Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sisplatiini on voimakas syöpälääkettä, mutta sen kliininen käyttö on rajattu koska sen ei-toivottuja kemialliset ominaisuudet ja vakavia sivuvaikutuksia. Parempi lääkeformulaatiot Sisplatiiniannos ovat erittäin haluttu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä olemme kehittäneet nanopartikkelimuotoa Sisplatiiniannos korkea kapselointi tehokkuutta ja vähentynyt toksisuus käyttämällä sisplatiini-silloitettu karboksimetyyliselluloosa ( CMC) ydin nanohiukkaset on valmistettu poly (laktidi-ko-glykolidi) -monomethoxy-poly (polyetyleeniglykoli) kopolymeerit (PLGA-mPEG). Nanohiukkasten keskimääräinen halkaisija on noin 80 nm mitattuna transmissioelektronimikroskoopilla (TEM). Kapselointi tehokkuutta sisplatiinin nanohiukkasten on jopa 72%. Samalla olemme myös havainneet kontrolloitu vapautuminen sisplatiinin kestävällä tavalla ja annoksesta riippuvainen hoidon tehokkuuden sisplatiinin ladattu nanohiukkasten vastaan ​​IGROV1-CP-soluja. Lisäksi mediaani tappava annos (LD

50) sisplatiinin ladattu nanopartikkelit oli yli 100 mg /kg laskimoon, joka oli paljon korkeampi kuin vapaan sisplatiinin.

Johtopäätös

Tämä kehittynyt sisplatiini-ladattu nanohiukkasten on lupaava muotoilu toimittamisesta sisplatiinin, joka on tehokas terapeuttinen hoito munasarjasyöpä ilman vakavia sivuvaikutuksia ja kumulatiivinen myrkyllisyys.

Citation: Cheng L, Jin C , Lv W, Ding Q, Han X (2011) kehittäminen erittäin stabiili PLGA mPEG Nanoparticle Loaded sisplatiinin kanssa Kemoterapia munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (9): e25433. doi: 10,1371 /journal.pone.0025433

Editor: Martin W. Brechbiel, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 05 syyskuu 2011; Julkaistu: 26 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa tukea China International tiede- ja teknologiayhteistyön Foundation (2007DFC30306, https://www.cistc.gov.cn/), ja Zhejiang teknologiahanketta Foundation (2009C11122, https://www.zjkjt.gov.cn/html /index.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cisplatin-pohjainen hoito-on vakiintunut standardi ensilinjan kemoterapiaa munasarjasyöpäpotilaalle lähtien 1980-luvun puolivälistä [1] – [3]. Sen soveltaminen on rajoitettu, koska vakavia sivuvaikutuksia ja kumulatiivinen myrkyllisyys merkittävistä elinten, kuten maksan, munuaisen, sydämen ja hermoston laskimoon [4] – [7]. Viime vuosina lukuisia nano-kokoinen lääkeaineen kantajina on kehitetty minimoimaan sivuvaikutuksia sisplatiinin ja parantaa sen tuumorin vastaista tehokkuutta läpi muodot misellejä, kuten poly (asparagiinihappo) -poly (etyleeniglykoli) misellit, liposomit, kuten pegyloidun liposomeihin ja kiinteä lipidinanohiukkasia syöpähoidon aikana [8] – [13]. Liukoinen lääkeaine-polymeeri-konjugaatteja on myös kehitetty lisäämään sisplatiinin liukoisuutta. Tällaisia ​​konjugaatteja sisältävät sisplatiinia komplekseja polykarboksylaatit, poly (amidoamiinit), polyamidoamiini dendrimeerit ja polyakryylihapon ketjuja. Nämä järjestelmät voivat vähentää toksisuutta ja saavuttaa erinomainen tehokkuus kemoterapian [14] – [16].

Poly (maito-ko-glykolihappo) (PLGA), mikropartikkelit on myös käytetty sisplatiinin loukkuun johtuen sen biologisesti ja biohajoavia ominaisuuksia [17], [18]. Avgoustakis K et ai. ovat osoittaneet, että laskimoon annetun PLGA mPEG nanohiukkasten ladattu sisplatiinin johtaa merkittävään pitenemiseen sisplatiinin läsnäolo veressä hiirillä [19]. Kuitenkin kapselointi tehokkuus Sisplatiinin on edelleen heikko valmistuksen aikana PLGA mPEG nanohiukkasten ladattu sisplatiinia. Gryparis EY et ai. [20] ovat havainneet, että nanohiukkasten sovellus on mahdollisuus ylläpitää riittävää tai useammalla pitoisuudella sisplatiinia 2 viikkoa, mutta suhteellisen vähän PEG pitoisuus PLGA-mPEG voi aiheuttaa kasvu nanohiukkasten koon. Lisäksi on toivottavaa kestävää vapautumista ja riittävä pitoisuus sisplatiinin kliinisissä yhteyksissä, koska jatkuva matala-annoksen sisplatiinia on tehokkaampaa apoptoosin kuin yhden suuren annoksen altistuminen Sisplatiinin [21], [22].

