Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

apoptoosin säätelyyn perusolosuhteissa (ei- stressi) vaikutus on ratkaisevan tärkeä normaalille nisäkkäiden kehityksen ja myös normaalin solujen liikevaihdon eri kudoksissa koko elämän. Puutteellinen sääntely pohjapinta apoptoosin, tai sen häiriön, voi johtaa heikentyneeseen kehitykseen ja /tai tautitilojen kuten syövän. Toisin kuin stressin aiheuttama apoptoosin apoptoosin säätelyyn perusolosuhteissa ymmärretään huonosti. Ongelman ratkaisemiseksi olemme verranneet basal- ja stressin aiheuttama apoptoosin ihmisen epiteelisolujen normaalin ja syöpä alkuperää. Tätä varten me Keskityimme tutkimuksen vastakkaisilla pro-apoptoottista JNK /antiapoptoottisia NFKB reittejä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kombinatoriset RNAi plus geeni Knockout käytettiin pääsyn ja kartta pohjapinta sääntelyyn polkuja apoptoosin. Jatkotehtävä, yksityiskohtainen analyysi sisältyi eksogeeninen ilmaus fosforylaation mutanttien ja chromatin immunosaostus. Osoitamme, että pohjapinta apoptoosin konstitutiivisesti tukahdutti JNK2 alueella ihmisen syöpäsolujen linjat. Tätä vaikutusta ei havaittu ei-syöpäsoluja. Hiljentäminen JNK2 RNAi johti JNK1-riippuvaista apoptoosia syöpäsolujen kautta säätely ylöspäin AP-1 tekijä c-kesäkuu Yllättäen huomasimme, että JNK1 ja c-Jun edistää pohjapinta apoptoosin puuttuessa ”aktivoiva fosforylaatiot” tyypillisesti aiheuttama stressi. Hypo-fosforyloitu c-Jun kertynyt korkeille tasoille JNK2 vaiennettu, auto-säännelty omaa ilmaisua ja tukahdutti ilmaus Bcl-3, epätavallinen IKB proteiinia ja säädin NFKB. Pohjapinta apoptoosi välittyy komponenttien TNFa vastereitissä mutta oli mekaanisesti erillään TNFa: n indusoiman apoptoosin.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset osoittavat, että mekaanisesti erilliset reitit toimivat säädellä apoptoosia nisäkässoluissa alle pohjapinta (fysiologinen) versus stressin aiheuttama olosuhteissa. Kuvaamme myös uudenlainen apoptoottista verkko, joka ohjaa pohjapinta selviytymisen syöpäsoluja. Tällainen tieto on ratkaisevan tärkeää ymmärtää normaalin solujen liikevaihdon aikana nisäkkäiden kehityksen ja sen jälkeen läpi elämän. Tämä tieto myös avaa uusia mahdollisuuksia terapeuttiseen interventioon ihmisen proliferatiivisen tautitiloissa kuten syöpä.

Citation: Ahmed SU, Milner J (2009) Basal Cancer Cell Survival Koskee JNK2 tukahduttaminen Novel JNK1 /c-Jun /Bcl -3 Apoptotic Network. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10,1371 /journal.pone.0007305

Editor: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 elokuu 2009; Hyväksytty: 07 syyskuu 2009; Julkaistu: 06 lokakuu 2009

Copyright: © 2009 Ahmed, Milner. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat Yorkshire Cancer Research ydin tutkimusohjelma palkinnon JM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

c-Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK: t) ovat jäseniä mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin perhe (MAP-kinaasien, MAPK: t), ja aktivoidaan vasteena solujen stressiä [1], [2]. Vastauksena korostaa JNK1 ja JNK2 ovat aktivoidaan kaksi fosforylaatiota T183 ja Y185 MAPK-kinaasien (MAPKK), erityisesti MKK4 ja MKK7 [3], [4]. MAPK ja MAPKKs ovat osa signaalitransduktion super-perhe, joka sisältää ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasien (ERK) ja p38 MAPK. Toiminnot JNK1 ja JNK2 määritetään solu- tyyppi ja luonne stressiä vastuussa niiden aktivaation. Alustavat tutkimukset tunnistaa JNK: illa niiden kyvystä fosforyloida N-päähän c-Jun, jäsen aktivoivan proteiinin 1 (AP-1) transkriptiotekijä perhe [5]. Tämän jälkeen JNK: t olivat osoitettu fosfory- ja säätelevät muiden AP-1-proteiineja sekä muita proteiineja, jotka liittyvät soluproliferaatioon ja apoptoosiin, mukaan lukien p53, c-Myc, Bcl-2 ja Bim [2], [6].

