Krooninen sairaus

tiivistelmä

kinaasien loppupään modulaattoreita sekä -efektiboksejamme useiden solun signalointikaskadien ja avainasemassa kehittämisessä neoplastisen taudin. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan SRC, LYN ja CKB proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen, sekä niiden promoottori metylaatio, mahasyövän. Löysimme kohonnut ilmentyminen SRC ja LYN kinaasi-mRNA ja proteiini mutta alentuneesta CKB kinaasi, muutoksia, joilla voi olla rooli invasiivisuus ja etäpesäkkeiden mahalaukun kasvaimet. Expression kolmesta tutkittu kinaaseja liittyi myös MYC onkogeenin ilmentymisen, mahdollisesti biomarkkereiden mahasyövän. Ymmärtämään mekanismeja, jotka säätelevät näiden geenien ilmentymistä, arvioimme DNA-promoottorin metylaation kolmen kinaasien. Huomasimme, että alennetaan

SRC

ja

LYN

metylaatio ja lisääntynyt

CKB

metylaatio liittyi mahasyöpä. Pienentynyt

SRC

ja

LYN

metylaatio liittyi kohonneeseen mRNA ja proteiinin ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että DNA: n metylaation on mukana ekspressiota säätelevät näiden kinaasien. Toisaalta, vähentää

CKB

metylaatio havaittiin näytteissä, joilla on alentunut mRNA ja proteiinin ilmentyminen, mikä viittaa siihen, CKB ilmentyminen havaittiin vain osittain säätelee DNA: n metylaation. Lisäksi huomasimme, että muutoksia DNA metylaatio kolmesta tutkittu kinaasit liittyy myös mahasyövän puhkeamista, kehittynyt mahasyöpä, syvempi kasvain invaasio ja läsnäolo etäpesäkkeitä. Siksi SRC, LYN ja CKB ilmaisun tai DNA: n metylaatio saattaa olla hyötyä merkkiaineita ennustettaessa syövän etenemiseen ja kohdentamalla syövän vastaisessa strategioita.

Citation: Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, montenegro RC, et ai. (2015) vapautettiin Expression of SRC, LYN ja CKB kinaasien DNA Metylointi ja sen mahdollisen roolin mahasyövän invasiivisuus ja Metastasis. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492

Editor: Jose G. Trevino, University of Florida, Yhdysvallat |

vastaanotettu: toukokuu 27, 2015; Hyväksytty: 25 syyskuu 2015; Julkaistu: 13 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; avustukset # 471072 /2012-5 ja 402283 /2013-9; apurahan MCS ja RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; myöntää #ICAAF 123/2014 ja RRB) ja Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; avustus # 2009 /07145-9; apurahan MFL) kuin apurahat ja apurahoja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä tyyppi ja toiseksi korkein syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1]. Hoito GC vaiheissa edelleen vaikea, ja ennuste on edelleen huono, osittain seurauksena paikallisen uusiutumisen, kasvaimen invaasio ja /tai etäpesäkkeitä. Yleinen suhteellinen 5 vuoden pysyvyys on tällä hetkellä alle 20% [2]. Parempi ymmärrys biologiasta etenemisen tämä kasvain on tärkeää vähentää kuolleisuutta kanssa kehittämään uusia potilaan hoitoon ja hoitostrategioita.

Phosphotransferases, joka tunnetaan myös nimellä kinaasien, ovat loppupään modulaattoreita sekä -efektiboksejamme useiden solusignaloinnis- kaskadeja ja avainasemassa kehitettäessä neoplastisen taudin [3]. Tähän mennessä useat proteiinikinaasi-vuorovaikutuksessa lääkkeitä on rekisteröity kliinisissä tutkimuksissa [4]. Olemme aikaisemmin suoritettu seulonta tunnistaa kinaasiproteiinien ilmaistuna GC Capture Yhdiste massaspekrometria [5, 6] (S1 File), ja 22 kinaasiproteiinien, kuten SRC, LYN ja CKB, havaittiin (S1 taulukko). Nämä kolme kinaasit valittiin lisätutkimuksia (S1 Kuva).