päätavoite nykyisen työ on kehittää innovatiivinen nanohiukkasten suurella kapselointi tehokkuutta ja kestävää vapautumista sisplatiinia. Tässä nanohiukkasten jakelujärjestelmä, d-alfa tokoferyylipolyetyleeniglykoli 1000-sukkinaatti (TPGS) uutena tehokas emulgointiaine hyödyllinen ihmisten terveydelle on käytetty ja biohajoavan PLGA-mPEG nanopartikkelien CMC ytimiä on kehitetty. Samaan aikaan, lastaus- ja kapseloinnin tehokkuus Sisplatiinin on myös määritetty. Lisäksi tuumorin vastaista tehokkuutta nanohiukkasten ladattu sisplatiinin hiiren munasarjasyövän mallissa on arvioitu. Lopuksi parantunut sisplatiinin jakelujärjestelmä tarjoaa järkevä suunnittelu potentiaalisen terapeuttisen soveltamisen sisplatiinin munasarjasyöpä.

Tulokset

Rational suunnittelu CMC ja TPGS valmistelemaan PLGA mPEG nanohiukkasten sisplatiinin

Se on haaste valmistaa nanopartikkelien ladattu sisplatiinin käyttämällä PLGA-mPEG kopolymeerit johtuen niiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien ja valmistelu olosuhteissa. Tässä tutkimuksessa, teimme järkevä suunnittelu nanohiukkasten sisältävien sisplatiinia räätälöimällä koostumuksia, koko ja muoto. Ensinnäkin PLGA-mPEG kopolymeerejä syntetisoitiin laktidi ja glykolidin läsnäollessa mPEG

5000, jonka hydroksyyliryhmä voi aloittaa Renkaanavautumisreaktion laktidin ja glykolidin. Rakenne syntetisoitu kopolymeerin havaittiin

1H-NMR CDCI

3, kuten on esitetty kuviossa 1. piikit 1,65 ja 5,10 ppm kuului protoneja metiini (CH) ja metyyli (-CH

3) ryhmien PLGA segmenttejä, kun taas huiput methene protonien (-CH

2) PEG segmenttien sijainti on 3,65 ppm, ja huiput methene protonien (-COCH

2O-), joka sijaitsee 4,78 ppm olivat edustettuina konjugoitujen segmenttien PLGA ja mPEG niin, ettei muita piikkejä ei havaittu. Vain yksi piikki GPC-spektri (kuvio 2) osoitti onnistuneen synteesin PLGA-mPEG-kopolymeerit, joilla on suuri puhtaus. Polydispersiteetti-indeksi (PI) kuin mittaus tuman leveys molekyylipainojen oli 1,78. Pohjalta geelipermeaatiokromatografialla (GPC) ja suhde

1 H piikkien pinta-alojen välillä 5,10 ja 3,65 ppm, keskimääräinen molekyylipaino syntetisoitiin kopolymeerien laskettiin olevan 37062, kuten on esitetty kuviossa 2. painoprosentti mPEG oli 13,5%.

piikit 1,65 ja 5,10 ppm kuului protoneja metiini (CH) ja metyyli (-CH

3) ryhmää PLGA segmenttien huippujen methene protonien (-CH

2) PEG segmenteillä sijaitsee 3,65 ppm ja piikit methene protonien (-COCH

2O-), joka sijaitsee 4,78 ppm edusti konjugoidut segmenttejä PLGA ja mPEG.

huippu edusti keskimääräinen molekyylipaino syntetisoitiin kopolymeerien laskettiin olevan 37062.

Toiseksi, modifioitu haihduttamalla liuotin perustuva menetelmä veden ja orgaanisen faasi-vesi (W /O /W) useita emulsioita myös suhteellisen yksinkertainen valmisteluprosessin käytettiin parantamaan kapselointi tehokkuutta sisplatiinin nanohiukkasia. Havaitut ominaisuudet nanohiukkasten voi vaihdella laajalti riippuen CMC pitoisuus, TPGS keskittyminen ja muuttuva prosessit mukaan lukien kytkimen liuottimen lisäys järjestyksessä. Jotta saavutettaisiin optimaalinen CMC pitoisuus korkea kapselointitehokkuus, eri lisäys määriä CMC sisäiseen vesifaasiin kaksinkertaisen -emulsiojärjestelmän tutkittiin. Efektiivinen kapselointi sisplatiinin nanohiukkasten oli suurempi kuin mikään määrä CMC, joka paljasti lastaus- ja kapselointi tehokkuutta sisplatiinin oli 3,88 ja 70,9% (p /p), tässä järjestyksessä, kuten on esitetty taulukossa 1. Täysin 1,7 mg CMC yhdistettynä 4 mg sisplatiinia valittiin optimaalinen sisäinen vesifaasi ja optimaalinen pitoisuus TPGS seulottiin olevan 0,035% (w /v).