AP-1 tekijät ovat joukko rakenteellisesti ja toiminnallisesti liittyvien jäsenten Jun-proteiinin perhe (c-Jun, JunB ja JunD) ja Fos-proteiinin perhe (c-Fos, FosB, Fra-1 ja Fra-1) [7]. Dimerointiteknologia näiden perheenjäseniä muodostaa AP-1 transkriptiotekijän ja suhteellinen runsaus yksittäisten AP-1 alayksiköiden ja dimeeri koostumus on tärkeä tekijä solujen kohtalon. Ohjelmistoon AP-1-dimeerin koostumus mahdollistaa räätälöinti AP-1-välitteisen vasteen yksittäisten solutyyppejä tietyn ärsykkeen. Translaation jälkeinen muutos ja proteiinia vaihtuvuus on kaksi mekanismeja säätelemiseksi AP-1-aktiivisuutta. Esimerkiksi vastauksena korostaa transaktivaatiota potentiaalia c-Jun aktivoidaan JNK-välitteisen N-pään fosfory- [8], [9], kun taas vakaus c-Jun-proteiinin on alas-säädellään GSK-3-välitteisen C-terminaalinen fosforylaation, joka on suunnattu c-Jun varten ubiquitinylation ja hajoamisen kautta E3-ligaasi Fbw7 [10].

tärkeä aktivaattori JNK apoptoottisen reitin on tuumorinekroositekijä α (TNFa), joka on pro-inflammatorinen sytokiini joka hallitsee solujen eloonjääminen kautta edistää joko solujen lisääntymisen tai apoptoosin [11]. TNFa sitoutuu sen trimeerinen reseptori, TNFR1, ulkopinnalla solukalvon. TNFa /TNFR1 vuorovaikutuksen tuloksena muodostuu solunsisäisen heterogeeninen proteiini-kompleksin (kompleksi 1) on sytoplasminen häntä TNFR1. Sen puolestaan ​​tässä monimutkaisessa johtaa aktivoitumiseen JNK ja myös IKB kinaasin (IKK). Elegantti tutkimukset

in vitro

ja

in vivo

ovat osoittaneet, että hepatosyyteissä alttiina TNFa, aktivoitu JNK1 fosforyloi ja aktivoi E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla ITCH [1], [12]. Aktivoitu ITCH indusoi ubiquitinylation ja hajoamista cFLIP (cellular FLICE-inhibitorinen proteiini), joka muuten estää spesifisesti aktivoitumista pro-kaspaasi 8 (kutsutaan myös FLICE). Kaspaasin 8 aktivaatio johtaa apoptoosin [1], [10]. Tämä proapoptootti- -systeemi vastapainona NFKB jotka up-regulation c-FLIP ilmaisun ja estää näin prokaspaasia 8 aktivaation ja apoptoosin [13].

NFKB on transkriptiotekijä, joka koostuu homo- tai heterodimeerejä jäsenten Rel proteiinien perheen, mukaan lukien p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 ja p52 (tarkistetaan [14]. transkriptio aktivaatiodomeeneista puuttuvat p50 ja p52, jotka siten täytyy muodostaa heterodimeerejä jotta transaktivoimaan kohdegeeneihin. pääasiallinen kokoonpano on heterodimeeri p65-p50 mutta eri dimeeriä koostumuksia muodostuu myös. NFKB on annetussa asetuksessa proteiini-proteiini vuorovaikutusten IKB proteiinien. IκBα ja IκBβ ensisijaisesti kohdistaa p65-p50 heterodimeerejä. fosforylaatio IKB mukaan IKB kinaasit laukaisee IKB hajoamista ja vapauttaa dimeerisen NFKB joka translokoituu tumaan ja säätelee geenien ilmentymisen. Bcl-3 on epätavallinen IKB joka sitoutuu ensisijaisesti p50-p50 ja p52-p52 NFKB homodimeerejä [15], [16]. Bcl-3 on lisäksi erottaa muista IKB-proteiinit, että se voi paikallistaa tumaan, se ei hajoa, kun aktivoinnin NFKB ja sillä on seitsemän, pikemminkin kuin kuusi, ankyriiniproteiinista toista aloilla. Nuclear lokalisointi Bcl-3 on yhteensopiva sen kyky muodostaa kolmen komponentin kompleksin DNA: han sitoutuneen p50: p50 homodimeerit NFKB, ja myös auttamaan käyttöönottoa p50 tumaan (katso [17] ja siinä olevat viitteet). Bcl-3 kuvattiin ensimmäisen krooninen lymfaattinen leukemia [18] ja sitä pidetään otaksutun onkoproteiini.

Lisäksi niiden roolit stressivasteeseen JNK1- JNK2 toimia myös alle pohjapinta, ei-stressi olosuhteet ovat osoituksena kudosspesifiset poikkeavuuksia havaitaan JNK1 – /- ja JNK2 – /- hiirissä. Esimerkiksi JNK1 – /- hiirillä laskivat T-solujen erilaistumista ja vialliset immuniteetti [19]. Tärkeää JNK1 – /- hiirillä myös kehittää spontaaneja suolen kasvaimet, mikä osoittaa, että JNK1 toimii tuumorisuppressorina tämän kudostyypin [20]. Kuitenkin mekanismit JNK1 ja JNK2 toimiva perusolosuhteissa, fysiologisissa olosuhteissa huonosti.

