Krooninen sairaus

tiivistelmä

pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) on erityinen alatyyppi keuhkosyöpään esittää mahdollisimman pitkälle etäpesäkkeitä erittäin huonoon ennusteeseen. Huolimatta vastaa aluksi hyvin kemo- tai sädehoidon, SCLC lähes poikkeuksetta pahenemisvai- ja kehittää vastustuskykyä kemoterapiaa. Tämä epäillään liittyvän kasvaimen solualapopulaatioiden on erilaiset ominaisuudet muistuttavat kantasoluja. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) tiedetään keskeinen rooli metastaattisen prosesseja ja kehittämään lääkeresistenssin. Tämä pätee myös NSCLC, mutta on hyvin vähän tietoa EMT prosesseista SCLC toistaiseksi. SCLC, toisin kuin NSCLC solulinjoihin, kasvaa lähinnä kelluva soluklusterien ja vähäinen osa adherentteina soluja. Olemme verranneet näitä morfologisesti eri alaryhmien SCLC solulinjojen EMT ja epigeneettiset ominaisuuksia, havaitsemiseksi merkittäviä eroja kiinnittyvä alapopulaatioiden joilla on korkea mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista ja fibronektiinin ja erittäin alhainen epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja Zona occludens 1. lisäksi ilmentyminen EMT liittyvien transkriptiotekijöiden kuten Snail /Snai1, Slug /Snai2, ja Zeb1, DNA metylaation EMT tunnusmerkki geenit, toiminnallisia vasteita kuten muuttoliike, invaasio, matriksimetalloproteaaseja eritystä, ja kestävyys kemoterapeuttisen lääkehoidon kaikki erosivat toisistaan ​​merkittävästi alilinjat. Tämä fenotyyppinen vaihtelevuus saattaa johtua kasvainsolun heterogeenisyys ja EMT aikana etäpesäkkeiden

in vivo

, mukana kehittäminen tulenkestävien taudin uusiutumisen. Ehdotamme, että epigeneettisellä asetusta avainasemassa aikana fenotyyppiset ja toiminnalliset muutokset kasvainsoluissa ja saattaa siksi tarjota uusia hoitovaihtoehtoja SCLC potilaille.

Citation: Krohn A, Ahrens T, Yalcin A, Plönes T, Wehrle J , Taromi S, et ai. (2014) Kasvainsolun heterogeenisuus on pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC): fenotyyppiset ja toiminnalliset erot liittyvät epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja DNA metylaatiomuutokset. PLoS ONE 9 (6): e100249. doi: 10,1371 /journal.pone.0100249

Editor: Bernard W. Futscher, University of Arizona, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 helmikuuta 2014; Hyväksytty: 22 toukokuu 2014; Julkaistu: 24 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Krohn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekti C3, CRC 850 (MB), ja Deutsche Krebshilfe (110213 BH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on erittäin pahanlaatuisten ja aggressiivinen keuhkojen kasvain osuus on noin 10-15% kaikista keuhkosyövässä raportoitu. Noin 30000 tapauksia diagnosoidaan vuosittain Yhdysvalloissa [1], [2]. Erillisenä keuhko-syöpä alaryhmä erotuksena Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC, mukaan lukien okasolusyöpä, suuri karsinooma, ja adenokarsinooma), SCLC on ominaista hyvin varhain etäpesäkkeiden ja huonon ennusteen. Useimmat potilailla esiintyy solmukohtien etäpesäkkeitä, ja kaksi kolmasosaa on jo etäispesäkkeitä aikaan diagnoosi [3]. Huolimatta vastaa aluksi hyvin radio- ja kemoterapia, valtaosa relapsien 1 vuoden eloonjäämistodennäköisyys SCLC on vain 40%, ja 5 vuoden eloonjääminen alle 5% [4]. Kun taas NSCLC käsittely on edennyt viime vuosina, SCLC hoito on edelleen epätyydyttävä [5]. Olemme nähneet mitään merkittävää edistystä sen hoidossa viimeisten 30 vuotta sitten vakiintunutta Etoposidea yhdistettynä Sisplatiini tai Carboplatin aikana todettiin 1980-luvun puolivälissä [6]; kirurginen resektio on poikkeus ja saattaa vain sellaista vähemmistö huolellisen valikoiduilla potilailla [7]. On tietysti kiireellisesti uusia lähestymistapoja ymmärtämiseksi ja hoitamiseksi tämän erityisen keuhkosyöpä alatyyppi.

