Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kehittää tehokkaita syövän rokotteita on edelleen haaste. Huolimatta ratkaisevaa roolia plasmasolumaisiin dendriittisolujen (pdCs) antituumoriselta vasteita, niiden terapeuttista potentiaalia ei ole vielä laadittu. Olemme tutkineet merkitystä HLA-A * 0201 täsmäsi allogeeninen pdCs vektoreina immunoterapiassa.

menetelmät ja havainnot

stimulointi PBMC HLA-A * 0201

+ luovuttajien HLA A * 0201 täsmäsi allogeenisten pdCs pulssitettiin kasvaimen peptidejä laukaisi korkeita antigeenispesifisten ja toiminnalliset sytotoksisia T-soluvasteita (jopa 98% tetrameeriä

+ CD8-T-soluja). PDC-rokote osoittanut voimakasta kasvaimia vastustavaa hoidollista tehokkuutta in vivo, kuten on esitetty tuumorin kasvun humanisoidun hiirimallissa. Se sai aikaan erittäin toimiva kasvaimen spesifisten T-solujen ex vivo PBMC ja TIL vaiheen I-IV melanooma potilailla. Vasteet mela, GP100, tyrosinaasi ja MAGE-3 antigeenejä saavutti tetrameerin tasolle jopa 62%, 24%, 85% ja 4,3% tässä järjestyksessä. pDC rokote-pohjustetaan T-solujen nimenomaan tappoi potilaan oma autologisia melanoomakasvainsolujen. Tämä semiallogeenisia pDC rokote oli tehokkaampi kuin tavanomaiset myelooinen DC-rokotteiden. Lisäksi PDC rokotesuunnittelussa hankkii sen kanssa hyvät mahdollisuudet kliiniseen käyttöön syövän hoidossa.

Johtopäätökset

Nämä havainnot korostavat HLA-A * 0201 täsmäsi allogeeninen pdCs kuin indusoivat kasvaimen immuniteetin ja tarjoavat lupaavan immunoterapeuttisen strategia taistelemaan syöpää.

Citation: Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) romaani syövän rokotteen strategia perustuu HLA-A * 0201 Hyväksytty Allogeeninen Plasmasolumaiset dendriittisoluja. PLoS ONE 5 (5): e10458. doi: 10,1371 /journal.pone.0010458

Editor: Graham Pockley, Sheffieldin yliopisto, Iso-Britannia

vastaanotettu: 04 joulukuu 2009; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2010 Julkaistu: 4. toukokuuta 2010

Copyright: © 2010 Aspord et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Institut National du Cancer (ACI-63-04 ja canceropole 2004-05) ja Etablissement Français du Sang. J. Charles oli vastaanottaja avustuksia National Academy of Medicine ja canceropole 2004-05. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tehokkaiden rokotteiden kehittäminen syövän hoitoon on suuri kansanterveydellinen kysymys [1]. Koska sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL) pystyvät tunnistamaan ja hajottamaan pahanlaatuisia soluja, monia terapeuttisia tutkimukset on voimistavan CTL-vasteita. Myeloidinen dendriittisolut (MDC) -pohjaisen rokotteita onnistunut taivuttaa T-soluja potilailla, mutta ilman riittävää kliinistä tehoa [2], [3]. Adoptiovanhemmat solujen siirto kasvainten vastaisten T-soluja monistettiin ex-vivo TIL aiheuttama tavoite kasvainregressio [4], [5], mutta monimutkaisuus tämä strategia on haitannut laaja kehitys. Sen vuoksi on olemassa voimakas tarve uusille immunoterapeuttisen strategioita rajoitusten voittamiseksi nykyisen protokollia.

asti, induktio spesifisten T-soluvasteiden sekä otto- ja aktiivinen immunoterapeuttisia strategioita on perustunut MDC: t [6 ] – [8]. Plasmasolumaiset dendriittisolut (PDC) ovat kuitenkin keskeisiä toimijoita immuniteetti [9], [10] reagoimaan osassa kasvaimen immuunivasteet [11]. pdCs eroavat MDC monin kuten TLR ilme, muuttoliike profiilin ja immuunivastetta liipaisu. pDC kykenevät myös antigeenin talteenotto, käsittely ja esitys [12] – [15]. Antigeeni-pulssi pDC voi stimuloida tiettyjä ensisijaisen (Mela) ja muistin (Flu) autologiset CD4 ja CD8 T-solujen immuunivastetta in vitro [16] – [19] ja prime toiminnallisia T-soluvasteiden in vivo esitetään rokotuksen jälkeen hiirien CpG tai virus-aktivoitu pDC [20] – [21]. pDC tavataan monia kasvaimia ihmisissä [22] – [26], jossa ne ajatellaan olevan epäkypsiä, tolerogeenistä tai yhteydessä huonoon ennusteeseen. Kuitenkin melanooma, pDC aktivaation TLR-L voi laukaista voimakas anti-kasvain vaikutuksia. Hiirillä, imikimodi sovellus (TLR7-L) [27] tai kasvaimeen injektion CpG (TLR9-L) [28] päinvastaiseksi toiminnallinen esto pDC, mikä edistää kasvaimen regressio. Lisäksi paikallinen CpG hallinto melanoomapotilaissa aiheuttama rekrytointi ja aktivointi PDC vartijaimusolmukkeista [29] ja myöhemmin kasvain CD8 T-soluja, jotka liittyvät kliinistä hyötyä [30]. Potentiaalia pDC synnyttämään tehokas kasvaimen immuunivasteet on myös osoitettu hiirimallissa [31]. pDC perustuvia lähestymistapoja ja TLR-agonistien [32] Tästä syystä lupaavia ihmisen syövän hoidossa.

