Krooninen sairaus

tiivistelmä

SEMA3B

geeni sijaitsee 3p21.3 LUCA alue, joka usein vaikuttaa eri syöpätyyppien. Tavoitteena Tutkimuksemme oli laajentaa tietämystä

SEMA3B

geeni tuumorisuppressorina ja mekanismeja sen inaktivaation. Tässä tutkimuksessa useita kokeellisia lähestymistapoja käytettiin: kasvaimen kasvua analyysit ja apoptoosin määritykset

in vitro

ja SCID-hiirissä, ilmaisun ja metylaation määrityksiä ja muita. Jossa käytön pienisoluisen keuhkosyövän solulinjassa U2020 olemme vahvistaneet funktio

SEMA3B

tuumorisuppressorina, ja osoitti, että vaimennus voidaan toteuttaa läpi apoptoosin induktion ja, mahdollisesti, inhibitioon liittyviä angiogeneesin. Lisäksi ensimmäistä kertaa, korkea metylointi taajuuksia on havaittu molemmissa introni (32-39%) ja promoottori (44-52%) CpG-saaret 38 ei-pienisoluisen keuhkosyövän, mukaan lukien 16 okasolusyöpää (SCC ) ja 22 adenokarsinoomat (ADC), ja 83 selkeä solussa munuaiskarsinoomia (ccRCC). Väliset korrelaatiot metylaatio taajuuksien promoottorin ja introni CpG-saaret

SEMA3B

kanssa kasvaimen vaiheen ja laatu ovat paljastaneet SCC, ADC ja ccRCC. Yhdistys välinen lasku

SEMA3B

mRNA-tasolla ja hypermetylaatiota promoottorin ja introni CpG-saarilla on arvioitu munuaisten primaarikasvainten (

P

0,01). Käyttämällä qPCR, havaitsimme keskimäärin 10- ja 14-kertainen lasku

SEMA3B

mRNA tasolla SCC ja ADC, vastaavasti, ja 4-kertainen pieneneminen ccRCC. Taajuus vaikutus oli korkea sekä keuhkojen (92-95%) ja munuaisten (84%) kasvainnäytteestä. Lisäksi osoitimme selvän eron (

P

0,05) ja

SEMA3B

suhteelliset mRNA tasot ADC ja ilman imusolmukemetastaaseja. Olemme päätellä, että poikkeava ilmaisu ja metylaation

SEMA3B

voitaisiin ehdottaa merkkiaineina keuhkojen ja munuaisten syövän etenemisessä.

Citation: Loginov VI, Dmitriev AA, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et ai. (2015) tuumorisuppressoriproteiinia toiminta

SEMA3B

Gene in Human Lung ja munuaisten syövät. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10,1371 /journal.pone.0123369

Academic Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 05 helmikuu 2015; Julkaistu: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Loginov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksin 13-04-00828a, 13-04-02072a ja 14-04-32084 mol_a Venäjän perustutkimusrahaston ; myöntää 28.12.07-6888 alkaen Istituto Toscano Tumori; avustusta CNR-RAS yhteisprojektit 2008-2010; avustuksen RAS puheenjohtajisto Program ”Molecular and Cellular Biology”; sopimukset 14.604.21.0117 (hankkeen yksilöllinen tunniste RFMEFI60414X0117) ja 14.621.21.0001 (hankkeen yksilöllinen tunniste RFMEFI62114X0001) alkaen opetus- ja tiedeministeri Venäjän federaation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat puuttumisen varmistamiseksi kilpailevat edut mutta julistaa kuuluminen Affina Biotekniikka. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Semaforiinien ovat negatiivisia välittäjiä aksonaalisista ohjausta keskushermostossa [1]. Semaforiinien käsittävät suuren perheen glykoproteiinien (8 luokat, mukaan lukien 5 selkärankaisten luokkaa, yli 30 jäsentä), mutta vain luokan 3 (SEMA3) edustaa erittyy liukoiset molekyylit. Jäsenet SEMA perheen ilmentyvät eri syövän, ja joko edistää tai estää solujen proliferaatiota, migraatiota ja angiogeneesiä, ja induktio lääkeresistenssin. Siten roolit erillisten jäsenten semaforiini perhe voi olla aivan erilainen [2-9].

