai nude-hiiriä lämpökäsiteltiin 60 ° C: ssa 1 h, vahat ksyleenillä, rehydroitiin etanolisarjassa (100-50%) ja käsiteltiin 0,01 mol /l sitraatti- puskuria (pH 6,0 ) antigeenin haku. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estyi inkuboinnin jälkeen metanolilla, joka sisältää 0,3% H

2O

2 30 min. Leikkeitä inkuboitiin sitten vasta-aineiden kanssa havaitaan RABEX-5 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) tai VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavassa kokeellisessa menettelyssä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen. Kudosleikkeet vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä. Objektilasit arvioitu riippumattomasti kahdella patologit, sokaissut tahansa potilastietoja. Värjäytyminen intensiteetti RABEX-5 pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (lievä värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäytyminen) tai 3 (voimakas värjäytyminen). Värjäys alue pisteytettiin 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) tai 4 (76-100%), perusteella prosenttiosuuden positiivisesti värjäytyneiden solujen. Lopullinen värjäys pisteet, lasketaan summa intensiteetti ja laajennus tulokset, jaettiin kolmeen ryhmään seuraavasti: 0-2, negatiivinen ilmaus; 3-4, heikko ilme; ja 5-6, vahva ilmaus.

Kohdennetut vaiennettu RABEX-5

RABEX-5 lentiviraalinen häiriö vektori hankittiin Shanghai GenePharma Co., Ltd. sekvenssi RABEX-5 häiriöitä kohdistaminen oligo oli 5′-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ’, kun taas ei-homologisen ohjaus sekvenssi oli 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’. SGC-7901 ja NCI-N87-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (5 x 10

4 solua /kuoppa), kasvatettiin 40% konfluenssiin ja käsiteltiin titrattiin viruksen supernatanttia infektiokertoimella (moi) 10.

Western blot-analyysi

Koko solun proteiinit uutettiin soluista käyttäen RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittori Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiini kvantifioitiin käyttämällä BCA Protein Assay Kit (Pierce). Solu-uutteita (100 ug) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), ja niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat kanin anti-RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) ja hiiren anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Membraanit pestiin sitten kolme kertaa TBS-Tween liuosta 15 minuutin ajan, ja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineita. Signaalit havaittiin käyttämällä vahvistettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio mitattiin käyttäen Cell Counting Kit -8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani). SGC-7901 tai NCI-N87-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (1,5 x 10

3 solua /kuoppa) ja inkuboitiin eri ajankohtina (24, 48, 72, 96 ja 120 h). Kasvualusta poistettiin sitten ja korvattiin 200 ui RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 20 ui CCK-8, ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 h. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen Safire2 mikrolevynlukijaa. RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: n ja CCK-8, käytettiin kontrollina.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1 x 10

3-soluja /kuoppa), ja viljelyalusta vaihdettiin joka 3-4 päivä. Sen jälkeen, kun 14 päivää ”kulttuuri, solupesäkkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan, värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20 minuutin ajan, ja valokuvattiin. Pesäkkeitä, joiden yli 50 solusta, laskettiin jokaisessa viiva.

analyysi solusyklin ja apoptoosin

SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD solut ja ohjaus solut kerättiin ja solusyklin ja apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla. Solusyklin analyysi, solut kiinnitettiin 75% etanolilla ja varastoitiin 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä kiinteät solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin RNaasi A: lla (50 ug /ml) ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) (50 ug /ml) 30 minuutin ajan pimeässä. Värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur, Becton-Dickinson).

apoptoosin analyysi, anneksiini V-APC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, USA) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PI ja anneksiini V-APC kaksinkertainen värjäys suoritettiin ja solut analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur, Becton-Dickinson) käyttäen Cell Quest -ohjelmistoa (Becton-Dickinson). Anneksiini V-APC-positiivisia ja PI-negatiivisia soluja määriteltiin apoptoosin. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskiarvot näiden ryhmien laskettiin.

TranswellTM maahanmuutto- ja invaasiomääritys

muuttoliike määrityksiä, 1 x 10

5 solut suspendoitiin serum- RPMI-1640-alustassa ja siirrostettiin kammioihin, joita ei ole päällystetty Matrigelillä (Corning Costar, NY, USA). Sillä invaasiomääritys, ylempi kammio esipäällystetty matrigeelin (BD Bioscience, CA, USA) valmistajan protokollien, ja 1 x 10

5 solua seerumivapaassa RPMI-1640-alustassa lisättiin kammioon. Sekä määrityksiä, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon kemoattraktantti. 24 tunnin kuluttua kulttuurin, kammiot värjättiin 0,5% kristallivioletilla liuosta 15 minuuttia, ja upotettiin fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) 10 minuutin ajan. Solut alempaan kammioon myöhemmin laskettiin käännettyä mikroskooppia. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona solujen määrä viidellä satunnaisesti näkökentät (200 x).