Kasvaimen antigeenejä aiheuttavat yleensä heikko vastauksia. Sen sijaan, allogeeninen vastaan ​​suunnattujen ei-itse MHC ovat äärimmäisen voimakkaita. Mielenkiintoista, allogeeninen vaste välittämä luokan II MHC-rajoittunut CD4 + T-solujen edistää sivullisten T-solun, induktio [33], [34] kuten jo esitetty viruspeptidejä [35] ja kasvaimen regressio seuraava allogeeninen ihonsiirto [36]. Allogeneicity voitaisiin siis hyödyntää edistämään immunogeenisyyttä kohti tuumoriantigeeneistä [37], kun otetaan huomioon osittaista HLA ottelua rokote ja potilaan myöhemmin kutsutaan nimellä HLA Hyväksytty allogeneicity.

Koska pdCs on keskeinen rooli käynnistämisessä T soluvasteita, niiden käyttö voi olla lupaava uutena immuuniterapeuttista strategioita. Kuitenkin autologinen pDC syövän immunoterapiassa on vaikeaa, koska niukkuuden näiden solujen [38] ja mahdollinen toiminnallinen muuttuminen pdCs korjattu kasvaimia omaavilla potilailla. Siksi tutkittu mahdollisuuksia HLA-A * 0201 sovitettu allogeenisiä pDC indusoida HLA-A * 0201-rajoitettu kasvaimen vastaisen immuniteetin. Käytimme ainutlaatuisen ihmisen pDC solulinja (GEN) perustetaan leukeeminen HLA-A * 0201

+ pDC kanssa fenotyyppiset ja toiminnalliset ominaisuudet suljettu ensisijainen pdCs [39], [40], [41]. Strategia koostui käyttämällä peptidin ladattu pdCs indusoida HLA-A * 0201-rajoitettu antigeenispesifisten CTL. Osoitamme tästä käyttäen kasvain ja virus malli antigeenejä potentiaali säteilytettyä peptidilisätyn ihmisen HLA-A * 0201 täsmäsi allogeenisten pDC linja (GENiusVac) in vitro, sen terapeuttinen teho in vivo humanisoituja hiirissä, ja sen kliininen merkitys ex-vivo melanooma potilaiden soluissa. Meidän havainnot korostavat HLA-A * 0201 täsmäsi allogeeninen pdCs kuin indusoivat kasvaimen vastaisen immuniteetin ja tarjoavat uuden lupaavan immunoterapeuttisen strategian taistelemaan syöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Viljelmät suoritettiin RPMI 1640 Glutamax täydennetty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1 mM natriumpyruvaattia (Sigma), 100 ug /ml gentamysiiniä ja 10% FCS: ää (kaikki Invitrogen-yhtiöltä, ellei ilmoitettu). Melanoomalinja Me275 tarjosi Pr J-C Cerottini (Ludwig Institute for Cancer Research, Epalinges, Sveitsi). Melanooma linjat COLO829 ja A375, T2 ja K562 linjat hankittiin ATCC (LGC Standards, Molsheim, Ranska). Melanoomalinja Mel89 tuotettiin laboratoriossamme (kuva S1). Anti-ihmis CD45, CD3, CD8 Abs hankittiin Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs hankittiin BD Biosciences ja anti- ihmisen MELA Sigma.

peptiditekijät tetrameereihin

käytimme seuraavia viral- ja kasvaimen HLA-A * 0201 rajoitettua peptidit (NeoMPS) ja vastaava iTag HLA-A * 0201 tetrameerit (Beckman Immunomics): Mela

26-35 (ELAGIGILTV), GP100

209-217 (IMDQVPFSV), tyrosinaasi

369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3

271-279 (FLWGPRALV), FluM1

58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65

495-503 (NLVPMVATV).

PBMC, pDC linja, ensisijainen pDC eristäminen ja MDC: t sukupolven

Ihmisen PBMC: t saatiin HLA-A * 0201

+ terveiden luovuttajien Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoinnilla (Eurobio). Ihmisen pDC linja GEN2.2 viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [39]. Ensisijainen pDC eristettiin verestä HLA-A * 0201

+ terveen luovuttajan. DC ensin rikastettiin ehtyminen toivottuihin soluihin käyttämällä Pan DC esirikastus- Kit (StemCell). Talteen soluja joko toimitettiin BDCA4 + valinta (Miltenyi) tai leimattu Lineage cocktail, CD123, HLA-DR ja CD11 c-vasta-aineita (BD) ja lajitellaan BD FACSAria perusteella CD123 ja HLA-DR ilmentymisen ja puute Lin ja CD11 c markkereita. Puhtaus pDC jälkeen lajitella oli yli 98%. MDC: t erottuivat veren monosyyteistä käyttäen 500 U /ml GM-CSF: n ja 10 ng /ml IL-4 (Tebu Prepotech, Ranska) 6 päivää. Tutkimus tehtiin alle hyväksymän menettelyn Ranskan Veren viraston Institutional Review Board. Kaikki avunantajat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen muotoja.

