Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska pentaspan kantasolu markkeri CD133 oli osoitettiin sitoutuvan kolesterolin ja paikallistaa solukalvon ulokkeita, tutkimme mahdollisen toiminnon CD133 endosytoosiin. Käyttämällä CD133 siRNA knockdown strategiaa ja jaksottamattomat ihmisen paksusuolen syöpä Caco-2-solut, jotka konstitutiivisesti yliekspressoidaan CD133 tarjoamme ensimmäistä kertaa suoraa näyttöä rooli CD133 solunsisäisessä kertymiseen fluoresoivasti leimattuja solunulkoisen yhdisteitä. Arvioidaan käyttämällä AC133 monoklonaalinen vasta-aine, CD133 knockdown osoitettiin parantaa Alexa488-transferriini (Tf) ottoa Caco-2-solut, mutta ei ole ollut vaikutusta FITC-dekstraania tai FITC-koleran toksiinin. Absence of vaikutusta CD133 knockdown TF kierrätyksestä perustettu rooli CD133 estämään Tf endosytoosin sijaan herättämään Tf eksosytoosilla. Käytä aiemmin havaittuja estäjiä tunnetaan endosyyttisiin reittejä ja myönteiset vaikutukset CD133 Knockdown on soluunottoa clathrin-endosytoidut synteettinen lipidi nanocapsules tuettu että CD133 vaikutus endosytoosin oli ensisijaisesti syyttää clathrin polku. Myös kolesteroli uuttamalla metyyli-β-syklodekstriini up säänneltyjen Tf ottoa suurempi intensiteetin CD133

korkea tilanne kuin CD133

alhainen tilannetta, mikä viittaa rooli kolesterolin estävää vaikutusta CD133 endosytoosin. Mielenkiintoista, solu hoidon AC133 vasta-säädeltiin Tf ottoa, mikä osoittaa, että suora solunulkoinen sitoutuminen CD133 voisi vaikuttaa endosytoosin. Lisäksi virtaussytometria ja konfokaalimikroskopialla vahvistettu, että säätelyä alaspäin CD133 paransi saatavuutta TfR solunulkoisesta tilaa, joka tarjoaa mekanismin, jonka CD133 estivät Tf ottoa. Kuten Tf on mukana toimittaa rautaa soluun, vaikutukset rautalisää ja puutteen päälle CD133 /AC133 ilme tutkittiin. Molemmat osoittivat annoksesta riippuvaista säätelyä alaspäin tästä keskustellaan valossa transkription ja post-transciptional vaikutuksia. Yhdessä nämä tiedot laajentaa tietomme funktio CD133 ja korostavat edun edelleen tutkia CD133-Tf-rauta verkkoon.

Citation: BOURSEAU-GUILMAIN E, GRIVEAU A, Benoit JP, Garcion E ( 2011) merkitys Stem Cell Marker Prominin-1 /CD133 on otto Transferrin ja Iron Metabolism in Human Colon Cancer Caco-2 solut. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10,1371 /journal.pone.0025515

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 07 syyskuu 2011; Julkaistu: 26 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 BOURSEAU-GUILMAIN et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ”Institut National de la Sante et de la Recherche médicale”, The ”Axe Cellules Souches et Cancer” at ”Cancéropôle Grand-Ouest” ja ”La Ligue Contre le Cancer” läpi ”Equipe Labellisée 2007” avustus . Erika BOURSEAU oli aluksi PhD mies kanssa ”Conseil Général de Maine-et-Loire” ja sitten tohtorin mies kanssa ”Comité Départemental de Maine-et-Loire de La Ligue Contre le Cancer”. Audrey GRIVEAU oli PhD mies kanssa ”Conseil Général de Maine-et-Loire”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jälkeen uusien monoklonaalisten vasta-aineiden varalta neuroepithelial ja hematopoieettiset kantasolut, CD133, joka tunnetaan myös ihmisen ja jyrsijöiden, kuten Prominin-1, oli eristettiin ja kloonattiin ensimmäisenä vuonna 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 on viiden domeenin transmembraanisen proteiinin, joka koostuu N-terminaalisen solunulkoisen hännän, kaksi pientä sytoplasminen silmukkaa, kaksi suurta solunulkoista silmukkaa, joka sisältää seitsemän mahdolliset glykosylaatiokohdat ja lyhyen C-terminaalinen solunsisäinen hännän, joka voidaan vaihtoehtoisesti liitettyjä [4], tai fosforyloitu [5].