kuten on esitetty taulukossa 2, keskimääräinen koko valmis nanohiukkasten ladattu sisplatiinin vaihteli 180-210 nm, ja lastausmääriä sisplatiinin oli 3,5-4,2% (w /w). PI määritettiin olevan noin 0,3, mikä osoitti homogeenisen jakelun halkaisija. CMC ja PLGA-mPEG polymeerien siirrettävä negatiivinen ζ-potentiaalin, joiden keskimääräinen arvo on -10,1 ja -9,5 mV tyhjä nanohiukkasten ja sisplatiini-ladattu nanopartikkelit, vastaavasti. Ei havaittu merkitsevää eroa kooltaan ja ζ-potentiaalin nanohiukkasten kanssa tai ilman sisplatiinia. Kuvio 3 osoitti edustavat kuvat ulkoinen rakenne nanohiukkasten tutkittiin TEM. Useimmat nanopartikkelit olivat pallomainen muoto halkaisijaltaan pienemmät kuin halkaisijat määritettiin dynaamisella valon sironta. Morfologia nanohiukkasten tai ilman sisplatiinia paljasti erottamattomat tai vastaavia rakenteita.

(A) tyhjä nanopartikkelit (B) sisplatiini-ladattu nanopartikkelit. Näytteet värjättiin 1% fosfovolframihappoa (50000 x).

Lisäksi kumulatiivinen vapautumisprofiili sisplatiinin nanopartikkeleista mitattiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC), kuten kuviossa 4. Tämä määritysmenetelmä oli tarpeeksi herkkä mittaamaan sisplatiiniin laajalla pitoisuusalueella kanssa havaitsemisraja 0,31 ng /ml. Kalibrointikäyrä perustettiin kussakin kokeessa. Vapauttamista kinetiikka sisplatiinin nanopartikkeleista paljasti jatkuvasti, kontrolloidusti vapautuvia nopeudella ajan funktiona. Kuitenkin sen vakaa julkaisu voi vaikuttaa CMC-sisplatiini konjugaation ja biohajoavat PLGA-mPEG kopolymeerit. Samoin, kuten on esitetty kuviossa 4, loukkuun sisplatiinin nanohiukkasten voisi merkittävästi hidastaa vapautumisnopeutta sisplatiinin ja näin ollen johtaa suhteellisen tasaisen vapautumisen ajan.

sisplatiini vapautuu nanohiukkasten funktiona inkuboinnin ajan 100 mmol /l natriumkloridiliuokseen 37 ° C: ssa.

Välitön myrkyllisyys CMC ydin nanohiukkasten

jotta voitaisiin arvioida sytotoksisuutta nanohiukkasten lastaamatta lääkkeitä, sytotoksisuuden nanohiukkasten annoksilla 0,005, 0,02, 0,04 ja 0,08 mg /ml testattiin käyttämällä 96-kuoppaista mikrolevyt istuttaa soluilla tiheydellä 3000 solua /kuoppa. Solun kasvukäyrät ohjaus- ja nanohiukkasten hoidetuissa ryhmissä olivat samanlaiset, mikä viittaa siihen, että nanohiukkasten testatuilla pitoisuuksilla ei ilmennyt selvää toksisuutta soluissa, kuten on esitetty kuviossa 5 (A). Lisäksi, enimmäismäärä nanohiukkasten (0,08 mg /ml), ja tiheys on 3000 solua /kuoppa olivat myös optimaaliset olosuhteet arvioidaan vaikutusta sisplatiinin ladattu nanohiukkasten solun kasvuun

in vitro

.

(A) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus IGROV1-CP-soluja altistetaan tyhjä nanohiukkasten 72 tuntia eri annoksilla. (B) Solujen kasvun estäminen altistumisen jälkeen vapaan sisplatiinin (harmaa histogrammi) ja sisplatiini-ladattu nanopartikkelit (musta histogrammi) 72 tunnin ajan. Tiedot edustettuina keskiarvona ± SD.

syövän vastaista aktiivisuutta vapaan sisplatiinin ja sisplatiini-ladattu nanohiukkasten IGROV1-CP-solujen

in vitro

määritettiin. Kuten kuviossa 5 (B), ei ole merkittävää eroa sytotoksisuuden välillä sisplatiinin ladattu nanopartikkelit ja vapaa sisplatiini testatuilla pitoisuuksilla havaittiin (

p

0,05). Sytotoksisuus sekä vapaan sisplatiinin ja sisplatiini-ladattu nanopartikkelit oli annoksesta riippuvaa. Siksi PLGA-mPEG nanohiukkaset voivat edistää kontrolloidun vapautumisen nopeudella sisplatiinin säilyttäen samalla syövän vastaisen tehokkuuden sisplatiinin.