Melanooma potilaan näytteitä

Näytteet saatiin vaiheessa I-IV HLA-A * 0201 melanoomaa potilaalla allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen muotoja. Käytimme ylimääräistä materiaalia, joka ei ollut tarpeen potilaan diagnoosin tai analyysiä eikä tarvita täydentävää menettelyjä. Siksi mukaisesti Ranskan asetuksen ei etiikkaa hyväksyntä tarvitaan, mutta tietoa ja allekirjoitettu suostumus potilaista. Kliiniset parametrit esitetään taulukossa S1. Verinäytteet saatiin 12: lla potilaista ja PBMC: t puhdistettiin gradientti tiheys. Tuore kasvainnäytteestä saatiin 6 potilasta, jotka leikattiin siirron etäpesäkkeitä. Näytteet dilacerated ja hajotettiin 2 mg /ml kollagenaasia D (Roche Diagnostics) 20 U /ml DNaasia (Sigma). Sitten kasvaimen solut eristettiin solususpensiosta, jonka tarttuvuus ja TIL rikastettu ei-kiinnittynyt osa tiheysgradientti.

Specific T-soluvasteen induktio in vitro

GEN solut ensin ladataan yhdellä tai useita peptidi (t) kohteisiin. Lyhyesti, solut pestiin 3 kertaa seerumittomalla RPMI ja suspendoitiin uudelleen 1,10

6 solua /ml. β2-mikroglobuliinin (0,1 ug /ml lopullinen) (Sigma) ja peptidi (t) (1-10 uM lopullinen) (NeoMPS) lisättiin. 3 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut pestiin kahdesti, säteilytettiin 30 Gy ja suspendoitiin uudelleen 2,10

5 solua /ml RPMI: ssä, jossa oli 10% FCS: ää. Peptidi-ladattu GEN Sitten viljeltiin yhdessä semiallogeenisia HLA-A * 0201 PBMC klo 1:10 RPMI + 10% FCS vähintään 7 päivää. Viljelmät viikoittain stimuloitiin uudelleen peptidillä lastattu GEN ja 200 U /ml IL-2 (Proleukine; Chiron). Joissakin kokeissa stimuloimattomissa ensisijainen pdCs tai MDC: t kypsytetään LPS (1 ug /ml) käytettiin noudattaen samoja ehtoja. Joissakin kokeissa estää anti-IFNa (50,000 U /ml) ja anti-IFN (25,000 U /ml), vasta-aineita (PBL Lääketieteelliset laboratoriot) tai vuohen kontrolli-IgG: tä lisättiin päivänä 0 ja päivänä 2 kulttuuriin. CD8-T-soluvasteita mitattiin tetrameerin merkintöjä PBMC alun perin ja eri vaiheissa viljelmästä. Solut suspendoitiin uudelleen HBSS: ään, jossa oli 2% FCS, värjättiin CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201-tetrameeri PE, CD3 PC7, CD8 APC vasta-aineita ja analysoitiin virtaussytometrialla analyysi käyttäen FACSCalibur ja Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Määrittämään alkuperäisen tetrameeri tasot, ainakin 1-2,10

6 tapahtumaa hankittu.

In vitro funktionaalisia määrityksiä

IFNy eritystä ja CD107 ilmentyminen tetrameerin + CD8 T-soluja.

T-solut ensin leimattiin iTag HLA-A * 0201-tetrameeri PE 30 min RT: ssä, pestiin ja niitä stimuloitiin uudelleen peptidillä pulssitetun T2-solujen (10:01 suhde) 5 h30. Sillä IFNy eritystä, 1 ul /ml brefeldin A (BD Biosciences) lisättiin viimeisten 3 h. Soluja Sitten pinta-leimattu anti-CD3 PC7 ja anti-CD8 APC vasta-aineita ja toimitetaan IFNy solunsisäistä värjäystä (BD Biosciences). Sillä CD107 havaitsemista, anti-CD107a ja CD107b FITC-vasta-aineita (10 ul /1,10

6 solua) (BD Biosciences) lisättiin väliaineessa alussa direstimulaatioon läsnä Golgi STOP (0,67 pl /ml) varten Viimeisten 4 h. Sitten solut leimattiin anti-CD3 PC7 ja anti-CD8-APC-vasta-aineita. IFNy ja CD107 värjäys analysoitiin tetrameeri

+ CD8 + T-solut, tetrameeri

– CD8 + T-solujen ja CD4 + T-soluja.

Sytotoksisuusmääritvs.

