Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lähes kaikki eturauhasen syöpiä vastata androgeenideprivaatio hoitoa, mutta monet toistu. Me olettaisi, että riski hormoni paeta taajuuspainotetun ja viivästää vaikuttavat hormonihoito säännöt. Enemmän, hormonihoidot aiheuttaa ratkaiseva biologisia muutoksia, joihin liittyy androgeenireseptorien; jotkut saattavat olla tavoitteita paeta ehkäisyyn. Olemme tutkineet suhde androgeenideprivaatio hoitoon ja uusiutumisen riskiä käyttämällä nude-hiiriä, joissa on korkea laatu, hormoniriippuvaisen ihmisen eturauhassyövän ksenograftin PAC120. Tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin luteinisoivan-hormonia vapauttava hormoni (LHRH-antagonisti) yksin, jatkuva tai ajoittainen hoito, tai yhdistettynä androgeenireseptorin (AR) antagonistit (bikalutamidi tai flutamidi). Kasvaimen kasvua seurattiin. Biologisia muutoksia tutkittiin kuten genomista muutoksiin, AR mutaatioita ja proteiinin ilmentymistä suuri joukko toistuvia kasvainten mukaan hormonihoito säännöt. Therapies kohdistaminen Her-2 tai AKT testattiin yhdessä kastraatio. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Kasvaimen kasvu estyi jatkuvaa antamista LH-RH-antagonisti degareliksi (kastrointi), mutta 40% kasvaimista uusiutui. Ajoittainen kastraatio tai täydellinen salpaava vaikutus degareliksi ja antiandrogeenit yhdistelmä, esti kasvaimen kasvua, mutta lisäsi riskiä toistumisen (RR) verrattuna jatkuvaan kastraatio (RR

ajoittainen: 14.5, RR

täydellinen saarto: 6,5 ja 1,35). Toistuva kasvaimia näytetään

uusi

määrällisiä geneettiset muutokset ja AR mutaatioita, riippumatta hoitomuotojen. AR monistaminen jälkeen havaittiin täydellinen saarto. Lisääntynyt ilmentyminen Her-2 /neu usein ERK /AKT aktivaatio havaittiin kaikki vaihtoehdot. Yhdistelmä kastraatio kanssa Her-2 /neu-estäjän laski toistumisen riski (0,17) ja yhdistettynä mTOR-estäjä esti sen. Anti-hormoni hoidot vaikuttavat uusiutumisen riskiä vaikka kasvaimen kasvun estäminen oli aluksi samanlainen. Toistuva kasvaimet näkyvät geneettinen epävakaus, AR mutaatioita, ja korjauksilla fosforylaation polkuja. Olemme oletettu, että Her-2 /AKT reitit sallitaan pelastaa kasvainsolujen alle kastraatio ja olemme osoittaneet, että niiden esto esti kasvaimen uusiutumisen mallimme.

Citation: Guyader C, Céraline J, Gravier E, Morin A, Michel S, Erdmann E, et ai. (2012) vaara Hormoni Escape Human Eturauhassyöpä Malli Riippuu Therapy menettelytavat ja voidaan vähentää tyrosiinikinaasiestäjiksi. PLoS ONE 7 (8): e42252. doi: 10,1371 /journal.pone.0042252

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 tammikuu 2012; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2012; Julkaistu: 06 elokuu 2012

Copyright: © Guyader et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ARC ja Ligue contre le syöpä (Pariisi, Ranska). Nämä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. ARTIC rahoitti Englanti editointi.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Yksi tekijä työskentelee bioMerieux. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Androgeenireseptorin (AR) säätelee solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen normaalissa eturauhasessa ja eturauhasen karsinoomat (PCA). Näin androgeenideprivaatio on ensilinjan hoitoon PCa. Hormonihoito sisältää kastraatio farmakologisesti saavutetaan luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LH-RH) tai -antagonistit, AR-antagonistit kuten flutamidi tai bikalutamidi tai uusien hoitomuotojen kuten estäjänä 17-20 lyase (abirateronin asetaatti, TAK700) tai MDV3100 [1] . Hoidot annetaan jatkuvasti tai ajoittain, LH-RH estäjä ei yksinään, antiandrogeeni yksinään tai yhdistettynä tarkoitettua loppuun androgeenien saarto.

Riippumatta hormonihoito, useimmat kasvaimet reagoivat sitten hankkia androgeeniriippumattomuuteen ja uusiutua [2], [ ,,,0],3]. Useita mekanismeja on ehdotettu [4], [5].

i.

Perimän muutoksia tapahtuu aikana syövän etenemiseen, mutta niiden rooli on edelleen epäselvä, vaikka klonaalinen kromosomi poikkeavuuksia on löydetty PCa [6], [7].

ii.

