Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut vuorovaikutuksessa ympäröivän strooman fibroblastien aikana tuumorigeneesiprosessin mutta monimutkainen molekyyli säännöt, jotka ohjaavat näiden vuorovaikutusten yhä puutteellisia mikä estää kehitystä terapeuttisten strategioita kohdistaa syövän strooman. Olemme ottaneet matemaattinen lähestymistapa aloittaa määrittelemällä näitä sääntöjä suorittamalla ensimmäinen laajamittainen kvantitatiivinen analyysi fibroblasti vaikutuksia syöpäsolujen lisääntymistä poikki yli neljäsataa heterotyyppisten solulinjan pairings. Järjestelmätason mallinnusta tämän monimutkaisen aineisto käyttäen singulaariarvohajotelma paljasti, että normaali kudos fibroblastit vaihtelevasti ilmaista vähintään kaksi toiminnallisesti erillistä toimintoa, joka heijastaa transkription ohjelmat, jotka liittyvät käytössä mesenkyymisolujen, jotka toimivat joko coordinately tai rajat tarkoituksiin moduloida syöpäsolu leviämisen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kvantitatiivinen lähestymistapa voi osoittautua hyödylliseksi tunnistaa organisaation periaatteita on monimutkainen heterotyyppisten solu-vuorovaikutuksiin syövän ja muissa yhteyksissä.

Citation: Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, Upadhyay R, Finn S, et ai. (2009) Systems-Level Modeling of Cancer-fibroblastien vuorovaikutus. PLoS ONE 4 (9): e6888. doi: 10,1371 /journal.pone.0006888

Toimittaja: Dov J. stekel, University of Nottingham, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2009; Julkaistu: 03 syyskuu 2009

Copyright: © 2009 Wadlow et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat jota HHMI lääkäri-tutkija uransa alkuvaiheessa Award (SR) ja Sidney Kimmel Translational tiedepalkinto (SR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut vuorovaikutuksessa dynaamisesti ympäröivien stroomasoluihin. Useiden asiaa solutyyppeihin syövän strooman, fibroblastit näyttävät toimivan näkyvästi [1]. Olemme kuitenkin puuttuu selkeä käsitys siitä, miten molekyyli- ja solutason epäyhtenäisyys tämän solutyyppi toiminnallisesti vaikuttaa syövän taudin alkamisen ja etenemisen [2]. Osittain tämä johtuu siitä, että kokeellinen haasteisiin, jotka liittyvät opiskelu monisoluisten vuorovaikutuksia. Vaikka yhä kehittyneempiä eläinmalleja käytetään määrittelemään erillisiä mekanismeja, joilla fibroblastien edistävät syövän etenemiseen, nämä mallit eivät ole sopivat hyvin järjestelmällistä löytö useiden geneettisten ja epigeneettiset yhteyksissä [3] – [6]. Vaihtoehtoisessa kokeellinen lähestymistapa käsittää analysoidaan vuorovaikutus dissosioituneen syöpäsolujen ja fibroblastien in vitro [7] – [11]. Tämä lähestymistapa on mahdollista mahdollistaa järjestelmällisen ja puolueeton molekyyliseulontaa uusille strooman tavoitteet, jotka voidaan myöhemmin validoitu useamman fysiologisesti vastaavien järjestelmien kautta.

In vitro Iähestymistapoja solujen vuorovaikutuksia yleensä rajoittaa valinnan tiettyjen solujen, viljelyolosuhteet, ja määritykset. Ihanteellinen järjestelmä tarkastelee toiminnallisia vuorovaikutuksia eri ensisijaisen syöpäsolun ja fibroblasti populaatioiden yhteistyössä peräisin samasta kasvaimia. Kuitenkin ensisijainen ihmisen syöpäsoluja on tunnetusti vaikea levittää pitkäaikainen ex vivo, ja primäärikasvain johdettuja fibroblasteja näytä läpikäyvän fenotyyppisiä muutoksia lyhytaikaisen viljelmän [6]. Sen sijaan pysyvien solulinjojen helposti kasvatetaan, suhteellisen edullisia, ja helposti saatavilla, mikä edustaa potentiaalisesti hyödyllinen ja uusiutuva luonnonvara tutkimiseen syövän-fibroblastien vuorovaikutus. Lisäksi viljelyolosuhteet voivat vaikuttaa solujen käyttäytymiseen mutta yhä monimutkaisempia lähestymistapoja, jotka yrittävät matkia fysiologisesti asiaankuuluvat olosuhteet, kuten kolmiulotteinen kulttuuri, skaalaa huonosti [12]. Lopuksi, fibroblastit vaikuttaa monia näkökohtia syöpäsolujen käyttäytymistä, kuten solujen lisääntymisen ja eloonjäämisessä, angiogeneesissä, invaasio, etäpesäke, ja lääkeresistenssi, mutta määrityksiä pisteet yhä monimutkaisempia fenotyypit voidaan haastavaa toteuttaa järjestelmällisiä tutkimuksia.