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin, kunnes ne saavuttivat konfluenssin. Haavat olivat naarmuuntunut yksikerroksista solujen käyttäen 20-ul pipetinkärjet. Levyt pestiin kerran tuoreella väliaineella poistamiseksi tarttumattomat solut seuraavat solujen viljelmän 0 tai 48 h (väliaine ilman vasikan seerumia), ja valokuvattiin.

ksenograftimallissa

Neljän viikko- vuotias mies BALB /C nude-hiiret ostettiin Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia Shanghai. Eläimiä pidettiin häkeissä hakkeella vuodevaatteet on lämpötilaohjattu huoneen (68-72 ° F), jossa on 12 tunnin valo-pimeä-sykli ja 45-55% suhteellisessa kosteudessa, ja sallittiin vapaa pääsy ruokaan ja juomaveden. Lyhyesti, SGC-7901 /KD tai SGC-7901 /NC solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään (pH 7,4) injektointiin yhden hiiren, kokonaistilavuudessa 100 ul. Solususpensio (1 x 10

6 solua) injektoitiin oikeaan kylkeen hiirillä. Kasvaimen koko mitattiin ulkoisesti joka 3. päivä käyttäen paksuus, ja kasvaimen tilavuus arvioitiin käyttämällä yhtälöä: pituus (mm) x leveys

2 (mm) x 0,52. Lievittävät kärsimystä hiirien havaittu nämä kokeelliset tutkimukset, hiiret tapettiin CO

2 hengitysteitse 28. päivänä intraperitoneaalisen injektion, ja kasvaimet punnittiin avauksen jälkeen. Näytteet varastoitiin nestemäisessä typessä qRT-PCR: llä tai kiinnitettiin 4% formaliiniin, jolloin saatiin parafiiniin upotetut leikkeet. Kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaan Animal Care ja käyttösäännöt hyväksymä Taishan Medical University Animal Care komitea.

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastolliset erot ryhmien välillä tutkittiin Studentin

t

-testi. Korrelaatioita RABEX-5 ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa ja kliinis parametrit analysoitiin chi-neliö tai Fisherin tarkkaa testeissä.

P

0,05 katsottiin merkitseväksi, ja

P

0,01 pidettiin erittäin merkittävä.

Tulokset

RABEX-5 ilmentyminen on yliaktiivista mahasyöpä kudokset

ilmentyminen

RABEX-5

tutkittiin mahasyövän ja viereisen ei-tuumorikudoksista by qRT-PCR. Havaitsimme huomattavasti korkeampi ilmentyminen

RABEX-5

mRNA mahasyövän kudoksissa verrattuna vastaaviin ei-tuumorikudoksissa (

P

0,01, Fig. 1A). Nämä tulokset vahvistettiin proteiinin tasolla immunohistokemiallisella värjäyksellä (Fig. 1 B, C, D, E). RABEX-5-ekspressio pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa syöpäsoluja. RABEX-5 yläreguloituja 61,8% (68/110) mahalaukun syöpäpotilailla. Me tutkimme seuraavaksi suhdetta RABEX-5 ilmaisua ja viittaavia tekijöitä mahasyövän. Ylössäätely RABEX-5 liittyi kasvaimen kokoa (

P

= 0,035) ja imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,006), mutta ei muiden kliinis tekijät kuten sukupuoli, ikä tai kasvaimen sijainti (taulukko 1).

(A)

RABEX-5

mRNA: n ekspression mahasyövän kudosten ja pariksi viereisen ei-kasvain kudoksissa tutkittiin kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR ) ja normalisoitiin

GAPDH

. Pylväät edustavat keinot

RABEX-5

suhteellinen ilmentyminen syövän kudoksissa ja ei-tuumorikudoksissa, vastaavasti. (B-E) karakterisointi RABEX-5-proteiinin ilmentymistä ihmisen mahasyövän kudosten ja pariksi viereisen ei-tuumorikudoksista immunohistokemiallisella värjäyksellä. (B) Vahva positiivinen RABEX-5 ilmentymistä mahasyövässä. (C) Heikko positiivinen RABEX-5 ilmentymistä mahasyövässä. (D) negatiiviset RABEX-5 ilmentymistä mahasyövässä. (E) Negatiivinen RABEX-5 ilmentymistä ei-kasvain mahan limakalvon.