Muuttaminen AR ilmaisu on usein johtuu geenin monistaminen [8], lisääntynyt transkriptio tai stabilointi AR proteiinin välityksellä fosforylaation spesifisten AR tähteiden [9], [10], AR mutaatioita, jotka laajentavat ligandi spektri [8], muutokset tumareseptori koaktivaattoreiden, ja ligandista riippumatonta sitoutumista AR DNA [2], [11]. Esiintyvyys ja vaikutus AR aiheuttanut muutoksia sairauden etenemiseen ei tunneta, koska vaihtelua hoitoyhdistelmien, rajoitettu pääsy materiaalia potilaille ja näin muutama kattava sekvensointi tutkimuksia.

iii.

Aktivointi eloonjäämisreittejä on mukana hormoni paeta [12], kuten Her-2 /neu (kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasi), mTOR /AKT (rapamysiinin kohde /AKT), tai ERK1 , 2 (solunulkoinen-signaali-säännelty kinaasi), kaikki sekaantunut AR fosforylaatioon [5], [10]. Her-2 /neu ilme on yleensä alhainen PCA. Kuitenkin korkea Her-2 /neu havaittiin liittyvän lyhentää eloonjäämisajasta alaryhmässä Eturauhassyövän potilaista [13], [14]. Enemmän, Craft

et al.

Osoitti, että pakko Her-2 /neu ilmaisu moduloi AR signalointi ja johtaa androgeeniriippumattomuuteen [15]. Muuntunut AKT polku liittyi PCa etenemiseen ja syntyminen AI kasvaimia [16]. Lisäksi Graff

et al.

Osoitti, että pakko yliekspressio AKT LNCaP solulinjassa nopeutetun kasvaimen kasvua [17]. AKT voisi olla vaihtoehtoinen tapa, jolla Her-2 /neu johtaa kieltää AR aktivointi [18].

Keskeinen kysymys klinikoilla, onko yksityiskohtaiset hormonihoidon eri vaikuttavat riski paeta. Vastata tähän kriittinen kysymys, käytimme kokeellista mallia hormoni riippuvainen ihmisen eturauhassyövän (PAC120), saadaan suoraan potilaan ja kasvava immuunipuutteisilla hiirillä. Arvioimme vaikutus eri hormonin hoitomuotojen on välitöntä vastausta ja uusiutumisen riskiä; biologiset muutokset liittyvät eri hoitoja, kuten genomin muutokset,

AR

mutaatioita, ja kasvutekijä ilmaisun /aktivointi tutkittiin. Osallistuminen fosforylaation koulutusjaksojen hormoni paeta johti meidät testaamaan yhdistelmä tyrosiinikinaasiestäjiksi farmakologisesti kastraatio vähentävän kasvaimen uusiutumisen.

Methods

Eturauhasen tuumoriksenografteja

PAC120, hormoniriippuvaisen ihmisen-in-hiiri PCa ksenografti, [19] ylläpitää sarjasiirteillä osaksi lapaluunvälisen rasva pad mies Sveitsin nude-hiirten (CRL: NU (Ico) -Foxn

LNU) Charles River (L ”Arbresle, Ranska) käytettiin välillä kohdat 47 ja 51. Tuumorin kappaletta 20 mm

3 ± 5 (± 20. 10

6 solua), jossa istuttaa. Kaikki noudatettavien institutionaalisten suuntaviivoja esiin Ranskan eettisen lautakunnan.

Hoidot

degareliksi (Firmagon® kutsutaan FE 200486 aikana se kehitys, Ferring Research Institute Inc., San Diego, CA) [20] ruiskutetaan ihon alle kuukaudessa 10 mg /kg [19], bikalutamidi (Casodex®, Astra Zeneca, Ranska) ja flutamidi (Eulexine®, Schering-Plough, Kenilworth, NJ) annettiin 50 mg /kg, suun, 5 päivää viikossa. Trastutsumabi (Herceptin®, Roche, Ranska) injektoidaan viikoittain 10 mg /kg intraperitoneaalisesti annon. Everolimuusin (Afinitor®, Novartis Pharma AG, Sveitsi) annetaan per os 2 mg /kg, 3 päivää viikossa. Määrittelemme jatkuvasti kastraatio kuin injektio degareliksi yksinään kerran kuukaudessa. Hiiriä pidettiin hoitoon asti uusiutumisen kasvain (kasvain oli saavuttaa 1500 mm

3). Ajoittainen kastraatio koostui 2 injektiota degareliksi päivänä 0 ja 28 (yksi jakso), sitten pysähtyi hoitoa, kunnes kasvain saavuttaa takaisin 2 kertaa alkutilavuuden. Täydellinen androgeenien saarto on yhdistys degareliksia kuukausittain yhdistettynä antiandrogeeninen -reseptoriestäjä (joko bikalutamidi tai flutamidi). Kuvio S1 esittää kaaviokuva hoitoja yksityiskohdista.