siis suoritettu kvantitatiivinen ja integroitu analyysillä käyttäen matemaattista mallintamista syöpäsolujen proliferaation kaksiulotteinen yhdessä viljelemisen, jossa on suuri määrä normaalin fibroblastisolulinjat. Nämä tutkimukset paljastivat, että normaali kudos fibroblastit vaihtelevasti ilmaista vähintään kaksi toiminnallisesti erillistä toimintoa moduloinnissa syövän solujen lisääntymisen. Lisäksi transkription profilointiin näiden eri fibroblastien populaatioiden osoitti, että ainakin yksi näistä toiminnoista voisi koskea molekyyli ohjelmia, jotka ovat läsnä aktivoitu mesenkyymissä. Järjestelmätason mallinnusta voi siten olla käyttökelpoinen tunnistamaan organisaation periaatteita, jotka laajasti taustalla vuorovaikutukset syöpäsolujen ja fibroblastit, ja se voi siksi tiedottaa järjestelmällisiä molekyylitutkimukset syöpään fibroblastien vuorovaikutus.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja plasmidi-DNA

Solulinjat hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA) tai Coriell Cell Repositories (Camden, NJ). Kaikki fibroblastien linjat käytettiin yhteistyössä kulttuureissa 10 kohtia oston jälkeen. Syöpä ja fibroblastisolulinjat viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), L-glutamiinilla (4 mM), penisilliiniä (100 yksikköä /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml). EGFP merkinnät syöpäsolulinjois- tehtiin käyttämällä kolmannen sukupolven lentivirusvektorilla järjestelmään. 293T-solut transfektoitiin käyttäen lipofektamiini 2000 on subkonfluenteista 10-cm malja vektorilla pCCLsin.PPT.hPGK (10 ug), johon EGFP oli kloonattu, sekä pMDLg /p pakkaus (7 ug) ja VSV-G-vaipan koodaavat pMD.G (5 ug) plasmideja. Nämä plasmidit saatiin Rafaella Sordella klo MGH Center for Cancer Research ja Luigi Naldini San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy. Viral Supernatantti kerättiin 48 tunnin kuluttua, suodatettiin 0,45 mikronin ruiskusuodattimen läpi, ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Syöpäsolulinjoja infektoitiin subkonfluenteista kuoppiin 24-kuoppalevyillä käyttäen 300 ui virus 1 ml: ssa DMEM elatusaineita 10% vasikan sikiön seerumia. Tämä protokolla tuotti tartuntojen määrä on yli 80% (määrittää visuaalisella laatiminen fluoresenssimikroskopiaa). EGFP-negatiiviset solut poistettiin käyttäen muunneltua 5-laser Becton-Dickinson FACSDiVa standardimenetelmien, kuten aikaisemmin on kuvattu [13].

Quantitative yhteisviljelmissä

2 x 10

4 fibroblasteja ympättiin 100 ui vähintään 6 rinnakkaisten kuoppien kussakin kaksi 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä osaksi yksisolukerroksena yön yli. Tämän jälkeen 10

3 EGFP-ilmentävien syöpäsolujen ympättiin vielä 50 ui suoraan fibroblastien sisältävät kuopat ja tyhjiin kuoppiin (150 ui kokonaistilavuudessa kuoppaa kohti). SpectraMax M5 -levynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) käytettiin saamiseksi loisteputki lukemien noin kerran päivässä 14 päivän ajan (eksitaatio 477 nm, emissio 515 nm). Kolmekymmentä mikrolitraa tuoretta väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan päivinä 3, 6, 9, ja 12. Kuopat, jotka sisälsivät fibroblastien tai pelkkä väliaine, joissa kaikissa on 150 ui media kuoppaa kohti päivänä 0, mitattiin rinnakkain ja arvot vähennetään co -Kulttuuri ja monokulttuuria kaivot vastaavasti tilille auto-fluoresenssi. Kaikki viljelmät suoritettiin DMEM 10% FCS.