SCLC olettaa monenlaisia ​​morfologisia esiintymisiä histopatologisesti, joissa kasvainsolujen yleensä pienempiä kuin koko 3 lepää lymfosyyttien. On kuitenkin olemassa näytteitä sisältävien solujen päästä niin suuri kuin 7 lymfosyyttien, jotka osoittavat niiden morfologiset vaihtelevuus [8] sisällä kasvainkudoksessa. Tyypillisiä sytologinen ominaisuuksia hienoksi rakeisia kromatiinin puute näkyvä nucleoli ja solujen rajat, ja ilmaus neuroendocrine merkkiaineiden [8]. Vuodesta 2004 SCLC: n WHO: n luokituksen kuvataan kaksi alatyyppiä: puhdas SCLC alle 10% suuria soluja, ja yhdistettynä SCLC yli 10% ei-pienisoluinen komponentit [9]. Kasvainten suuren määrän ei-pienisoluinen komponentteja kuvataan olevan enemmän hoitoa kestävä kuin puhdas SCLC [10]. On myös väitetty, että SCLC kasvaimia hankkia kemo- ja radioresistance hoidon aikana, kehittyy yhdistettynä SCLC [11].

etäispesäkkeitä, solut täytyy muuttaa niiden fenotyyppi. Yksittäisten solujen tai pienten solujen hankkia kyky siirtää ja hyökätä läpi ympäröivän kudoksen tyvikalvon. Tämän prosessin aikana kasvainsolujen hajottamaan solu-yhteydet, menettää pohjapinta-apikaalisella polaarisuus, mukana morfologisia muutoksia paljastaen karan muoto, jonka jälkeen mikrovillusten filopodia ja microtentacles tullut lausutaan sijaan. Lisäksi proteaasit kuten Matrix (MMP) tulevat voimistunut, mikä helpottaa hajoamista soluväliaineen. Nämä prosessit tunnetaan myös epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja niitä on kuvattu eri syöpätyyppien [12] – [15]. Kuitenkin ei ole juuri mitään tietoja EMT prosesseista SCLC toistaiseksi [16]. On näyttöä siitä, että EMT on kriittinen sekä etäpesäkkeiden ja yhdessä kemo- ja radioresistance [17]. EMT on monivaiheinen prosessi, johon lausutaan solujen plastisuus ja lukuisia erillisiä geneettiset ja epigeneettiset muutokset [18]. Transkriptiotekijöiden kuten Snail /Snai1, Slug /Snai2, Zeb1, FSP ym aiheuttavat ylä- ja downregulation useiden geenien. E-kadheriinin on kuvattu keskeisenä tekijänä siirtyminen epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyypin. Zeb1 ja Snail /Snai1 sitoutuvat E-kadheriinin promoottorin ja tukahduttaa transkription soluadheesiomolekyylien [19]. Kun taas E-kadheriinin ja Zona occludens 1 tyypillisesti vaimentua aikana EMT mesenkymaaliset geenejä, kuten vimentiinista, fibronektiinin, ja MMP: t voimistunut. Epigeneettiset muutoksia, kuten DNA: n metylaatio, histonimodifikaation ja MikroRNA tiedetään olevan osallisena EMT liittyviin geenisäätelyn [15], ja siksi voi olla vastuussa muutoksia solujen fenotyyppi, jotta leviäminen ja sopeutuminen uusiin mikroympäristöjen.

tässä tutkimuksessa analysoitiin eri solualapopulaatioiden in SCLC solulinjojen, etenkin NCI-H69-solujen, erojen EMT keskeisten geenien ja toiminnalliset ominaisuudet. Vertasimme kelluva-solujen aggregaatteja (NCI-H69) ja toisissaan kiinni kasvavia variantti alapopulaatiot (NCI-H69V). NCI-H69V valittiin emosolulinjassa NCI-H69 ja on muunnelma johtuu alhainen neuroendokriini merkkiaineiden [20]. Vertaamalla alalinjoja NCI-H69 paljastaa selvästi erilainen ilme malli EMT markkereita ja DNA: n metylaatio, joka puolestaan ​​liittyy toiminnallisia seurauksia, kuten kyky hyökkäystä, muuttoliike, MMP eritystä ja aktivointi, solujen lisääntymistä, ja chemoresistance. Yhteenvetona, tämä tutkimus oletetaan, että on olemassa osa mesenkymaalisten solujen SCLC-solulinjat, jotka saattaisivat vaikuttaa

in-vivo

tilanne SCLC kasvaimia, jotka sisältävät heterogeenisen kasvainsolun alapopulaatiot enemmän tai vähemmän epiteeli- ja /tai mesenkymaaliset ominaisuudet, jotka voivat liittyä toimintavasteisiin aikana etäpesäkkeiden prosesseja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen SCLC solulinjat NCI-H69, NCI-H82 ja NCI-N592 saatiin American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA). NCI-H69 ja NCI-N592 varmistettiin LGC Standards Cell Line Authentication. NCI-H69V ystävällisesti antamat BIOSs Toolbox (Freiburg, Saksa). Lisäksi, NCI-H69 ja NCI-H69V soluja verrattiin SNP array (tuloksia ei ole esitetty), joka osoittautui saman solun alkuperää. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) kostutetussa ilmakehässä (5% CO2) 37 ° C: ssa. Jotta valita varten kiinnittynyt alapopulaatioita, kiinnittyneet solut NCI-H69, NCI-H82 ja NCI-N592 pidettiin kulttuurin, kun taas kelluva solut hävitetään useilla kohtia.