alassäätely RABEX-5 estää mahasyövän soluproliferaatiota ja pesäkkeiden muodostumista

Seuraava tutkineet ilmentyminen RABEX-5 mahalaukun solulinjoissa ja ei-syöpäsolujen linja, GES-1, western blot -analyysillä. RABEX-5 ilmentyi kaikissa testatuissa solulinjoissa, ja oli erityisen korkea SGC-7901 ja NCI-N87-soluissa (kuvio. 2A). Tutkia toiminnot RABEX-5 mahasyövän solulinjoissa, suoritimme kohdennettua knockdovvn RABEX-5 korkean ilmentämissolulinjat, SGC-7901 ja NCI-N87. RABEX-5 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt SGC-7901 /KD ja NCI-N87 /KD soluja verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 2B). Ensin tutkittiin, mikä vaikutus menetys RABEX-5 kasvuun mahalaukun syöpäsoluja. Kun 5 päivän viljelyn kasvuvauhti SGC-7901 /KD ja NCI-N87 /KD soluja oli huomattavasti hitaampaa kuin verrokkiryhmässä (Fig. 2C). Olemme myös vahvisti nämä havainnot pesäkemuodostusta määrityksissä. Colony numerot vähensi merkittävästi SGC-7901 /KD soluja ja NCI-N87 /KD soluja verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 2D), ja havaitsimme, että pesäkkeen koko oli pienempi kokeellisissa ryhmissä verrattuna kontrolleihin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että downregulation RABEX-5 estää mahalaukun syövän solujen proliferaatiota.

(A) Western blot -analyysi RABEX-5-proteiinin ekspression seitsemän mahasyövän solulinjoissa ja GES-1. (B) RABEX-5-proteiinin tasot SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD ja NCI-N87 /NC solut analysoitiin western blot. (C) CCK-8-solulisäkasvumääritykselle SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD ja kontrolliryhmiin. Käyrät osoittavat huomattavan määrän lisääntymistä verrattuna kontrolleihin (

P

0,05). (D) Kuvat ovat sekä määrällisesti pesäkkeen muodostumisen määritykset kussakin solulinjassa. *

P

0,05; **

P

0,01.

alassäätely RABEX-5 edistää apoptoosin mahalaukun syöpäsolujen ja indusoi G0 /G1 solukierron pysähtymisen

havaitut vaikutukset of RABEX-5 knockdown solu- kasvu voi johtua muutoksista solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Siksi tutkittiin vaikutuksia RABEX-5 hiljentäminen solusyklin ja apoptoosin

in vitro

, käyttämällä virtaussytometria. Virtaussytometrianalyysin paljasti, että osuus solujen G0 /G1 vaihe SGC-7901 /KD tai NCI-N87 /KD soluja oli korkeampi kuin SGC-7901 /NC tai NCI-N87 /NC kontrolliryhmää, kun taas osuus solut G2 /M vaiheessa väheni huomattavasti verrattuna kontrolleihin (Kuva. 3A, B). Havaitsimme myös merkittäviä vaikutuksia apoptoosia eri käsiteltyjen ryhmien (Fig. 3C, D), jossa downregulation RABEX-5 ilmentyminen johtaa kasvuun mahasyövässä apoptoosia.

(A) osuus solujen eri vaiheissa solusyklin. (B) edustaja histogrammit esittävät solukierron profiilit SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD ja NCI-N87 /NC soluja. (C) solut värjäytyvät positiivisiksi anneksiini V-APC ja negatiivinen propidiumjodidilla (PI) katsottiin olevan tehty apoptoosia. (D) edustaja histogrammit esittävät apoptoosin kunkin ryhmän mahalaukun syöpäsoluja. *

P

0,05; **

P

0,01.

alassäätely RABEX-5 estää muuttoliike, invaasio ja haavan paranemista kyky mahalaukun syöpäsolujen

vaikutuksen tutkimiseksi of RABEX-5 muuttoliikettä ja invaasio, me seuraavaksi suoritetaan siirtokuoppaan maahanmuutto- ja invaasion määrityksissä. Downregulation RABEX-5 tukahdutetaan solumigraation (SGC-7901 /KD ryhmä, 121,3 ± 6,1 solua /alalla SGC-7901 /NC ryhmä, 261,0 ± 10,5 solua /kenttä, NCI-N87 /KD ryhmä, 108,7 ± 6,1 solua /kenttä ; NCI-N87 /NC ryhmä, 241,7 ± 10,6 solua /kenttä;

P

0,05) (Fig. 4A, C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin transwell invaasiota määrityksissä (SGC-7901 /KD ryhmä, 76,3 ± 6,1 solua /alalla SGC-7901 /NC ryhmä, 108,7 ± 6,0 solua /kenttä, NCI-N87 /KD ryhmä, 60,7 ± 6,0 solua /kenttä ; NCI-N87 /NC ryhmä, 119,0 ± 8,5 solua /kenttä;

P

0,05) (Fig. 4B, D).