Heterotyyppisten ksenografteissa:

estradioli pellettejä (0,72 mg, 60 päivän julkaisu, Innovative Research of America, Sarasota, FL) istutettiin naispuolinen karvattomia hiiriä (Charles River Laboratories) kaksi päivää ennen ksenograftin injektioita. Hiiret jaettiin 2 ryhmään: 5-hiiriin injektoitiin AG09877 fibroblastien ja EGFP-ilmentävien T47D rintasyövän soluja, ja 5-hiiriin injektoitiin AG04351 fibroblastien ja EGFP-ilmentävien T47D-soluissa. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen pitoisuutena 4 x 10

6000000 solua per 100 mikrolitraa. Eläimet nukutettiin isofluraanilla injektoitiin 4 × 10

6 fibroblastit ja 4 x 10

5 syöpäsolujen Ihonalaisen yli utarerasvaa alusta. EGFP signaali mittausta ja kvantitoitiin käyttäen bonsai fluoresenssin optisen kuvantamisen järjestelmä heti injektion jälkeen, päivässä neljän päivän ajan, ja sen jälkeen 2-3 päivän välein. Hiiriä käsiteltiin noudattaen MGH Institutional Animal Care ja käyttö komitean määräyksiä ja tapettiin 43 päivää injektion jälkeen. Kasvainkudoksessa resektoitiin ja flash jäädytetty. Jäädytetyt leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla tai anti-sytokeratiini (CAM 5.2, Becton-Dickinson).

Tietojenkäsittely

määrällisesti vaikutusta fibroblastien kasvuun syöpäsolujen, me määritteli mono-kulttuuri kaarre,, olla ero päivänä

t

välisen keskimääräisen fluoresenssin mittausta varten kuopat syöpäsolut, mutta ei fibroblastit ja keskimääräinen fluoresenssin mittausta varten kuopat pelkkä väliaine. Olemme määritelleet yhteistyön kulttuuri kaarre,, olla ero päivänä

t

välisen keskimääräisen fluoresenssin mittausta varten kuopat syöpäsolujen ja fibroblastit ja keskimääräinen fluoresenssin mittausta varten kuopat fibroblastien yksin. Poistimme jatkuva signaali vähentämällä pienempi päivä 0 arvo. Erityisesti annamme ja anna. Co-kulttuuri-suhteet on määritelty suhteena pinta-ala näissä kahdessa käyriä. Erityisesti jos

M

on AUC, annamme olla päivistä, joista olemme mittauksia ja interpoloitu lineaarisesti mittauksen kertaa. Vuoteen puolisuunnikkaan sääntöä,

määritelty

C

samalla olla AUC. Sitten määritellään yhdessä viljelemisen suhde,

E

, jonka

Laske luottamusväli (CI) ja

E

käytimme liitto kolmen alkulatauksen BC

kaksipuolisen 95% CI, kukin lasketaan 10000 bootstrap näytteistä [14]. Bootstrap Näytteet muodostetaan valitsemalla ensin korvausinvestointeihin kahdesta jäljitellä 96-kuoppaisille levyille ja valitsemalla sitten korvaten kuoppiin kutakin (eli media-vain, fibroblasti, mono-kulttuuri, co-kulttuuri) valitusta levyt. Yhdessä viljelemisen suhde pidettiin merkittävinä, jos 95% CI varten

E

oli täysin yli tai alle yhden.

Matemaattiset mallit

Oletimme, että pieni määrä toiminnallisesti erillisiä vuorovaikutustavat taustalla useita datapisteitä matriisissa yhteistyön kulttuurin suhde. Olemme epäillään, että jos voisimme määrittää optimaalinen määrä,

N

, yksinkertaisempia matriiseja, joiden avulla voidaan lähentää yhteistyötä kulttuurin suhde matriisi, niin että optimaalinen

N

antaisi meille jonkinlaisen käsityksen useita toiminnallisesti erillisiä vuorovaikutuksen tyypit työssä ja matriisit, jotka käsittävät lähentäminen saattaa antaa meille jonkinlainen käsitys luonteesta ne yhteisvaikutukset.

erilaisia ​​menetelmiä on hajottamiseksi matemaattisen matriisi osaksi summa yksinkertaisempi matriiseja, jotka ovat jossain mielessä kohtisuorassa tai toisistaan ​​riippumattomia [15]. Mallit perustuvat singulaariarvohajotelma (SVD) tai pääkomponenttianalyysi (PCA) on yleisimmin käytetty useilla eri biologisten, kemiallisten ja fysikaalisten tieteiden [16]. Esimerkkejä ovat dekonvoluution anatomista tai patofysiologisia tietoja dynaaminen kontrasti-MRI ja analyysi kolmiulotteinen kvantitatiivinen rakenne-aktiivisuus suhteita ennustaa aktiivisuuden lääkekandidaatteina [17] – [19]. Valitsimme SVD analyysimme yli PCA koska PCA ensin keskittää data vähentämällä rivin tai sarakkeen keinoin. Kuitenkin nolla meidän matriisi oli asetettu yhtä suureksi AUC-suhde on 1, merkitsee puuttuessa vaikutus yhdessä viljelemisen syövän solujen proliferaatiota. Näin siirtää nolla-arvoon vähentämällä avulla olisi uhrannut luontainen merkitys.