Jotta voidaan arvioida mahdollisten myrkyllisyys riskejä, ICR injektoitiin suonensisäisesti sisplatiinin ladattu nanopartikkelit eri annoksilla ja muutos eloonjäämisaste hiirten tutkittiin. Kaikilla testatuilla annostasoilla, kuolleisuudessa ryhmien välillä paljasti merkittävän eron aikana 2 viikon odotusaika (

p

0,05). Kuolleisuus Sisplatiinin ladattu nanopartikkelit annoksella 100 mg /kg (perusteella sisplatiinin) oli 40,0%, mutta kuolleisuus on 10 mg /kg sisplatiinia hoitoryhmässä saavutettiin jopa 62,5%. Ei terveyden heikkeneminen ei havaittu hiirissä, joita hoidettiin tyhjä nanohiukkasten havaintojakson aikana, ja yleinen hiirten käyttäytymiseen sisplatiinia-ladattu nanopartikkelit tai tyhjä nanopartikkelit eivät osoittaneet selvää eroa. LD

50 oli 8,6 mg /kg ilmaiseksi sisplatiinin ja 103,4 mg /kg sisplatiinia ladattu nanopartikkelit, kuten on esitetty taulukossa 3. Siten verrattuna vapaa sisplatiiniin, nanohiukkasten ladattu sisplatiinin voi tarjota lisää turvallisuutta kliinisen käytön .

turvallisuusprofiili CMC ytimen nanohiukkasten IGROV1-CP ksenosiirrettyjä nude-hiiriin

jotta tarkkailla myöhässä elintoksisuus annetun hiirillä tietyn hoitojakson aikana tärkeimpien elinten kuten sydämen , maksa, keuhkot, munuaiset ja perna BALB /c-nude-hiirten annettiin vapaa sisplatiinin ja sisplatiini-ladattu nanopartikkelit leikeltiin ja värjättiin HE. Ei selvää histopatologisia muutoksia havaittiin sydän-, keuhko- ja perna sisplatiinin ladattu nanopartikkelit hoidetuissa hiirissä, kuten on esitetty kuviossa 6. Kuitenkin maksanekroosiin patologinen surkastuminen munuaisen hoidetuilla hiirillä vapaan sisplatiinilla havaittiin. Samoin sisplatiinin antamisen ladattu nanopartikkelit ovat enintään 3 mg /kg 5 peräkkäisenä annokset eivät aiheuttaneet merkittävää patologinen ero maksassa ja munuaisissa.

Nude kateenkorvattomia hiirillä IGROV1-CP -ksenografteja käsiteltiin suolaliuoksella ( ohjaus), tyhjä nanohiukkasten (tyhjä NP), sisplatiinin ja sisplatiinin ladattu nanopartikkelit (NP-cp) viisi annosta 4 päivän välein. Elimet, kuten sydän, keuhkot, perna, maksa ja munuaiset hoidetuilla hiirillä suolaliuosta on esitetty ensimmäisellä rivillä. Elimet käsitellyillä hiirillä on tyhjä nanohiukkasten on esitetty toisella rivillä. Elimet hiiriltä käsitelty vapaa sisplatiinin näytettiin kolmannen rivin. Elimet hiiriltä sisplatiinia ladattu nanohiukkasten esitetään neljännellä rivillä.

Jotta voitaisiin arvioida vaikutusta sisplatiinin ladattu nanohiukkasten apoptoosin, kasvainkudossektioista värjättiin TUNEL arvioimiseksi DNA: n fragmentoituminen. Leimaus apoptoottisten tumien (noin 200 solua laskettiin) tehtiin dioja kyytiin satunnaisesti kaksi riippumatonta kokeiluissa. Klusterin apoptoottisten kappaleiden annettiin yhtenä count, ja apoptoottisten laskee eri hoitoryhmissä oli kuviossa 7 (A). Ksenografteissa sisplatiinia ladattu nanopartikkelit paljasti suurempia apoptoottisten tasolla kuin kontrollit (suolaliuos ja tyhjä nanohiukkasia,

p

0,05). Vaikka kokonaismäärät apoptoottisten solujen kasvaimia sisplatiinia ladattu nanopartikkelit olivat hieman korkeammat kuin kasvaimia hoidetaan perinteisellä sisplatiinin, ei merkittävää eroa kokonaismäärät apoptoottisten solujen molemmissa hoitoryhmissä havaittiin, kuten on esitetty kuviossa 7 (B) (

p

0,05).

(A) mikroskooppinen arviointi kasvaimen apoptoosin TUNEL värjäys. Kateenkorvattomiin hiirillä IGROV1-CP -ksenografteja käsiteltiin suolaliuoksella (kontrolli), tyhjä nanohiukkasten (tyhjä NP), sisplatiinin ja sisplatiinin ladattu nanopartikkelit (NP-cp) viisi annosta. (B) keskimääräinen apoptoottinen solumäärät laskettiin perusteella TUNEL värjäystä. Kateenkorvattomiin hiirillä IGROV1-CP -ksenografteja kuvatulla tavalla käyttämällä (A).