Luokka 3 semaforiineilla (SEMA3s, joka tunnetaan myös collapsins) muodostavat yhden viidestä selkärankaisten perheiden Semaforiinien ja niillä on tärkeä rooli kasvaindiagnostiikassa, kuten säätelevät solujen prosesseja, kuten endoteelisolujen proliferaatiota, apoptoosin, muuttoliike ja angiogeneesi [10]. Äskettäin osallistuminen tämän proteiinin luokan syövän synnyssä on tutkittu intensiivisesti. SEMA3s joita erittää solujen useita suvusta, mukaan lukien epiteelisoluissa, neuronien, ja erityisiä kasvainsoluja [10]. Neuropilins (NRP) edustaa ensisijaista reseptorit SEMA3s. Sitoutumisen SEMA3s ja NRP1 /2 aloittaa niiden alavirran signalointia, mutta estää vuorovaikutuksen NRP1 /2 ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja sen jälkeen induktio pro-angiogeenisten transkription ohjelma. Kuitenkin, ei ole selvää, onko SEMA3s estää kasvaimen kasvua kilpailemalla VEGF neuropilins ligandia sitovat kohdat, ja toimia itsenäisesti VEGF, tai yhdistämällä nämä vaikutukset [10-13].

Aikaisemmat tutkimukset, myös meidän, ihmisen kromosomin 3 munuaisten, keuhko-, rinta- ja kohdunkaulan karsinoomien paljasti usein alleelinen tappiot (jopa 40%) on LUCA alue (3p21.3), joka satamat kaksi semaforiineilla-SEMA3B ja SEMA3F. Tämä alue (hg38 /CHR 3: 50.0-50.5Mb) koostuu 445 Kb sisältää noin 20 tuumorisuppressoreilla (APT) ja TSG-ehdokkaat:

RASSF1

,

NPRL2

,

TUSC2

,

CACNA2D2

ym. Yllättäen nämä geenit pelaa rooli solun prosesseja ja kohdistamalla tuumorisuppressiogeeneksi useiden eri tavoilla (solusyklin lohko, angiogeneesin inhibition, apoptoosin induktio jne.) Sijaitsevat kompakti alue [14-18].

Merkittävä osoitus tuumorisuppressorin toimintaan kuuluu tunnistaminen solun säätelyreittejä ja muiden mekanismien, jotka ovat alttiita SEMA3B. Käyttämällä MDA-MB435 (rintasyöpä) ja A549 (keuhko adenokarsinooma) soluissa se oli aiemmin osoittaneet, että SEMA3B tukahdutti kasvaimen kasvua vaan laukaisi pro-metastasoitunut ohjelma vapauttamalla interleukiini 8 [19, 20]. Lisäksi todettiin, että apoptoosin induktio SEMA3B kasvainsoluissa välitti inaktivoimalla Akt signalointireitin [21]. Sen vuoksi oli tärkeää edelleen valaista tiettyjä näkökohtia SEMA3B kasvaimen suppression.

Metylointi on tärkeä mekanismi

SEMA3B

geenin inaktivaatio [17, 22]. Kuitenkin suurin osa aikaisemmasta tutkimuksesta keskittyi metylaatio tutkimuksia introni CpG-saari, joka oli virheellisesti pidetään sijaitsee promoottorialueen.

Tavoitteena Tutkimuksemme oli valottaa erilliset roolit SEMA3B kasvainkudoksessa tukahduttaminen, erityisesti apoptoosin ja angiogeneesin. Lisäksi pyrittiin arvioimaan taajuuksille promoottori (hg38 /CHR 3: 50,267,308-50,267,797) ja introni (hg38 /CHR 3: 50,268,972-50,269,271) CpG-saari hypermetylaation korrelaatiot

SEMA3B

ilmaisun, ja syövän etenemisen keuhkojen ja munuaisten syövät.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

Genominen DNA eristettiin 14 syöpäsolulinjasta: 3 levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä (SCLC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC: NCI-H157, NCI-H647) ja 9 munuaissolukarsinooma syöpiä (RCC: A498, ACHN, Caki-1, Caki-2, HN-51, KH-39, KRC /Y, TK-10, TK-164). Solulinjaa U2020 on selostettu aikaisemmin [23]. ACC-LC5 solulinja, joka kuljettaa häviämä 3p21.3 [24] luovutti ystävällisesti Dr. Yusuke Nakamura (University of Tokyo, Tokio, Japani). Munuaisten A498, Caki1, ja Caki2 ja keuhkojen NCI-N417, NCI-H157, ja NCI-H647-solulinjoja ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Solulinjat KRC /Y, ACHN, TK-164, HN-51, TK-10, ja KH-39 saatiin Karolinska Institute (Tukholma, Ruotsi) solulinja collection [25]. Kaikki ihmisen solulinjoja kasvatettiin yksikerroksisina viljelminä, IMDM: ssä /RPMI tai DMEM (4,5 g /l glukoosia), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS).