tutkimiseksi yksittäisten roolit JNK1 ja JNK2 ihmisen epiteelisoluissa perusolosuhteissa käytimme yhdistelmä (i) indusoima RNAi puuttuessa käytetyn jännityksen, (ii) geeni knock-out solulinjoissa, ja (iii) eksogeenisen geenin ilmentymisen. Alueella, joka on ihmisen solulinjoja olemme havainneet, että JNK1 on aktiivisesti pro-apoptoottisen mutta konstitutiivisesti estää läsnäolo JNK2 syöpäsoluissa. Tätä vaikutusta ei havaittu ei-syöpäsoluja. Co-hiljentäminen kokeet paljastivat, että nämä pohjapinta, vastakkaiset pro- ja anti-apoptoottisen toimintoja JNK1 ja JNK2 ovat pitkälti riippumattomia alkupään kinaasien MKK4 ja MKK7. Tämä oli yhdenmukainen puute havaittavaa muutosta JNK1 fosforylaatio huolimatta JNK1-riippuvaista apoptoosia seuraavat ehtyminen JNK2. Lisäkokeet osoittivat, että pohjapinta JNK1 pro-apoptoottista reittiin kuuluu c-Jun ja komponentit TNFa-reagoiva MAP-kinaasireitin yhdessä NFKB-reitin kautta c-Jun-välitteisen down-regulation of Bcl-3. Siten pohjapinta säätelyyn syöpäsolun selviytymisen näyttää olevan riippuvainen vastakkaisten toimintojen JNK2 /Bcl-3 (pro-eloonjääminen) ja JNK1 /c-Jun (pro-apoptoottinen) ja olla alle konstitutiivista valvonnan JNK2.

tulokset

valikoiva knock-alas JNK2 parantaa JNK1 ilmaisu

RNAi käytimme synteettisten siRNA olosuhteissa aiemmin osoitettu annettava tehokkaita knock-down kohde mRNA: iden ilman aktivointia p53 solu stressivaste [21], [22]. RNAi kontrollit sisälsivät BCR-ABL siRNA, jolla ei ole kohde-mRNA: epiteelisoluissa ja siten toimii ei-toiminnallinen siRNA ohjaus, ja lamiini A /C siRNA, joka kohdistuu lamiini A /C-mRNA: n ja toimii toiminnallisena siRNA ohjaus (Methods ). Valikoiva knock-alas JNK1 ja JNK2 mRNA toistettiin kahdella eri siRNA kohde (menetelmät ja Fig. S1). Tehokkuus mRNA knock-down määritettiin kvantitatiivisen PCR: llä ja oli samanlainen sekä JNK1- ja JNK2 (~75% vähennys; ks. 1A JNK1 mRNA-tasoja). RNAi aiheuttama hiljentäminen Lamin A /C tai JNK1 ei aiheuttanut mitään muutosta p53 tai p21

WAF1, p53-riippuvaisen kohdegeenin (Fig. 1B JNK1 siRNA ja Fig. S2 Lamin A /C siRNA) , mikä vahvistaa, että olosuhteet RNAi

sinänsä

eivät aloittaa p53 stressivaste. Kuitenkin JNK2 hiljentäminen johti ~ 3 kertaistanut p53-proteiini (Fig. 1 B) viittaa siihen, että JNK2 suoraan tai epäsuorasti säätelee liikevaihdon p53-proteiinin. Tämä on sopusoinnussa raportti, joka JNK: t voivat säädellä pohjapinta liikevaihto p53 [23]. Mielenkiintoista, co-vaimentaminen JNK1 kanssa JNK2 kumottiin nousun p53 (Fig. 1 B) ymmärtää, että JNK1 ja JNK2 käyttää koordinoi vaikutukset, kun liikevaihtoon p53.

(A) JNK1 mRNA-tasot, ja ( B) JNK1, JNK2, ja myös p53 ja p21-proteiinin tasot määritettiin 48 tunnin kuluttua transfektiosta JNK1- ja JNK2-siRNA kuten (menetelmät). (C) Faasikontrasti- kuvia HCT116-solujen 48 tunnin kuluttua transfektiosta JNK1- ja JNK2-siRNA. (D) Apoptoosin määräytyy anneksiini V merkintöjä siRNA käsiteltyjä soluja verrattuna käsittelemättömien kontrollien alueella ihmisen solulinjoja (Methods. Huom: apoptoosin tulokset edustavat vähintään kolmea toistetuista kokeista, ellei virhepalkkeja sisältyvät toista analyysejä on ainoassa kokeessa). (E) kaspaasi 8 ja sen pilkkoutumistuotteet, aktivoitu kaspaasi 7 ja efektori kaspaasi 3 seuraava RNAi-välitteinen vaiennettu JNK1 ja JNK2 kuten. Actin = lastaus valvontaa. HCT116 p53 + /+ ja HCT116 p53 – /- ovat isogeeninen kloonit ihmisen HCT116 peräsuolen syöpäsoluja (menetelmät).

Yllättäen vuonna HCT116 peräsuolen syövän solut JNK2 knock-down johdonmukaisesti johti -50% kasvu JNK1 mRNA-tasojen ja ~ 3-kertainen nousu JNK1-proteiinin tasot (Fig. 1A ja 1B). Samanlaisia ​​tuloksia JNK1 mRNA saatiin isogeenisiin HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- solut (Fig. 1A ja 1 B), mikä osoittaa, että vaikutus on p53-riippumatonta. Siten HCT116-soluissa, läsnäolo JNK2 suoraan tai välillisesti estää pohjapinta JNK1 ekspressiotasoja.