Antigeenispesifinen sytotoksista aktiivisuutta mitattiin suorittamalla standardi

51Cr release määrityksessä. Efektori-T-solut lajiteltiin Yhdessä viljelemisen käyttäen EasySep ihmisen T-solujen rikastaminen Kit (Stem Cell). Kohdesoluja (peptidi-pulssi T2-soluja, K562, allogeenisiä tai autologisia kasvainsoluja) leimattiin 50 uCi 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, pestiin 3 kertaa ja päällystetty efektori-T-solujen kanssa ilmoitetun E: T-suhde pyöreäpohjaisessa 96 -kuoppaiset levyt. 4 tunnin inkubaation, radioaktiivisuus mitattiin 30 ui supernatanteista on mikrolevyn tuikelaskimella Top Count NXT (Perkin Elmer). Keskiarvoa kolmesta mittausten ilmaistiin prosentteina spesifisen lyysin kaavalla: (mallitiedotetta – spontaani vapautuminen) /(maksimaalinen vapautuminen – spontaani vapautuminen) x 100.

In vivo funktionaalisia määrityksiä in humanisoituja hiirillä

NOD-SCID β

2m

– /- immuunivajaisiin hiiriä (NOD.Cg-Prkdc

SCIDβ

2m

Tm1Unc /J) hankittiin Jackson Immuno- Laboratories (Bar Harbor , USA) ja kasvatettu klo Plateforme de Haute Technologie animale (PhtA, La Tronche, Ranska). Aktiivisille hoito kokeita HuPBL hiiret rakennettiin siirtämällä vatsaonteloon (ip) 50.10

6 PBMC terveistä luovuttajista osaksi sublethally säteilytettyä NOD-SCID β

2m

– /- hiirillä (120-150 cGy). Hiiret edelleen rokotettiin 5,10

6 säteilytetty peptidilisätty GEN solujen ip tai sc reittejä kerran viikossa. Rokotevasteeseen analysoitiin eri aikapisteissä verta, vatsakalvon huuhtelu, pernassa ja imusolmukkeissa. Elimet pilkottiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa 2 mg /ml kollagenaasia D (Roche Diagnostics). Tuloksena solususpensiot pestiin HBSS + 2% FCS, värjättiin käyttäen seuraavia anti-ihmisen vasta-aineita (CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201-tetrameeri PE, CD3 PC7, CD8 APC), ja ne toimitetaan virtaussytometria-analyysi. Arvioida terapeuttista tehokkuutta, 1,10

6 ihmisen kasvainsoluissa istutettiin ihonalaisesti kylkeen humanisoidun hiiret joko 5 päivää sen jälkeen, kun (profylaktinen) tai 4 päivää ennen (terapeuttinen) ensimmäisen rokotuksen. Rokotus toistettiin joka viikko. Kasvaimen koko seurattiin 2-3 päivän välein ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: (lyhyt halkaisija)

2 x pitkä halkaisija /2. Analysoida spesifisten T-solujen kasvainkohdassa ja DLN, kudokset digestoitiin kuten aikaisemmin on kuvattu, ja solususpensiot toimitettiin tetrameerin merkintöjä ja virtaussytometria-analyysi. Kaikki in vivo kokeissa on hyväksynyt alueneuvoston eläinten eettisen Rhone-Alpes (CREEA) sidoksissa CNRS.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Mann-Whitneyn parametritonta U-testi ja parittomia t-testi käyttäen Prism-ohjelmiston.

tulokset

Ihmisen HLA täsmäsi allogeenisen pdCs indusoi antigeenispesifisiä T-soluvasteita terveistä luovuttajan PBMC vahva teho in vitro

tutkia mahdollisuuksia HLA täsmäsi allogeenisten PDC antigeenispesifisten T-soluvasteiden induktio, vertasimme kyky peptidin ladattu ensisijainen pDC järjestetty terveiltä luovuttajilta veren indusoida spesifisten T-soluvasteiden autologisten ja allogeenisten HLA-A * 0201-Hyväksytty asetukset. pDC johti huomattavasti korkeampaan spesifisten T-solujen induktio HLA-A * 0201 täsmäsi allogeenisen asetukset verrattuna autologiseen olosuhteissa (monistamisen absoluuttinen määrä MELA-spesifisten T-solujen 7 päivää: 35,6 ± 8,9 vs. 17,9 ± 8,7, keskiarvo ± SEM , p = 0,02) (kuvio 1A ja 1 B, neljä kokeita kolmella eri luovuttajilta). Koska niukkuus ensisijaisen pDC estää niiden laaja terapeuttinen käyttö, käytimme ihmisen pDC solulinja (GEN) perustetaan leukeeminen HLA-A * 0201

+ pDC lähteenä HLA-A * 0201 Hyväksytty allogeenistä pdCs. Sen arvioimiseksi, onko säteilytetty HLA-A * 0201

+ pDC linja voi aiheuttaa spesifistä T-soluvasteita kuin ensisijainen pDC in vitro, allogeeninen HLA-A * 0201