SRC oli ensimmäinen esikasvaintekijän löydetty, ja sillä on keskeinen rooli solun signaalitransduktioreitteihin. Poikkeava SRC aktiivisuus havaitaan useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien GC [7-9], ja se voi olla tärkeä aikana kasvaimen kehittymisen ja etenemisen [10, 11]. Mitogeenista funktio SRC on, ainakin osittain, välittyy induktion MYC, solusykliä säädin ja transkriptiotekijä [12, 13]. Ryhmämme aikaisemmin kuvattu MYC säätelyyn ylöspäin ihmisen GC ja N-metyyli-nitrosourea saaneilla kädellisten [14-19]. Koska aktivointi SRC sekä muiden kinaasien, on dalmatialaistäpläisiä jotka riippuvat solutyypistä ja yhteydessä [20], se on silti tärkeää ymmärtää mahdolliset suhdetta kinaasien ja MYC ilmaisun mahasyövän ja molekyylimekanismin mukana niiden sääntelyä.

LYN on toinen jäsen SRC kinaasiperhe, ja

LYN

geeni sijaitsee kromosomissa 8q13. Ryhmämme aiemmin raportoitu läsnäolo voitot kromosomin 8 (johon

MYC

geeni sijaitsee myös) GC tapauksissa Pohjois Brasiliasta [16, 21-23], ja kaikissa GC solulinjoissa perustetaan neoplasioihin vuonna tämä väestö [24, 25]. Siksi tämä kromosomi voi sisältää tärkeitä geenien mahasyövän. Tietääksemme ei ole aikaisempaa tutkimusta on tutkinut roolin LYN ja sen sääntely GC. Kuitenkin LYN yli-ilmentyminen on raportoitu useissa syövissä [26-32]. Lisäksi sääntely

LYN

DNA metylaatio osoitettiin sekä peräsuolen syövän ja Ewingin sarkooma [33, 34], ja

LYN

metylaatio on havaittu joillakin hematopoieettisten ja ei-hematopoieettista solulinjat [35]. DNA: n metylaatio on molekyylejä muunnetaan DNA, joka on tiiviisti liittyy geenien toiminnan ja solutyyppispesifistä geenien toiminnan [36]. Lisäksi DNA: n metylaatio saattaa olla vankka biomarkkeri, koska se on huomattavasti stabiilimpi kuin RNA: n tai proteiinin ja on siksi lupaava kohde uusien lähestymistapojen diagnoosi ja ennuste syöpien [36].

CKB on toinen kahdesta sytosolin isoformia kreatiinikinaasin ja voivat osallistua aineenvaihduntaan joihin Glykolyysivaiheen ei-lihassoluissa [37]. Toisin kuin normaalit solut, jotka synnyttävät ensisijaisesti energian kautta oksidatiivinen fosforylaatio, useimmat syöpäsolujen mieluummin aerobinen Glykolyysivaiheen, joka tunnetaan Warburg vaikutus [38]. Mielenkiintoista, MYC onkogeenin näyttää aktivoida useita glukoositransporttereita ja glykolyyttiset entsyymit, mikä edesauttaa Warburg vaikutus [39]. Aikaisemmat proteomic tutkimuksessa kävi ilmi, että useat proteiinit, jotka osallistuvat energian tuotantoprosesseissa vapautui vuonna GC näytteiden ja vahvisti Warburg vaikutus tässä neoplasia [40]. Rooli CKB GC edelleen huonosti ymmärretty: jotkut transcriptomic tutkimuksissa raportoitu säätelyä

CKB

GC näytteissä [41, 42], kun taas toinen osoitti

CKB

downregulation [43]. Lisäksi, kuten

LYN

geeni,

CKB

metylaatio on aiemmin kuvattu hematologinen ja kiinteän syövän solulinjat, mukaan lukien GC-solulinjat [44]. Metylaatio

CKB

näyttää liittyvän sen alentuneen tason ilmentymisen; kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan vielä ymmärtää sääntelyn

CKB

mukaan epigenetic muutoksin.

Siksi meidän ensimmäinen pyrittiin arvioimaan mRNA ja proteiini ilmentymä SRC, LYN ja CKB isossa joukko GC näytteitä. Sitten me arvioitava, ovatko kyseiset geenit voidaan säädellä DNA-metylaation mahasyövän. Lisäksi olemme tutkineet Mahdollinen yhteys kinaasin ilmentymiseen tai metylaation ja kliinisten muuttujien sekä MYC ilmaisun ja metylointi.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Kinase ilmaisun ja metylaatiovyöhykkeiden arvioitiin 138 paria GC näytteitä ja niitä vastaavat ei-neoplastisia mahalaukun kudosnäytteitä saatiin potilailta, joille tehtiin gastrektomia Pohjois Brasiliassa. Kaikilla potilailla oli negatiivinen historiaa altistumisen joko kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta, ja ei ollut yhteistyössä esiintyminen muiden diagnosoitu syöpiä. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea João de Barros Barreto yliopistollisen sairaalan (Protocol # 316737). Kirjallinen suostumus hyväksynnällä eettisen komitean saatiin kaikille potilaille ennen näytteen keräämistä.