JNK2 knock-down indusoi apoptoosin

Knock-down of JNK2 johti apoptoosin erilaisia ​​syöpä solulinjojen HCT116-solut (Fig. 1 C ja 1 D). Apoptoosi määritettiin anneksiini V värjäytymistä (menetelmät) ja mukana prokaspaasia 8 aktivaatio ja efek- caspases 3 ja 7 (Fig. 1 E). Tämä apoptoottinen vaikutus JNK2 ehtyminen oli riippumaton p53 osoituksena HCT116 p53 – /- solut (Fig. 1 C ja 1 D). Ei-syöpäsoluja JNK2 hiljentäminen ei aiheuttanut apoptoosia (ARPE19 ja MCF10A epiteelisolujen ja Wi-38 fibroblastit) huolimatta tehokas JNK2 mRNA knock-down (Fig. 1D ja tietoja ei näytetty). Toisin kuin JNK2 hiljentämiseltä vaiennettaisi JNK1 ei vaikuttanut elinkelpoisuutta tahansa testatuista solulinjoista (kuvio. 1C ja 1D). Kaiken nämä tulokset osoittavat, että JNK2, mutta ei JNK1, on välttämätöntä pohjapinta elinkelpoisuuden useissa ihmisen syövän solulinjojen MCF7 rintasyövän epiteelisolujen, mutta on tarpeeton pohjapinta elinkelpoisuuden ei-syöpäsolujen, kuten MCF10A rintojen epiteelisoluissa.

Apoptosis on JNK1 riippuva

ensi yhteistyötä vaientaa JNK1 kanssa JNK2 selvittääkseen niiden toiminnalliset sidos säätelyssä syöpäsolun selviytymisen. Kaikissa tapauksissa, joissa JNK2 hiljentäminen aiheuttaman apoptoosin huomasimme, että yhteistyössä hiljentäminen JNK1 kanssa JNK2 pelastettiin JNK2 vaje solujen apoptoosin (Fig. 1 D). Näin voimme päätellä, että JNK1 ja JNK2 tasoittamaan toisensa ylläpidossa syöpäsolun elinkelpoisuuden ja että JNK2 konstitutiivisesti vaimentaa JNK1 välittämää apoptoosia perusolosuhteissa.

JNK1-riippuvaista apoptoosia on riippumaton parannettu JNK1 S63 /73 fosforylaatio

edellä esitetyt tulokset osoittavat, että JNK1 on pohjustettu indusoida apoptoosia ihmisen epiteelisyöpäsolujen mutta konstitutiivisesti tukahduttaa JNK2. Sekä JNK1 ja JNK2 ovat alavirtaan välittäjiä MAP kinaasin apoptoottisen reitin ja aktivoidaan vastauksena stressiä MKK4 ja /tai MKK7 fosforylaation T183 /Y185 (Introduction). Me seuraavaksi verrataan JNK1 ja JNK2 fosforylaatiota alle pohjapinta (RNAi) ja stressin aiheuttama (UV- tai TNFa) olosuhteissa.

Kuten odotettua UV aiheuttama voimakas fosforylaatiota tähteissä T183 /Y185 sekä JNK1- ja JNK2 proteiinien HCT116-soluissa (Fig. 2A). Samoin hoito HCT116-solujen TNFa indusoi myös JNK1 ja JNK2 fosforylaation T183 /Y185 (Fig. 2B, yläpaneeli). Tässä jälkimmäisessä tapauksessa JNK1 fosforylaatio vallitsevina JNK2 fosforylaatiota. Nämä tulokset osoittavat selvästi fosforylaatioon JNK1 ja JNK2 vastauksena genotoksinen stressi (UV) ja reseptorivälitteisen stressi (TNFa) in HCT116-soluissa. Sekä UV-säteilytys ja TNFa: n indusoiman apoptoosin (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Vertailu JNK1 /JNK2 fosforylaation tilan valvonta, JNK2-vaiennetaan ja seuraavat UV-säteilytys (HCT116-solut, menetelmät). p-JNK1 = fosforyloitu JNK1, pJNK2 = fosforyloitu JNK2 (nuolella). (B) vaikutus TNFa fosforylaatiota asemasta JNK1, JNK2 ja c-kesäkuu (C) Co-hiljentäminen c-Jun kanssa JNK2 pelastaa HCT116-soluja apoptoosin (anneksiini V merkintöjä, Methods). (D) JNK1, JNK2 ja c-Jun-proteiinin tasot 48 tunnin kuluessa RNAi-välitteinen vaiennettu JNK2 ja c-kesäkuu P53 ja p21-proteiinin tasot ovat myös osoittaneet. (E) c-Jun mRNA-tasojen jälkeen JNK1 ja JNK2 hiljentäminen. (F) kertainen C-Jun mRNA tasot HCT116-soluissa verrattuna ARPE19 soluihin 48 tuntia sen jälkeen JNK2 hiljentäminen. (G) pudotus c-Jun-mRNA: n ja proteiinin tasot HCT116 p53 + /+ soluissa c-Jun-siRNA hoitoon.