huolimatta jatkuvasti tutkimustyötä, biologista funktiota CD133 edelleen suurelta osin tuntemattomia. Niistä tunnettuja fenotyyppejä, on osoitettu, että katkaistun CD133, jota ei ole kuljetetaan solukalvon johtaa ihmisen verkkokalvon rappeuma [6]. Korostaa tässä tärkeä havainto, analyysi sukupolven CD133-hiirillä ilmeni, että vaikka on ilmaistu hyvin varhaisessa vaiheessa verkkokalvon kehitystä, CD133 toiminut keskeisenä säätelijänä levyn morphogenesis ja häviäminen CD133 aiheuttanut fotoreseptorilla rappeutuminen ja sokeus [7]. Lisäksi, AC133, glykosyloitu epitooppia CD133-proteiinin alun perin liittyy alkion kantasoluja [8] ja erilaisia ​​somaattisia kantasoluja, on laajasti kuvattu oletetun syövän kantasolujen markkerina veressä, aivoissa, paksusuolen, eturauhasen, keuhko-, rinta- , maksa, ja ihosyöpiä [9], [10]. Muut tutkimukset osoittivat, että CD133 liittyy solujen aineenvaihduntaa kuin glukoosi reagoiva geenin lihasputkia [11], sekä tarjoaa todisteita bioenergetic stressin [12] ja ei-altistuminen korkeille hapen paine glioomis- (BOURSEAU-GUILMAIN et al. toimitti).

Tällä subcellular tasolla, CD133 on edullisesti lokalisoitu solukalvon ulokkeita ja mikrovilluksen [13]. Sieltä CD133 voi sitoutua kolesterolia [14] ja vuorovaikutuksessa gangliosidien [15]. Koska kalvo ulokkeita ja mikrovillukset laajentamista kalvon pinnan lisäämiseksi solujen altistuksen solunulkoiseen tilaan, nämä havainnot tarjoavat tärkeitä vihjeitä tunnistaa molekyylitasolla rooli CD133, erityisesti kun otetaan huomioon solujen vaihdot microenvironment. Todellakin, CD133 löydettiin membraanivesikkeleihin erillään eksosomeiksi jotka vapautettiin epiteelisolujen erilaistumisen aikana [16].

Samanaikaisesti näiden ulkopuolella-in signaaleja, kolesteroli ja sfingolipidejä segregoitu- lipidilautan kalvo mikrodomaineja sekaantunut sisällä uloskirjautuminen signalointi ja endosytoosin [17], [18]. Kun otetaan huomioon tiukka suhde CD133 ja kolesterolin sekä sen mahdollista yhteyttä sfingolipidit ja altistuminen solunulkoiseen tilaan, me arveltu, että CD133 on mukana endosytoosin: perustavanlaatuinen prosessi, jossa solunulkoinen yhdisteet sisäistetään ja jaetaan solunsisäisiin osastoihin.

esillä olevassa tutkimuksessa, käyttäen RNA-interferenssin strategian ja erilaistumaton ihmisen paksusuolen syövän Caco-2-solut, jotka konstitutiivisesti yli-ilmentynyt CD133 /AC133, tarjoamme ensimmäistä kertaa näyttöä rooli CD133 solunsisäisessä kertymiseen solunulkoisen yhdisteiden erityisesti esimerkkeinä transferriiniä (Tf). Lisäksi tiedot, joissa osoitetaan rooli CD133 endosytoosiin, myös osoittamaan, että CD133 itse säätelee raudan, mikä tukee olemassaolon Tf-CD133-rauta verkkoon. Nämä uudet havainnot käsitellään valossa CD133 rakenteessa ilmaisun ja nykyisen tietämyksen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Eriyttämätön ihmisen paksusuolen syöpä Caco- 2-solut (American type Culture collection: HTB-37 ™) viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM; Lonza, Levallois-Perret, Ranska), joka sisälsi 4,5 g /I glukoosia ja L-glutamiinia. Alustaa lisättiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Lonza, Verviers, Belgia), 1% antibiooteilla (10 yksikköä /ml penisilliiniä, 10 mg /ml streptomysiiniä, 25 ug /ml amfoterisiini B: tä, Sigma-Aldrich, Saint- Louis, USA, MO) ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Lonza, Verviers, Belgia). Kun solut saavuttivat 80% konfluenssin, ne hajotettiin 0,5% sian trypsiiniä ja 0,2 g /ml EDTA (Lonza, Verviers, Belgia) ennen uudelleen pinnoitus päällystämättömän muovi pulloissa 15 x 10

3 solua /cm

2. Puolet elatusaine korvattiin tuoreella alustalla joka toinen päivä.

siRNA knockdovvn CD133

Caco-2-solut maljattiin kuuden kuoppalevyillä 2,3 x 10

5 solua kuoppaa kohti 2 ml edellä mainitun väliaineen 24 tuntia. Väliaine poistettiin ja solut transfektoitiin 30 nM RNA oligonukleotididuplekseilla (Sigma-Aldrich) käyttäen N-TER mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden mukaisesti (Sigma-Aldrich). N-TER /siRNA komplekseja inkuboitiin sitten Caco-2 väliaine 48 tuntia 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. siRNA poistettiin sitten ja korvattiin tuoreella alustalla 24 tuntia. Sekvenssi sekoituskoodin käytettiin negatiivisena kontrollina: 5′-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 ’. Sekvenssi käytetään suorittamaan kohdennettuja RNA-interferenssi eston CD133 oli 5’-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 ’.