Tumor Growth arviointi

seuranta tuumorin kasvun tehtiin mukainen Marangoni et ai. [21]. Toistuminen määriteltiin päivissä vaaditaan kasvaimet saavuttaa 5-kertainen lisäys peräisin alkuperäisestä määrästä.

PAC120 ksenografti kasvain fragmentit satunnaisesti istutettiin 204 uroshiirillä. Heti kun kasvaimet saavuttivat keskimääräisen tilavuuden 63-250 mm

3, hiiret jaettiin hoitoon (

n

taulukossa S1). Sen jälkeen, kun kasvaimen uusiutumista, AI kasvaimet istutettiin farmakologisesti kastroitu uroshiirillä ja tunnettu varhaisessa kohdissa (1-4).

RT-PCR mRNA-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin, kuten aiemmin on julkaistu [21 ]. Sekvenssit alukkeiden on ilmoitettu Methods S1.

Functional AR Mutaation havaitseminen ADE2- Reporter Assay

Käytimme toiminnallinen määritys on EJ250 hiivakanta havaita AR mutaatioiden [22].

Androgeenireseptorin (AR) hiiva perustuva tehtävä määritys.

AR aktiivisuuden määritys suoritetaan rekombinantti EJ250 hiivakanta (MATa ade2-101 his3–D200 LEU2-D1 lys2-801 trp1-D1 ura3 -52 URA3: ARE-ADE2- [hlö /AREAde2]) käytettiin näytön kasvainnäytteestä AR mutaatioita kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. Tässä EJ250 hiivakanta, ekspressiota ADE2 reportterigeeni, joka on tarpeen adeniini biosynteesin, on asetettu tiukka androgeenin-promoottoriin [22]. Näin ollen, EJ250 hiivan kasvu perustuu transkriptionaalista aktiivisuutta ligandin aktivoitu androgeenireseptorin. Transformaation jälkeen AR ekspressioplasmidin kuten aiemmin on kuvattu [22], hiiva maljattiin selektiiviselle alustalle köyhdytettyä adeniinin ja jotka sisälsivät joko dihydrotestosteroni (DHT), dehydroepiandrostenedione, β-estradioli, progesteroni, 17A-hydroxyprogesterone, FLUTAMIDE tai syproteroniasetaatti (Sigma Aldrich St Quentin Fallavier, Ranska) on ilmoitetun pitoisuuden. Negatiivinen kontrolli (vehikkeli) ja positiivinen kontrolli (täydennetty adeniini) on myös mukana. Sovellettuna kasvain näytteet, mutatoitunut AR variantteja voidaan erottaa villityypin AR mukaan niiden reaktio steroidi tai steroidiset molekyyli lisätään keskipitkällä.

Detection of androgeenireseptorin (AR) mutaatiot Tuumorinäytteissä.

Lyhyesti, kokonais-RNA valmistettiin kasvainnäytteet (RNeasy Midi Kit, Qiagen, Courtaboeuf, Ranska). Käänteistranskriptio suoritettiin Omniscript käänteistranskriptio (Qiagen) 1 ug kokonais-RNA: ta. AR: n cDNA-fragmentit monistettiin eteenpäin (5′-TGCGGCGGCGCAGTGCCGCTAT-3 ’) (nukleotidit 2310-2339) ja reverse (5′-GGTGCCATGGGAGGGTTAGATAGGGAG-3’) (nukleotidit 4075-4101) alukkeita, jotka reunustavat eksonit 1-8 (GenBank NM_000044. 2, nukleotidit 2310-4101). Sen jälkeen 100 ng AR cDNA-fragmentit insertoitiin hiivan ilmaisu ”aukon korjaus” homologisen rekombinaation avulla, ja sen jälkeen, kun pinnoitus ja inkuboimalla 30 ° C: ssa 72 h, hiivan pesäkettä [22]. Villityypin AR määritettiin rinnakkain, kuten kokeellinen valvonta. Androgeenireseptorin riippuvainen hiivan kasvua vasteena steroidi tai antiandrogeeni lisättiin väliaineeseen arvioitiin pesäkkeitä pisteytys. Tiedot esitetään histogrammien vastaavan lukumäärän suhde hiivan pesäkkeiden teki pesäkkeiden lukumäärä saadaan, kun läsnä on 100 nM DHT. AR mutaatiot luonnehdinta, AR ekspressioplasmidin pelastettiin hiivasoluista sekvensointia. Lyhyesti, hiivat lyysattiin 150-212 um happopestyä lasihelmiä (Sigma Aldrich), ja plasmidi-DNA uutettiin kanssa NucleoSpin plasmidi Kit (Macherey-Nagel, Hoerdt, Ranska) ja käsitellään sekvensointia (GATC Biotech AG, Konstanz, Saksa ).