(A, B) Transwell määritykset. Valokuvat, joissa näkyy solujen Seuraavia siirtymisen läpi mikrohuokoisen kalvojen kanssa tai ilman Matrigel. (C, D) Histograms kuvaa numerot vaeltavia ja tunkeutuvat soluihin. (E) haavan paranemista määritystä mahalaukun syöpäsoluja. Kuvat otettiin 0 ja 48 tunnin jälkeen raapiminen solun pinnalla. Edustaja kuva kolmesta itsenäisestä kokeesta. (F)

VEGF

mRNA ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR. (G) VEGF-proteiinin ilmentymistä arvioitiin Western blot. *

P

0,05; **

P

0,01.

vaikutuksen tutkimiseksi RABEX-5 liikkuvuuteen ja haavan paranemiseen, myös suorittaa arpeutumisprosessit määrityksissä. Havaitsimme, että välimatka haavan reunojen SGC-7901 /KD ja NCI-N87 /KD soluja oli selvästi pidempi kuin SGC-7901 /NC tai NCI-N87 /NC-solut (Fig. 4E). Mukaisesti näiden havaintojen, VEGF olivat vaimentua sekä mRNA ja proteiini tasoilla SGC-7901 /KD-soluissa (kuvio. 4F, G).

vaiennettu RABEX-5 estää mahalaukun syövän kasvua

in vivo

Perustuu

in vitro

edellä kuvattujen havaintojen, me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus RABEX-5 hiljentäminen kasvaimen kasvuun

in vivo

injektoimalla SGC7901 /KD tai SGC7901 /NC soluja ihon alle oikeaan kylkeen alueet nude-hiirten. Kasvaimen koko seurattiin joka 3. päivä tämä paksuudeltaan. Kasvaimen tilavuus väheni merkittävästi hiirillä kaksi viikkoa post-injektion SGC-7901 /KD soluja verrattuna säätökennoja (

P

0,05; Fig. 5A). Kasvaimen tilavuus ksenograftien johdettu SGC-7901 /KD ryhmässä oli verrattavissa SGC-7901 /NC ryhmä, jolla vähentyneen merkittävästi kasvaimen tilavuuden 4 viikon kuluttua tuumorisoluinokulaatiosta (

P

0,05, Fig. 5B, C). Lisäksi paino kasvaimista peräisin SGC-7901 /KD soluissa oli merkittävästi pienempi kuin valvonta (

P

0,05; Fig. 5D). Tutkimme seuraavaksi VEGF: n ilmentymistä elinsiirron kasvaimen näytteistä qRT-PCR: llä ja immunohistokemiallisesti. Kuten on esitetty kuviossa. 5E ja 5F, VEGF-mRNA ja proteiini määrä väheni SGC-7901 /KD ryhmässä verrattuna SGC-7901 /NC ohjaus. Nämä

in vivo

tiedot ovat johdonmukaisia ​​sen

in vitro

havainnot ja vahvistaa, että hiljentäminen RABEX-5 estää mahalaukun syövän kasvua ja etenemistä säätelemällä VEGF transkription aktiivisuutta. Yhteenvetona, RABEX-5: llä on onkogeenisen rooli mahasyövässä.

(A) Tuumoritilavuudet mitattiin eri ajankohtina hiirillä, jotka inokuloitiin SGC-7901-soluja infektoitiin RABEX-5 pudotus lentivirusvektorilla (SGC- 7901 /KD-solut). (B) Kasvaimet kerättiin hiiristä 4 viikkoa injektion jälkeen SGC-7901 /KD soluja (C) Yksittäiset kasvainten kullekin hiirelle avauksen jälkeen. (D) Lopullinen tuumorin paino mitattiin kokeen lopussa. (E) Expression of

VEGF

mRNA kasvaimissa peräisin nude-hiirissä. (F) immunohistokemiallinen analyysi VEGF ilmaisun kasvaimissa johdettu SGC-7901 /NC ja SGC-7901 /KD ryhmiä. *

P

0,05; **

P

0,01.