Osa kunkin leikellään kasvaimen näyte oli formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE). Jaksot FFPE kudoksessa värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla histologista arviointia tai käytetään immunohistokemia (IHC) analyysi. Muihin osiin kunkin kasvaimen ja pariksi ei-neoplastisen kudosnäytteet olivat snap-jäädytetty nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes proteiinia ja nukleiinihapon puhdistus.

Kaikki näytteet luokitellaan Laurénilta [45 ], ja kasvaimia järjestetään mukaan TNM pysähdyspaikan kriteerit [46]. Läsnäolo

Helicobacter pylori

, I-luokan karsinogeeniksi, maha- näytteissä havaittiin nopea ureaasia testi, ja sen virulenssitekijä sytotoksisuus liittyvät A-geenin (CagA geeni) oli havaita PCR: llä käyttämällä DNA puhdistettiin samanaikaisesti proteiineja ja mRNA, kuten aiemmin suorittaa ryhmämme [47]. Epstein-Barrin virus (EBV) havaittiin RNA in situ -hybridisaatio [47].

49 Näiden parien neoplastisten ja ei-neoplastisia näytteitä, arvioimme MYC immunoreaktiivisuus, mRNA ilmaisun ja metylaatiostatuksen tiedot aikaisemmin julkaissut ryhmämme [18].

Protein, mRNA: n ja DNA: n puhdistus

Yhteensä proteiinin, mRNA: n, ja DNA: ta samanaikaisesti eristettiin mahalaukun kudosnäytteistä käyttämällä AllPrep DNA /RNA /proteiini-Kit ( Qiagen, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiini Pelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 50 mM DTT: tä, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) ja 0,5% kutakin fosfataasinestäjällä Cocktail 1 ja 2 (Sigma -Aldrich, USA), kuten aiemmin on suorittaa ryhmämme [48]. Proteiinin pitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä (Sigma-Aldrich, USA). RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (Kisker, Saksa) ja 1% agaroosigeeleillä, vastaavasti. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Protein immunoreaktiivisuus analyysi

Kasvaimen kudosleikkeiden (3 tai 4 mm: n paksuinen), poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia. Sen jälkeen kun lämmön epitooppisup- haku, kudoksen leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita SRC (laimennus 1: 400; klooni 28, Life Technologies, USA), LYN (laimennus 1: 400; klooni C13F9, Life Technologies, USA) tai CKB (laimennus 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Universaali peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) käytettiin havaitsemiseen. Käytimme 3,30-diamino-bentsidiinin /H

2O

2 (DakoCytomation, Tanska) Kromogeenin ja hematoksyliinillä kuin vastavärinä. Proteiini immunoreaktiivisuus-positiivinen näyte määriteltiin sellainen, jossa 10% tai enemmän neoplastisia soluja, jotka olivat positiivisia proteiinia.

Proteiinin ekspressiota analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu ryhmämme [49]. Alennettu proteiinia (25 ug) kustakin näytteestä erotettiin 12,5% homogeeninen SDS-PAGE: lla ja elektro-blotattiin PVDF-kalvolle (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membraani blokattiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween 20 ja 5% vähärasvaista maitoa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vastaavien primaaristen vasta-aineiden: anti-SRC (laimennus 1: 1000, klooni 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (laimennus 1: 1000, klooni C13F9, Life Technologies, USA), anti-CKB (laimennus 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), ja anti-ACTB (laimennus 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Perusteellisen pesemisen jälkeen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin käyttäen western blotting Luminol reagenssia, ja kuvat hankittiin käyttämällä ImageQuant 350 digitaalinen kuva-järjestelmä (GE Healthcare, Ruotsi). ACTB käytettiin lastaus vertailukontrollina.

mRNA: n ilmentymisen analyysi

Ensimmäinen, RNA käänteistranskriptoituneet käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit mukaan valmistajan protokollan (Life Technologies, USA) . Täydentävä DNA monistettiin sitten reaaliaikaisella käänteistranskriptio kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) käyttäen Taqman ostetaan määritykset-on-demand Tuotteet Gene Expression (Life Technologies, USA) ja 7500 Fast Real-Time PCR väline (Life Technologies , USA).