+ PBMC terveistä luovuttajista stimuloitiin säteilytettyä peptidi-ladattu GEN-soluja. Sekä kasvain (Mela) ja virusten (Flu) peräisin olevien peptidien ennustaminen, saimme massiivisen vahvistus spesifisten T-solujen jälkeen vain 7 päivän viljelyn havaittuna tetrameerin merkintöjä (Kuva 1C, kuva S2). Tämä induktio oli parantaa entisestään sarja- ärsykkeet 7 päivän välein peptidin ladattu pDC linja, yhdessä IL-2. Me rutiininomaisesti saatu 5-25% tetrameeripositiivisista

+ CD8-T-solujen 7 päivän jälkeen, 40-60% 15 päivän kuluttua, ja jopa 98% 40 päivän jälkeen (kuvio 1 C). Tällainen korkea vasteita toistetaan solujen 14-20 terveiltä luovuttajilta ja eri melanoomakasvaimen johdetut antigeenit, kuten mela, GP100, TYR, MAGE-3 (kuvio 1 D) sekä virus-johdetut antigeenit (kuvio S2). Kasvainspesifiset tetrameerin

+ T-soluvasteiden saavutti keskiarvot 22% Mela (vaihteluväli 2-60%), 0,3% GP100 (vaihteluväli 0-3%), 1,2% TYR (vaihteluväli 0-8%) ja 0,84% MAGE-3 (vaihteluväli 0-4%) 20 päivää. Multi-vasteita indusoitui myös käyttämällä GEN-soluja ladattu useita erilaisia ​​peptidejä (ei esitetty). Siten HLA Hyväksytty allogeeninen ensisijainen pdCs tai PDC linjan saada vahva ensisijainen ja muistin antigeenispesifisiä T-soluvasteita in vitro terveiltä luovuttajilta.

(A, B) autologista tai allogeenista HLA-A * 0201

+ ensisijainen pDC lajiteltu verestä terveiden luovuttajien pulssitettiin MELA peptidin ja käyttää stimuloimaan HLA-A * 0201

+ PBMC. Spesifinen T-soluvaste analysoitiin d7 mukaan tetrameerin merkintöjä. (A) Prosenttia Melan spesifisten T-solujen (aidatulla CD8 + T-solujen). Yksi edustava koe esitetään. (B) monistaminen absoluuttinen määrä T-solujen välillä d0 ja d7 (4 erillisen kokeen suoritettiin 3 eri luovuttajilta). (C, D) allogeenista HLA-A * 0201

+ PBMC terveistä luovuttajista stimuloitiin säteilytettyä peptidi ladattu HLA-A * 0201

+ pDC linja ja viikoittain stimuloitiin uudelleen läsnäollessa IL2. Spesifisyys T-solujen määritettiin tetrameerin merkintöjä ja virtaussytometria-analyysi. (C) edustaja pistekuvaajat eroteltiin CD8 + T-solujen (vasen paneeli) ja prosenttiosuudet (oikea paneeli) Mela tetrameerin

+ T-solujen viljelmän alun ja eri ajankohtina stimulaation jälkeen PDC linjan ladattu MELA peptidin. Flu-tetrameerin käytettiin kontrollina. (D) edustaja piste tontteja eroteltiin CD8 + T-solujen (vasen paneeli) ja prosenttiosuudet tetrameerin

+ CD8 + T-solut saadaan päivää 7, 14 ja 20 viljelmän kohti Mela (n = 18), GP100 (n = 16 ), TYR (n = 16) ja MAGE-3 (n = 16) kasvaimen antigeenejä.

erityinen T-solujen indusoima HLA täsmäsi allogeenisen pDC näytteillä in vitro toiminnallinen HLA-rajoitettu aktiivisuus

tutkitaan edelleen toiminnallisuutta spesifisten T-solujen indusoima HLA-A * 0201 täsmäsi allogeenisen pDC line. Ensin analysoidaan kykyä kasvaimen spesifisten T-solujen erittämään IFNy ja ilmaista CD107, kun -uudelleenstimulaation. Kun viljeltiin yhdessä peptidin ladattu T2-soluja, mela-spesifisten T-solujen erittää IFNy ja ilmaisi CD107 läsnä ollessa asiaan, mutta ei kontrolloida peptidin (kuva 2A). Saimme sisällä kasvaimeen reagoivien T-solujen keskiarvot 25% IFNy

+ tetrameeri

+ CD8-T-solujen erityisin -uudelleenstimulaation verrattuna 5% kontrolloiduissa olosuhteissa (p = 0,007), ja 50% CD107

+ tetrameerin

+ CD8-T-solujen nimenomaisesta -uudelleenstimulaation verrattuna 24% kontrolloiduissa olosuhteissa (p = 0,02) (aineistoa ei esitetty). Seuraavaksi testasimme niiden sytotoksisuus suorittamalla

51Cr vapautumisen määrityksellä käyttäen peptidi-ladattu T2-soluja ja melanoomakasvain linjat kohteina. Mela-spesifisten T-solujen kanssa osoitti voimakasta sytotoksista aktiivisuutta kohti T2-soluja ladattu asiaa, mutta ei kontrolli-peptidiä (kuvio 2B). Saimme 88% erityisten tappaminen verrattuna 13% kontrolloiduissa olosuhteissa (keskiarvo 8 kokeissa, p 0,001) (ei esitetty). Lisäksi MELA-T-soluja kykenivät hajottamaan HLA-A * 0201