Kasvunopeuksia ja väestö kaksinkertaistui aika

kasvuvauhdin NCI-H69 ja NCI-H69V määritettiin kylvö 3 * 10

6 solua (kolmena kappaleena) osaksi kudosviljelykolveissa. Solut laskettiin päivänä 2, 4 ja 6 hemosytometrillä. Laskea väestön kahdentumisaika (PDT), kaava PDT = h * ln (2) /ln (c2 /c1) käytettiin mukaisesti ATCC ohjeita.

immunofluoresenssi vimentiinin, E-kadheriinin, Zona occludens ja Ki-67

Solut kiinnitettiin 2% PFA, läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: 4 ° C: ssa 10 min, ja pysäytettiin PBS, joka sisältää 5,0% (v /v) normaalia vuohen seerumia ja 0,3% (v /v) Triton X-100. Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin hiiren mAb Ki-67 (Dako, Hampuri, Saksa), vimentiinistä XP Rabbit mAb, E-kadheriinin kani mAb ja Zona occludens mAb (Cell Signaling Technologies, MA, USA), ja sopiva toissijainen vasta (vuohi-anti -hiiri IgG-Alexa488 ja vuohen anti-kani-lgG-Alexa467, Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Sitten lasit asennettu Prolong Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Käänteinen transkriptio-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden, minkä jälkeen DNA: ta pilkkomalla DNaasi I (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK). CDNA-synteesiä varten 1 ug kokonais-RNA: ta transkriptoitiin käyttäen iScript kit (

Bio-Rad

, Hercules, CA, USA). CDNA monistettiin käyttämällä

Taq

-polymeraasia (Qiagen, Hilden, Saksa) käyttämällä seuraavia PCR-ohjelma kaikkien alukkeita: 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 28 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sek ja 72 ° C 30 sekuntia ja viimeisen kierroksen monistaminen 72 ° C: ssa 5 min. PCR-tuotteet analysoitiin 1,0% agaroosigeelillä, visualisoitiin ja valokuvattiin UV-valossa. Kvantifiointiin, PCR nauhat analysoitiin ImageJ 1.42q. Sillä alukesekvensseissä katso taulukko 1.

valmistaminen solu-uutteiden ja western blot analyysi

Solut pestiin jääkylmällä PBS: lla ja hajotettiin käyttämällä Qproteome Nisäkkäiden Protein Prep Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) tai hajotuspuskuria, joka sisälsi 20 mM Tris /HCI, pH 8,0, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 0,5 mM PMSF proteiinin inhibiittoricocktailia (täydellinen, Roche Applied Science, Basel, Sveitsi). Yhtä suuret määrät proteiinia näytteitä denaturoitiin 95 ° C: ssa 5 minuuttia, erotettiin 10% SDS-PAGE ja siirrettiin PDVF- kalvoja. Sitten kalvot estettiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS /0,1% Tween-20, ja niitä inkuboitiin yön yli seuraavien vasta-aineiden: ZO-1 mAB, vimentiinistä XP kani mAb, E-kadheriinin kani mAb, Snail kani mAb, Slug kani mAb, TCF8 /ZEB1 Rabbit mAb, β-kateniinin kanin mAb anti-kani-IgG, GAPDH kani mAb, HRP-kytketty vasta-aine (Epithelial-mesenkymaalitransitioon (EMT) Vasta-Sampler Kit # 9782 peräisin Cell Signaling Technologies, MA, USA) ja L -Dopa (# 8786 Cell Signaling Technologies, MA, USA), Neuron enolaasin (NSE) (# 9536 Cell Signaling Technologies, MA, USA). Lopuksi, immunoreaktiivisia vyöhykkeitä visualisoitiin käyttäen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja tehostetun kemiluminesenssin (Amersham Biosciences, Freiburg, Saksa).