Hoito teho

in vivo

tutkimuksissa

hoito sisplatiinin tehoa ladattu nanopartikkelit ja IGROV1-CP solun ksenograftin BALB /c-nude-hiirissä arvioitiin. Sen jälkeen, kun keskimääräinen kasvainten tilavuus oli jopa 100-130 mm

3, joilla oli kasvain, hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 8), jossa minimaalinen ero painon ja koon kasvainten ryhmien välillä. Lisäksi hiiriä käsiteltiin seuraavien hoito, mukaan lukien suolaliuos, nanopartikkelit ilman sisplatiinia, vapaa sisplatiini, ja sisplatiini-ladattu nanohiukkasten joka neljäs päivä. Sisplatiinin annosta-hoitoja oli 3 mg /kg kehon paino.

Tuumorin koko, paino ja eloonjäämisaste jälkeen hiiriä tarkkailtiin 21 päivää sen jälkeen, kun hoidon alussa. Keskimääräinen kasvaimen tilavuus lopussa hoitojakson oli 209 ± 25 mm

3 suolaliuoksella käsitellyssä ryhmässä, ja 213 ± 19 mm

3 tyhjä nanohiukkasten hoidetussa ryhmässä, kuten kuviossa 8 (A) . Kuitenkin sisplatiini-hoidetussa ryhmässä, lopullinen keskimääräinen kasvaimen tilavuus oli 166 ± 16 mm

3, mikä oli huomattavasti pienempi kuin vuonna suolaliuoskäsiteltyihin ryhmien ANOVA 95%: n luottamusväli. Verrattuna sisplatiinin saaneiden ryhmässä, lievää laskua kasvaimen tilavuuden sisplatiini- ladattu nanopartikkelit käsitellyn ryhmän keskimääräinen kasvaimen koon 146 ± 19 mm

3 lopussa hoitojakson aikana. Yksi mahdollinen syy oli se, että myöhempi solunsisäistä toimittamiseen sisplatiinin estyä mPEG muuttaminen nanohiukkaset, jotka eivät osoittaneet merkittävästi kasvaimen vähentämiseen. Lopussa hoitojakson (päivää 21), eloonjäämislukuja hiiristä sisplatiinin ladattu nanopartikkelit hoidetussa ryhmässä, sisplatiini-käsitellyssä ryhmässä, tyhjä nanohiukkasten käsitellyn ryhmän ja suolaliuoksella hoidetussa ryhmässä olivat 87,5, 62,5, 75 ja 75 %, vastaavasti, kuten on esitetty kuviossa 8 (B). Ero eloonjäämisen alk neljään ryhmään ehdotti, että sisplatiini ladattu nanopartikkelit olivat paljon turvallisempia kuin vapaa sisplatiinia. Ruumiinpainot hiirillä osoittivat asteittainen väheneminen alkaen toisen annoksen vaikka mitään merkittävää eroa neljään ryhmään havaittiin, kuten on esitetty kuviossa 8 (C).

(A) vaikutus vapaan sisplatiinin (3 mg /kg) ja sisplatiinia-ladattu nanopartikkelit (NP-cp, 3 mg /kg perusteella sisplatiinin) kasvaimen kasvuun kateenkorvattomissa hiirillä kanssa IGROV1-CP solun ksenografteissa. Hiiret annettiin valmiit muotoiluja 4 päivän välein koko hoitojakson ajan 21 päivää. Suolaliuosta käytettiin kontrolliryhmän, ja vaikutus tyhjä nanohiukkasten (tyhjä NP) on vahvistanut myös. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD (n = 8 alussa kokeen). (B) Survival nopeus kasvainta kantavien kateenkorvattomissa hiirissä sisplatiinia (3 mg /kg), NP-cp (3 mg /kg perusteella sisplatiinin), tyhjä NP: itä ja suolaliuoksella (kontrolli). (C) Kehon painon muutos, kun hoidon keston IGROV1-CP tuumoreita kantavaa hiirtä. Bars merkitty standardipoikkeamat.