Hajoaminen menetelmät ovat usein yhdistettynä ristivalidointi strategioita erottaa mielekkäitä komponentteja tilastollinen melu [20]. Rajat kelpuutusstrategian päätimme käyttää työllistää EM-algoritmi estimointijärjestelmässä puuttuvien tietojen [21] jäljempänä esitetyllä tavalla.

Anna

R

olla matriisin erot yhdessä viljelemisen suhde matriisi ja 1, niin että positiiviset arvot

R

vastaavat yhteistyössä kulttuureja, jotka stimuloi syöpäsolujen lisääntymistä ja negatiiviset arvot

R

vastaavat yhteistyössä kulttuureissa, joka esti syöpäsolujen lisääntymistä. Haluamme määritellä optimaalinen

N

varten

R

. Tätä varten käytämme malleja monimutkaisuutta, jotka kasvavat

N

ennustamaan kunkin elementin arvo on

R myynnissä maassa kaikki muut osat on

R

ja pitävät optimaalinen

N

joille nämä ennusteet ovat maksimaalisesti tarkkoja.

Erityisesti mitään matriisi

S

, Sallikaa kuvaamaan elementti

S

vuonna

i

nnen rivin ja

j

nnen sarakkeen, anna merkitsevät

S

kanssa elementti

S

että

i

nnen rivin ja

j

nnen sarakkeen puuttuvat ja anna olla puuttuva elementti täyttää

x

. Antaa on lähentää

S

saanut lisäämällä paras

N

matriisit Singulaarista on

S

(eli ne, jotka vastaavat

N

suurimmat yksittäiset arvot). Kun kyseessä on puuttuvien tietojen määrittelemme joita EM-algoritmi estimointijärjestelmässä puuttuvien tietojen seuraavasti. Letand anna

Kokemuksemme mukaan tämä EM-algoritmi on aina samansuuntaisia ​​niiltä

k

kasvaa, jotta voimme antaa

Letand anna on mediaani kaikessa

i

ja

j

.

N

joille on minimaalinen katsotaan optimaalinen

N

varten

R

.

geeniekspressioprofilointi

Confluent levyt fibroblasteissa (replikoituva ehdot co-kulttuuri) tai syöpäsoluja log-vaiheen kasvun trypsinoitiin, sentrifugoitiin pelleteiksi ja flash-jäädytettiin nestetypessä. RNA eristettiin Qiagen RNeasy sarjat ja profiloitu käyttäen Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 mikrosiruja kanssa vakioprotokollia [22].

Tulokset ja keskustelu

Ensimmäinen systemaattisesti viljeltiin yh- kaksitoista ihmisen rinta-, melanooma , ja keuhkosyövän solulinjat kanssa kolmekymmentäkuusi transformoimattomassa, ihmisen fibroblastisolulinjat peräisin normaalin ihon ja keuhkojen (katso taulukko S1 ja taulukko S2 lisätietoja). Jokainen tasyöpäsolulinja leimattiin EGFP käyttämällä lentiviraalinen transduktion jotta komposiitti kvantifiointiin syöpäsolujen lisääntymistä ja eloonjäämisen yli neljätoista päivää käyttämällä yksinkertaista levylukijaa perustuva määritys järjestelmään. Kunkin solulinjan liittäminen (n = 432), jota tarkastellaan useita toistojen yli itsenäisestä kokeesta, me laskettu suhde pinta-ala EGFP käyrän syöpäsoluja kasvatetaan yhdessä viljelemisen jaettuna käyrän alla oleva ala syöpäsoluja kasvatettiin yksinään (kuvio 1A). Huomasimme, että viisikymmentäkolme 432 solulinjan parit (12%) oli kasvua stimuloiva absoluuttisesti määritelty 95%: n luottamusväli, jossa alaraja on yli 1 (kuvio 1 B). Sitä vastoin, 176 (41%) oli kasvua estävä ja 203 (47%) oli nolla. Nämä tiedot osoittavat, että vain pieni osa heterotyyppisten solulinjan parit aikaan parantuneen syöpäsolujen kasvua.