pyrosekvensointi

Genominen DNA uutettiin käyttäen DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja kvantitoitiin käyttäen NanoDrop 1000 Spektrofotometri (peqlab, Erlangen, Saksa). DNA oli bisulfiitti-käsiteltiin käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit (Zymo Research, CA, USA) valmistajan ohjeiden ja varastoidaan erinä -20 ° C: ssa käyttöön asti. PCR-alukkeet suunniteltiin käyttämällä pyrosekvensointi Assay Design Software (Qiagen, Hilden, Saksa) (Tab.2). Universaali tag sijoitettiin 5′-päässä sekvenssin, erityisten käänteisaluketta ja CDH1 ja vastaava yleinen biotinyloidun alukkeen, joka sisältää 5′-biotiinileiman lisättiin näitä PCR-reaktiot. 5′-päässä sekvenssin, erityisten reverse-aluketta käytetään VIM amplikonin 1 ja amplikoni 2 on biotiinileimattua. Amplikonin (ulottuu -61-18 suhteen TSS) on CDH1 mukana seitsemän CpG sivustoja. Tapauksessa vimentiinin, amplikonin oli jaettu kahteen osaan, joita erottaa 73 bp aukko. Ensimmäinen amplikoni on vimentiinista välillä nt 608-703 suhteen TSS sisälsi kaksitoista ja toisen amplikoni (ulottuu 468-537 suhteen TSS) kahdeksan CpG sivustoja, vastaavasti. Kukin 25 ui PCR-reaktio sisälsi 1,5 mM MgCI 2: ta, 0,4 mM dNTP: tä, 0,03 U /ul Hot aloittaa Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen, CA, USA), 0,16 uM eteen- ja taaksepäin-aluketta ja 1 ui bisulfiitin käsitellyn DNA. Sillä CDH1 0,16 uM alukkeena eteenpäin ja 0,03 ui pyrstö käänteisaluketta ja 0,14 uM universaali biotinyloitua aluketta käytettiin. Sykliolosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 5 min alkudenaturaatio; 50 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, vaihteleva hehkutus lämpötilassa 30 s ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s. PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 2% agaroosigeeleillä. Jokainen pyrosekvensointi reaktio saatiin 8-10 ui kutakin biotinyloitua PCR-tuotetta ja Pyromark Gold Kit mukaan valmistajan ohjeiden on PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen, Hilden, Saksa). Lyhyesti, biotinyloitua yksijuosteinen DNA immobilisoitiin streptavidiinipäällystetyille Sepharose High Performance helmiä (GE Healthcare, UK) ja erotettu denaturointi 0,2 N NaOH. Hehkutuksen jälkeen ja sekvensointialuke (0,25 uM /reaktio) biotinyloitu yksiketjuisen DNA: n, seos saatettiin sekvensointiin. Pyrograms analysoitiin käyttämällä Pyro Q-CpG ohjelmisto määrittää metyloinnin tason metyloitu ja metyloimattomien sytosiinien kussakin CpG sivusto amplikonin. Kukin pyrosekvensointi analyysi itsenäisesti suoritetaan ainakin kolme kertaa. Studentin parittomalla t-testit suoritettiin testaamaan tilastollisia eroja keskimääräisessä metylaation tason analysoitiin amplikonien. Viljellyt keuhkojen fibroblasteista eristettiin kolmesta potilaasta ei fibroottisten sairauksien toimi normaalia ohjausta. Alukeparit käytettiin PCR on lueteltu taulukossa 2.

Live-solun proteolyysin määrityksessä

roksilla Labtek 4-kuoppaisen kammion levyt päällystettiin fenolipunattomalla tyvikalvon matriisin, joka sisältää 30 ng /ml DQ-kollageeni IV (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Sen jälkeen 12 min jähmettymisen, 3 x 10

4 solut fenolipunattomalla RPMI 1% FCS maljattiin päälle pinnoitetun tyvikalvon matriisi. 48 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 2% PFA, värjättiin Hoechst ja asennettu. Hajoamistuotteet DQ-alustan (vihreä fluoresenssi) analysoitiin automaattisella mikroskoopilla (scan∧R – Olympus) käyttämällä 20x, NA 0,75 UPLSAPO tavoite Hoechstin emissio mitattiin 440-475 nm ja DQ-Kollageeni on 520-550 nm . Keskimääräinen intensiteetti DQ-alustan hajoaminen laskettiin käyttäen scan∧R Analysis Software (v. 1.2.0.6) ja normalisoitu lukumäärään solutumien.

matriksimetalloproteinaasi vasta-array

Matrix metalloproteinaasientsyymien solu-elatusaine analysoitiin ihmisen MMP Array 1 (RayBiotech, Norcross, GA, USA). Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin FCS-vapaa ja fenoli-punaista RPMI 1640: ssa yön yli. Sentrifugoinnin jälkeen solujen elatusaine levitettiin esitukittiin kalvoja, inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli ja käsitellään valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aine paneelit olivat määrällisesti ImageJ ohjelmiston v. 1.42q.