AC133 immunoleimaus

Caco-2-soluja altistetaan siRNA kerättiin ja hajotettiin käyttämällä Versene (Lonza) . Soluja inkuboitiin 5 ug /ml AC133-vasta-aine (Miltenyi Biotech, Pariisi, Ranska) tai IgG1κ isotyyppikontrolli (BD-Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa PBS: ssä, joka sisälsi 5% FBS: ää ja 0,02% natriumatsidia. Sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä, joka sisälsi 5% FBS: ää ja 0,02% natriumatsidia, ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa FITC-konjugoidun vuohen anti-hiiri-IgG-F (ab ’) 2-fragmentti polyklonaalista vasta-ainetta (DakoCytomation, Trappes, Ranska) 20 ug /ml PBS: ssä, joka sisälsi 5% FBS: ää ja 0,02% natriumatsidia. Seuraavat kolme pesua PBS: ssä, joka sisälsi 5% FBS: ää ja 0,02% natriumatsidia, solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 2% formaldehydiä ja 0,02% natriumatsidia.

Virtaussytometria

BD FACSCalibur ™ fluoresoiva aktivoituva virtaussytometrillä ja BD CellQuest ™ ohjelmistoa (BD-Biosciences) käytettiin virtaussytometriaa hankintaan. Analyysi suoritettiin käyttäen WinMDI 2,9 ohjelmistoa (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA).

synteesi Nile red-leimattua lipidiä nanocapsules (NR-LNC) B

50 nm Nile red ( NR) -leimattua lipidi nanokapselit (LNC) (NR-LNC), joka sisälsi fluoresoivaa yhdistettä NR valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [19] käyttämällä faasinvaihtomenetelmällä joka seuraa muodostuminen öljy /vesi-mikroemulsio, joka sisältää triglyseridejä (Labrafac® WL 1349, Gattefosse, Saint-Priest, Ranska), ionitonta hydrofiilistä pinta-aktiivista ainetta (Solutol® HS 15, Gmbh, Ludwigshafen, Saksa) ja lesitiinit (Lipoïd® S75-3, Gmbh). NR liuotettiin asetoniin 1% (w /w), ja tuloksena saatu NR liuos sisällytetty Labrafac® klo 01:10 (w /w). Siten 846 mg Solutol®, 75 mg Lipoïd®, 1029 mg Labrafac® sisältävät NR, 89 mg NaCl: a ja 2975 mg vettä sekoitettiin ja kuumennettiin magneettinen sekoittaen 85 ° C: ssa. Kolme sykliä progressiivinen lämmityksen ja jäähdytyksen välillä 85 ° C ja 60 ° C: ssa jälkeen toteutunut. Lopuksi ne seuraa peruuttamaton indusoima sokki laimentamalla 12,5 ml: lla 0 ° C: ssa deionisoitua vettä lisätään inversio vaiheen vyöhyke. Kokoekskluusio- ja korkean paineen nestekromatografialla (HPLC) määritykset osoittivat täydellisen kapseloinnin ja säilyttäminen NR, kuten aikaisemmin on havaittu [19]. LNC analysoitiin niiden kokojakauma käyttäen Malvern Zetasizer® Nano Series DTS 1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).

sisäistäminen transferriiniä (Tf), dekstraani (Dx), koleratoksiinin B-alayksikköä (CTB ) ja lipidi nanokapselit (LNC) B

väliaine transfektoiduista soluista poistettiin ja korvattiin DMEM: 1% seerumitonta N1 väliaineessa (Sigma Aldrich) 1 h. Seuraavat kolme yhdisteet, Tf-Alexa 488 0,5 ja 5 ug /ml: lla (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska), Dx-FITC 0,5 ja 5 mg /ml (Sigma Aldrich) ja CTB-FITC 1 ja 10 ug /ml (Invitrogen), tai sen sijaan, NR-LNC 1/1000 laimennus alkususpensiota vastaa siten 100 ug /ml pitoisuuden, lisättiin sitten väliaine 1 h. Sitten solut hajotettiin käyttämällä Versene (Lonza). Jotta määritys osa merkittyjä molekyylejä tai partikkeleita, jotka on tosiasiallisesti sisäistää soluissa, solunulkoinen fluoresenssi sammutettiin käyttäen 0,4% trypaanisinistä (Sigma Aldrich). Sitten solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 2% formaldehydiä ja 0,02% natriumatsidia. Sisäistäminen fluoresoivasti leimattuja Tf, Dx, CTB ja LNC seurattiin virtaussytometrialla.