kudosnäytteitä

Yhteensä , 70 pariksi kasvain /normaali näytteet NSCLC (29 ADC ja 41 SCC) ja 133 selkeä solu RCC (ccRCC) saatiin NN Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences (Moskova, Venäjä). Joukko 38 NSCLC (16 ADC ja 22 SCC) ja 83 ccRCC käytettiin metylaation tutkimuksissa ja ilmaisu tai kopiomäärä tutkimuksia semikvantitatiivinen RT-PCR. Ylimääräinen sarja 32 NSCLC (13 ADC ja 19 SCC) ja 50 ccRCC käytettiin validointi qPCR ilme tutkimuksissa. Näyte tiedot on esitetty taulukossa 1 ja S1 Taulukko. Näytteet kerättiin mukaisesti antamien suuntaviivojen eettisen komitean N.N. Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences (Moskova, Venäjä). Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus (saatavilla pyynnöstä). Eettinen komitea N.N. Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen. Tutkimus suoritettiin mukaisesti esitettyjä periaatteita Helsingin julistuksen mukaisesti. Kasvainkudoksissa ja pariksi morfologisesti normaalien kudosten saatiin potilailta, kun kirurginen resektio ennen säteilyä tai kemoterapiaa ja säilytettiin nestemäisessä typessä. Diagnoosi varmistettiin histopatologisesti, ja vain näytteitä 70-80% tai enemmän kasvainsoluja käytettiin tutkimuksessa. ”Normaali” valvonnan saatiin vähintään 2 cm: n päässä kasvain ja vahvistettiin histologisesti normaalit epiteelisoluja. Kasvaimen näytteet ominaista mukaan International System of Classification of Kasvaimet, perustuen kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) ja lavastus luokittelu unionin International Cancer ohjaus (UICC, versio 2002) [26] ja Maailman terveysjärjestö (WHO ) kriteerit luokittelu [27, 28]. Verinäytteitä 15 terveistä luovuttajista käytettiin myös tutkimuksessa.

SCID-hiirissä

Kaksitoista SCID-hiiriä käytettiin kokeissa. Hiiret saatiin Scanbur (Sollentuna, Ruotsi). Lopettaminen suoritettiin CO

2 tukehtumisen seuraa niskanmurrolla. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (NRC 2011), Euroopan suojelemista käytettävien selkärankaisten eläinten kokeellisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin, Euroopan neuvoston (ETS 123 ), ja suuntaviivat Pohjois Tukholman eettisen komitean hoito ja käyttö Laboratory Animals. Kokeet kanssa SCID hiiriin hyväksynyt Pohjois Tukholman eettisen lautakunnan.

transfektio ja valikoima on stabiilisti transfektoitu

SEMA3B

-U2020 solukloonien

koodaava cDNA

SEMA3B

geeni kloonattiin episomaalisessa tetrasykliinillä säädellyllä vektori Pete. Saatu plasmidi sekvensoitiin. Saadakseen vakaa solun klooneja, jotka ilmentävät

SEMA3B

, U2020 soluja (SCLC) transfektoitiin tyhjällä Pete tai Pete /

SEMA3B

-DNA (0,5 mg DNA kohti kuoppa) 12-kuoppalevyillä käyttäen Lipofectamine ja Plus Reagent (Invitrogen, CA, USA) valmistajan protokollan. Transfektoitiin lyhytaikaisesti Pete /

SEMA3B

-U2020 ja Pete-U2020-soluja viljeltiin 2-3 viikkoa in sisältävää IMDM-elatusainetta Bsd (5 ug /ml) ja valitse stabiileja klooneja. Ilmaisu on

SEMA3B

säädeltiin doksisykliini.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

transfektoitiin U2020 soluja (Pete ja Pete /

SEMA3B

) irrotettiin 24-48 h transfektion jälkeen ja maljattiin 100 mm

2 soluviljelymaljoille tiheydessä 500-1000 solua levyä kohti. Kun valinta on Bsd (5 ug /ml), Giemsa-värjättiin pesäkkeet valokuvattiin ja laskettiin käyttäen Määrä One -ohjelmiston (versio 4.4.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Elinvoimaisten solujen arvioitiin FACS-analyysillä propidiumjodilla (PI-FACS), seuraten valmistajan ohjeita (FACSCalibur, BD Bioscience).

kasvaimen kasvua SCID-hiirissä

tuumorigeenisyystesti Pete /

SEMA3B

-transfected U2020 ja tyhjät Pete-transfektoiduissa U2020-solut (kontrolli) määritettiin ihon alle ruiskuttamalla solut 6-8 viikon ikäisiä SCID-hiirten kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla nopeudella 800 rpm: ssa 2 min ajan ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan IMDM pitoisuutena 2-3 x 10