A) Heat kartta edustus kokeellisesti määritetty yhdessä viljelemisen suhdeluvut 432 syöpään fibroblastisolulinjassa vuorovaikutuksia. Punainen tarkoittaa kasvua stimuloiva vuorovaikutusta ja sinisen kasvun heikentävän vuorovaikutusta. B) Vuorovaikutus johtaa tilastollisesti merkittävää kasvua stimulaatiota syöpäsolujen (eli alaraja 95% CI, että yhteistyön kulttuuri suhde on 1) näkyvät punaisina, ja vuorovaikutukset johtaa tilastollisesti merkittävää kasvua estämällä syöpäsolujen ( eli yläraja on 95% CI, että yhteistyön kulttuuri suhde on 1) on merkitty sinisellä. Ympyrä osoittaa vuorovaikutuksen T47D ja AG04351, ja neliö osoittaa vuorovaikutuksen T47D ja AG09877.

tutkia merkitystä näiden samanaikaisesti kulttuureissa in vivo, me seuraavaksi keskittyneet kaksi erityistä syöpää fibroblasti parit että näyttöön vastakkaiset proliferatiivisia vaikutuksia in vitro. Erityisesti AG09877 stimuloi T47D leviämisen, kun AG04351 oli kasvua estävää tähän samaan tasyöpäsolulinja. Co-injektion T47D-solujen ja AG09877 fibroblastien ihonalaisesti nude-hiiriin johti muodostumista pieniä kasvaimia Yli viikon (kuvio 2A ja 2B). Sen sijaan, ksenografti nämä syöpäsolut AG04351 fibroblasteja ei johtanut tuumorin muodostumisessa. Nämä tulokset vahvistivat, että vastakkaiset vaikutukset eri fibroblastien populaatioiden syöpäsolujen kasvua in vitro havaittiin myös in vivo. T47D yksin on heikosti tuumorigeenisiä (tuloksia ei ole esitetty) [23], [24], ja se, että useimmat tuumoreita pysyvästi taantuvat ensimmäisen viikon jälkeen ehdotti, että kasvua stimuloivaa vaikutusta AG09877 fibroblastien oli yleensä riittämätön ylläpitämään pitkäaikaista kasvua tässä solulinjassa in vivo. Erityisesti kuitenkin yksi eläin oikeastaan ​​kehittänyt pysyviä kasvain aikana kuusi viikkoa. Patologinen tutkimus Tämän yksittäisen kasvaimen paljasti EGFP-positiivisten syöpäsolujen upotettu merkittävä desmoplastic strooman komponentti (kuvio 2C). Vaikka vain yksi kokeilu, tämä provosoiva tulos viittaa siihen, että kasvu stimulointikyvyn fibroblastien tunnistettu in vitro voisi pystyttävä kohdistamaan sekä ohimenevää ja pitkäjänteisemmin tuumorigeenisia vaikutuksia vierekkäisten syöpäsoluihin in vivo.

A) EGFP signaali injektiot EGFP-ilmentäviä T47D solut AG09877 fibroblastien (5 hiirtä, sininen käyrä) tai AG04351 fibroblasteissa (4 hiirtä, punainen käyrä). Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. B) edustaja kuvia hiirten ksenosiirrettyjä keskenään sekoittumisen otettu 3 päivää injektion jälkeen, valkoisilla osoittavia nuolia pistoskohtaan. C) mikrovalokuvia on T47D-AG09877 kasvain. Vasemmalta oikealle: hematoksyliinillä ja eosiini värjäystä, GFP fluoresenssi, ja immunohistokemiaa sytokeratiinia.

vieressä tavoitteena oli tunnistaa organisaation periaatteiden matriisin yhteistyössä kulttuureissa, jotka saattavat antaa yksityiskohtaista tietoa biologisista tekijöihin syöpä-fibroblastien vuorovaikutus. Systemaattisesti uudestaan ​​solujen vuorovaikutuksia matriisi heterotypic ksenografteissa saattanut tarjonnut paremmin sisälle fysiologinen merkitys yksittäisten parit, mutta ei ollut toteuttamiskelpoinen 432 eri vuorovaikutuksia. Siksi käytettiin järjestelmätason lähestymistapaa luonnehtia ja mallimme in vitro data. Ensinnäkin, pintapuolinen tarkastus datan kuviossa 1 paljastivat, että syövän solulinjat voidaan ryhmitellä ne, jotka olivat pääasiassa esti (n = 3), suurelta osin estivät (n = 6), tai stimuloi vahvasti (n = 3), fibroblastit , mikä viittaa siihen, että kasvureaktio syöpäsolun linjaa tietyllä strooman co-viljelmää esiohjelmoitu ja riippumaton pariksi fibroblastien linja (esim kuvio 3A). Kuitenkin vain SKBR3- näkyy yhtenäinen vastauksia kaikilla fibroblasti linjat, syyllistämättä useita fibroblasti-erityisiä maksuja syöpäsolun leviämistä. Useissa tapauksissa tämä fibroblasti osuus oli riittävä ohittaa yleinen alttius syöpäsolun linja, joka johtaa kasvuun stimuloiva vuorovaikutus muuten kasvuinhiboitujen syöpäsolulinja tai päinvastoin (esim. Kuva 3B). Näin kasvureaktio syöpäsolun linjat strooman yhdessä viljelemisen näyttävät johtuvan yhdistelmästä määräävän syöpäsolu määrätty panos ja pienempi, mutta usein ratkaisevan tärkeää fibroblastien vaikutus.