GAPDH

geeni valittiin sisäisenä kontrollina RNA panos ja käänteistranskriptiotuotteiden tehokkuutta. Kaikki RT-qPCRs tehtiin kolmena kappaleena sekä kohdegeeneissä (

SRC

: Hs01082246_m1;

LYN

: Hs00176719_m1;

CKB

: Hs00176484_m1) ja sisäisen valvonnan (

GAPDH

: NM_002046.3).

suhteelliseksi kvantitoimiseksi geeniekspression laskettiin Livak ja Schmittgen [50]. Vastaava kontrollinäyte nimettiin kalibraattori kunkin kasvaimen.

DNA metylointianalyysi

mety- ja taajuus kinaasin geenien arvioitiin metylaatiospesifinen PCR (MSP) [51]. EZ DNA Metylointi-Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) käytettiin muuttaa gDNA mukaan vetysulfiittikäsittelyä, muuntaa metyloitumattomat sytosiinit osaksi urasiileja ja jättää metyloituja sytosiineja ennallaan. Spesifisiä alukkeita geenin promoottorit on kuvattu taulukossa 1.

PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 0,1 umol /l dNTP 2 umol /l MgCl

2, 0,5 umol alukkeita, 1,25 U Taq DNA-polymeraasia ja 100 ng bisulfiitti-modifioitua DNA: ta. Alkuvaiheen denaturaatio 5 minuutin ajan 94 ° C: ssa, 40 sykliä 94 ° C: ssa 45 s, hehkutus lämpötila (taulukko 1) 45 s, ja 72 ° C: ssa 30 s tehtiin, minkä jälkeen suoritettiin lopullinen pidennys 5 min 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet suoraan ladattiin 3% agaroosigeeleillä ja elektroforeesi. Geeli värjättiin SYBR

® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) ja sitä näkyviksi UV valaistus. Positiivisena kontrollina kaikille MSP reaktioissa gDNA näyte oli täysin metyloitu käyttäen CpG (SSSI, New England Biolabs, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi alukkeet havaitsemiseksi villityypin sekvenssin, jolla valvotaan täydellisen konversion DNA saadaan bisulfiittireaktion.

Näytteet ositettu seuraavasti: 1) näyte määriteltiin hypometyloidut kun positiivinen vahvistus tuote havaittiin ainoastaan ​​PCR spesifisiä alukkeita metyloimaton sekvenssejä; 2) näyte määriteltiin hypermetyloitunut kun positiivinen vahvistus havaittiin vain PCR: spesifisiä alukkeita metyloitu sekvenssejä; 3) näyte määriteltiin osittain metyloidut kun positiivinen vahvistus havaittiin PCR kahden alukkeen sarjaa.

Pohjustusaineilla spesifisyys ja MSP tulokset vahvistettiin käyttäen bisulfiitin sekvensointia PCR (BSP) lähestymistapa [52] . BSP käytettiin myös arvioimaan prosenttiosuus metylaation. Alukkeet ja anneling lämpötilat BSP on kuvattu taulukossa 1. Sen jälkeen monistuksen jälkeen fragmentit puhdistettiin käyttämällä NucleoSpin Gel ja PCR Clean-up Kit (Macherey- Nagel, Saksa), ligoitiin pGEM T-easy Vector (Promega, Saksa) ja kloonattiin toimivaltaisten

E

.

coli

JM109-soluja. Inkuboinnin jälkeen ajan, valkoiset pesäkkeet valittiin PCR M13 eteenpäin (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ’) ja M13-reverse (5′-caggaaacagctatgac-3’) alukkeina [53]. Sen jälkeen, kun alkudenaturaation 3 min 94 ° C: ssa, PCR-monistus koostui 35 syklistä 94 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 90 s tehtiin, minkä jälkeen lopullinen laajennus 5 min 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet visualisoitiin agaroosigeelissä. Kuusi kloonit valittiin puhdistukseen ja sekvensoitiin käytettäessä ABI310 automaattisen sekvensserin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kaikki sekvenssit kohdakkain BioEdit v7.0.5 [54], ja metylointi analyysit tehtiin kanssa BiQ Analyzer ohjelmisto [55]. Prosenttiosuus metylaation kunkin näytteen laskettiin jakamalla määrä metyloitu CpG: t, jonka kokonaismäärä CpG: t sekvensoitiin (CpG: t kaikki kuusi kloonia).