Keskustelu

fysikaaliskemialliset ominaisuudet sisplatiinin, kuten huono vesiliukoisuus (1 mg /ml), suuri sitoutumisaffiniteetti plasman proteiineihin ja hajoavuus, voi rajoittaa terapeuttinen teho sisplatiinin. Sisplatiini-pohjainen esteitä sen kliinisten sovellusten voidaan ratkaista käyttämällä biologisesti polymeerisiä nanohiukkasten. Tällä hetkellä joidenkin nanohiukkasten valmistettu poly (laktidi) -monomethoxy-poly (etyleeniglykoli) (PLA-mPEG) ja PLGA-mPEG kopolymeerit ovat saaneet yhä enemmän huomiota. Perusteet Tämän tutkimuksen tarkoituksena on lisätä kuormaus- ja kapseloinnin tehokkuus Sisplatiinin mukaan nanopartikkelit, mikä parantaa vakautta sisplatiinia. TPGS voi myös tarjota turvallinen vaihtoehto polyvinyylialkoholia (PVA) tai muita lisäaineita parantamiseksi valmistamiseksi yhtenäisen nanohiukkasten erästä toiseen.

käyttämällä muunnettua W /O /W kahden emulsion kehittämä menetelmä Gryparis EY et ai . [20], olemme kehittäneet uuden käsitteen ”core-CMC-sisplatiini-silloitus”, joka voi parantaa huomattavasti lastaus tehokkuutta sisplatiinia. Silloitusreaktion aikana CMC, kloridi-ioni sisplatiinin vaihtaa vetyioneja CMC veteen muodostaen kompleksin. Johtuen säilyttämistä kompleksin ensisijaisen emulsion faasi, sisplatiinin voidaan ladata nanohiukkasten hydrofobisista PLGA hydrofiilisten metoksi polyetyleeniglykolin ketjuja. Lastaus tehokkuus Sisplatiinin on parantunut 3,9 ± 0,3% (w /w), ja kapselointi tehokkuus on jopa 70,9 ± 2,6%. Lisäksi ei ole raportoitu soveltamiseen liittyviä CMC polymeerien strategiana parantamiseksi lastaus tehokkuutta sisplatiinia. Siksi sisplatiini ladattu nanopartikkelit olisi tehokas lääkeaineen kantajina sisplatiinin

in vivo

tutkimuksessa.

korkea kapselointi tehokkuus Sisplatiinin on myös osittain soveltamisen TPGS emulgointiaineena coordination- aiheuttama nanohiukkasten muodostumiseen. TPGS on erilainen kuin aiemmin raportoitu PVA, natriumkolaatti tai muita emulgointiaineita [17], [20]. TPGS, vesiliukoinen johdannainen E-vitamiinia, on tavallisesti käytetään farmaseuttisissa ja nutraceutical formulaatioita. Tässä tutkimuksessa olemme onnistuneet syntyy homogeeninen nanopartikkelien avulla TPGS. Ei roskia ja kasautumisen homogeenisen nanohiukkasten havaittiin TEM. Monodispersinen emulsiopisaroiden suosii yhtyminen ilman TPGS, ja nanopartikkelit ovat vaikea muodostaa. Tässä TPGS käytetään toivoa syrjäyttää edellä mainitut emulgaattorit ja välttää niiden poistamiseksi ongelmia.

Arvioinnin aikana solujen elinkelpoisuuden ja hoidon tehokkuuden valmistettua sisplatiinin ladattu nanopartikkelit, elinkelpoisuutta IGROV1-CP soluja inkuboitiin vapaa sisplatiinia pitoisuusalueella 8-24 uM kolme päivää osoitti laskua 79,6%: sta 14,8%, kun taas solujen elävyys sisplatiinia-kapseloitu nanohiukkasia paljasti vähennystä 76,9%: sta 10,8%. Lisäksi sisplatiinin ladattu nanopartikkelit tehokkaasti esti kasvaimen kasvua nude-hiirissä verrattuna vapaa sisplatiini samalla annoksella, mikä viittaa siihen, että nanohiukkaset eivät keskeytä syövän vastaisen tehokkuuden sisplatiinin

in vivo

. TUNEL määritys vahvisti myös parannettu tehokkuus Sisplatiinin ladattu nanohiukkasten kasvain estoon. Samaan aikaan, histopatologinen tutkimus paljasti maksanekroosiin surkastumista munuaisten ryhmässä käsitelty vapaa sisplatiinilla, mutta tällaisia ​​histopatologisia muutoksia ei havaittu potilailla, joita hoidettiin sisplatiinilla-ladattu nanopartikkelit. Lisäksi muut tärkeiden elinten, kuten sydämen, pernassa ja keuhkoissa ei havaittu poikkeavuuksia myöskään. Siten ydin-CMC-sisplatiini-silloitettu nanohiukkasten pitäisi olla paljon turvallisempi ja suurempi tehokkuus kuin vapaan sisplatiinin aikana syövän hoidossa.