6 solua 100 ui injektiota. Solut upotettu Matrigel matriisiin (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) mukaan valmistajan protokollaa. Hiiriä tarkkailtiin kasvainten muodostumisen kahdesti viikossa ja tuumorin koko mitattiin mittaharpilla. Sitten käytimme monen geenin toiminnan lopettamisesta testi (MGIT) kolme geenien (

ZMYND10 /BLU

,

TUSC2 /FUS1

ja

SEMA3B

) SCID-hiirissä. MGIT perustuu seurantaan tuumorisuppressorigeenin ehdokas geenin toiminnan lopettamisesta soluissa ja kasvaimia. Se toteutettiin mukaisesti julkaistun menetelmän [29, 30]. Lyhyesti, U2020 solut transfektoitiin joko Pete /

SEMA3B

Pete /

ZMYND10

Pete /

TUSC2

tai tyhjä PETE plasmideja. Seokset solukloonien injektoidaan subkutaani- SCID-hiirissä. Tämän jälkeen, jos kasvain on muodostunut, ilmaus

SEMA3B

,

ZMYND10

ja

TUSC2

arvioidaan. Koputus-alas geenien ehdottaa niiden merkitystä tuumorisuppressiogeeneksi.

immunohistokemiallinen analyysi SCLC kasvainsolulinjan U2020 ja tuumoriangiogeneesissa SCID-hiirissä

Plasmidi Pete /

SEMA3B

tuotiin SCLC solulinjaan U2020, joka konstitutiivisesti tuotti tetrasykliiniä transaktivaattoria (tTA) [29]. Tuloksena sub-line ympättiin ihonalaisesti SCID hiiriin. Hiiret saivat juomavettä doksysykliinillä (+ DOX, geeni on OFF) tai ilman (-dox, geeni on päällä). Hiiret lopetettiin sen jälkeen, kun 1 kuukausi. Kasvaimet tai -alueita solun injektioita leikattiin ja upotettu parafiiniin. Leikkeet 5 mikrometriä paksu. Parafiini liuotettiin ksyleeniin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ja kudosleikkeet käsiteltiin peräkkäin 99, 95, 75 ja 30% etanolia. Epitooppeja otettiin talteen kuumentamalla mikroaaltouunissa 5 min sitraattipuskurissa. Anti-CD31 hiiren vasta-aineen, kanssa kanin anti-hiiri-FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Dako, Karlstrup, Tanska), käytettiin värjäämään mikrosuonten. TUNEL-määritys (in situ Cell Death Detection Kit, Boehringer Mannheim, Saksa) havaitsemiseksi apoptoosin suoritettiin valmistajan protokollan.

DNA ja kokonais-RNA: n eristämistä, käänteistranskriptio-PCR

Typpi-pakastetut kudokset hajotettiin käyttäen Mikro-Dismembrator (Sartorius, Saksa). DNA ihmisen kudoksista ja soluviljelmissä eristettiin uuttamalla fenolilla standardin protokollia. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy mini kit suositusten Qiagen (Alankomaat). Puhdistettu RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies Inc., DE, USA). RNA laatu arvioitiin käyttämällä 28S ja 18S rRNA-bändejä elektroforeesin jälkeen 1% denaturoivalla agaroosigeelillä ja analysoitiin käyttäen Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA). Puute DNA-kontaminaation tarkastettiin semikvantitatiivinen PCR alukkeilla tärkeimpien histocompatibility complex I-geenin (

MHCI

, suunniteltu käyttäen Vector NTI, katso S2 taulukko). Kaikki RNA-näytteet käsiteltiin RNaasi-vapaata DNaasia I (Fermentas, Liettua). RNA-näytteet, jotka sisältävät yli 0,1% DNA heitettiin pois. CDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä M-MuLV-käänteistranskriptaasia ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä, standardin mukaisesti valmistajan protokollan (Fermentas, Liettua).

bisulfiittimodifiointi sekvensointi promoottorin CpG-saari

SEMA3B

geenin

bisulfiittimodifiointi DNA konversio suoritettiin, kuten on kuvattu [31, 32], jossa käytetään 1-2 ug DNA: ta (keuhkojen ja munuaisten solulinjat ja kasvaimen /normaaleissa kudoksissa). Modifioitu DNA puhdistettiin käyttäen JETquick PCR Purification Spin Kit (Genomed, Ruotsi). Muunnettua DNA: ta pidettiin -20 ° C: ssa ja sitä käytettiin templaattina PCR-suunniteltu alukkeita (lueteltu S2 taulukossa), jonka tuote sekvensoitiin. Monistaminen