Protein Expression analysoitiin Western blot -menetelmällä

AKT, fosfo-AKT (S473), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology, Ozyme, Saint Quentin en Yveline, Ranska), ja PSA ( Dako) käytettiin 1:1000. Her-2 /neu (Cell Signaling), AR (Upstate, Millipore, Saint Quentin en Yveline), ja p-ERK1 /2 (RnD järjestelmät, Lille, Ranska) käytettiin 1:500. Anti-beeta-aktiini käytettiin 1:5000 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Ranska). Protokollia yksityiskohtaisesti Methods S1.

Comparative Perimän Hybridisaatio Arrays

Menettely on aiemmin julkaistu [24]. Suoritimme co-hybridisaation DNA uutetaan AI variantteja ja jotka tulevat PAC120p47. Vähäinen yhteinen muutokset tunnistettiin [25]. Hierarkkinen klusterointi suoritettiin profiileihin perustuen minimaalinen alueisiin. Euklidinen etäisyys käytettiin samankaltaisuutta toimenpiteen ja Ward algoritmi kuin agglomerative menetelmällä. Erotus ryhmiin ehdotettiin pohjalta rakenteen dendrogrammin.

Histologia

Light mikroskoopilla histologia tutkimuksissa käytettiin 4 um paksu formaliinilla parafiiniin upotetut leikkeet päässä PAC120, PAC120 jäljellä kasvaimet ja AI-variantit värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla safran.

tilastollinen analyysi

Käytimme Mann-Whitneyn testi, Kaplan-Meier selviytymisen tontteja, log-rank testejä, ja Fisherin testiä, mukaan vastaaviin kokeita kuten esitetään yksityiskohtaisesti menetelmät S1.

tulokset

in vivo

vastaus Hormoni hoito-ohjelmat

Jatkuva kastraation jonka degareliksi pidätettiin kasvu kaikkien PAC120 kasvaimia. Toistuminen havaittiin 8/20 hiirillä, joka mediaani viive 274 päivää [vaihteluväli 211-323] (kuvio 1A). Ajoittainen kastraatio testattiin mukaan seuraavalla tavalla: Ensimmäinen antaminen degareliksi vähensi kasvainten tilavuuden kaikilla eläimillä (14/14, 100%). Toinen anto annettiin kerran kasvain regrew on kaksijakoinen tilavuus, mediaani viive 119 päivää. Kuusi kasvaimia, käsiteltiin ei vastannut (6/14, 43%) ja 8 osoittivat vähän vastauksia tai stabilointi. Kaplan Meier-analyysi osoitti lisääntynyttä suhteellinen riski toistumisen 14,5 (95% CI: 2,98-70,9,

p

0,001, log-rank-testi) (kuvio 1A ja taulukko S2). Siksi ajoittainen androgeenideprivaatio lisääntynyt uusiutumisen riskiä ja vähentää aikaa taudin etenemiseen verrattuna jatkuvalla kastraatio.

A) Kaplan-Meier-analyysi hormoni paeta-elinaika jälkeen jatkuva (valkoinen neliö, täysi rivi), ajoittainen (valkoinen neliö, katkoviiva) degareliksi, bikalutamidi plus degareliksi (musta kolmio, täysi rivi) tai FLUTAMIDE plus degareliksi (musta kolmio, pisteviiva). B) Kasvaimen kasvukäyrät funktiona ajan ohjaus (valkoinen cercle, täysi rivi), bikalutamidi (valkoinen kolmio, täysi rivi), FLUTAMIDE (valkoinen kolmio, pisteviiva), degareliksi (valkoinen neliö, täysi rivi), bikalutamidi plus degareliksia (musta kolmio, täysi rivi) ja flutamidi plus degareliksi (musta kolmio, pisteviiva); C i) PAC120 -ksenografti [x200], jäljellä PAC120 kasvain (300 päivää) ii) [x100], iii) [x400], AI variantteja rauhasmainen toiminnot (iv) [x100], amphicrine ominaisuuksia (v) [x200], ja mucosecretant ominaisuudet (vi) [x200].

FLUTAMIDE tai bikalutamidi merkittävästi viivästynyt kasvaimen kasvua (

p =

0,03 ja

p

0,001, tässä järjestyksessä) (kuvio 1 B). Täydellinen androgeenien saarto (degareliksi plus bikalutamidi) pidätetty kasvaimen kasvua 30 käsitelty tapauksissa mutta 24. kasvaimia toistumisesta. Toistuminen tapahtunut aikaisintaan jälkeen kastraation yksinään (taulukko S2) ja lisääntynyt suhteellinen riski toistumisen (suhteellinen riski 6,55; 95% CI: 2,41-17,8,

p

0,001, log-rank-testi) (kuvio 1A ja Taulukko S2). Täydellinen androgeenien saarto kanssa degareliksi plus FLUTAMIDE johti 8/11 toistuva kasvaimia ja ajan mediaanin hormoni karkaamisen 253 päivää [vaihteluväli 43-337] (taulukko S2); kasvua uusiutumisen riski ei ollut tilastollisesti merkitsevä verrattuna degareliksi yksinään (

p =

0,561, log-rank-testi).