+ Mela

+ (Me275), mutta kumpikaan HLA-A * 0201

+ Mela

– (A375) eikä HLA -A * 0201

-MelA

+ (COLO829) melanoomakasvainsolujen (kuvio 2B, kuvio S1) osoittavat HLA-A * 0201-rajoitus ja antigeenispesifisyys tätä toimintaa. Lisäksi tämä hajoaminen inhiboitui EGTA-MgCl2: a tai CD8-T-soluja tuhoavan (ei esitetty), joka yhdessä CD107: n pinnalla ilmenemisen yhteydessä tiettyyn direstimulaatioon, ehdottaa mekanismia, johon sytolyyttinen rae eksosytoosia CD8 T-soluja. Tällaisia ​​toimintakyvyn havaittiin T-solujen otettu eri ajankohtina on 7-40 päivää kulttuuriin. Samanlaisia ​​analyysi suoritettiin virus-spesifisten T-solujen osoitettiin kapasiteettia Flu tetrameerin

+ T-solut erittämään IFNy ja ilmaista CD107 nimenomaisesta direstimulaatioon, ja niiden sytotoksisia ominaisuuksia (kuviot S3A ja S3B). Mikä tärkeintä, havaitsimme vain vähäinen allogeenisen vasteen induktion josta on osoituksena huonosta aktivoituminen epäspesifisten tetrameerin

– CD8 + T-solujen ja CD4 + T-soluja kohtaan GEN soluja. Tämä havaittiin yhden stimulaation (Flu vaste) (Kuva S3C ja S3D), mutta myös toistuvan stimulaation PDC viiva (Mela vaste), mittaamalla IFNy erittämä (kuvio 2C) ja CD107 ilmentäviä T-soluja (kuvio 2D) upon -uudelleenstimulaation T2 tai GEN soluja. Havaitsimme myös, ettei tetrameerin

+ T-solujen aktiivisuutta GEN lastatut solut irrelevantilla peptidillä. Siten PDC linja herättää täysin toimiva antigeenispesifisten T-solujen vähäinen sivullisten allogeenisten vastauksia.

(A) MELA-spesifisten T-solujen aiheuttama pDC linja erittää IFNy ja ilmaista CD107 pinnalla yhteydessä tiettyyn -uudelleenstimulaation. Solut viljelmästä (päivä 14) toimitettiin tetrameerin merkinnät ja stimuloitiin uudelleen T2-soluja pulssitettiin asiaan tai kontrollipeptidiä. IFNy tuotanto arvioitiin solunsisäistä värjäystä ja CD107 ilmentyminen lisäämällä anti-CD107a + b vasta aikana uudelleenstimulointi. Pistekuvaajat ovat aidatulla on tetrameeri

+ CD8 + T-soluja. Edustajalle 8 kokeet suoritettiin 3 luovuttajien päivänä 8-40 viljelmän. (B) Melan-spesifisten T-solujen aiheuttama pDC linja on sytotoksinen. T-solut valittiin viljelmästä ja altistetaan

51Cr vapautumisen määrityksellä käyttäen peptidi-ladattu T2-soluja ja melanoomakasvainsolujen kohteina. Edustajalle 8 kokeet suoritettiin 4 rahoittajien d13-40 viljelmän. (C, D) IFNy eritystä ja CD107 ilmentyminen arvioitiin kuten on kuvattu (A) kolmen ärsykkeitä PBMC ja analysoitiin tetrameeri

+ CD8 + T-solut (valkoiset pylväät) ja epäspesifinen tetrameerin

– CD8 + T-soluja (harmaat pylväät) ja CD4 + T-soluja (mustat pylväät), kun -uudelleenstimulaation peptidi-pulssitetuilla T2 tai GEN-solujen (4 kokeissa kunkin kunnossa).

peptidi-ladattu HLA täsmäsi allogeenisen pDC linja saa aikaan vahva in vivo antigeenispesifisten T-soluvasteiden humanisoidun hiirissä

käyttö HLA täsmäsi allogeenisen pdCs rokotteena edellyttää induktion antigeenispesifisten T-soluvasteiden in vivo. Siksi arvioimme rokotepotentiaalia PDC linjan humanisoitua hiirimallissa [42] rakentama xenotransplanting ihmisen PBMC osaksi immuunivajaisiin NOD-SCIDβ

2m

– /- hiirillä (HuPBL SCID malli). Kaksikymmentä neljä tuntia vatsaonteloon siirron, ihmisen CD45

+ hematopoieettisten solujen havaittiin injektiokohdassa vaan myös verenkierrossa ja imukudoselimet (ei kuvassa). Yksi intraperitoneaalisella injektiolla säteilytetyn peptidin ladattu HLA-A * 0201 täsmäsi allogeenisen pDC line indusoi voimakkaan antigeenispesifisten T-soluvasteiden kohti viruksen (FluM1, CMVpp65) ja kasvaimen (mela) antigeenejä in HuPBL hiirillä (kuvio 3A). Ihmisen tetrameeri