perusolosuhteissa, kun JNK1 oli aktiivisesti pro-apoptoottisen seuraavat JNK2 hiljentämisen, on ei ollut havaittavissa kasvua JNK1 T183 /Y185 fosforylaatiota (kuvio. 2A, vertaa ohjaus kaista JNK2 siRNA kaista). Tämä on silmiinpistävä vastakohta stressin aiheuttama olosuhteissa (Fig. 2A; vertailla JNK2 siRNA kaista UV kaista). Siten päättelemme, että JNK1 kykenee edistämään apoptoosia puuttuessa ”aktivoivan” T183 /Y185 fosforylaatiot, joita tyypillisesti indusoituu vasteena stressille. Co-hiljentäminen alkupään kinaasien MKK4 tai MKK 7 JNK2 vain osittain pelastettiin JNK1-riippuvaista apoptoosia (kuvio. S3), lisäksi todisteet kyky JNK1 edistää apoptoosin puuttuessa tehostetun T183 /Y185 fosforylaatioita.

Olemme päätellä, että perusolosuhteissa, JNK1 voi aktiivisesti edistää apoptoosia eikä niille parannettu T183 /Y185 fosforylaation ominaisuus solustressiä vastausta. Tämä pohjapinta pro-apoptoottisen funktion JNK1 on ilmeistä ihmisen epiteelisyöpäsolujen (mutta ei ei-syöpäsolujen) ja konstitutiivisesti estää endogeenisen JNK2. Tutkia pohjapinta apoptoottisen reitin alla JNK1 valvonnan seuraavan kerran suorittaa sarjan yhteistyössä hiljentäminen kokeita, joilla pyritään tunnistamaan olennainen proapoptoottisten välittäjäaineiden liittyy JNK1- riippuvan apoptoosin seuraavia JNK2 hiljentäminen.

c-Jun on olennainen välittäjänä tyvi- apoptoosin ja edellyttää vastakkaisia ​​vaikutuksia JNK1 ja JNK2

kysyä c-Jun vaaditaan apoptoosin perusolosuhteissa yhteisrahoittaisimme vaiennetaan c-Jun kanssa JNK2 (Fig. 2; tehokkuus c-Jun-mRNA: n pudotus on esitetty kuviossa. 2G). Tulokset osoittavat selvästi, että c-Jun co-hiljentäminen pelastaa JNK2-vaiennetaan HCT116-soluja apoptoosin näin tunnistaa c-Jun olennaisena välittäjänä apoptoosin kohteena JNK2 tukahduttaminen perusolosuhteissa (Fig. 2C).

c-Jun-proteiinin kertynyt korkeille tasoille JNK2 hiljentämisen HCT116-soluissa (kuvio. 2D, lisääntynyt c-Jun havaittiin myös RKO ja Lovo soluissa JNK2 vaiennettu, ei esitetty) rinnan lisääntyminen c-Jun mRNA (kuva. 2E). Kiinnostavaa kyllä, tämä vaikutus poistettiin, kun JNK1 oli yhteistyössä vaiennettu kanssa JNK2 (Fig. 3A c-Jun-proteiinia ja Fig. 2E for c-Jun mRNA) osoittaa, että säätely ylöspäin c-Jun riippuu jatkuva läsnäolo JNK1 . JNK1 hiljentäminen yksin vähensi c-Jun mRNA ja proteiini (Fig. 2E ja kuvio. S4). Nämä yhdistetyt havainnot viittaavat siihen, että JNK1 ja JNK2 aiheuttavat vastakkaiset vaikutukset, kun c-Jun ilmaisun ja että JNK1 tarvitaan ylläpitoon pohjapinta c-Jun mRNA ja proteiini ekspressiotasot, vaikka JNK2 konstitutiivisesti estää c-Jun mRNA ja proteiini ekspressiotasot. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- solut (katso esimerkiksi kuvio. 2E). Mielenkiintoista kasvanut c-Jun mRNA ei havaittu JNK2-vaiennetaan ARPE19 soluja (Kuva. 2F) vastasi puute apoptoosin näissä soluissa (Kuva. 1 D).

(A) yhteensä c-Jun-proteiinin ja fosforylaatiot at S63, S73 ja T91 seuraavissa joko UV-säteilytys (oikeanpuoleinen kaista) tai JNK1- JNK2 RNAi aiheuttama hiljentäminen. (B) Kaaviokuva

c-Jun

ja amplikoni käyttää havaitsemaan c-Jun on promoottori. (C) kokonaismäärä, ja fosforyloitu muotoja c-Jun sidottuina c-Jun promoottori havaitaan kromatiinin immunosaostuksella (ChIP), jossa c-Jun ja c-Jun fosfo-spesifisiä vasta-aineita. Histogrammi esittää fold-rikastaminen suhteessa IgG-kontrolleihin (menetelmät).