Tilastolliset analyysit

Tiedot esitetään taajuuden, mediaani ja kvartiiliväli (IQR). Shapiron-Wilk testiä käytetään arvioimaan jakautumista iän, mRNA, proteiini ilmaisun ja prosenttiosuus metylaation datan ja määrittää sopivan myöhempien testi tilastollisessa vertailussa. Mann-Whitneyn testiä käytettiin tutkimaan mahdollisia assosiaatioita kinaasi-mRNA: n tai proteiinin ilmentymisen ja luokan muuttujia, kuten immunoreaktiivisuus, metylaatio ja kliinis. Mann-Whitneyn testiä käytettiin tutkimaan mahdollisia assosiaatioita prosenttiosuus metylaation ja immunoreaktiivisuus ja kliinis. Wilcoxonin testiä käytettiin vertaamaan prosenttiosuus metylaation parien välillä neoplastisten ja ei-neoplastisten näytteitä. Yhdistyksen välillä kategorisen muuttujien analysoitiin käyttämällä Chi-squared (χ

2) testi. Spearmanin korrelaatio testiä käytettiin arvioimaan mahdollisia korrelaatiota mRNA ja proteiinin ilmentyminen sekä promoottori metylointi. P-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Bonferroni säätö p-arvo sovellettiin kun monivertailuja tehtiin, alfa taso on jaettu useissa vertailuissa.

Tulokset

-kinaasin ilmentymistä mahalaukun kasvaimet

Non-epätyypillinen mahalaukun soluissa eivät esittäneet SRC tai LYN immunoreaktiivisuus (kuvio 1A ja 1C). Kuitenkin SRC immunoreaktiivisuus havaittiin dysplastic soluissa. Solukalvon ja sytoplasman immunoreaktiivisuus SRC ja LYN havaittiin neoplastisten solujen (kuvio 1B ja 1D), ja LYN esitti myös nukleii- immunoreaktiivisuus. CKB immunoreaktiivisuus havaittiin sytoplasmassa tai solukalvossa ei-neoplastisten mahalaukun soluissa (kuvio 1 E). Sen sijaan, GC solut eivät esittäneet CKB immunoreaktiivisuus (kuvio 1 F).

) mahalaukun limakalvon ilman SRC immunoreaktiivisuus; B) diffuusi-tyyppinen mahasyöpä esittelevän solun ja sytoplasman immunoreaktiivisuus SRC; C) ei-neoplastisia mahalaukun kudoksesta ilman LYN immunoreaktiivisuus; D) suoliston-tyyppinen mahasyöpä esittämällä LYN immunoreaktiivisuus; E) ei-neoplastisia mahalaukun limakalvon osoittaa heikkoa sytoplasmista CKB värjäytymistä rauhas soluissa; F) diffuusi-tyypin mahasyövän soluja ilman CKB immunoreaktiivisuus.

SRC, LYN ja CKB immunoreaktiivisuus havaittiin 72 (52,2%), 66 (47,8%) ja 0 (0%) kasvaimen näytteet. SRC ja LYN immunoreaktiivisuus liittyi korkeampi mRNA ja proteiini tasoilla GC näytteissä (p 0,001, kaikkien vertailujen, Mann-Whitney testi; kuvio 2A, 2C, 2E ja 2G). Proteiini- ja mRNA-tasojen SRC lisättiin vähintään 1,5-kertainen (vähintään 50%: n lisäys ilmentymisessä) 67 (48,6%) ja 80 (58%), vastaavasti, GC näytteet suhteessa niiden täsmäsi ei-neoplastisia mahalaukun näytteet (kuvio 2B, 2D ja 2K). Lisäksi proteiini ja mRNA tasot LYN nostettiin vähintään 1,5-kertaisesti 36 (26,1%) ja 72 (52,2%) GC näytteistä, vastaavasti (kuvio 2F, 2 H ja 2K). Kääntäen, downregulation CKB proteiinia ja mRNA (vähintään 50%: n lasku ilmaisun) havaittiin 104 (75,4%) ja 49 (35,5%) GC näytteistä, vastaavasti (kuvio 2 I, 2J ja 2K). Vahva ja suora korrelaatiota ei havaittu mRNA ja proteiini ilmaisun SRC (p 0,001, ρ = 0,856, Spearmanin korrelaatio testi), LYN (p 0,001, ρ = 0,762) ja CKB (p 0,001, ρ = 0,819).