A) kasvu vaste syöpään solulinjoja (ympyrät) ja fibroblasteissa (pitkulainen muoto) määräytyy pääasiallisesti ohjelmoitua kyky syöpäsolujen lisääntyä vasteena geneeristen fibroblastien signaaleja (mustat nuolet) jakaa samoja kaikissa fibroblastien linjat. Jotkut syöpäsolun riviä (vihreä) ovat kasvun stimuloidaan, kun taas toiset (keltainen) ovat jumiutua tai kasvuinhiboitujen. B) Muita tuottamat signaalit osajoukkoja fibroblastien (punaiset nuolet) lisätä monimutkaisuutta joko edelleen stimuloimalla syövän solujen lisääntymistä (ylempi vasen paneeli) tai kompensoi puute vastaus geneeristen signaalien (alempi vasen paneeli). Vaikka kaikki signaalit tämän kaavamaisen määritellään kasvua stimuloivia, ne voivat olla myös kasvua estävää mikä lisää entisestään monimutkaisuutta.

Vaikka kuvio 3B esittää kaavamaisesti parsimonious kahden signaalin malli, kokonaismäärä vuorovaikutuksen tyyppejä ei helposti voida hankkia laadullinen tarkastus meidän aineisto. Siksi käytetty matemaattinen mallintaminen perustuu singulaariarvohajotelma kysyä monimutkainen kasvumallin stimulaation ja eston me havaittiin kaikilla tietoaineiston johtui pieni, rajallinen määrä vuorovaikutustavat välillä syöpäsoluja ja fibroblastit. Hajoavasta matriisi yhteistyön kulttuurin suhteet osaksi summa

N

komponentti matriiseja, käytimme jätettävää one-out ristivalidointi strategia määritellä optimaalinen arvo

N

(kuva 4 ; katso materiaalit ja menetelmät täydelliset tiedot mallista). Huomasimme, että mediaani ristivalidointi error saavutti aallonpohjan kanssa

N

= 3, mikä viittaa siihen, että verkko co-kulttuurin suhde kutakin solulinjaa pariksi johtui summasta vuorovaikutuksen edustamat arvot kolme erillistä komponentin matriiseja. Matriisi A, jonka osuus useimpien virheiden väheneminen mallissa, heijastuu vaihtelevan reagointikykyä eri syöpäsolulinjojen geneeristen strooman tuottamat signaalit fibroblastit (kuvio 5A). Esimerkiksi 9 12 syöpäsolulinjojen yleensä vastannut fibroblastien hidastunut kasvu, esimerkkinä SKBR3- ja MCF7, kun taas kolme syöpäsolun riviä olivat tyypillisesti kasvua stimuloidaan, mistä on osoituksena BT-474 ja SK-MEL-2.

mediaani leave-one-out ristivalidointi virheen, kun matriisi yhteistyön kulttuurin suhteet approksimoidaan summa N komponentin matriiseja.

A) -C) Hajoaminen co -Kulttuuri matriisin 3 komponentti matriiseihin. Tarvittaessa syöpä ja fibroblastisolulinjat jaetaan kahteen ryhmään (X, vihreä, ja Y, violetti) siten, että vuorovaikutukset samassa ryhmässä tehdä kasvusta stimuloivaa (eli positiivinen) maksuja arvioitua yhteistyön kulttuurin suhde välinen vuorovaikutus vastakkaisen ryhmät tekevät kasvua estävää (eli negatiivinen) maksuja arvioitua yhteistyön kulttuurin suhteen. P-arvot viittaavat kudoksen alkuperän erottelua X ja Y ryhmien. Ympyrät ilmaisevat vuorovaikutus T47D ja AG04351, ja neliöt osoittavat vuorovaikutus T47D ja AG09877. Punainen tarkoittaa kasvua stimuloiva vuorovaikutus ja sininen kasvua suppressoiva vuorovaikutusta, intensiteetillä, joka vastaa lujuuden vaikutus ja skaalata riippumattomasti kussakin matriisissa.