Histologinen ja Molecular Alterations Associated kanssa androgeeniriippumattomuuteen

Jäljellä PAC120 kasvaimia alle kastraatio osoitti nekroottisen alueilla, lukuisia mitoosien eikä apoptoottiset kappaleet (kuvio 1 C

ii iii

). Androgeeniriippumattomaksi (AI) variantit näytetään histologisia muutoksia, kuten mucinous neuroendokriinisiä kaltainen, tai rauhasmainen erilaistumisen piirteitä (kuvio 1C iv-vi). Kaikki AI vaihtoehdot näkyvät sekoittaa kuvioita, hallitsevat mucinous erilaistuminen ja /tai apocrine erilaistumista ja lukuisia Monitumaisia ​​soluja. Ei ole ominaisuuksia olivat liity tiettyyn hormonihoidon.

kromosomi vakautta PAC120 kasvainten läpi ajan ja kohtia on aiemmin osoitettu [24]. Teemme yhteistyötä hybridisoitiin AI DNA vanhempien PAC120 DNA paljastaa uusia muutoksia. Kolmekymmentäviisi minimaalinen alueita muutettiin ainakin 5 (20%) ja 26 AI variantit tutkittu. Yllättäen mikään muutokset olivat yhteisiä kaikille AI variantteja. Gene kopio voitot ja tappiot esitetään taulukossa S3. 26 AI variantit ryhmiteltiin muuntunut alueet viiteen eri ryhmään käyttämällä hierarkkista klusterianalyysin (kuva 2). Kuitenkin, emme löytäneet mitään hoitoa erityisiä mallia muutoksiin liittyy toistuminen (Fisherin tarkka testi ja Benjamini ja Hochberg korjaus säätää useita testaus). Nämä tulokset osoittavat, että androgeenien luotu satunnainen monimuotoisuuden uusia geneettisiä muutoksia, mutta mitään erityistä kuviota voitaisiin katsoa tyypin hoito. Näiden muutosten stabiilisti hankittu (tuloksia ei ole esitetty).

ei ollut suhdetta geenin kopioluvun muutoksia ja tyyppi hormonihoidon. Vasemmanpuoleinen sarake kertoo numeroituja AI variantit käsittelemällä jossa

de

merkitsee degareliksi,

de-a

degareliksi plus antiandrogeeni (bikalutamidi tai flutamidi),

de-t

degareliksia plus trastutsumabi. Vihreä ja punainen värit vastaavat tappiot ja voitot geenikopiomäärä, vastaavasti. Keltainen vastaa puuttuminen ero työpaikan geenikopiomäärä välillä AI variantteja ja vanhempien PAC120 DNA.

AR

geenimonistukseen havaittiin 15% (4/26) AI varianttien ja esiintyi vain AI johdettu jälkeen täydellinen saarto (AIDEn-a) ryhmä (taulukko S3). Taajuus geenimonistuman jälkeen täydellisen androgeenien saarto oli merkittävästi korkeampi kuin jälkeen kastraation yksinään (

p =

0,01, Fisherin eksakti testi). Näissä tapauksissa AR-mRNA-tasot nousivat on 10-20-kertainen, kuten oli kasvaimeen PSA-mRNA: n tasoja (kuvio S2).

AR

mutaatioita todettiin käyttäen funktionaalista hiivan perustuva määritys, kuten kuvattu aiemmin [22]. Ei toiminnallinen

AR

mutaatioita löydettiin PAC120 kasvain mutta esiintyi 28% (10/36) AI variantti kasvaimia. Eräs esimerkki profiilin saimme AIDEn-a4 on esitetty kuviossa S3. Mutaatiot esiintyi 46%, 17%, ja 25%, kun täydellinen saarto, antiandrogeenit ja degareliksi, vastaavasti (taulukko S4). AR cDNA sekvensointi paljasti 30 eri

AR

mutaatioita (kuvio 3, taulukko 1), joista 70% oli sijoitettu sarana-alueella (HR) tai ligandia sitova alue (LBD), 27% johti katkaistun AR proteiinia. Jotkut AI variantit näkyy useita mutaatioita. Vain Q693X oli yhteinen kaikille eri hormonihoitojen. Q693X mutaatio, samoin kuin muut ennenaikaisen stop-kodonit taulukossa 1, johtaa siihen, että katkaistun AR variantti, jolta puuttuu ligandia sitovan domeenin ja AF-2. Q693X AR variantti on havaittu myös ihmisen eturauhassyövän kasvaimia (julkaisematon data). Katkaistu AR variantit osoittavat konstitutiivisen transkription toimintaa aiemmin raportoitu [23]. Ne on liitetty kastraatio-vastus, koska ne voivat edistää eturauhasen syöpäsolujen kasvua in vitro soluviljelmissä ja eläinten kasvainmuotoja puuttuessa androgeenien (kuva S4). Useimmat mutaatiot olivat uusia.