A) Association välillä SRC immunoreaktiivisuus ja sen proteiinin ilmentymiseen; B) SRC-proteiinin ilmentymisen; C) välistä assosiaatiota SRC immunoreaktiivisuus ja sen mRNA: n ilmentymisen; D)

SRC

mRNA ilmaisun. E) välistä assosiaatiota LYN immunoreaktiivisuus ja sen proteiinin ilmentymiseen; F) LYN proteiinin ilmentymisen; G) välistä assosiaatiota LYN immunoreaktiivisuus ja sen mRNA: n ilmentymisen; H)

LYN

mRNA ilmaisu; I) CKB proteiinin ilmentymisen; J)

CKB

mRNA ilmaisu; K) edustava kuva Western blot, jokaisessa TNM kunkin näytteen on näyttää. Proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen määritettiin Western-blot ja RT-qPCR analyysi, vastaavasti. Kaikissa kuvaajat, ilmaisu mahalaukun kasvaimet normalisoitiin sovitettu ei-neoplastisia mahalaukun kudoksesta. * Merkittävä ero ryhmien välillä Mann-Whitney (p 0,05). IHC +: tapaukset esitetään proteiini immunoreaktiivisuus; IHC-: tapaukset ilman proteiini immunoreaktiivisuus; NM: normaali limakalvo näyte.

immunoreaktiivisuus SRC liittyi immunoreaktiivisuus LYN (p 0,001, χ

2 testi), jossa on 52 (37,7%) GC näytteiden esittelee immunoreaktiivisuus molemmille proteiineille. Lisäksi suora korrelaatiota ei havaittu SRC ja LYN proteiinia (p 0,001, ρ = 0,556) ja mRNA (p 0,001, ρ = 0,779) lauseke. Tasot CKB proteiinin ja mRNA ilmentyminen korreloi käänteisesti SRC (p 0,001, ρ = -0,734, p 0,001, ρ = -0,806, vastaavasti) ja LYN (p 0,001, ρ = -0,643, p 0,001, ρ = -0,703, vastaavasti).

taulukossa 2 esitetään tulokset SRC, LYN ja CKB ilmaisun ja kliinis ominaisuudet. Kasvaimet sairastavien potilaiden viiveellä ilmaantuvia GC esitteli huomattavasti korkeampi SRC ja LYN proteiinia (IHC ja western blotting) ja mRNA (RT-qPCR) ilmentymisen, sekä vähennetään CKB proteiinin ilmentyminen western blotting verrattuna varhain alkanut CG näytteet (p 0,05, kaikki vertailut, taulukko 2). Lisääntynyt proteiini ja mRNA ilmaus SRC ja LYN ja vähentää CKB ilmentyminen liittyi pitkälle, syvempi tuumori-invaasio, ja läsnäolo imusolmuke ja kaukaisia ​​etäpesäkkeitä (p 0,05, kaikkien vertailujen, taulukko 2).

asteittain merkittävä kasvu SRC-proteiinia (western blotting), ja mRNA: n ilmentymisen havaittiin vastaava kasvaimen vaiheen (p 0,008, suurin osa vertailuja; Mann-Whitneyn testiä ja sen jälkeen Bonferroni korjaus; kuvio 3A ja 3B). Sen sijaan asteittain merkittävä lasku CKB proteiinia ja mRNA: n ilmentymisen havaittiin vastaava kasvaimen vaiheen (p 0,008, suurin osa vertailuja, kuviossa 3G ja 3H). Mitä LYN ilmaisun, emme tarkkailla merkittävä ero vaiheiden I ja II välillä tai vaiheiden III ja IV. Kuitenkin vaiheet I ja II olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin vaiheiden III ja IV (p 0,008, Näissä vertailuissa, kuvio 3D ja 3E).

A) SRC-proteiinin ilmentymisen; B)

SRC

mRNA ilmaisu; C) Prosenttiosuus

SRC

metylointi; D) LYN proteiinin ilmentymisen; E)

LYN

mRNA ilmaisu; F) Suhteellinen

LYN

metylointi; G) CKB proteiinin ilmentymisen; H)

CKB

mRNA ilmaisu; I) Prosenttia

CKB

metylaatio. Proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen määritettiin Western-blot ja RT-qPCR analyysi, vastaavasti. Näissä ilme analyysien ilmaisu mahalaukun kasvaimet normalisoitiin sovitettu ei-neoplastisia mahalaukun kudoksesta. DNA: n metylaatio määritettiin bisulfiitti sekvensoimalla PCR. * Merkittävä ero ryhmien Mann-Whitneyn testi seuraa Bonferroni korjauksia useita vertailun analyysi (p 0,008); ** Merkittävä ero ryhmien välillä Mann-Whitneyn testiä ja sen jälkeen Bonferronin korjausten moninkertaista vertailua varten analyysi (p 0,001);