Tuloksemme tunnistaa vastakkaisia ​​vaikutuksia JNK1 ja JNK2 on c-Jun. Tässä suhteessa ne eroavat havaintoja saatiin käyttäen ”kemiallista genetiikan lähestymistapaa, jossa katalyyttinen ATP-sitova taskussa JNK2 laajennettiin mutaatio [2]. Johtopäätös tällainen lähestymistapa oli JNK1 ja JNK2 molemmat positiivisesti säädellä c-Jun ilme. On kuitenkin mahdollista, että laajennus ATP-sitoutumistaskun JNK2 voi häiritä spatiaalinen molekyyli organisaatio viereisen β-juosteen-kaltaisen alueen JNK2 proteiinia. Koska tämä β-lohkon n kaltainen domeeni on tärkeää JNK2 proteiini-proteiini vuorovaikutusten suosittelemme paikallisia häiritseekin tällä sivustolla saattaa vaarantaa sitoutumisominaisuudet JNK2 proteiinin sen kohdesubstraatteja. Tämä saattaa vaikuttaa toimintaan mutantti JNK2 tavoilla lisäksi ennustetuista vaikutuksista molekyylien pääsyä laajennettu ATP: n sitoutuminen taskuun JNK2.

Toinen tutkimus, jossa verrataan hiiren fibroblasteja peräisin JNK1 – /- ja JNK2 – /- hiiret osoittivat, että JNK1 ja JNK2 voivat toimia vastakkaisen sääntelyviranomaisten c-Jun [3]. Omia tuloksia, perusolosuhteissa, ovat yhdenmukaisia ​​tämän raportin ja osoittavat, että HCT116-soluissa (i) JNK2 hiljentäminen johtaa ylössäätöä c-Jun mRNA mukana selvää kerääntymistä c-Jun-proteiinia, ja (ii) säätelyä ylöspäin c-Jun näissä olosuhteissa riippuu JNK1.

Up-regulation JNK1 in JNK2-köyhdytettyä soluissa on riippumaton c-Jun

Koska pohjapinta ylössäätöä c-Jun (in JNK2-köyhdytettyä solut) vaatii JNK1 (katso edellä) mietimme, c-Jun, puolestaan, tarvitaan säätely ylöspäin JNK1 proteiinin seuraavista JNK2 hiljentäminen (Fig. 1 B). Kuitenkin kasvu JNK1 johdonmukaisesti havaittu JNK2-vaiennetaan soluissa ei vaikuttanut yhteistyössä hiljentäminen c-Jun kanssa JNK2 (Fig. 2D; yläpaneeli). Tämä osoittaa, että tehostettu mRNA: ta ja proteiinia ilmentyminen JNK1 seuraavista JNK2 ehtyminen on riippumaton c-Jun.

Hypo-fosforyloitua c-Jun sitoo c-Jun promoottori

Stressin indusoima S63 /S73 fosforylaatiota c-Jun by JNK kinaasien vapauttaa c-Jun peräisin estävä kompleksi mikä mahdollistaa c-Jun sitomaan ja transaktivoimaan tavoite promoottorit [24]. Stressin aiheuttama fosforylaatiota c-Jun HCT116 soluissa, joita käsiteltiin UV-säteilytys on esitetty kuviossa. 3A. Kuitenkin, vaikka havaittu kertyy runsaasti c-Jun-proteiinin seuraavat JNK2 hiljentäminen (Fig. 3A, JNK2 siRNA kaista) tämä oli riippumaton kasvoi N-terminaalista fosforylaation S63, S73 tai S91 (Fig. 3A).

JNK2 hiljentäminen indusoi huomattavasti enemmän c-Jun-mRNA-tasoja (katso edellä, kuvio. 2E). Kysymään kasvanut c-Jun transkriptien johtuivat ainakin osittain positiivista automaattinen sääntely palautetta loop suoritimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) ja c-Jun /c-Jun promoottori komplekseja (Fig. 3B ja 3C) . Käsittelemättömästä HCT116-soluissa c-Jun oli havaittavissa vuoden c-Jun-promoottori (Fig. 3C, valvonta). Seuraavat UV-säteilytyksen c-Jun fosforyloitiin S63 ja S73 (kuvio. 3A), ja fosforyloidun proteiinin sidottuina c-Jun promoottori kuten on osoitettu ChIP-analyysillä käyttäen anti-fosfo-T63 /73 c-Jun-vasta-aineilla (Fig. 3C). In JNK2-köyhdytettyä soluja, perusolosuhteissa, ei muutosta c-Jun-T63 /73 fosforylaatio oli ilmeistä kontrolleihin verrattuna (Fig. 3A). Kuitenkin c-Jun näissä soluissa oli sidottu on c-Jun promoottori (Fig. 3C). Puute fosforylaation kromatiinin sitoutuneen c-Jun vahvistettiin puute reaktiivisuus anti-fosfo-T63 /73 c-Jun-vasta-aineita (Fig. 3C vertailla näytteitä UV-säteilytetään solujen JNK2-vaiennetaan solut). Näin voimme päätellä, että S63 /73 hypo-fosforyloitu c-Jun sitoutuu sen oma promoottori seuraavat JNK2 ehtyminen ja todennäköisesti edistää korkea c-Jun mRNA ekspressiotasot (~9-kertainen kontrolliin verrattuna, katso kuva. 2E) indusoi näissä pohjapinta olosuhteissa.