Sen sijaan, matriisi B ja matriisi C näkyy selvä fibroblastien toimintaa, joka korreloi merkittävästi mutta epätäydellisesti tietyllä fibroblasti kudoksen alkuperän (p = 6 x 10

-5 ja p = 0,0072, jos matriisin B ja C vastaavasti) (kuviot 5B ja 5C). Tilaan kunkin matriisin, fibroblastit olivat jaettu kahteen ryhmään, jotka vuorovaikutuksessa erillisen osajoukkoja syöpäsolulinjojen edistää syöpäsolujen lisääntymistä (vihreä vs. purppura kuviossa 5). Vaikka suurin osa syöpäsolujen linjojen vuorovaikutuksessa yhteistoiminnallisesti kanssa ”iho-like” fibroblastien matriisi B, toinen enemmistö suosi ”keuhkojen kaltaiset” fibroblastien matriisi C. Näin ollen pystyimme tunnistamaan useita esimerkkejä, joissa samassa fibroblasti -cancer pariksi johti positiivisia vaikutuksia syöpäsolujen lisääntymistä yhdessä matriisissa ja kielteisiä vaikutuksia muiden (esim T47D-AG07139), mikä viittaa siihen, että fibroblastit voisivat vuorovaikutuksessa syöpäsoluja vähintään kahdella toiminnallisesti eri tapaa.

huolimatta se, että suurin virhe väheneminen mallin myötävaikuttanut matriisi A, joissakin tapauksissa vaikutus koko matriiseissa B ja C yhdessä riitti ohittaa että matriisin A Itse tarkempi analyysi paljasti, että nettovaikutukset eri fibroblasteissa on syöpäsolujen lisääntymistä voi vain tarkasti määritelty kyseisille

kvantitatiivinen

osuudet vaikutukset kaikista kolmesta matriiseista. Tätä havainnollistaa vuorovaikutukset rintasyövän T47D ja kaksi ihon fibroblastisolulinjat AG09877 ja AG04351 (merkitty kuviossa 1A ja kuviossa 5A-C neliöt ja ympyrät, vastaavasti). Matriisi A (kuvio 5A) paljasti, että T47D yleisesti alttiita kasvun hidastuminen kaikki fibroblastisolulinjat. Yksi uskottava biologinen selitys tälle voisi olla ilmaus solun pinnan reseptoriin jonkin sytostaatit tekijä erittämä kaikki fibroblastit. Kuitenkin matriisi B (kuva 5B) osoitti, että suurin osa iho fibroblastisolulinjat oli kasvua stimuloiva vaikutus T47D, joiden muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta myös AG04351. Teoriassa tämä aktiivisuus voi johtua ilmaisun useimmat ihon fibroblastit tietyn mitogeenisellä kasvutekijällä. Sen sijaan, matriisi C (kuvio 5C) osoitti, että suurin osa iho fibroblastisolulinjat oli myös toinen selvä kasvua estävä aktiivisuus T47D, jonka tärkeänä poikkeuksena AG09877 ja monet muut. Tämä toiminta voisi uskottavasti johtua erityksen useimmat ihon fibroblasteista tietyn kasvua estävän sytokiinin. Siten AG09877, ilmaisemalla kasvua stimuloiva vaikutus, ja siitä puuttuu kasvua estävä aktiivisuus, teki kaksi toiminnallisesti erillistä kasvua stimuloiva maksuja T47D kasvuun, jotka olivat riittävät yhdessä ohittaa yleinen alttius T47D ja fibroblastin välittämää kasvun hidastuminen. Sen sijaan AG04351 tehty vain kasvua tukahduttava maksuja suhteen molempien fibroblastien toimintaa.

perehtyä molekyyli identiteetti näiden fibroblastien toimintaa, RNA: ta eristettiin 36 fibroblastisolulinjassa monokulttuureja ja suoritetaan microarray-pohjainen geeniekspression profilointi käyttäen Affymetrix geenilastut. Ensin tunnistettu geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti ihon ja keuhkojen fibroblasteista, ryhmien välillä X ja Y matriisi B, ja ryhmien välillä X ja Y matriisiin C. Sitten käytimme geeniperimä rikastus analyysi (GSEA) [25] määrittämään geenin sarjaa rikastettu kussakin vertailussa. Käyttämällä väärä löytö määrä (FDR) kynnys 0,25 tunnistimme yhdeksän geenin sarjaa rikastettu ihoa vs. keuhkojen fibroblastien eroa, mukaan lukien kaksi, jotka luonnehtivat epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi (taulukko 1) [26]. Vaikka liittyy korkeampi FDR, molemmat olivat myös rikastettu B

x (iho kaltainen) vs. B

y (keuhko-like) ero. Sen sijaan ei-geenin sarjaa oli merkitty C

x (iho kaltainen) vs. C

y (keuhko-like) ero, mikä viittaa siihen, että tämä fibroblasti toiminta voi joko heijastaa transkription eroja ainoastaan ​​aiheuttama puitteissa co-kulttuuri tai ei-transkription eroja, joita ei voida helposti havaita käyttäen microarray-pohjainen transkription profilointiin.