Liivate Zymografia

MMP-2 ja MMP-9 toimintaa arvioitiin gelatiinitsymografialla. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin FCS-vapaa ja fenoli-punaista RPMI 1640: ssa yön yli. Soluravintoliuoksista väkevöitiin käyttäen Amicon Ultracel 10 k saraketta. Määrittämisen jälkeen proteiini pitoisuuksia Bradfordin menetelmällä, yhtä suuret määrät proteiinia, ja 2 ui MMP-2 Zymografia ohjaus (ProteaImmun, Berliini, Saksa) suoritettiin elektroforeesi 7% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia (Merck, Darmstadt, Saksa) . Geelit pestiin 2,5% Triton X-100-liuoksella 1 tunnin ajan, sitten niitä inkuboitiin yön yli inkubointipuskuriin (0,05 M Tris /HCI, pH 7,5, 0,2 M NaCl ja 0,005 M CaCl2) 37 ° C: ssa. Geelit kiinnitettiin 12% TCA 1 tunnin ajan ja värjättiin Coomassie brilliant blue-R250 Värjäysliuos 1 tunti, jonka jälkeen värinpoisto. Sillä lastaus valvonta, näytteet ladattiin SDS-PAGE ja värjättiin Coomassie brilliant blue-R250 värjäystä.

Drug Resistance

Voit testata kemosensitiivisyys, 3 x 10

4 NCI-H69 tai NCI-H69V-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 12 tuntia ja sitten käsiteltiin 200 uM Etoposidi (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa) 48 tunnin ajan kuten aiemmin on kuvattu [21]. Jälkeenpäin solujen elinkelpoisuus testattiin propidiumjodidi (PI) (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa) ja 3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodidi (DIOC6) (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa). Soluja inkuboitiin RPMI 1640, joka sisälsi 0,5% BSA: ta, 10 nM DIOC 6 ja 2 mg /ml PI-37 ° C: ssa 20 min ja analysoitiin virtaussytometrialla FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Virtaussytometria Aineisto analysoitiin FlowJo ohjelmistoa v.7.6.3 (Puu Star Inc., San Carlos, CA, USA).

TranswellTM muuttoliike

Migration SCLC-solujen arvioitiin käyttäen 24- hyvin microchemotaxis (Costar, New York, USA), jossa 1 x 10

6 solua 100 ui RPMI 1640 ilman FCS jälkeen nälkään 12 tuntia pantiin saliin ja alemman kammio sisälsi RPMI 10% FCS . 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, solut laskettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tunkeutuneet solut insertin pohjaan kalvo hajotettiin trypsiinillä ja laskettiin hemosytometrillä. Migration Indeksi laskettiin määrä siirtynyt solujen jaettuna siirtynyt solujen käsittelemättömässä ryhmässä. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Data edustaa keskiarvoa +/- SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Invasion määrityksissä

invaasio määrityksissä QCMTM 24-Well Cell Invasion määritys (ECM 550; Chemicon International, Temecula, CA, USA) jossa on 8 uM huokoskoko polykarbonaattikalvon ja kerros ECMatrix kaltaista materiaalia käytettiin. Määritykset tehtiin mukaisesti valmistajan ohjeiden, jonka 6 x 10

5-soluja ilman ravintoa 12 tuntia, ympättiin ylempään kammioon, ja inkuboitiin 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Alempi kammio sisälsi RPMI 10% FCS. 48 h kuluttua solut ylemmässä kammiossa poistettiin käyttäen vanupuikoilla, hyökkäsi solut alareunassa insertin kalvo hajotettiin trypsiinillä ja laskettiin hemosytometrillä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen

Tilastollinen merkitys välillä valvonnan ja yksittäisten olosuhteet arvioitiin GraphPad Prism 5 Software käyttäen t-testiä. * Merkitsee P-arvo +0,01-+0,05, ** edustaa P-arvo 0,01-0,001 ja *** edustaa P-arvo alle 0,001. P-arvo on 0,05 pidettiin tilastotieto merkittävä.