SEMA3B

promoottori CpG-saari-fragmentti tehtiin 50 ul: n reaktioseoksessa, joka sisältää PCR-puskuria (67 mM Tris-HCI, pH 8,8, 16,6 mM ammoniumsulfaattia, 0,01% Tween 20: tä); 2,0 mM MgCl

2; 0,25 mM kutakin dNTP: tä; 25 pM kutakin aluketta; 1 yksikkö Hot Start Taq DNA-polymeraasia (SibEnzyme, Venäjä); ja 5-20 ng modifioidun DNA: n DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, Yhdysvallat) käyttäen seuraavaa ohjelmaa: 95 ° C, 5 min; 35 sykliä 95 ° C, 15 s; 62 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s ja 72 ° C, 7 min. PCR: llä monistettu tuote puhdistettiin käyttäen 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja JETquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Ruotsi). Sekvensointia varten, 5-10 ng puhdistettua DNA-fragmenttia ja 25 pM yhden alukkeita. Sekvensointi suoritettiin käyttäen automaattista sekvensointia kone (Beckman-Coulter).

metylointi PCR (MSP) B

ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta, liuotettiin kahdesti tislattua vettä, oli myös käytetty mallin MSP. PCR-olosuhteet ja alukkeet metyloitu ja metyloimaton alleeli introni [17] ja promoottori (suunnitellut DNASTAR Lasergene 2000 -ohjelma) CpG-saarilla on esitetty S2 taulukossa. Mikäli promoottori CpG-saari, 6 CpG-dinukleotidien analysoitiin (2 eteenpäin aluketta ja 4 käänteinen), ja jos introni-3 (1 forward-aluketta ja 2 käännetyn). PCR suoritettiin DNA Engine Dyad Cycler vahvistin (Bio-Rad, Yhdysvallat) käyttämällä seuraavaa ohjelmaa: 95 ° C, 5 min; 35 sykliä 95 ° C, 10 s; T

Ann (ks S2 taulukko), 20 s; 72 ° C, 30 s ja 72 ° C, 3 min. Puuttuminen PCR tuotteen kääntymättömät DNA tarkistettiin kunkin parin alukkeita. DNA ihmisen fibroblastisolulinjassa L-68 toimi metyloimattoman alleeli valvonta; L-68 SSSI DNA L-68-fibroblasteja käsiteltiin SSSI metyylitransferaasin (SibEnzyme, Venäjä) toimi positiivisena kontrollina 100% metylaation.

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR

ohjata käänteistranskriptiolle, pohjamaalit transkriptio beeta2-mikroglobuliini (

B2M

) geeniä käytettiin [33]. Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin yhtä suuret määrät cDNA käyttämällä alukkeita ja olosuhteita luetellaan S2 taulukossa. Multiplex PCR alukkeilla, että

SEMA3B

[17] ja

B2M

geenit suoritettiin olosuhteissa optimoitu

SEMA3B

alukkeita, ja pitoisuus

B2M

alukkeet oli 1,5 kertaa pienempi. Tuotteet RT-PCR erotettiin 2% agaroosigeeleillä, ja juovakuvio analysoitiin käyttämällä GelImager ohjelmistoa (DNA Technology, Venäjä). Puolikvantitatiivista kopioluvun määritys markkereita LUCA alueella käytettiin, kuten on kuvattu muualla [14].

qPCR

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin alukkeilla ja TaqMan-koettimet on lueteltu S2 taulukossa käyttäen 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Kukin reaktio toistettiin kolme kertaa. Nukleotidisekvenssien amplikonien varmistettiin sekvensoimalla on 3730 DNA Analyzer automaattisen sekvensserin (Applied Biosystems, CA, USA). QPCR Aineisto analysoitiin viitteen geenejä

GAPDH

,

GUSB

ja

RPN1

[34] ja suhteellisen kvantifioinnin tai ΔΔCt-menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [35]. Vähintään 2-kertainen mRNA-tasolla muutoksia pitää merkittävinä, koska mRNA-tasolla vaihtelua viitteen geenien.

Tilastollinen

paramerinen Wilcoxonin testiä käytettiin vertaamaan mRNA: n ilmentymisen eroja kohde- ja viite geenien ccRCC ja NSCLC näytteitä. Kruskal-Wallis ja Mann-Whitneyn rank-sum testejä, Fisherin testiä ja χ

2 kriteereitä käytettiin analysointiin mRNA-tasolla ja metylaatiostatuksen muutokset ccRCC ja NSCLC erilaisten ryhmien patologinen ja histologinen ominaisuudet. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan saatuja ryhmille Toistojen. P-arvot ≤ 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin (

r

s

) käytettiin paljastamaan korrelaatioita.