EMT kuvataan koordinoidun solun fenotyyppejä tunnustetaan yhä ratkaiseva etäpesäkkeiden karsinoomasoluja. Näihin fenotyypit sisältävät menetys epiteelisolujen polariteetin, lisääntynyt solumigraatiota, ja invaasio ympäröiviin kudoksiin [27]. Lisäksi viimeaikaiset todisteet osoittavat, että EMT ohjelmia myös säätelevät mesenkyymisolun toimintoja kuten angiogeneesi [28]. Lisäksi transkriptiotekijä Snail, mestari säätelijä EMT, ilmaistaan ​​aktivoituneiden fibroblastien sisällä parantavan haavat ja kasvain-strooman rajapinta [29]. Meidän data siten ehdotti, että EMT ohjelmia ilmentyy monien ihon fibroblastit, ehkä toimii molekyylitason perustan yhden fibroblastien toiminnan (tyyppi B) on kuvattu meidän kvantitatiivista mallia.

Lähempi tarkastelu kahden EMT-geenin sarjaa paljastaa, että monet geenit ajo rikastus ihon fibroblasteissa (eli ydin rikastettu geenit) ovat solun pinnan ja erittävät molekyylit ovat sekaantuneet tukikudosten maksujen kasvaimen etenemiseen (kuva 6). Esimerkiksi metalloproteinaasien ja katepsiinit kuten MMP-2, MMP-12, ja katepsiini Z ovat säädellään ylöspäin kasvain strooman ja edistää syöpäsolujen lisääntymistä, muuttoliike, ja invaasio hajottamalla tyvikalvoissa ja altistaa arvoituksellinen muuttavien ja kasvun signaalia [30] . Tenaskiini C on Soluvälitilan proteiini, joka stimuloi syöpäsolujen lisääntymistä ja angiogeneesin [31]. N-kadheriinin (CDH2) ilmaistaan ​​filopodia myofibroblastien, jotka vaeltavat kohti pahanlaatuisia syöpäsoluja transformoivan kasvutekijä beeta-riippuvaisella tavalla [32]. SPARC (erittyvän proteiinin hapan ja runsaasti kysteiiniä) on toinen tukikudosten matriisi proteiinia, joka lisää syöpäsoluinvaasiota ja joka on käänteisesti verrannollisia selviytymisen potilailla, joilla haimasyöpä [33], [34]. Stroomakasvaimet PDGFRB säätelee soluvälinesteessä paineet ja huumeiden oton kasvaimiin [35]. Siten samat geenit, jotka säätelevät EMT vuonna epiteelisyöpäsolujen säätelevät myös toiminnallinen osuus pahanlaatuiseen etenemistä kasvain strooman. Rikastettu näiden geenien ilmentymistä ihon fibroblasteissa viittaa kudosspesifisiä esiohjelmoitu mesenkymaalisten populaatioiden kasvaimen strooman toiminnallisuutta.

Lämmön kartta (oikealla) ja rikastus juoni (vasemmalla) varten EMT geeni asettaa GSEA analyysi ihon vs. keuhkojen fibroblastit [26].

fibroblastit siten ilmeisesti näyttää vähintään kaksi erillistä vaikutuksia proliferatiivinen vaste syövän solujen yhteisviljelmässä. Tärkeää on,

määrällisesti tasapainossa

näiden kahden fibroblastien toiminnan ja yleinen reagointikykyä syöpäsolujen fibroblastin signaaleja suureksi osaksi yhdessä viljelemisen suhde tietylle solulinjan pariksi. Nämä riippumattomat fibroblasti vaikutukset voivat ilmeisesti rinnakkain yksittäisissä fibroblasti populaatiot, toimivat joko yhteistoiminnallisesti tai rajat tarkoituksiin nähden syöpäsolujen kasvua. Kiehtovan, meidän analyysi viittaa siihen, että sekä toimintaan erotella fibroblasteja pitkälti mukainen kudosta alkuperän. Lisäksi mikrosirujen profilointi osoitti, että yksi näistä toiminnoista saattaisivat ero ilmaus koordinoidun transkriptionaalisen ohjelma liittyy aktivoituna mesenkyymisolujen. Lisätyötä tarvitaan täysin luonnehtia molekyylitason kunkin fibroblastien toiminnan ja arvioida merkitystä havainnoistamme syöpää fibroblastien vuorovaikutuksen todellinen kasvaimissa.

Tämä työ rajoitti luonne solupopulaatioiden tutkitaan , sikäli kuin perustetun syöpäsolun linjat ja normaalin kudoksen fibroblastit ehkä ole täysin phenocopy niitä solupopulaatioiden, jotka ovat olemassa kehittyvä ihmisen kasvain. Lisätutkimukset suurempia tai monipuolisempi fibroblasti paneeleja voi tunnistaa uusia ja erilaisia ​​malleja toiminnan. Lisäksi nämä kokeet mukaan vain 12 syöpäsolulinjaa.