+ Ero ryhmien välillä, mutta ei tilastollisesti merkitsevä jälkeen Bonferroni säädön (p 0,05).

kinaasigeenin metylaatiovyöhykkeiden mahalaukun näytteistä

Taulukossa 3 mety- tutkituissa proteiinikinaasien neoplastisia ja ei-neoplastisia mahalaukun näytteiden MSP. Noin 60% ja 30% GC näytteiden esitetään positiivinen vahvistus vain metyloitumattomalla alukesettiä (hypometyloidut näytettä)

SRC

ja

LYN

geenejä, tässä järjestyksessä (kuvio 4A ja 4B). Hypometylaatio näistä geeneistä ei havaittu missään ei-neoplastisia näyte. Siksi taajuus

SRC

ja

LYN

hypometylaatio oli merkitsevästi korkeampi GC kuin ei-neoplastisia mahalaukun näytettä (p 0,001, kaikkien vertailujen; χ

2 testi seurasi by Bonferroni korjaukset).

)

SRC

promoottori metylointianalyysi, joissa näytteet 1 ja 2 esitetään hypometyloidut promoottori, näyte 3 esitetään osittainen metylaatio ja näyte 4 esitetään hypermetyloitunut promoottori; B)

LYN

promoottori metylointianalyysi, joissa näytteet 1 esitetään hypometyloidut promoottori, näyte 2 esitetään osittainen metylaatio ja näytteet 3 ja 4 esitetään hypermetyloitunut promoottori; C)

CKB

promoottori metylointianalyysi, joissa näytteet 1 ja 2 esitetään hypermetyloitunut promoottori, ja näytteet 3 ja 4 esitetään hypometyloidut promoottori. C-: tyhjä; C +: positiivinen kontrolli, gDNA näyte täysin metyloitu; U: PCR metyloitumattomilla alukesettiä; M: PCR denaturoidulla alukesettiä; MW: molekyylipainomarkkeri; bp: emäsparia.

BSP analyysi vahvisti MSP-analyysi. Vuoteen BSP, 82 (59,4%) neoplastisten näytteiden ja 0 (0%) ei-neoplastisten näytteiden esitteli kloonattu sekvenssi ilman CpG-metylaation

SRC

promoottori. Lisäksi 4 (2,89%) ja 1 (0,72%) neoplastisten ja ei-neoplastisia näytteiden esitteli kloonattu sekvenssi ilman CpG-metylaation

LYN

promoottori, vastaavasti. Vuoteen BSP prosenttiosuus

SRC

[0,135 (0,31)

versus

0,563 (0,23); p 0,001] ja

LYN

[0,238 (0,40)

versus

0,7063 (0,26); p 0,001] metylaatio oli alhaisempi neoplastisten näytteissä kuin ei-neoplastisia näytteistä (kuvio 5A ja 5B).

)

SRC

metylaatio mahalaukun kasvaimet ja ei-kasvain näytteissä; B)

LYN

metylaatio mahalaukun kasvaimet ja ei-kasvain näytteissä; C)

CKB

metylaatio mahalaukun kasvaimet ja ei-kasvain näytteissä; D) välinen korrelaatio prosenttiosuus

SRC

metylaation mahalaukun kasvaimet ja pariksi ei-kasvain näytteitä; E) välinen korrelaatio prosenttiosuus

LYN

metylaation mahalaukun kasvaimet ja pariksi ei-kasvain näytteitä; F) välinen korrelaatio prosenttiosuus

CKB

metylaation mahalaukun kasvaimet ja pariksi ei-kasvain näytteitä. * Merkittävä ero ryhmien Mann-Whitneyn testi (p 0,05).

SRC

ja

LYN

metylaation neoplastisten ja ei- neoplastiset näytteitä taas havaittu liittyvän (p 0,001, molempien analyysien; χ

2 -testi). Havaitsimme, että 70/81 (86,4%) ja kasvainten hypometyloidut

SRC

esitetään osittainen metylaatio tämän geenin sovitetussa epäneoplastisis- näyte. Lisäksi olemme havainneet, että 37/41 (90,24%), kasvainten hypometyloidut

LYN

esitetty osittainen metylaatio tämän geenin sovitetussa ei-neoplastisia näyte.