Tulokset

Avain EMT markkereita vimentiinista ja E-kadheriinin ilmentyvät eri

SCLC solulinjoja kuten NCI-H69 tyypillisesti kasvavat tiiviisti pakattu kelluva aggregaatteja. Kuitenkin johdonmukainen osa (5-10%) koko havaittavissa solujen määrä kasvaa toisissaan kiinni. Sillä solulinjaa NCI-H69 kiinnittyvä alilinja toteamista nimetty NCI-H69V [20]. Immunofluoresenssivärjäyksellä poikkesivat huomattavasti verrattaessa NCI-H69 ja sen alilinja NCI-H69V keskeisille merkkiaineiden epiteeli- ja mesenkymaalisten solujen fenotyyppien E-kadheriinin ja vimentiinista: NCI-H69 oli positiivinen E-kadheriinin (kuva 1a) ja Zona occludens (kuva 1b ), mutta ei osoittanut mitään vimentiinista lauseke (kuva 1c), kun taas tarttuu NCI-H69V oli negatiivinen E-kadheriinin (kuvio 1 d), mutta vahvasti positiivinen vimentiinista (kuva 1f). Valtaosa NCI-H69V solut olivat negatiivisia Zona occludens (kuva 1e); mutta jotkut yksittäiset solut osoittivat vähäistä jäljellä Zona occludens ilmaisu (kuvio 1e, tähdellä). Expression of E-kadheriinin ja vimentiinin, kuten tunnusmerkki geenit EMT, erotetaan eri alapopulaatioita sisällä solulinjan, osoittaa suurin osa epiteelin kaltaisia ​​soluja ja vähemmän toisissaan kiinni kasvavia soluja, joiden mesenkymaalisten kaltainen fenotyyppi.

Suspensiosoluja (NCI-H69) ovat vahvasti positiivisia E-kadheriinin (punainen) (a) ja Zona occludens (punainen) (b), kun taas tarttuu NCI-H69V solut ovat negatiivisia E-kadheriinin (d). Valtaosa NCI-H69V solut olivat negatiivisia Zona occludens, mutta jotkut yksittäiset solut osoittivat vähäistä Zona occludens lauseke (tähti, e). Suspensiosoluja (NCI-H69) ovat negatiivisia (c), kun taas tarttuu NCI-H69V ovat positiivisia (f) vimentiinista (punainen). Ki-67 oli co-värjätty (vihreä). Solut kuvantaa Zeiss Axioplan mikroskoopilla ja AxioCam Digital ja analysoitiin ZeissAxioVision ohjelmisto. Palkki edustaa 20 um.

Eri solujen morfologia SCLC solulinjoissa

tutkineet solujen morfologia alaryhmien (kelluva vs. kiinnittynyt) in SCLC solulinjoissa. Tätä tarkoitusta varten kiinnittynyt alaryhmästä lisättiin valinnan, kunnes solut kasvoivat täysin kiinnittynyt yksikerroksinen (kuviot 2b, e, g). Solulinjat osoittivat eroja spontaani sitoutuminen: NCI-N592 kiinnitetty useammin ja nopeammin kuin NCI-H69 (NCI-H69: kuviot 2a, b /NCI-N592: Kuviot 2d, e). Kiinnittyvä alalinja on perustettu NCI-H69, nimittäin NCI-H69V (kuva 2c) [20]. Tarttuvat solulinja valitsimme itse paljasti samankaltainen morfologia (kuviot 2b, c). Kasvuluvut ja kaksinkertaistaa aikoina NCI-H69 ja NCI-H69V olivat verrattavissa 28 h (± 6,02) ja NCI-H69 ja 30 h (± 7,34) ja NCI-H69V (Kuva S1).

NCI-H69 SCLC solulinjoja kasvavat kelluva klustereissa (a) pienellä alapopulaatio toisissaan kiinni kasvavia soluja, jotka valittiin luovuttamalla kelluvat solut usean kohtia (b) muistuttaa perustettu alilinja NCI-H69V (c). NCI-N592 ja NCI-H82 tyypilliseen kelluva klustereita (d, f) ja valittujen kiinnittyneitä soluja (e, g). Adherentteja alapopulaatioiden paljastavat karan muoto, filopodia ja microtentacles. Solut kuvantaa Zeiss Axioplan mikroskoopilla ja AxioCam Digital ja analysoitiin Zeiss LSM Image Browser. Palkki edustaa 200 pm.

On vaikuttavia morfologisia eroja kiinnittyneet ja kelluvat solut kaikissa tutkituissa SCLC solulinjat: taas solujen kelluvien klustereita näyttävät pieniltä ja pyöreä, pieni ydinten kiinnittyneet solut ovat suurempia, levittää, ja on suuri solulimassa-to-ydin suhde. Erityisesti NCI-H69V solut ovat kara muoto pitkillä valejalka ja kuidut, hieno rakeinen chromatin ja puute merkittävä nucleoli. Lisäksi tarttuvat solut eivät kasva kautta tiukka solu-solu kontakteja, kunnes ne ovat erittäin konfluentteja.