Analyysi vapauttamaan Tf peräisin Caco-2-solujen jälkeen sisäistämisen

Ohjaus ja CD133-spesifisiä siRNA käytettiin tuottaa CD133

korkea ja CD133

matalan transfek- Caco-2-soluissa, vastaavasti. Sitten soluja inkuboitiin Tf-Alexa 488: ssa 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa /5% CO

2 ennen solunulkoinen väliaine poistettiin, pestiin ja korvattiin tuoreella alustalla vapaa Tf-Alexa 488. Sen jälkeen kun vielä oli inkuboitu 37 ° C /5% CO

2 1 h, 2 h ja 3 h, jäljellä oleva solunsisäinen Tf-Alexa 488 fluoresenssin, mikä määrä Tf-Alexa 488, jota ei ole kierrätetty solunulkoiseen osastoon, mitattiin puoli- kvantitatiivinen virtaussytometrillä, kuten on kuvattu edellä.

Cell, käsitelty kemiallisilla estäjien endosytoosin ja soluunottoa Tf

aiemmin tunnistetut kemialliset estäjät tunnettuja endosyyttisissä reittejä käytettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [19], [20 ], [21]. Lyhyesti, transfektoitiin Caco-2-soluja esikäsiteltiin estäjillä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa N1 väliaineessa. Klooripromatsiini (10 ug /ml; Sigma-Aldrich) käytettiin estämään clathrin-välitteisen kuljetuksen [22], kun taas filipiini (1 ug /L; Sigma-Aldrich) ja dimethylamiloride (DMA, 10 uM, Sigma-Aldrich) käytettiin estävät kaveoleja riippuvaisen endosytoosin [23] ja macropinocytosis [24], tässä järjestyksessä. Kolesterolin väheneminen saatiin 2 tunnin esikäsittely metyyli-β-syklodekstriini (MβCD, 10 mM, Sigma-Aldrich) läsnä ollessa, lovastatiinin (1 ug /ml; Sigma-Aldrich) [25], [26]. Sen jälkeen, soluunottoa 5 ug /ml Tf-Alexa 488 seurattiin virtaussytometrialla analyysi edellä kuvatulla tavalla. Kolesterolin esto, 1 ug /ml lovastatiini myös säilytetään keskipitkällä hoidon aikana Tf-Alexa 488.

Analyysi Tf oton Caco-2-solujen käsittelyn jälkeen AC133 vasta-

Caco-2-solut maljattiin 2,3 x 10

5 24-kuoppaisille levyille 400 ul: aan seerumia sisältävää alustaa. Sen jälkeen, kun 24 tunnin alkuperäisen inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa /5% CO

2 ensimmäinen väliaine korvattiin N1 seerumittomalla väliaineella ennen inkubaatiota joko 0, 5 tai 10 ug /ml: aan AC133-vasta-aineen tai isotyyppikontrolli-IgG1κ . Tf-Alexa 488 lisättiin sitten 5 ug /ml ja inkuboitiin 37 ° C: ssa /5% CO

2 1 h tutkia vaikutusta immunoglobuliinin hoidon tf-Alexa 488 ottoa. Tf-Alexa 488 sisäänotto kvantifioitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu edellä.

Vasta tunnustamista tf-reseptorin pinnalla Caco-2 cell riippuen tasosta CD133 ilmentymisen

Caco-2-soluja altistuvat CD133 tai ohjaus siRNA kerättiin ja hajotettiin käyttämällä Versene (Lonza). Soluja inkuboitiin 5 ug /ml CD71 hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa Tf reseptorin (TfR tai CD71-antigeeni) (klooni M-A712, BD-Biosciences) tai 5 ug /ml IgG2a, κ isotyyppikontrollilla (BD-Biosciences) ja edetä immunoleimaus ja virtaussytometria edellä kuvatulla tavalla AC133 solun pinnalla tunnustamista.

Immunocytochemisty yhdistettynä CLSM tunnistamiseksi AC133, CD71 ja clathrin raskaan ketjun sisällä Caco-2-solut