+ CD8 T-solujen havaittiin paitsi paikalla immunisaation (vatsakalvon huuhtelu), mutta myös verenkierrossa (veressä) ja lymfaattisen elimet (perna, imusolmukkeet) (kuvio 3A). Sitten arvioidaan, onko useita viikoittain injektiot peptidilisätty pDC linja voisi parantaa tasoa vasteen. Mielenkiintoista, virusperäinen antigeeni (Flu) aiheuttama korkea vaste, joka oli korkeimmillaan 7 päivän ensimmäisen rokotteen ja laski sen jälkeen, kun taas vaste kasvaimen antigeeni (Mela) kasvoi edelleen, kun myöhemmin uudelleenstimulaatiot (kuva S4). Kuluessa kaikki rokotetut HuPBL hiiret (n = 22, 18 ja 38), liuotetaan ihmisen PBMC: (lähtötasolle tetrameeriä + CD8 + T-solut olivat 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) ja 0,01% (mela) tetrameerin

+ T solut), spesifisten T-solujen talteen eri elimissä vaihteli 0,7-1,9% ja FluM1, 1,1-5,9% ja CMVpp65, ja 0,2-1% ja mela (kuvio 3B). Näin ollen, peptidi-pulssitetuilla pDC line saa aikaan voimakkaan ja laajalle levinnyt antigeenispesifisiä T-soluvasteita in vivo.

(AB) immuunivajaisiin NOD-SCIDβ

2m

– /- hiiret käyttövalmiiksi intraperitoneaalisesti 50,10

6 ihmisen HLA-A * 0201

+ terveen luovuttajan ”PBMC ja rokotettu samaa reittiä kanssa 5,10

6 säteilytetty peptidi-ladattu GEN soluissa. T-solun, induktio analysoitiin injektiokohdassa (huuhtelun), verenkierrossa (veressä) ja lymfaattisen elimet (perna, LN) mukaan tetrameerin merkinnät ihmisen T-solujen solususpensioiden. (A) Rokotus peptidi-ladattu GEN indusoiman spesifisten T-soluvasteiden in vivo. Edustavia dot käyrät tetrameerin merkitty T-solujen aiheuttamaa yhden rokotuksen jälkeen peptidi-ladattu GEN solujen eri elimissä päivänä 8 anti-virusrokote (Flu, CMV) ja päivänä 10 anti-kasvain rokote (Mela) (aidatulla CD8

+ T-solut). Yksi hiirtä ryhmässä näytetään. Lähtötasoa spesifisten T-solujen sisällä PBMC olivat 0,04%, 0,14% ja 0,003% vastaavasti. (B) tasot spesifisten T-solujen ennen (päivä 0) ja jälkeen rokotuksen GEN täynnä FluM1 (n = 22 hiirillä, 4 luovuttajia, 1-rokote), CMVpp65 (n = 18 hiirillä, 2 luovuttajia, 1-rokote) ja mela ( n = 38 hiiret, 4 luovuttajien 2-3 rokotteet) peptidit on merkitty aikoina eri elimissä. Jokainen piste edustaa yhtä rokotettujen HuPBL hiiriä (palkit keskiarvo).

Rokottaminen peptidi-ladattu HLA täsmäsi allogeenisen pDC linja suojella humanisoitu hiiriä syövän etenemisen sekä profylaktinen ja terapeuttinen asetukset

Me tutkimme seuraavaksi terapeuttista mahdollisuuksia tämän strategian humanisoituja hiirillä edelleen Siirto tehty ihmisen kasvain. NOD-SCIDβ

2m

– /- hiiret saatettu vatsakalvonsisäisesti ihmisen HLA-A * 0201

+ PBMC ja viikoittain rokotettu subkutaanisesti säteilytettyä peptidilisätty GEN soluja ennen tai jotka altistettiin melanoomatuumorin solut. Ennaltaehkäisevässä ympäristössä, injektio HuPBL hiirten MELA-ladattu GEN soluja verrattuna Flu ladattu GEN soluja, esti HLA-A * 0201

+ Mela

+ kasvaimen kasvua (Me275) viidessä itsenäisestä kokeesta (kasvain koko päivänä 27 = 12 vs 77 mm

3, p 0,0001) (kuvio 4A ja 4C). Sen sijaan kasvu HLA-A * 0201

-MelA

+ (COLO829) ja HLA-A * 0201

+ Mela

– (A375) melanooma kasvaimissa ei ollut vaikutusta injektion jälkeen Mela tai Flu-ladattu GEN-solut kolmessa riippumattomassa kokeessa (kuvio 4C), mikä osoittaa, HLA-A * 0201-rajoitus ja antigeenispesifisyys hoidon. Lisäksi peptidi-ladattu pDC aiheuttavien suojaava immuunivaste jo kasvaimia. Rokottaminen kasvainta kantavien HuPBL hiirten MELA-ladattu GEN soluissa esti kasvaimen kasvua verrattuna Flunssan ladattu GEN soluja (kasvaimen koko päivänä 25 = 6 vs 36mm

3, p = 0,01) (kuvio 4D-4F). Erityisesti tetrameeri

+ CD8 + T-soluja löydettiin kasvain sivusto ja tyhjennys LN (kuviot 4B ja 4F), mikä viittaa siihen, että kasvain-reaktiivisten T-solujen indusoima HLA Hyväksytty allogeenisen pDC oli siirtynyt paikalle antigeenin ilmaisun ja T-solut kykenivät tappamaan syöpäsoluja.