Täysi korostaa osoittavat mutaatiot löytyy useampi kuin yksi kasvain käsiteltiin samalla agentti. Mutaatiot kuvattu sininen, vihreä tai punainen tausta on aikaisemmin kuvattu PAIS, CAIS ja PCA vastaavasti.

AR proteiinin taso (normalisoitu aktiini) oli lisääntynyt kaikilla AI vaihtoehdot (kuvio 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että AR muutokset ovat keskeisiä tapahtumia kasvaimen uusiutumisen jälkeen androgeenideprivaatio, tarvitaan eturauhassyövän solujen eloonjäämistä.

Actin käytettiin kontrollina lastaus proteiinia. B) histogrammit edustavat määrällisesti AR, Her-2 /neu ja suhteet Pakt /AKT ja Perk /ERK normalisoitu aktiini ja keskiarvo PAC120 peräisin eri kohdista (ilmaistuna mielivaltaisia ​​yksiköitä). AR (mustat palkit) ilmennettiin PAC120 ja kaikki AI variantit ja Her-2 /neu (pisteviiva harmaat palkit) yliekspressoitui kaikissa AI vaihtoehdot. Joko p-AKT /AKT (harmaat palkit täysi rivi) tai Perk /ERK (valkoiset pylväät) aktivoitiin AI varianttien. Lyhenteet käytetään tunnistamaan varianttien selitetään legenda kuvion 2

Her-2 /neu-proteiinia yli-ilmennetään kaikissa AI variantit (

n =

17) testattiin verrattuna PAC120 (kuvio 4). Lisäksi, AKT tai ERK1,2 tai molempia reittejä aktivoitiin useimmissa AI variantteja, jotka osoittavat, että tällainen aktivaatio liittyy paeta hormonin puutetta, ja osallistuu korvaavia mekanismeja AR aktivoinnin. Keskeinen rooli näiden fosforylaation reittejä epäsuorasti osoittaa voimakas vaikutus heidän eston.

Effects of Combination kastraatio kanssa tyrosiinikinaasiestäjiksi

Degarelix yhdistettynä trastutsumabi merkittävästi ja rajusti suhteellista riskiä toistuminen 0,17 (95% CI: 0,04-0,67,

p =

0,005, log-rank-testi) (kuvio 5A), ja pitkäaikainen keskimääräinen aika hormoni paeta 274-351 päivää (taulukko S2) versus kastraatio kanssa degareliksia yksin. Kasvaimen uusiutumisen havaittiin vain 17% (4/24) saavien eläinten yhdistelmähoidon. Trastutsumabi ainoana lääkkeenä ei ollut vaikutusta kasvaimen kasvuun.

B) kasvaimen kasvukäyrät funktiona ajan kontrolliryhmässä (valkoinen cercle, täysi rivi) ja ryhmissä everolimuusihoidon 2 mg /kg kolme kertaa viikossa (valkoinen timantti muoto, pisteviiva), degareliksi 10 mg /kg kuukaudessa (valkoinen neliö, täysi rivi) trastutsumabi plus degareliksi (cross, täysi rivi) tai everolimuusille plus degareliksi (black Diamond-muotoinen, täysi rivi).

Degarelix yhdistettynä everolimuusiin täysin esti hormoni karkaamisen 17 käsitellyt kasvaimet. Koska yhden aineena everolimuusia viivästynyttä kasvaimen kasvua ja TGI

36 päivää oli 59% (

p =

0,001, Mann-Whitney) (kuvio 5B).

Nämä tulokset osoittavat superior vaikutus kastraatio yhdistettynä HER-2 /neu kohdistamista vasta-aineita tai mTOR-estäjä.

keskustelu

suoritti

in vivo

kokeellinen tutkimus vaikutus eri hormonihoitojen riskistä hormonin paeta. Olemme perustaneet suuren joukon AI varianttien tutkia moninaiset geneettiset ja molekyylitason jälkeisistä tapahtumista hormoni paeta. Käytimme hormoniriippuvaisen ihmisen PCa ksenograftin (PAC120) [19]. PAC120 johdettu suoraan primäärikasvain potilaan. PAC120 osoitti silmiinpistävää karyotyyppi vakautta, ylläpidetään stabiili hormoni riippuvuus [24] ja puute

AR

mutaatioita, kun useita kohtia [19].