Tulokset

In vitro

kasvun hidastuminen SCLC-solujen U2020 by

SEMA3B

pienisoluinen keuhkokarsinoomasolulinja U2020 transfektoitiin Pete

/SEMA3B

tai Pete kontrollina. Transfektoituja soluja viljeltiin 15 päivää. Kasvunopeus U2020 soluja, jotka ilmentävät

SEMA3B

oli alhaisempi kuin kontrolli (

P

0,01 koska päivä 5, katso kuva 1A). Pesäkkeiden muodostuminen määrityksessä osoitti, että pesäkkeiden määrä ja U2020, jotka sisältävät Pete /

SEMA3B

oli pienempi, kun uudelleen ilmentymisen doksisykliinin tukahdutetaan

SEMA3B

geenin verrattuna kontrollisoluihin (890 ± 60 vs. 190 ± 40,

P

0,01, kuvio 1 B). Perustuen PI-FACS-analyysiä, runsaasti apoptoottisten ja nekroottisten soluissa, jotka ilmentävät

SEMA3B

(ilman doksisykliini) lisääntyi merkitsevästi verrattuna

SEMA3B

off soluja (doksysykliinillä): (7 ± 2) × 10

2 (49 ± 5) x 10

2,

P

0,01, ks 1C. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että

SEMA3B

on estäjä ihmisen SCLC-solujen kasvun kautta induktion apoptoosin

in vitro

.

A-kasvunopeus U2020 solut: katkoviiva neliöillä-U7111 klooni Pete /

SEMA3B

, yhtenäinen viiva piireissä-U2020 solujen Pete (kontrolli); B-pesäkemuodostusta; C-PI-FACS-analyysi solujen kanssa ja ilman ilmentymistä

SEMA3B

. Keskiarvot ± keskihajonnat 4 rinnakkaisnäytettä ovat edustettuina kussakin tapauksessa.

Multi-geenin toiminnan lopettamisesta koe SCID-hiirissä

Olemme aiemmin raportoitu, että GIT tekniikka mahdollistaa tehokkaan ja ohjattu induktio eri geenien soluissa [29, 30]. Sillä MGIT kokeessa käytimme SCLC solulinjan U2020 varten ehtolauseke kolmen TSG-ehdokasta sijaitsee 3p21.3:

ZMYND10

(

BLU

),

TUSC2

(

FUS1

) ja

SEMA3B

. Seokset solukloonien, jotka kantavat eri geenejä istutettiin ihonalaisesti kuuden viikon ikäiset SCID hiiriin käyttäen Matrigel (tyvikalvon matriisin) implantaation tekniikkaa ilman doksisykliiniä (geenit olivat ON).

PCR-pohjainen vertailu SCID-hiirten kasvainten ja ensisijaisen solun klooneja osoittivat yksiselitteisesti, että

SEMA3B

selektiivisesti tippuu alas kaikissa kolmessa kasvaimissa kasvaneet

in vivo

(katso näytteet 8-10 kuvassa 2), kun taas ilmaus

ZMYND10

ja

TUSC2

geenit eivät muutu näissä olosuhteissa. Nämä kaksi geeniä todennäköisesti ei antagonisoivat kasvaimen kasvua U2020 solujen SCID-hiirissä (jätämme tämän kysymyksen avoimeksi, koska etsintää mutaation kautta säilytti geenejä ei sisälly MGIT). Nämä tiedot viittaavat siihen, että SEMA3B on kasvun inhibiittori ihmisen SCLC-solujen

in vivo

.

Elektroferogrammin multiplex PCR plasmideista, kloonit ja SCID-hiirissä kasvaimia kolme geeniä. M-merkki, 1-PCR plasmidista Pete /

SEMA3B

, 2-PCR plasmidista Pete /

TUSC2

, 3-PCR plasmidista Pete /

ZMYND10

, 4 -PCR päässä U7111 /

SEMA3B

solun klooni 1, 5-PCR U7111 /

TUSC2

solun klooni 3, 6-PCR U7111 /

ZMYND10

solun klooni 4, 7-sekoitettu solukloonien, 8-PCR kasvain 1, 9-PCR kasvain 2, 10-PCR-kasvain 3, 11-negatiivinen kontrolli.

vaikutus

SEMA3B

siirtogeenien kasvaimen kasvua SCID-hiirissä ja angiogeneesissä

U2020 Saharan linjassa ehdollista

SEMA3B

ilmentymistä doksisykliini valvonnan ympättiin SCID-hiirissä ihon alle. Neljä hiirtä sai doksisykliini juomavedessä (+ DOX hiiret, ohjaus) ja viisi ei annettu doksisykliiniä (-dox hiiret). Puhkeamista kiinteiden kasvainten aktiivisesti ilmentävien