Caco-2-solut maljattiin 4 x 10

3 solua per kuoppa kahdeksan hyvin Lab-Tek Chamber diat (Nunc, Roskilde, Tanska) 300 ui DMEM, joka sisälsi 10% FCS: ää 24 tunnin ajan. Sitten ne altistettiin CD133 tai valvoa siRNA edellä kuvatulla ennen edetä immunosolukemiallinen. Sitten solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä (pH 7,4) 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sen jälkeen pesun PBS: llä, solut altistettiin 60 minuutin ajan huoneen lämpötilassa esto liuokseen, jossa oli PBS: ää, joka sisälsi 4% naudan seerumin albumiinia (Sigma-Aldrich) ja 10% normaalia vuohen seerumia (Sigma-Aldrich). Ensisijainen monoklonaalisia vasta-aineita CD133 (IgG1κ, Miltenyi Biotech), TfR tai CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) tai clathrin raskaan ketjun (CHC) (lgG1, BD-Biosciences) inkuboitiin 5 ug /ml PBS /BSA 4% yön yli 4 ° C: ssa. Huomaa, että CHC solunsisäisen immunoleimaus, Triton X-100 lisättiin 0,1% vuoden esto menettelyn solun läpäisevyyttä. Pesujen jälkeen sekundaarinen hevosen anti-hiiri-biotiini-konjugoitu vasta-aine (Vector, Burlingame, CA) käytettiin 1/100 PBS /BSA 4% 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Jälkeen lisäpesua, streptavidiini Fluo Probe Alexa 488 (Interchim, Montluçon, Ranska), laimennettu 1/700, on käytetty. Solut pestiin lopuksi ja asennettu alle peitelasi fluoresoivassa kiinnitysväliaine (DakoCytomation). -konfokaalimikroskoopilla Kuvat saatiin käyttäen Olympus Fluoview ™ FU 300 CLSM kuvantamisjärjestelmä (Pariisi, Ranska).

Iron hoitoja

Caco-2-solut maljattiin kuuden kuoppalevyillä 2,3 × 10

5 solua per kuoppa 2 ml: ssa 24 tuntia. Ennen rauta-hoidon aloittamista, FBS sisältävä väliaine korvattiin seerumittomalla N1 väliaineessa vielä 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla (50-800 uM) rauta nitrilotrietikkahappo (Fe-NTA), 72 tuntia 37 ° C: ssa /5% CO

2, kuten on osoitettu. Fe-NTA (moolisuhde 01:04) oli ex tempore valmistettiin 20-mM kannan NTA ja Ferrikloridiheksahydraatti (Sigma-Aldrich). Soluja vaihtoehtoisesti käsiteltiin FeSO

4 (Sigma-Aldrich), toinen rauta luovuttajan [27], [28], joko 150 tai 300 uM 24 tuntia.

Rauta puutteesta ja hoidon hypoxia- jäljittelevää aineet

Noudattamalla samanlaista viljelmä kuin ennen raudan käsittelyä solut sen sijaan käsiteltiin 24 h rautaa kelatoiva, joka tunnetaan myös hypoksian jäljittelevää ainetta, desferrioksamiini (DFO, Sigma-Aldrich) 100 ja 150 uM [29], [30]. Vaihtoehtoisesti ne käsiteltiin 24 tunnin ajan yhdessä hypoksian jäljittelevää ainetta, joka toimii itsenäisesti raudan puutteesta, koboltti kloridi (CoCl

2, Sigma-Aldrich) 100 ja 150 uM [31].

Tietokanta , bioinformatiikan

Jos haluat etsiä otaksuttu raudan reagoivan elementin (IRE) sekvenssit sisällä 3 ’ja 5’ transloimaton alue (UTR) ihmisen CD133 mRNA sekvenssit tässä tutkimuksessa käytetyt (joista

Homo sapiens

prominin 1-transkriptin variantti 2, NM_001145847.1) saatiin NCBI GenBank. Kaikki sekvenssirinnastukset suoritettiin käyttämällä ClustalW tietokoneohjelmaa EMBL Euroopan bioinformatiikan instituutin (Heidelberg, Saksa). Uroksella (etsivät IRES) web-palvelimen (https://ccbg.imppc.org/sires/) käytettiin myös ennustamiseen raudan reagoivat elementtien RNA [32].

Tilastollinen analyysi

XLSTAT 2006 Version 2006,3 (Addinsoft Pariisi, Ranska) käytettiin analyysiin. Tilastollinen merkitsevyys kunkin kokeen määritettiin Dunnettin testillä. Kokeet pitää merkittävinä kanssa p-arvot 0,05.

Tulokset

vaikutus tiettyjen siRNA-välitteisen knockdovvn CD133 kertymiseen solun Tf, Dx ja CTB jaksottamattomat Caco -2-solut

määrittämiseksi mahdollinen vaikutus CD133 kerääntyminen solun ekstrasellulaarisen yhdisteiden, ei-eriytetty ihmisen koolonin karsinooman Caco-2-soluja, jotka luonnollisesti ilmentävät korkeita CD133, käytettiin. Käyttämällä joko siRNA, joka ei johda transkription säätely alaspäin (kontrolli siRNA) tai siRNA, jolla ei säätelisi kohdennettuja CD133 mRNA ja proteiinin ilmentyminen (CD133 siRNA), kaksi tilannetta analysoitiin: Caco-2-solut ilmentävät korkeita CD133, ja Caco -2 solut ilmentävät alhainen CD133. Kuvio 1A osoittaa, että hoito Caco-2-solujen 30 nM CD133 siRNA tehokkaasti vähensi 52 ± 11% CD133-proteiinin ekspression, analysoitiin virtaussytometrialla immunofluoresenssilla (AC133-vasta-aine) kontrolliin verrattuna siRNA. Analysoida Caco-2 cell pinocytic kyky että CD133