Jatkuva farmakologinen kastraatio pidätyksiä kasvaimen kasvua, pakenee esiintyy 40% tapauksista. Antiandrogeeni monoterapia hidasti kasvaimen kasvua. Tämä heijastaa kliiniset havainnot. Mallissa, täydellinen androgeenien saarto lisäsi riskiä hormoni paeta verrattuna kastraatio yksin. Näyttää siltä, ​​että täydellinen androgeenien saarto kohdistaa korkea paine AR signalointireitin, joka johtaa aktivoinnin useita eloonjäämisreittejä. Suuret satunnaistettuja tutkimuksia ja meta-analyysit osoittivat, että täydellinen saarto ei jatkanut aika taudin etenemiseen useimmilla potilailla [26]. Vaiheen II ja III tutkimuksissa verrattiin ajoittainen vs. jatkuva kastraatio eturauhassyövässä liittyi suurempi riski hormonin paeta tapauksessa ajoittaista kastraation, mutta eloonjäämiseen ei lyhennetty jälkeen ajoittaista androgeenideprivaatio verrattuna jatkuvaa annostusta paremman laadun elävien ja vähemmän kustannuksia [27], [28]. Ero meidän data voidaan selittää aggressiivisuus PAC120 (Gleason 9), kun taas kliinisissä tutkimuksissa oli mukana moninaiset eturauhasen kasvainten matala ja korkea laatu. Enemmän, aika valittu uudelleen hoito perustui unic parametrin, eli kasvaimen tilavuus, kun taas klinikalla useita parametreja pidetään (testosteronemia, PSA). Ajoittainen hoito saattaa olla tarkoituksenmukaista kaikissa tapauksissa eturauhasen syöpiä.

AI-variantit näkyvissä biologisia muutoksia. Histologia kasvaimia alle kastraation osoitti lukuisia mitoosin ja nekroottista alueilla, mikä viittaa tasapainoon mitoosia /solujen selviytymistä /kuolema ja erottaa kaikki käyttämättömät tilaa kasvainten jäämiä. AI-variantit näkyvissä sekoittaa kuvioita, mucinous tai /ja apocrine erilaistumista samanlainen vanhempien kasvain ja kukaan erityispiirteet hormoni hoitomodaliteettia.

tarkistanut, että syvästi muuttunut karyotyyppi PAC120 pysyi melko vakaana elinsiirron ja aika [24 ], ja osoitimme, että kastraatio johti aallon uuden genomista muutoksia. Lisäksi nämä hankitut muutokset ovat stabiileja (tuloksia ei ole esitetty) ehkä miksi hormoni itsenäisyyden peruuttamattomasti hankittu. Yllättäen yksikään uusista muutoksista olivat yhteisiä 26 AI variantteja. Geneettinen epävakaus tiedetään liittyvän syövän etenemisessä, meidän havainto viittaa tällaiseen etenemistä mekanismi [29], [30]. Sitten etsittiin muutoksiin liittyy AR ilme, geenimonistuksen tai geneettisiä mutaatioita.

AR

geeni monistuksia, havaittiin jälkeen täydellisen androgeenien saarto kuin todettu potilailla [31].

AR

mutaatioita, jotka edistävät hormoni paeta tarjoamalla suuremman vastaanottavaisuus AR muihin ligandeihin [8], vaikuttavat useat AR-riippuvaisia ​​prosesseja [2], [32]. Steinkamp

et al.

Raportoitu, että hormoni-naiivi PCa kasvain näytteissä oli hyvin vähän

AR

mutaatioita viittaa siihen, että nämä mutaatiot antoi heikon kasvun etu ja olivat itse asiassa satunnaisia ​​”matkustaja” mutaatioita [33]. Määritys käytimme nimenomaan valitsee

AR

mutaatioita, jotka vaikuttavat reseptorin toimintaa [22]. Havaitsimme valtava monimuotoisuus androgeenideprivaatio hoidon aiheuttama

AR

mutaatioita, vaikka hyvin harvat olivat yhteisiä kaikille AI variantteja ja enemmistöä ei kuvattu [34]. Kaikkiaan AI variantit kuvitettu oletetun moninaisuuden biologisten tapahtumien liittyy hormonin paeta ja korosti, että AR-riippuva ohjaus on edelleen keskeinen eturauhasen syöpiä. Uudet terapeuttiset lähestymistavat kohdistaminen AR reittejä estämällä joko 17-20 lyaasi tai siirtää reseptorin kohti ydin korostivat tätä keskeistä kysymystä [1]. Viimeinen datajoukon on toinen vaihtoehto estää AR polkuja, jotka voitaisiin käsitellä klinikoilla.