SEMA3B

ei havaittu 4 out of 5 tapauksessa (kuvio 3, punainen viiva). Viidennessä-DOX hiiren aktiivinen kasvaimen kasvua (kuvio 3, keltainen viiva) alkoi viikkoa myöhemmin kontrolliin verrattuna (kuvio 3, sininen viiva), siitä huolimatta, että läsnä on

SEMA3B

konstruktissa. Kuitenkin ilmaus

SEMA3B

geeni ei havaittu tämän kasvaimen mukaan Northern blot-analyysi (tietoja ei esitetä), mikä viittaa menetys

SEMA3B

näissä soluissa. Kasvaimet (havaittu

SEMA3B

-OFF hiiret) oli alueilla aktiivista solujen proliferaation, toisin kudoksiin otettu auttaakseen solujen injektiota (

SEMA3B

-ON hiiret), jossa runsas kuitu- ja huonosti eriytetty solujen strooman ja nekroottista alueilla havaittiin. Nämä tiedot osoittavat mahdollisuutta

SEMA3B

tuumorisuppressiogeeneksi aktiivisuutta SCID-hiirissä.

kasvuvauhti U2020 soluja (U7111 klooni) SCID-hiirissä: sininen viiva-U2020 soluja ilman

SEMA3B

lauseke (+ doksisykliini, 4 hiirtä), punainen ja keltainen viiva-U2020 solujen

SEMA3B

lauseke (- doksisykliini, 4 hiiret ja 1 hiiri vastaavasti). * -Ei Ilmentyminen

SEMA3B

mukaisen geenin Northern blot (tuloksia ei ole esitetty). Yksi + DOX ja yksi-DOX hiiret poistettiin tutkimuksesta sen jälkeen, kun yksi kuukausi.

kudokset kahdessa kohtaa U2020 solujen ymppäyksen analysoitiin CD31-värjäys ja TUNEL-määritystä: yksi SEMA3B-negatiivinen (Kuva 4A ja 4B) ja yksi SEMA3B-positiivisia (kuvio 4C ja 4D) hiiri. Anti-CD31 hiiren vasta-aineita käytettiin värjäämään veren pienten verisuonten. Hyvin harvat useita mikroverisuonten havaittiin SEMA3B-positiivisten kudosten. Fragmentti, joka sisältää yhden pienten suonten-esineet on esitetty kuviossa 4C. Pienten suonten signaali (vihreä kanava) on yhteistyössä paikallistaa signaalin punasolujen (punainen kanava) tuloksena on keltaisia ​​alueita kuvassa 4A. Kuitenkin SEMA3B-negatiivinen kiinteä kasvain osoitti runsaasti pitkänomainen, pakattu veri kanaviin, joiden fluoresenssi tyypillistä epiteelin. Näiden kasvainten kanavat myös yhteistyössä paikallistaa punasolujen (kuvio 4A). Tämä voisi tukea rooli SEMA3B kuten angiogeneesin estäjä. Kuitenkin lisäkokeita laajennettuun näytteenottoa tarvitaan osoittamaan tämän ehdotuksen.

(A, B) –

SEMA3B

on OFF (hiiri sai doksisykliini juomavedessä). (C, D) –

SEMA3B

on päällä (hiiri ei annettu doksisykliini). (A, C) -staining anti-CD31 seurata verisuonten (vihreä signaali). Kun

SEMA3B

on OFF, alueet täynnä punasolujen (punainen merkkivalo) nähdään. Keltainen ilmaisee, kolokalisaation vihreä ja punainen signaalit. Sininen signaali vastaa DNA. (B, D) -TUNEL määrityksessä. Huomaa, jossa apoptoottiset solut (vihreä signaali), jossa

SEMA3B

-geeni ilmentyy.

arveltu, että SEMA3B-positiivisten solujen alueilla ilman verisuonia ja erytrosyytit käynnissä solukuolemaa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, osat kuin saman kudoksen fragmentit analysoitiin TUNEL-määritys, tekniikka mahdollistaa havaitsemisen apoptoottisten solujen. (Kuvio 4B, 4D). Valtava alue apoptoottisten solujen havaittiin SEMA3B-positiivisten kudosnäyte taas mitään apoptoottisen alue nähtiin SEMA3B-syöpäkasvain. Tässä tapauksessa on oletettu, että ilmaus

SEMA3B

tukahdutti kasvaimen kasvun

in vivo

, todennäköisimmin apoptoosin. Angiogeneesin estäminen voitaisiin ehdottaa myös.

metylointi promoottorin ja introni

SEMA3B

CpG-saaria keuhkojen ja munuaisten solulinjoja ja primaarisia kasvaimia bisulfiitti sekvensointi ja metylaatiospesifistä PCR