korkea ja CD133

alhainen tilanteita, kertymiseen solun eksogeenisen merkkiaineiden pinocytic polkuja jälkeen seurattiin. Vaikka vaihtoehtoisia sisäistäminen väyliä on kuvattu riippuen solutyyppejä ja erilaistumisen tila (katso katsaus [33]), Tf-Alexa 488, Dx-FITC ja CTB-FITC käytettiin prototyyppi merkkiaineiden reseptorin endosytoosin [34], nestefaasin endosytoosin [24], [35] ja kaveoleja riippuvainen endosytoosin [23], [36], tässä järjestyksessä. Virtaussytometria mittaus solunsisäisen fluoresenssin 1 h kuluttua altistuksen CD133

high-Caco-2-solut joko 0,5 tai 5 mg /ml Dx-FITC, 1 tai 10 ug /ml CTB-FITC ja 0,5 tai 5 ug /ml Tf -Alexa 488 käytössä 100% ottoa voidaan mitata verrattuna pohjapinta GEOMEAN fluoresoiva intensiteetti ajoneuvon yksin käsiteltyjä soluja edustavat 0% ottoa. Vaikka CD133 Knockdown ollut vaikutusta solunsisäiseen kertymiseen Dx-FITC (kuvio 1 B) tai CTB-FITC (kuvio 1 C), soluunottoa Tf-Alexa 488 oli merkittävästi monistettiin CD133

matala-Caco-2-solut riippumatta pitoisuus testattiin (kuvio 1 D). Nämä tiedot vahvistettiin ensimmäisen kerran, että CD133 toimii modulaattorin solunsisäisen kertymisen eksogeenisten yhdisteiden.

A) Immunofluoresenssi liittyvä virtaussytometrianalyysin CD133 ilmaisun jaksottamattomien Caco-2-soluja käsiteltiin 30 nM ohjaus- tai CD133-spesifisiä siRNA. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina verrokkihoito, jotka edustavat GEOMEAN fluoresenssin intensiteetin taso saadaan, kun AC133 immunovärjäystä käsiteltyjen solujen merkitystä siRNA (CD133

korkean Caco-2-solut); Huomaa tehokasta säätelyä alaspäin CD133 kun CD133-spesifisiä siRNA (CD133

matalan Caco-2-solut) käytettiin. B-D) virtaussytometrianalyysin solunsisäisen oton Dx-FITC (B), CTB-FITC (C) ja Tf-Alexa 488 (D) sisällä CD133

korkea ja CD133

matalan Caco-2-solujen jälkeen 1 h inkubointi 37 ° C: ssa /5% CO

2. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina kontrollista, mikä edustaa GEOMEAN fluoresenssin intensiteetin taso saadaan solut, joita käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Data edustaa keskiarvoa ± s.e.m. saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Dunnettin testillä: ** p 0,01, *** p 0,001

vaikutus siRNA-välitteisen knockdovvn CD133 Tf eksosytoosia

Kun otetaan huomioon, että CD133 näytti olevan estäjä soluunottoa Tf mutta sillä ei ole vaikutusta Dx ja CTB, me edelleen keskitettävä suhdetta CD133 ilmaisun ja Tf kertymistä. Mahdollinen vaikutus siRNA-välitteisen knockdovvn CD133 Tf-Alexa 488 eksosytoosilla syystä tutkittiin. Tätä tarkoitusta varten CD133

korkea ja CD133

matalan jaksottamattomia Caco-2-soluja inkuboitiin Tf-Alexa 488 2 tuntia 37 ° C: ssa /5% CO

2 ennen solunulkoiseen poistettiin , pestiin ja korvattiin tuoreella alustalla vapaa Tf-Alexa 488 jälkeen inkuboitiin edelleen 1, 2 ja 3 tuntia 37 ° C: ssa /5% CO