Expression of EMT liittyviä geenejä ja DNA: n metylaation muutokset vimentiinista ja E-kadheriinin aikana EMT

mRNA: n ilmentymisen tyypillisiä EMT-geenin tuotteita verrattiin eri SCLC-solulinjat ja valitaan kiinnittynyt alalinjoja RT-PCR: llä (kuva 3a). Epiteelin markkerigeeni E-kadheriinin oli hyvin ilmaistu kelluva NCI-H69. Sen sijaan E-kadheriinin ilmentyminen oli alhainen kiinnittyvä NCI-H69V. Vimentiinista puuttui kelluvan NCI-H69-soluissa, kun taas se oli vahvasti ilmaistu toisissaan kiinni kasvavia NCI-H69adh ja NCI-H69V (kuva 3a). Nämä erot mRNA ilmaisun havaittiin myös NCI-H82 ja NCI-N592 alalinjoja, jossa kiinnittyneet solut osoittavat enemmän mesenkymaalisten-kuviona. Kuitenkin muuntaminen ei ollut yhtä selvä kuin NCI-H69 /NCI-H69V (kuva 3a).

EMT markkereita ja transkriptiotekijöitä ilmentyvät eri tavalla sisällä SCLC linjat (NCI-H69, NCI-H82, ja NCI-N592). NCI-H69-soluissa ei ilmaissut mesenkymaalisten markkereita tai induktorit suspensioviljelmissä, ilmenevään mRNA- tasolla RT-PCR (a). Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2, ja FSP ilmaistaan ​​kiinnittyneet alalinja (NCI-H69V), mutta E-kadheriinin ilmentyy vain suspension soluissa. Mesenkymaaliset markkereita fibronektiini ja vimentiinista ovat yläreguloituja kiinnittyvä alilinjat (a). MRNA: n ilmentyminen NCI-H82 ja NCI-N592 verrattuna sen kiinnittynyt alakulttuureineen yleensä paljasti samanlaisen suuntaus kohti mesenkymaalisten fenotyypin kiinnittyneet solut (a). Western blot-analyysi näyttää vähentynyt proteiinipitoisuus tasoilla epiteelin merkkiaineiden E-kadheriinin ja Zona occludens 1, ja ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden vimentiinista ja ZEB1 NCI-H69V. EMT induktorit Snail /Snai1, Slug /Snai2 ilmaistaan ​​NCI-H69V (b). Ilmaisu muutos tarttuu NCI-N592 kohti mesenkymaalisten kaltainen fenotyyppi on merkittävämpi proteiinitasolla kuin mRNA-tasolla (b). Neuroendokriinivasteen markkereita NSE ja L-dopan ilmentyvät emosolulinjassa NCI-H69, mutta eivät ole havaittavissa kiinnittyvä alilinja NCI-H69V (c). DNA metyloituvuutta (d) EMT tunnusmerkki geeni vimentiinista osoittaa vahvaa metylaatio NCI-H69 ja merkittävä hypometylaatio NCI-H69V, E-kadheriinin metylaatio on huomattavasti korkeampi H69V. Kontrollina viljellyt keuhkojen fibroblasteista eristettiin kolmesta potilaiden vimentiinista metylaatiotasoilla ja kahdelta potilaalta E-kadheriinin metylaatiotasoilla ilman fibroottisten sairauksien toimi normaalia ohjausta. Palkki esitetään keskimääräiset kolmen itsenäisen mittauksen. Erot keskiarvo metylaatio tasot analysoitiin amplikonin testattiin käyttäen Studentin pariton t-testi (* p-arvo 0,01-0,05, ** p-arvo 0,01-0,001 ja *** p-arvo pienempi kuin 0,001).

Yhteenvetona todettakoon, että EMT liittyvien transkriptiotekijöiden Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2 ja FSP ilmaistiin vaihtelevasti eri solulinjoissa (kuvio 3a). Totesimme, vahvin erot NCI-H69V verrattuna NCI-H69, ja siksi keskityttiin ne solut seuraavissa kokeissa.

Tämä muuntaminen epiteelin NCI-H69-soluja osaksi mesenkymaaliset fenotyypin (NCI-H69V) oli osoitti vieläkin ilmeisesti proteiinitasolla (kuva 3b): havaitsimme merkittävää downregulation epiteelin merkkiaineiden E-kadheriinin ja Zona occludens 1 NCI-H69V mukana säätelyä EMT induktoreiden ja efektoreja kuten ZEB1, Snail /Snai1, Slug /Snai2 ja vimentiinista. Vaikka mRNA: n ekspressiota NCI-N592 vain taipumus kohti mesenkymaaliset fenotyypin (kuvio 3a), proteiinin ilmentyminen selvästi paljasti mesenkymaaliset kuvio (kuvio 3b).

Mielenkiintoista on, että neuroendocrine markkereita NSE ja L-dopan ilmennettiin emosolulinjassa NCI-H69, mutta eivät olleet havaittavissa sen kiinnittynyt alalinja (kuvio 3c).