SRC

ja

LYN

osittaisen metylaatio ei-neoplastisia näytteissä havaittiin useammin yksilöillä esittää kasvaimen näytteitä hypometylaatio tämän geenin verrattuna kasvaimiin osittaisella metylaatio (p 0,001, molempien analyysit) tai hypermetylaation (p 0,001, molempien analyysit). Lisäksi osittain metyloitu

LYN

epäneoplas- näytteissä oli myös useammin havaittavissa henkilökortin esittävä Tuumorinäytteissä osittaisella metylaatio tämän geenin verrattuna kasvainten hypermetylaation (p = 0,004). Vuoteen BSP, olemme myös havaittu, että prosenttiosuus

SRC

(p 0,001, ρ = 0,6902; kuvio 5D) ja

LYN

(p 0,001, ρ = 0,739; Kuva 5E ) metylaatio neoplastisten ja ei-neoplastisia näytteet korreloivat.

CKB

osittainen ja hypometylaatio havaittiin sekä neoplastisia ja ei-neoplastisia näytteitä. Kuitenkin, 48 (39%) GC näytteiden esitetty

CKB

hypermetylaation (kuvio 4C), joka ei tunnista, että ei-neoplastisia näytteitä. Lisäksi, taajuus

CKB

-hypermethylated näytteitä oli huomattavasti korkeampi neoplastisten verrattuna ei-neoplastisia mahalaukun näytteistä (p 0,001), ja

CKB

osittainen metylaatio oli merkittävästi yleisempää GC kuin ei-neoplastisia näytteistä (p 0,001). Vuoteen BSP prosenttiosuus

CKB

metylaatio oli suurempi neoplastisten näytteissä kuin ei-neoplastisia näytteet [0,511 (0,42)

versus

0,133 (0,12); p 0,001; Kuva 5C]. Kloonattuja sekvenssejä ilman CpG metylaatio havaittiin 4 (2,89%) ja 0 (0%) neoplastisten ja ei-neoplastisten näytteet, vastaavasti.

CKB

metylaatio neoplastisten ja ei -neoplastic näytteitä näyttäneet liittyvän (p = 0,014, jonka χ

2 -testi). 2×2 analyysi käyttäen χ

2 testi paljasti, että parit, joissa kasvain näytteet esitti hypermetyloitunut

CKB

ja vastaavan ei-neoplastisia näytteitä esitteli hypometylaatio tämän geenin olivat yleisempiä kuin paria kasvainten hypermetylaation ja Hyväksytty epäneoplastisis- näytteiden osittainen metylaatio (p = 0,0381), mutta tämä havainto ei ollut tilastollisesti merkitsevä, jos Bonferronin tehtiin oikaisu (oikaistu α = 0,05 /3 = 0,0167). Kuitenkin BSP, havaitsimme, että prosenttiosuus

CKB

metylaatio neoplastisten ja ei-neoplastisia näytteet korreloi käänteisesti (p 0,001, ρ = -0,375, kuvio 5F).

suoraa korrelaatiota ei havaittu

SRC

ja

LYN

metylaatiovyöhykkeiden ei-neoplastisten näytteistä (p 0,001, ρ = 0,627). Lisäksi käänteinen korrelaatio havaittiin välillä

SRC

ja

CKB

(p 0,001, ρ = -0,467) ja

LYN

ja

CKB

(p 0,001, ρ = -0,359) metylointi. Kuitenkin GC näytteiden suora korrelaatio havaittiin keskuudessa metylaatio prosenttiosuus kolme tutkittu kinaasien:

SRC

ja

LYN

(p 0,001, ρ = 0,840);

SRC

ja

CKB

(p 0,001, ρ = 0,684);

LYN

ja

CKB

(p 0,001, ρ = 0,663).

metylointi sääntely kinaasien

valaista epigeneettiset sääntelyn tutkittu geenit, arvioimme mahdollinen yhteys promoottorin metylaation ja proteiinin immunoreaktiivisuus ja mRNA ja proteiinin ilmentyminen (western blotting).

Havaitsimme, että sekä mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä SRC (p 0,001, ρ = -0,834; p 0,001, ρ = -0,718, vastaavasti, kuvio 6A ja 6B) ja LYN (p 0,001, ρ = -0,792, p 0,001, ρ = -0,654, vastaavasti, kuvio 6D ja 6E) oli kääntäen korreloi prosenttiosuus promoottorin metylaation. Lisäksi kasvaimista SRC [0,062 (0,08)

versus

0,375 (0,33); p 0,001; Mann-Whitney testi; 0,001; Yang et ai.