Keskustelu

Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RABEX-5 on rooli tuumorigeneesiä useiden syöpätyyppien [11 ] – [14], sen rooli mahasyövässä ei ollut tutkittu. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että RABEX-5 ilmentyminen on huomattavasti yliaktiivista mahasyövän kudoksissa verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen, mikä osoittaa, että RABEX-5 voi myötävaikuttaa syöpään kasvaimien syntyyn. Lisäksi, ekspression RABEX-5 oli merkittävästi liittyy kasvaimen koon ja imusolmuke etäpesäke. Sen sijaan ei ollut merkittäviä korrelaatioita epänormaali RABEX-5 ilmaisua ja sukupuolen, iän tai kasvaimen sijainnista. Tämä on ensimmäinen tutkimus valottaa kliinis merkitys RABEX-5 ilmentymisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän.

roolin tutkimiseksi RABEX-5 kasvaimen edistäminen, me seuraavaksi suoritetaan laaja toimintakyvyn menetystä analyysin RABEX- 5 korkean ilmentämissolulinjat, SGC-7901 ja NCI-N87. Estämisen RABEX-5 ilmentyminen saavutettiin RNAi teknologia, ja knockdown varmistettiin Western blot. Meidän analyysit paljastivat, että solujen lisääntyminen oli merkittävästi vähentynyt SGC-7901 /KD ja NCI-N87 /KD-solujen ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin pesäkemuodostusta määrityksissä. Tärkeää on,

in vivo

ksenograftimalleissa tukenut näitä

in vitro

havaintoja. Tämä fenotyyppi voi johtua RABEX-5 säädellään tiettyjä geenejä ja signalointireittejä, mikä vaikuttaa solusyklin ja apoptoosin. Vuonna siirtokuoppaan määrityksissä, vähemmän SGC-7901 /KD ja NCI-N87 /KD solujen siirtynyt alempaan kammioon kuin kontrolli soluja, mikä viittaa siihen, että RABEX-5 parantaa muuttoliikettä ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Haavojen paraneminen oli myös huomattavasti vähentynyt seuraavat vaiennettu RABEX-5. Nämä tulokset osoittavat merkittävää roolia RABEX-5 mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja metastaattinen käytös. Kuitenkin tarkka molekyyli mekanismi, jonka RABEX-5 aikaan nämä vaikutukset on edelleen tuntematon, koska tutkimukset, joissa RABEX-5 ovat rajalliset.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RABEX-5 voi sitoutua spesifisesti aktiivinen muoto RAB- 5, mikä säännellään telakointi ja fuusio endosomaalisen kalvoja, motiliteettia endosomeista ja solunsisäistä viestintää [15]. Ekspression RAB-5-proteiinien on liittynyt kehittää erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [16] – [18] ja joka pystyy edistämään kasvainsolujen vaeltamista [19], [20]. Angiogeneesi on keskeinen rooli tuumorigeneesissä [21], ja säätelevät useat tekijät, kuten verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF) ja endoteelikasvutekijä (VEGF) [22]. PI3K /Akt-signalointireitin voidaan säädellä sekä VEGF ja PDGF. Esimerkiksi VEGF parantaa neuroblastooma leviämisen aktivoimalla PI3K /Akt signalointi [23]. Vastaavasti, tutkimukset ovat osoittaneet, että PDGF voi vaikuttaa siirtyminen solujen kykyä kautta PI3K /AKT-reitin [24]. Aktivoituminen PI3K /Akt signalointi voi estää apoptoosia useiden erilaisten ärsykkeiden indusoimaa [25] – [29], ja edistää solusyklin etenemisen [30], [31], mikä edistää solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota. Tämä polku on mukana myös angiogeneesiä [32], [33], ja sillä on tärkeä rooli kasvainten muodostumista, invaasio ja etäpesäkkeiden [34], [35]. Tutkimuksemme osoittaa, että RABEX-5 hiljentäminen laukaisee väheneminen VEGF ilme. Siksi oletamme, että RABEX-5 edistää kasvua ja metastaattisen kyvyn mahasyövän solujen aktivoitumisen kautta VEGF ja sen loppupään signalointireitteihin.

Yhteenvetona osoitamme, että RABEX-5 edistää leviämisen, pesäkkeiden muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasio, mikä viittaa siihen, että RABEX-5 voi olla onkogeenin mahasyövässä, ja sen vaikutukset voivat olla osittain välittämä modulaatio VEGF aktivointia. RABEX-5 voi siis edustaa uutta ja ennustavia merkki ja uusi terapeuttinen tavoite mahasyövässä. Enemmän olisi pyrittävä selvittämään signalointireittien taustalla nämä biologiset ilmiöt.