DNA metyloinnin vimentiinista ja E-kadheriinin

sen arvioimiseksi, onko epigeneettisellä sääntelyn DNA promoottorin metylaation saattaa olla merkitystä ekspressiotasoja, haimme kvantitatiivinen pyrosekvensointi jotta promoottorialueiden vimentiinista ja E-kadheriinin (kuvio 3d). Vaikka vimentiinista promoottori osoitti DNA metylaatiotasoilla 35% NCI-H69-solujen DNA metylaatiotasoilla NCI-H69V solut olivat merkittävästi alhaisemmat 1,3% (p 0,0001). Tämä johtaa aktiiviseen geenin transkription, joka kuuluu mukaisesti havaittu lisääntyminen vimentiinista mRNA- /proteiinin taso (kuva 1 ja 2). Normaali keuhko fibroblastit (n = 3) osoitti vimentiinista metylaatiotasoilla 1,1%. Kääntäen, DNA: n metylaatio tasoa E-kadheriinin /CDH1 oli 31% H69-soluissa ja nousi 40% NCI-H69V solujen (p = 0,0032). Normaali keuhko fibroblastit (n = 2) osoitti 17% ja 8% metylaation, vastaavasti. Tämä käänteinen korrelaatio ilmaisu ja DNA: n metylaatio saattaa ehdottaa, että DNA: n metylaatio edistää vimentiinista ja E-kadheriinin mRNA sääntelyn ja proteiinin ilmentymisen aikana EMT prosessin SCLC solulinjoissa.

Korkeampi maahanmuutto- ja invasiivisia mahdollisia tarttuneiden NCI-H69

Sen tutkimiseksi, nämä dramaattiset fenotyyppiset erot ovat toiminnallisia seurauksia, teimme siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Kiinnittyvä NCI-H69V solut osoittivat merkitsevästi korkeampi muuttoliikkeen ja invaasion soluväliaineen proteiinien kohti 10% FCS: ää sisältävää väliainetta kuin NCI-H69-soluja (kuvio 4). NCI-H69 osoitti hyvin vähän muuttopotentiaalia ja lähes mitään hyökkäystä. Siirtymäarvo NCI-H69 suspension soluissa oli 15 solua muuttoliikkeen kammio (± 6 /n = 3), kun taas NCI-H69V nousi 11-kertaiseksi 196 solua muuttoliikkeen kammio (± 81 /n = 3) (p = 0,0001 ). Invaasio taso H69 oli 7 solua muuttoliikkeen kammio (± 3 /n = 3), kun taas NCI-H69V oli 16-kertainen 118 solua muuttoliikkeen kammio (± 35 /n = 3) (p = 0,0001).

toisissaan kiinni kasvavia NCI-H69-soluissa osoittaa huomattavasti suuremmat muuttoliike (a) ja hyökkäys (b) kohti 10% FCS sisältävässä väliaineessa verrattuna suspension solulinja (*** p = 0,0001). Migration Index määriteltiin kuinka monen solujen jaettuna siirtynyt solujen hoitamattomassa ryhmässä (ei FCS) 48 tunnin kuluttua. Invasion Index määriteltiin määrä laskettiin solujen viidellä mielestä aloilla jaettuna useissa siirtynyt solujen hoitamattomassa ryhmässä (ei FCS) 48 tunnin kuluttua.

Live solukuvauksessa solunulkoisen proteolyyttinen aktiivisuus osoittaa korkeampi proteolyyttinen potentiaali kiinnittyneet alalinjoja

syöpäsoluinvaasiota liittyy hajoaminen soluväliaineen (ECM). Koska suurempi hyökkäystä kiinnittyneet-alalinja, analysoimme sen mahdollisuudet kollageenin IV hajoamista. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin Matrigelillä sisältävien DQ-kollageeni IV, joka tarttuu NCI-H69V solut paljasti merkittävästi suurempi Perisellulaarinen kollageenin hajoamista kuin NCI-H69-soluissa mitattuna vihreän fluoresenssin. Kvantifiointi proteolyyttisesti aktiivisten solujen paljasti, että 77%: n NCI-H69V solut olivat positiivisia, kun taas vain 8% NCI-H69 suspension solut olivat positiivisia (kuva 5).

Live-solun proteolyysin määritys: suspension NCI -H69 ja kiinnittynyt NCI-H69V soluja inkuboitiin 48 tuntia matrigeeliä, joka sisälsi 30 ng /ul DQ-kollageeni IV. (A) hajoaminen kollageenin määräytyy vihreän fluoresenssin, joka ympäröi positiivisia soluja. Palkki edustaa 30 um.