(AC) immuunivajaisiin NOD-SCID β

2m

– /- hiirillä käyttövalmiiksi vatsaonteloon ihmisen HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL hiiret) on viikoittain rokotettiin subkutaanisesti säteilytettyä Mela tai Flu-ladattu GEN solujen ja haastoi viisi päivää myöhemmin melanoomakasvainsolujen kylkeen. (A) seuranta syövän etenemisen. Eräässä kokeessa edustaja 5. (B) tetrameeriä merkintöjä kasvaimen ja tyhjennys LN solususpensioita alkaen HuPBL rokotetuilla hiirillä MELA-ladattu GEN solujen osoittaa läsnäolon MELA-T-solujen (aidatulla CD8 + T-solujen). (C) terapeuttiset vaikutukset rokotteen HLA-A * 0201-rajoitettu ja antigeenispesifisen. Vertaileva kasvaimen kokoa 27 päivää implantaation jälkeen Me275, COLO829 ja A375-melanoomasoluja osaksi HuPBL rokotettujen hiirten Mela tai Flu-ladattu GEN soluja (pooli 3 itsenäisen kokeen kullekin kasvaintyyppi suoritetaan 6-14 hiirtä per ryhmä). (DF) immuunivajaisiin NOD-SCID β

2m

– /- hiirillä käyttövalmiiksi vatsaonteloon ihmisen HLA-A * 0201

+ PBMC (HuPBL hiiret) ensin altistettiin melanooma Me275 kasvainsolujen kylkeen ja sitten rokotettu subkutaanisesti säteilytettyjen Mela tai Flu-ladattu GEN solujen viikoittain alkoi 4 päivää myöhemmin. (D) seuranta syövän etenemisen. Yksi edustava koe 2 (E) Vertaileva tuumorin koon 25 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen (allas 2 riippumattomasta kokeesta 8 hiirtä /ryhmä). (F) tetrameeriä merkintöjä kasvaimen ja tyhjennys LN solususpensioita alkaen HuPBL rokotetuilla hiirillä MELA-ladattu GEN solujen osoittaa läsnäolon MELA-T-solujen (aidatulla CD8 + T-solujen).

HLA Hyväksytty allogeeninen pDC linja täynnä melanooma peptidien indusoi monen erityinen ja erittäin toimiva T-soluvasteiden ex-vivo vaiheen I-IV melanooma potilaiden

tutkimme seuraavaksi merkitystä tämän strategian syöpäpotilailla. Testasimme kapasiteetin peptidilisätty pDC line käynnistää ex-vivo kasvaimen-vasteita PBMC: stä ja kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) eristetään vaiheen IV HLA-A * 0201

+ melanoomapotilailla (taulukot S1 ja S2 ). Weekly ärsykkeet potilaiden PBMC kanssa pDC linjan pulssi joko mela, GP100, TYR tai MAGE-3-peptidi johti massiiviseen vahvistus spesifisten CD8 + T-soluja vähintään 2 out of 4 melanooma-antigeenejä (kuviot 5A ja 5B). Kasvain-erityinen tetrameerin

+ CD8 T-soluvasteiden saavutti keskiarvot 23% for Mela (vaihteluväli 0,4-62%), 1,2% GP100 (vaihteluväli 0,05-3,5%), 0,3% TYR (vaihteluväli 0,01-2,5% ) ja 0,2% MAGE-3 (vaihteluväli 0,03-0,72%), kun 20 päivää (lähtötilanteen tetrameerin + CD8 + T-solut olivat 0,02-0,03%: iin d0). Yksi potilas jätettiin pois analyysistä johtuen äärimmäisen intensiivistä vaste (85% tetrameeri

+ T-solut päivänä 14) kohti TYR (kuva S5). Lisäksi toistuvat ärsykkeet on patients’TIL kanssa PDC linjan pulssi sekoitus 4 melanooman peptidien johti massiiviseen vahvistus spesifisten T-solujen vähintään 3 antigeenejä (kuviot 5C ja 5D). Kasvainspesifiset tetrameerin

+ CD8 T-soluvasteiden saavutti keskiarvot 39% for Mela (vaihteluväli 12-59%), 7,4% GP100 (vaihteluväli 0,2-24%), 0,3% TYR (vaihteluväli 0,05-1,2%) ja 1,1% MAGE-3 (vaihteluväli 0,1-4,3%) jälkeen 20 päivän lähtötasolle muodossa päivä 0 1,7, 0,2, 0,05 ja 0,3%, tässä järjestyksessä.