Jotta edelleen ymmärtää sivuvaikutuksia sisplatiinin ladattu nanopartikkelit, mahdolliset akuutti myrkyllisyys sisplatiinin -pitoinen nanohiukkasten arvioitiin myös. ICR-hiiriin injektoitiin suonensisäisesti 0,8 ml sisplatiinia ladattu nanohiukkasten sisplatiinin konsentraatiot 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 ja 3,0 mg /ml, vastaavasti, ja eloonjäämisaste hiirten tutkittiin. Kuten odotettua, LD

50 sisplatiinin ladattu nanopartikkelit paljasti 12-kertainen vapaan sisplatiinin. Verrattaessa koko eloonjäämisaste, BALB /c-hiiret osoittivat enemmän toleranssin sisplatiinin ladattu nanopartikkelit kuin vapaa sisplatiinin, joka osoitti, että sisplatiini ladattu nanopartikkelit oli enemmän turvallisuutta kuin vapaa sisplatiinia kunnon suhteellisen korkea annoksena.

yleensä sisplatiinin ladattu nanopartikkelit on onnistuneesti suunniteltu ja valmistettu. Pallomaisia ​​hiukkasia ja kapea kokojakauma on ominaista. Pitkävaikutteinen Sisplatiinin viiden päivän PLGA-mPEG nanohiukkasten

in vitro

havaittiin. Siksi voimme päätellä, että nanohiukkaset on merkittävä panos kontrolloidun vapautumisen sisplatiinin ja eivät vahingoita hoidon tehokkuudesta sisplatiinin. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy lisäarviointia sisplatiinin ladattu nanopartikkelit uutena syövän hoidossa. Kuitenkin jotta voidaan maksimoida antituumorivaikutusta sisplatiinin ladattu nanopartikkelit, on välttämätöntä optimoida annoksena ja injektio järjestelmää.

Nykyinen strategioita, erityisesti tällaisten nanohiukkasia, mukana monivaiheinen valmiste. Tämän seurauksena, menettely on luonnostaan ​​tehotonta järjestelmä, joka ei voi olla helposti skaalautuva ja voi johtaa tuote-erän vaihtelua. Laboratoriossamme, olemme kehittäneet uuden menetelmän valmistamiseksi nanopartikkelien tuote-erän yhdenmukaisuus. Se on yksinkertainen, skaalautuva, tehokas ja valvottavissa järjestelmä käyttämällä hyvin suunniteltu formulaatiostrategia. Meidän proof-of-concept

in vitro

ja

in vivo

arviointi osoittaa, että PLGA-mPEG nanopartikkelimuotoa on potentiaalinen sisplatiini toteutustapa munasarjasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Sisplatiini hankittiin Shandong Boyuan Chemical Co Ltd (Jinan, Kiina). CMC hankittiin Aladdin Reagent Co. Ltd (Shanghai, Kiina). mPEG (M

W 5 kDa) ja TPGS saatiin Jiangsu XiXin vitamiini Co Ltd-käänteisfaasipylvästä (ZORBAX-NH

2, 250 x 4,6 mm, 5 pm) hankittiin Agilent Technologies Co . Ltd (USA). Kaikki reagenssia vettä käytetään laboratoriossa esikäsiteltiin Milli-Q Plus System (Millipore Corporation, USA). Kaikki mPEG näytteet kuivattu tislaamalla atseotrooppisesti tolueenin kanssa, ja sitten tyhjökuivatetaan 50 ° C: ssa 12 tunnin ajan ennen käyttöä. IGROV1-CP solut ystävällisesti Dr. Stephen Collins UCSD (CA, USA).

Eläimet

Kaikki eläinkokeet suoritettiin suostumuksella institutionaalisten Animal eettisen komitean (IACE) tutkimuskeskuksen of Laboratory Animal Science Zhejiangin Kiinan Medical University (Hangzhou, Kiina). Lupa luvut ovat Syxk (zhe) 2008-0115. ICR-hiiriä ja BALB /c-hiiriä (4-6 viikkoa vanhoja ja joiden paino on 18-22 g) pidettiin eläinten keskelle. Sisplatiini-ladattu nanohiukkasten annettiin injektiona laskimoon. Lopussa hoitojaksojen, maksa, munuaiset, sydän, perna ja keuhkojen kudoksia kerättiin kohti hyväksymisestä IAEC.

synteesi ja karakterisointi PLGA-mPEG kopolymeeri

PLGA-mPEG kopolymeerit valmistettiin sulapolymerointi- prosessi tyhjiössä käyttäen tina-2-etyyliheksanoaattia katalyyttinä [23]. PLGA (30) -mPEG (5) syntetisoitiin koostumus LA:GA:EO = 03:01:01, Mw (painokeskimääräinen molekyylipaino) = 3,7 x 10

4, PI = 1,8 (LA, GA ja EO seistä maitohappo, glykolihappo ja etyleenioksidin komponentit tässä järjestyksessä). Kopolymeeri, tunnettu siitä, jossa

1 H-NMR ja GPC.

valmistaminen ja karakterisointi sisplatiinin ladattu nanohiukkasten

PLGA-mPEG nanohiukkasten ladattu sisplatiinia valmistettiin W /O /W-emulsio haihduttamalla liuotin kehittämä menetelmä Gryparis EY [20], jossa on erityisiä muutoksia. Lyhyesti, 5,71 mg /ml sisplatiinia liuotettiin 30 mM CMC vesiliuosta emulgoidaan orgaaniseen faasiin käyttämällä sonikoimalla (bioruptor, malli UCD-200 TM-EX) 100 W: ssa 45 sekunnin ajan. Orgaaninen faasi, joka koostuu pääasiassa kloroformia ja asetonia, joka sisälsi 50 mg PLGA-mPEG. Vesi-orgaaninen faasi emulsio lisättiin vesiliuosta TPGS (0,035%, paino /tilavuus).