2 määrän Tf-Alexa 488, jota ei ole kierrätetty solunulkoiseen laatikolla mitattiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Data on esitetty kuvassa 2 osoitettu, että solunsisäisiä tasoja Tf-Alexa 488 väheni inkubaatioajan. 1 tunnin inkuboinnin yli 80% internalized Tf-Alexa 488 pysyivät soluissa sekä CD133

korkea ja CD133

alhaiset ilmentäviä soluja samalla kun 3 tunnin inkuboinnin, 54 ± 9% ja 43 ± 4 %: n internalized Tf-Alexa 488 pysyivät CD133

korkea ja CD133

alhainen ilmentäviä soluja, vastaavasti. Kuitenkin aina tutkittu, ei havaittu merkittävää eroa riippuen CD133 ilmentymistasoihin (kuvio 2). Nämä havainnot korosti, että vaikka Tf kierrätys tapahtui molemmissa CD133

korkea ja CD133

matalan jaksottamattomia Caco-2-solut, lyhyellä aikavälillä erot solunsisäisen Tf kertymiseen johtuvat pääasiassa vaikutuksesta CD133 endosytoosin mekanismien sijasta eksosytoosilla .

CD133

korkea (ohjaus siRNA) ja CD133

alhainen (CD133 siRNA) jaksottamattomat Caco-2 solut altistettiin Tf-Alexa 488 2 tuntia 37 ° C: ssa /5% CO

2 ennen solunulkoinen väliaine poistettiin, pestiin ja korvattiin tuoreella alustalla vapaa Tf-Alexa 488. määrät Tf-Alexa 488, joita ei kierrätetä solunulkoiseen osastoon mitattiin virtaussytometrianalyysillä jälkeen edelleen solun inkuboitu 37 ° C /5% CO

2 1 3 tuntiin. Tiedot ilmaistaan%: na Tf-Alexa 488 aluksi sisäistetty. Ne edustavat keskiarvoa ± s.e.m. saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

vaikutus kemiallisen estäjiä tunnetaan endosyyttisissä reitit ottoa Tf jaksottamattomilla Caco-2-soluja riippuen tasosta CD133 ilmentymisen korosti, että clathrin reitin

Todettuaan, että ilmentymistaso on CD133 oli vaikutusta Tf oton sisällä jaksottamattomia Caco-2-solut, mutta ei moduloida Tf kierrätykseen, me sitten käsitteli kysymystä siitä CD133 on mukana tiettyjä pinocytic reittejä [ ,,,0],33]. Tätä varten ottoa Tf-Alexa 488 sisällä CD133

korkea ja CD133

alhainen ilmentävien solujen seurattiin hoidon jälkeen on aiemmin määritelty kemiallisia estäjiä tunnetaan endosyyttistä polkuja. Klooripromatsiini käytettiin estämään clathrin välittämää [22], filipiini estää kaveoleja riippuvainen endosytoosin [23] ja DMA estää macropinocytosis [24]. Virtaussytometria todettu, että esikäsittely ohjaus CD133

high Caco-2-solujen filipiini, klooripromatsiini ja DMA ennen altistusta 5 ug /ml Tf-Alexa 488, johti 30%, 90% ja ei-merkitsevä väheneminen Tf oton , vastaavasti (kuvio 3A). Suurimmat vaikutukset klooripromatsiini yhdessä lievempi vaikutus filipiini näin korosti, että Tf kasaantumisen jaksottamattomia Caco-2-solujen johtui pääasiassa clathrin välittämää kuljetusta [37]. Filipiini vaikutus voidaan selittää sillä, endosytoosin Protopic substraatteja reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, kuten LDL tai Tf, joka yleensä reitti solunsisäiseen osastoon kautta clathrin reitin, voitaisiin vaihtoehtoisesti käyttää kaveoleja reitti [38], [39] . Lisäksi, kuten kolesteroli on osoitettu olevan mukana muodostumiseen clathrin päällystetyn endosyyttisissä rakkuloiden [26], filipiini, joka sequestrates kolesteroli, voi olla myös välillistä vaikutusta clathrin endosytoosin. Mielenkiintoista on, että kun otetaan huomioon CD133 pudotus ja CD133

alhaisen Caco-2-solut, erittäin samanlainen saatiin filipiini, klooripromatsiini ja DMA, joka johtaa 18%, 85% ja ei-merkittävä väheneminen Tf oton, vastaavasti (kuvio 3A) . Siten määrällisiä vaikutuksia CD133 Tf endosytoosin näyttävät olevan liittyvät pääasiassa clathrin-riippuvaisen reitin. Yllättäen kolesteroli ehtyminen, saavuttaa käyttämällä MβCD yhdistettynä lovastatiinin [25], [26], joka on sanottu vaikuttavan clathrin riippumattomia polkuja ja jossain määrin clathrin riippuvaisia ​​reittien [26], [40], [41], johti merkittävä parannus Tf-Alexa 488 kasaantumisen CD133

high Caco-2-solut (+ 49%, kuvio 3A). Mielenkiintoista, vaikutukset kolesteroli ehtyminen TF-Alexa 488 oton sisällä CD133