SEMA3B

geeni koostuu 18 eksonista ja sisältää kaksi CpG-saarta: yksi sijaitsee promoottorialue (1-st CpG-saari, hg38 /CHR 3: 50,267,308-50,267,797, 22 CpG- dinukleotidit) ja toinen ensimmäisen intronin (2-nd CpG-saari, hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271, 12 CpG-dinukleotidit). Analysoimme metylaatio profiilia 16 CpG-dinukleotidien promoottorin CpG-saari 5 keuhkosyövän solulinjoja (3 SCLC ja 2 NSCLC) ja 12 NSCLC primaarikasvainten käyttäen bisulfiitin sekvensointia (5 ADC ja 7 SCC, katso kuva 5A). Tiheä metylaatio ( 40% analysoiduista CpG: t olivat metyloituja) promoottorin CpG-saari

SEMA3B

geeni havaittiin 2 3 SCLC solulinjojen, mutta yksikään NSCLC solulinjojen (NCI -H157 ja NCI-H647). Kuitenkin kaikissa 7 SCC primaarikasvaimille ja 2 5 ADC ensisijainen kasvaimia, metylaatio havaittiin 2-12 ja CpG: t. Lisäksi tutkimme metylaation profiilin 9 munuais- syövän solulinjoissa ja 25 ccRCC ensisijainen kasvaimia (kuvio 5B). Tiheä metylaatio promoottori CpG-saari havaittiin 8 9 solulinjojen ja 11 25 ccRCC primaarikasvaimia. Niistä Hyväksytty histologinen normaaleissa kudoksissa, metyloituja CpG: t havaittiin vasta 2 25 ccRCC tapauksissa ja mikään 12 NSCLC tapauksissa (kuvio 5A ja 5B).

bisulfiittimodifiointi sekvenointitulosten, 16 CpG-dinukleotidien (2-17) CpG-saari annetaan. Harmaat ruudut osoittavat metyloitu CpG-dinukleotideille valkoiset neliöt-metyloimaton. Numbers primaarikasvainten määrät vastaavat S1 taulukossa. Rohkea numerot CpG-dinukleotidien (3-4 ja 9-12) osoittavat sijainnin alukkeita, joita käytettiin MSP menetelmällä.

Seuraavaksi arvioimme metylaatio taajuudet sekä CpG-saarilla on

SEMA3B

geenin MSP menetelmällä käyttäen edustava joukko ensisijaisen kasvaimia. Metylointi taajuus promoottori CpG-saari oli 44% (7/16) ADC, 45% (10/22) SCC ja 52% (43/83) in ccRCC. Introniset CpG-saari metyloitiin hieman vähemmän kuin promoottori saaren molemmissa histologisia tyyppejä NSCLC (ADC -38%, 6/16, SCC -32%, 7/22) ja ccRCC (39%, 32/83; taulukko 2). Metylointi taajuudet Molempien saarten olivat merkittävästi korkeammat kasvaimen kudoksissa kuin pariksi histologisesti normaaleissa kudoksissa (

P

≤ 0,04, katso taulukko 2). Siten metylaatio sekä CpG-saarilla

SEMA3B

geeni on tunnusomaista keuhkojen ja munuaisten syöpä. Kuten odotettua, metylointi ei ole 1-st eikä 2-nd

SEMA3B

CpG-saari havaittiin tahansa DNA-näytteet eristetään veren lymfosyyteistä terveiden luovuttajien (n = 15). MSP tiedot olivat yhtä mieltä bisulfiitti sekvensoinnin tulokset kullekin syövän tutkittu.

käyttö on edustava joukko primaarikasvainten pystyimme paljastaa mahdollisia korrelaatioita metylaatio taajuuden promoottorin ja Introniset CpG-saarten kanssa patologinen ja histologinen parametrit kasvaimia. Advanced ccRCC ja NSCLC kasvaimia oli suurempi taajuus CpG-saaren metylaatio verrattuna alkuvaiheessa (taulukot 2 ja 3). Vahvin korrelaatio osoitettiin SCC (Spearmanin rho korrelaatiokertoimet olivat yhtä 0,37,

P

= 0,09, ja 0,60,

P

0,01, että 1-st sekä 2- nd CpG-saari, vastaavasti). Positiivinen korrelaatiota ei havaittu kasvaimen ja taajuus CpG-saaren metylaatio varten NSCLC ja ccRCC (taulukko 3). Tämä korrelaatio oli vahvempi kuin välinen korrelaatio kasvaimen vaiheen ja taajuuden CpG-saaren metylaatio molemmille histologista tyyppiä NSCLC ja lähes samat varten ccRCC (taulukko 3).