Tuloksena W /O /W-emulsio sitten microfludized jonka paine on vähintään 12000 PSI, ja sekoitetaan magneettisella sekoittimella 3 h huoneen lämpötilassa, kunnes täydellinen haihtuminen kloroformia ja asetonia. Lopuksi nanohiukkasten suspensio lyofilisoitiin ja varastoitiin 4 ° C: ssa, kunnes tulevaa käyttöä varten. Lisäämiseksi loukkuun sisplatiinin nanohiukkasia, CMC sisäiseen vesifaasiin W /O /W konjugoitiin sisplatiinia 1 ml: ssa vettä 3 tuntia jatkuvasti sekoittaen varovasti. Tyhjä nanohiukkasten valmistettiin myös samalla menetelmällä ilman sisplatiinia.

Hiukkaskoko ja zeta-potentiaali mitattiin käyttämällä Malvern Zetasizer väline (13 kulkee näytettä kohti, NETASIZER NANO S90). Morfologiset tarkastelu nanohiukkasten havaittiin alle TEM (JEM-1230, JEOL, Japani). Yksi tippa nanohiukkasten suspensio sijoitettiin kupari verkkoon peitetty nitroselluloosakalvolle ja kuivataan ulkoilmassa ennen negatiivisen värjäyksen phosphotungstic Natriumin (1% w /v).

määritys lastaus tehokkuutta ja

in vitro

-vapauttamisnopeus sisplatiinin

lataamisteho sisplatiinin nanohiukkasten määritettiin suoralla menettelyä [24]. Täysin 5 mg lyofilisoitua nanohiukkasten liuotettiin 1 ml: aan NaOH: a (0,1 N) ja sekoitettiin yön yli magneettisekoittimella huoneen lämpötilassa. Suspensiota sentrifugoitiin 18000 g: ssä 10 min, ja 90 ui supernatanttia käytettiin määrittämään sisplatiinin sisällön HPLC: llä. Kapselointi tehokkuus laskettiin määrä sisplatiinin talteen nanohiukkasia suhteessa alkuperäiseen määrään sisplatiinia käytetään kunkin valmistamiseksi. Lisäksi, jotta voidaan määrittää vapautumiskinetiikat sisplatiinin nanopartikkeleista, sisplatiini-ladattu nanopartikkelit (5 mg) suspendoitiin 10 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Suspensio laitettiin mikrosentrifugiputkeen ja sitten laittaa kiertoradan vesihauteessa ravistellen nopeudella 120 rpm 37 ° C: ssa. Putkia sentrifugoitiin nimetty aikavälein. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit kerättiin määrittämiseksi sisplatiinia. Näytteenoton jälkeen meidän supernatantit, inkubointiaineeseen korvattiin tuoreella PBS: llä ja putket sijoitettiin takaisin inkubaattoriin. Sisplatiini sisältö Näiden liuosten määritettiin mittaamalla absorbanssi 310 nm: ssä, jossa on ei-gradientilla, liikkuva faasi koostui 0,9% NaCl: a ja metanolia (v /v, 25/75) tasaisella virtausnopeudella 1,0 ml /min.

In vitro

sytotoksisuus tutkimus

MTT-määritystä käytettiin arvioimaan myrkyllisyyden tyhjä nanohiukkasia, sisplatiini-ladattu nanopartikkelit ja vapaa sisplatiini vastaan ​​IGROV1-CP munasarjasyöpäsoluja [25 ]. Solut ympättiin muovi 96-kuoppalevyille 3 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, sisplatiini, tyhjä nanohiukkasten ja sisplatiini-ladattu nanopartikkelit (molemmat suspendoitiin elatusaineeseen) eri pitoisuuksina, lisättiin kuoppiin. Kaikkiaan 50 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä, pH 7,4) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tunnin ajan. Liuos poistettiin, ja sen jälkeen 200 ui hapanta isopropanolia (0,33 ml HCI: a 100 ml: ssa isopropanolia) lisättiin ja sekoitettiin perusteellisesti liuottamiseksi formatsaanikiteet. Liuos välittömästi luetaan mikrolevylukijalla (TECAN infinit M200, USA) aallonpituudella 490 nm. Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa. Sytotoksisuus ilmaistiin inhibitio prosentteina solujen elinkelpoisuuden.

In vivo

arvioinnissa akuutin myrkyllisyyden

ICR arviointiin käytettiin suhteellista myrkyllisyyttä suonensisäisen sisplatiinin ladattu nanopartikkelit .