c-Jun proteiinien kertymistä korreloi menetyksen fosforylaation S243

on mahdollista, että c-Jun pidetään vähäisinä määrinä HCT116-soluissa, alempi kuin havaittu non -cancer ARPE19 soluja (tietoja ei esitetty), kautta, jatkuva c-Jun-proteiinien hajoamista. Hajoamista c-Jun käsittää C-terminaalisen fosforylaation S243, jossa pohjustaa c-Jun on GSK3-välitteisten fosforylaation T239. Tämä luo liitetiedoston sivusto Fbw7 E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla, jolloin polyubiquitinylation ja c-Jun hajoaminen [10]. Meidän Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että JNK1 hiljentäminen aiheutti lievää mutta toistettavissa nousu c-Jun S243P (kts. 4B-4D; ohjaus kaista cp JNK1 siRNA kaista S243P immunobloteista). Toisaalta JNK2 hiljentäminen toistettavasti aiheutti alhaisempia c-Jun: 243P, joskus havaita huolimatta massiivinen kerääntyminen koko proteiinin (Fig. 4B-4D, ohjaus kaista cp JNK2 siRNA varten S243P immunobloteissa). Näin JNK1 ja JNK2 aiheuttavat vastakkaisia ​​vaikutuksia, kun c-Jun-fosforylaation S243, muutos liittyy de-vakauttaminen c-Jun-proteiinin.

(A) Kaavamainen näyttää sivustojen fosforylaation c-Jun by JNK, GSK -3 ja ERK, ja niiden toiminnallinen seurauksia. Huomaa, että S243P on ennakkoehtona T239 fosforylaation (merkitty kaareva nuoli). (B) Immunoblotit osoittavat vaikutukset JNK1, JNK2 ja GSK3 hiljentämiseltä yksin ja yhdistelminä, on paneeli HCT116 solun proteiinien. (C) ja (D) Immunoblotit seuraavat kombinatorinen vaiennettu JNK1 ja JNK2 kanssa Fbw7 ja ERK. (E) Essential proapoptoottisten välituotteiden määritettiin yhteistyössä hiljentäminen kanssa JNK2. (F) Apoptosis seuraavat JNK2 hiljentäminen perusolosuhteissa on riippumaton Bax osoituksena Bax +/- ja Bax – /- HCT116 isogeenisiin klooneja.

GSK3, ERK, Fbw7 ja ITCH ovat keskeisiä välittäjiä pohjapinta JNK1-riippuvaista apoptoosia

vielä sarjassa yhteistyön hiljentäminen kokeet me osoittavat, että kinaasien GSK3, ERK, ja ubikitiinipromoottori 3 ligaasi Fbw7 ovat myös välttämättömiä välittäjiä JNK1 riippuvaisen apoptoosin JNK2-köyhdytettyä soluja (kuvio. 4E). Kuitenkin mikään näistä komponenteista vaikuttivat törmäämään S243 fosforylaation tai kertyminen c-Jun-proteiinia (Fig. 4B, 4C ja 4D, kaistat GSK3, Fbw7 ja ERK vastaavasti). Tämä oli odottamatonta, koska vasteena stressille, kaikki kolme on yhdistetty c-Jun hajoamisen kautta S239 ja S243 fosforylaatiota (ERK ja GSK3 vastaavasti) ja ubikitiini-välitteisen hajoamisen (Fbw7) [10], [25], [26] . Vaikuttaa siltä, ​​että perusolosuhteissa, GSK3, ERK ja Fbw7 toimivat olennainen välittäjinä apoptoosin kautta substraattien muut kuin c-kesäkuu

Bax ja CKII ovat tarpeeton pohjapinta JNK1 /JNK2 apoptoottista reitin

jälkeen stressi Bax on proapoptoottinen välittäjänä JNK aiheuttaman apoptoosin [27], [28]. Kysymään Bax tarvitaan myös pohjapinta JNK1 /JNK2 säädelty apoptoottista polku käytimme isogeenisiin Bax +/- ja Bax – /- HCT116-solut [2]. JNK2 hiljentäminen indusoi apoptoosia sekä HCT116 Bax

+/- ja HCT116 Bax

– /- solut (Fig. 4F), mikä osoittaa, että Bax ei vaadita apoptoosin näissä perusolosuhteissa. Co-hiljentäminen CKII, otaksuttu kinaasi c-Jun [3], ei myöskään pelastamaan JNK2 vaje HCT116-soluja apoptoosin (Fig. 4E). Siten sekä Bax ja CKII näyttävät tarpeeton pohjapinta JNK1 /JNK2 apoptoottisen reitin.

Vuorovaikutus c-Jun ja ITCH

proapoptoottisten reitin aiheuttama TNFa huipentuu fosforyloidun JNK1 riippuvaisen aktivaation of ITCH, hajoamista c-FLIP ja kaspaasin 8 aktivaation (katso johdanto). Tässä osoitamme, että ITCH on myös olennainen proapoptoottisten sovittelija säätelee JNK1 /JNK2 perusolosuhteissa ja että yhteistyö hiljentäminen ITCH kanssa JNK2 pelastaa soluja apoptoosin (Fig. 5A ja 5B).