Tutkimme Her-2 /neu ja p-AKT ilmentymisen PAC120 AI varianttien onko kinaasin ja fosforylaatio reitit olivat mukana hormonitoimintaan paeta, mikä näkyy muiden [15], [18]. Kliinisissä näytteissä, Her-2 /neu ilmentymistä koholla AI kasvaimissa [14], [35] ja raportoidaan varhainen tapahtuma androgeenireseptorin riippuvuudesta itsenäisyyteen kytkin [36]. Ehdotettu mekanismi rooli Her-2 /neu hormonin paeta on, että tämä kinaasi aktivoi AR fosforylaatiota (välityksellä MAPK-reitin tai AKT-reitti) [18], [37], mikä puolestaan ​​ylläpitää AR eheyden ja siten sen toiminta puuttuessa testosteronia. Lin HK et ai., Osoittivat, että PI (3) K /Akt, mutta ei PI (3) K /p70S6K-signalointireitin voivat moduloida AR-transaktivaatiota. Käyttämällä herseptiini, me estää PI (3) K reitin alkupään, joka voisi selittää hidastanut kasvaimen paeta [38].

Muita muutoksia voidaan edistää ligandista riippumaton aktivointi AR. Menetys PTEN, PI3K mutaatio, AKT1 ja AKT2 vahvistus voi aktivoida AKT-kinaasi. Lisäys fosfo-AKT tasot havaittiin bicatulamide saaneilla PCa [39]. Meidän AI variantteja, Her-2 /neu ja p-AKT ilmentyminen /aktivaatio lisääntyi ja ennaltaehkäisevän vaikutuksen trastuzumab- tai everolimus- degareliksi yhdistetään hoitojen hormonin paeta osoittaa niiden avainasema. Her-2 /AKT ja mTOR reitit ovat tavoitteita saatavilla uusia estäjiä; trastutsumabi on osoittanut tehosta Her-2 /neu-monistettiin rintasyövän [40]. Wang et ai osoitettu eturauhassyöpäsolulinja että esto mTORC1 ja AR reitit yhdistelmällä rapamysiinin ja bicatulamide johti apoptoosin ja voisi olla terapeuttista arvoa eturauhassyövän hoidossa [41]. Tuore tutkimus osoitti LNCaP ja lyhyen aikavälin kokeilu eduksi saarto AR signalointia yhdessä mTOR polkuja [42]. Me raportoimme että nämä aineet yhdessä kastraatio suuresti vähentynyt androgeeniriippumattomuuteen, samanaikainen noudattamista. Lisäksi vahva tuki peräisin tutkimuksesta, jossa Everolimuusi yhdistettynä aromataasinestäjällä parannetun ilman taudin etenemistä potilailla, joilla hormonireseptori–positiivisten kehittynyt rintasyöpä aikaisemmin hoidettu steroideihin kuulumattomien aromataasinestäjillä [43].

Tuloksemme vahvistavat, että AR on edelleen keskeinen toimija PCA solujen eloonjäämistä, ja meidän tiedot viittaavat siihen, että androgeenireseptorin voi aktivoida vaihtoehtoisia väyliä johtaen androgeeniriippumattomuuteen. Lopuksi osoitimme, että yhdistelmä hoito kastraation kohdennettuja molekyylitason hoito vähensi riskiä hormonin paeta. Tämä tutkimus voi olla suurta vaikutusta hoidossa androgeeniriippuvaista eturauhassyövän ja dual esto on tutkimisen arvoinen kliinisessä ympäristössä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kaaviokuva

in vivo

hoito-ohjelmia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042252.s001

(TIF) B Kuva S2.

suhteellinen mRNA ilmaus androgeenireseptorin (AR) (mustat palkit) ja kasvaimensisäisenä eturauhasen antigeenin (PSA) (valkoiset pylväät) androgeenien riippumattomia (AI) vaihtoehdot. * Tarkoittaa variantteja monistettiin

AR

geenikopiomäärä. Lyhenteet käytetään tunnistamaan varianttien selitetään legenda Kuva 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0042252.s002

(TIF) B Kuva S3.

Hormoni vastaus profiili AIDE-a4 kastraation kestävä kasvain. Reagointikykyä AR avustaja-a4 kastraation vastustuskykyisten kasvainten arvioitiin käyttämällä hiivaperustaista funktionaalinen määritys ja verrattiin villityypin AR kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Histogrammit edustavat poikkeava vasteet saatiin 100 nM β-estradioli (E2) ja 1 uM syproteroniasetaatti (CPA) verrattuna villityypin AR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0042252.s003

(TIF )

Kuva S4.

konstitutiivinen aktiivisuus Q693X androgeenireseptorin variantti.