matalan Caco-2-solut oli vähäisempää (+ 21%, kuvio 3A). Nämä viimeiset tiedot tukevat hypoteesia, että CD133 vuorovaikutus solunsisäisen kolesterolin myös vaikuttaa Tf endosytoosin. Edelleen vahvistaa mahdollisen yhteyden CD133 ja clathrin riippuva endosytoosin reitin, vaikutus CD133 Knockdown annetun oton synteettisten nanohiukkasten (LNC), jotka on kuvattu aikaisemmin käyttämään clathrin polku matkalla solunsisäiseen tilaan Caco-2-solut [ ,,,0],21] tutkittiin. Mielenkiintoista, kuten loisteputki Tf, otto fluoresoivasti merkittyjen LNC (NR-LNC) oli merkitsevästi korkeampi CD133

matalan Caco-2-solut (ohjaus siRNA) verrattuna CD133

high Caco-2-solut (CD133 siRNA) (kuvio 3B).

A) seuraukset CD133-spesifisiä siRNA knockdown tehokkuuden kemiallisten modulaattoreiden tunnettujen endosyyttisissä reittejä moduloinnissa Tf oton jaksottamattomilla Caco-2-soluilla. Hoidon jälkeen joko pelkkää kuljetinta (kontrolli), filipiini, klooripromatsiini, DMA tai MβCD lisätty lovastatiini (MβCD), CD133

korkea (ohjaus siRNA) ja CD133

alhainen (CD133 siRNA) jaksottamattomat Caco-2-solut altistettiin 5 ug /ml Tf-Alexa 488 Cellular internalisaation Tf-Alexa 488 jälkeen seurattiin virtaussytometrialla. Tulokset ilmaistaan% TF-Alexa 488 määrät, hoidettaviksi ajoneuvoon käsitelty kontrolli. Huomautus puuttuminen vaikutuksen CD133-siRNA Knockdown suurista eston Tf-oton aiheuttama klooripromatsiini. Huomaa myös pienentää jopa sääntelyn vaikutusta kolesterolin louhinta on CD133 pieni tilanne (MβCD). Data edustaa keskiarvoa ± s.e.m. kolminkertaisessa saatu kokeen yhdestä edustavasta kokeesta, joka on toistettu kaksi kertaa. Vertailut ohjaus: Dunnettin testi, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; vertailu ohjaus siRNA ja CD133 siRNA: Dunnettin testi: p 0,05. B) Erityiset siRNA välittämä knockdovvn CD133 sisällä jaksottamattomien Caco-2-solut johti kasvuun LNC kertymiseen solun. Virtaussytometrianalyysin solunsisäisen oton NR-LNC sisällä CD133

korkea (ohjaus siRNA) ja CD133

alhainen (CD133 siRNA) Caco-2-solujen jälkeen 1 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa /5% CO

2. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina kontrollista, mikä edustaa GEOMEAN fluoresenssin intensiteetin taso saadaan solut, joita käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Data edustaa keskiarvoa ± s.e.m. saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Dunnettin testi: ** p 0,01.

hoito jaksottamattomien Caco-2-solujen kanssa AC133 tunnistavaa vasta-ainetta solunulkoisen domeenin CD133 johti vähenemiseen Tf oton

Todettuaan, että CD133 ilmentyminen määrällisesti vaikuttaa Tf endosytoosin, me sitten katsoi, että suora vuorovaikutus CD133-proteiinin ja Tf endosyyttistä koneet olisi vaikuttanut solunulkoisen ligandin sitoutumista CD133. Koska solunulkoinen ligandin CD133 ei ole vielä tunnistettu ja koska monoklonaalisia vasta-aineita on jo käytetty aktivoimalla tai toiminnan estävää immunoglobuliineja, esimerkiksi vuorovaikutukset integriinien ja soluväliaineen [42] mukaan AC133-vasta-aine, joka tunnistaa solunulkoisen glykosylaatio liittyy epitoopin of CD133 [43], oli sitten testattiin CD133 ligandina eläviin Caco-2-soluilla. Mielenkiintoista, kun taas käsittely jaksottamattomien Caco-2-solujen kanssa IgG1κ isotyyppikontrolli immunoglobuliini ei ollut vaikutusta kertymiseen solun Tf-Alexa 488 arvioitiin virtaussytometrialla (kuvio 4A), käsittelemällä AC133-vasta johti merkittävä vähentäminen tf otto 38 ± 8% ja 75 ± 1% 5 ja 10 ug /ml, vastaavasti (kuvio 4A). Nämä tiedot vahvistettiin, että AC133 voidaan tehokkaasti käyttää toiminnallisia vaikutuksia eläviin soluihin tässä katsoneet vuorovaikutusta CD133 itsensä ja Tf endosyyttistä koneiden jaksottamattomien Caco-2-soluilla.

A) AC133 vasta-hoito esti Tf ottoa.