(A) ja (B) Protein ja apoptoottisten tasolla havaittu ITCH ja JNK2 hiljentämisen HCT116-soluissa. (C) komplekseja endogeenisen ITCH-c-Jun-proteiineista havaitaan ennen JNK2 äänenvaimennusjärjestelmän menetetään seuraavien JNK2 ehtyminen.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia proapoptoottisten rooli ITCH perusolosuhteissa suoritimme immunosaostus /immunoblot analyysi endogeenisen kompleksit ITCH-c-Jun ennen ja jälkeen RNAi-välitteinen vaiennettu JNK2 (Fig. 5C). On merkittävää, ITCH-c-Jun kompleksit olivat havaittavissa kontrolloiduissa olosuhteissa, mutta nämä kompleksit menetettiin seuraavan JNK2 hiljentäminen (Fig. 5C).

Apoptosis etenee kautta c-FLIP ja kaspaasin 8

Co- hiljentäminen kaspaasi 8 JNK2 pelastettiin soluja apoptoosin (Fig. 4E). Tämä vaikutus on rajoitettu perusolosuhteissa, koska kaspaasin 8 RNAi ole pelastaa apoptoosin seuraavat UV-säteilyllä (tuloksia ei ole esitetty). c-FLIP äänenvaimennusjärjestelmän yksin indusoi apoptoosin HCT116-soluissa [29]. Co-hiljentäminen c-Jun, GSK3 tai Fbw7 c-FLIP ei solujen pelastamiseksi apoptoosin (Fig. 6A), mikä osoittaa, että kukin näistä pro-apoptoottisen välituotteet toimivat ylös-stream c-FLIP (Fig. 7A kaavamainen ). Niinpä tyvi- ja stressin aiheuttama apoptoottisia MAP-kinaasin reitit lähenevät tasolla c-FLIP. Kuten odotettua, co-hiljentäminen kaspaasin 8 c-FLIP pelastettu soluja apoptoosin (Fig. 6A ja 6B).

(A) tasot apoptoosin havaittu yhteistyössä hiljentäminen c-FLIP kanssa proapoptoottisten välittäjien . (B) Protein tasot osoittavat prokaspaasia 8 pilkkominen ja c-Jun kumuloitumista c-FLIP ehtyminen RNAi.

(A) kaaviokuva villityypin c-Jun (wt-c-Jun) ja ei-fosforyloitavissa mutantti c-Jun rakentaa. (B) anneksiini V mittaamista apoptoosin seuraavista yli-ilmentymisen wt-c-Jun tai mut-c-Jun kuten. (C) Immunoblotit osoittaa kokonais- ja fosforyloitu c-Jun seuraavat yliekspressio, SIRT1 latauskontrollina esitetty. (D) tasot apoptoosin seuraavista yhdistetyn siRNA hoidon läsnä tai poissa muiden kuin kohde-mut-c-Jun (katso materiaalit ja menetelmät).

Yli-ilmentyminen eksogeenisen c-Jun indusoi apoptoosin

seuraavan kysytään, korkean tason ekspressiota c-Jun yksinään on riittävä indusoimaan apoptoosin. Yli-ilmentyminen eksogeenisen villityypin c-Jun indusoiman apoptoosin HCT116 syöpäsoluissa (Fig. 7A ja 7B). Tärkeää on, että yli-ilmentyminen c-Jun-fosforylaation mutantti, jossa S63, S73, T91 ja T93 ovat kaikki mutatoitu alaniiniksi, myös indusoi apoptoosia näin uudelleen valvoa näyttöä pro-apoptoottisen toimintoja hypo-fosforyloitu c-Jun (kuvio . 7A ja 7B). Huomaa, että eksogeeninen ilmentymistä toisen proteiinin, SIRT1, ei indusoi apoptoosia HCT116-soluissa [22] osoittaa, että esillä olevat tulokset ovat spesifisiä c-kesäkuu Proteiinin ilmentyminen c-Jun konstruktioita ja fosforylaatio tila näyttää fosforylaatio lainkaan sivustoja tutkitaan villityypin c-Jun (Kuva. 7C). Tämä osoittaa solujen stressin aiheuttaman eksogeenisen geenin yli-ilmentyminen. Huomaa, että tämä on toisin kuin jatkuva c-Jun hypo-fosforyloitua asemasta seuraavat RNAi-välitteinen geenien mukaisesti perusolosuhteissa käytössä koko tämän työn (katso esimerkiksi kuvio. 3A). C-Jun-fosforylaation mutantti puuttui reaktiivisuus anti-fosfo-S63, S73 ja T91 vasta odotetusti (vasta-aine fosfoseriini 93 ei ollut saatavilla). Vaikka sekä mutantti ja villityypin eksogeenisen c-Jun-proteiinien fosforyloitiin T239 ja S243 (kuva. 7C) uskomme, että tämä oli ei-välttämättömiä apoptoosin induktion jälkeen endogeenisen c-Jun vaaditaan apoptoosin, vaikka ei ole C-terminaalin fosforylaation (katso esimerkiksi kuvio. 4B-4D seuraavat JNK2 hiljentäminen). On merkittävää, että yli-ilmentyminen eksogeenisen c-Jun ei indusoinut apoptoosia syöpäsolujen ARPE19 solut (Fig. 7B). Nämä yleiset havainnot edelleen uudelleen valvoa päätelmillemme (i) että kohonneita hypo-fosforyloidun c-Jun ovat pro-apoptoottisia in HCT116 syöpäsoluissa, ja (ii) että vaikutus on spesifinen syöpäsoluja (HCT116) ja ei havaita